木犀草素制備趨化因子受體拮抗劑的抗炎用圖
【技術領域】
[0001] 本發明涉及木犀草素對趨化因子受體2b拮抗劑的抗炎用途。
【背景技術】
[0002] 趨化因子（chemokines)是指具有趨化作用的細胞因子，屬于小分子的分泌蛋白 超家族（約8-10KDa，含70-90個氨基酸）。它在很多種疾病的病理生理過程中起著重要作 用，如多發性硬化、類風濕性關節炎、器官移植排斥、心腦血管疾病、腫瘤以及HIV等。趨化 因子通過與受體結合，在某種程度上促進了各種炎癥性疾病以及各種自身免疫性疾病的發 生和發展。因而通過抑制趨化因子與其受體結合可在一定程度上抑制相關疾病的發生。趨 化因子受體拮抗劑的研究已經成為當前新藥研究的熱點課題之一。
[0003] 趨化因子受體2b (CCR2b)是單核細胞趨化蛋白-1 (Monocyte Chemoattractant Protein-1，MCP-1)的受體，MCP-1是重要的趨化類炎癥因子，在炎癥、風濕性關節炎、多發 性硬化、動脈粥樣硬化、肺纖維化等多種疾病的發生和發展過程中起著關鍵作用。因此篩選 趨化因子受體2b拮抗劑在一定程度上對研究以上疾病的發病機制及治療有一定的意義。

【發明內容】

[0004] 為了開發趨化因子受體2b拮抗劑從而為炎癥的治療尋找新的候選藥物，本發明 在采用趨化因子受體2b拮抗劑高通量篩選模型，通過功能性驗證尋找先導化合物，發現了 一類雷公藤三萜酸C類趨化因子受體2b拮抗劑，為新型的抗炎藥開發提供先導化合物。本 發明可為此類臨床炎癥治療藥物的開發提供先導化合物，為新型抗炎藥物開發提供線索和 實驗依據。
[0005] 本發明的技術方案為：在中國倉鼠卵巢癌細胞（CH0)內穩定轉染趨化因子受體 2b，建立趨化因子受體2b詰抗劑祀向激動劑高通量篩選模型，初篩，復篩，得到一類具有抗 炎作用的候選藥物。具體步驟如下：
[0006] 步驟一：建立及培養穩定轉染趨化因子受體2b的CH0細胞株。
[0007] 步驟二：激動劑模型建立及陽性藥驗證，確定激動劑的ECS。。
[0008] 步驟三：拮抗劑模型建立及陽性性藥驗證。
[0009] 步驟四：采用穩轉細胞株和實驗確定的最佳檢測條件對化合物進行趨化因子受體 2b拮抗劑的高通量篩選，得到有明顯量效關系的化合物。
【附圖說明】：
[0010] 圖1 :激動劑對照量效關系
[0011] 圖2 :詰抗劑對照量效曲線
[0012] 圖3 :先導化合物量效曲線
【具體實施方式】
[0013] 以下結合【附圖說明】本發明的【具體實施方式】：
[0014] 1.實驗材料：
[0015] (1)完全培養：F12 ;10% FBS。
[0016] (2)選擇培養：400 μ g/mL G418。
[0017] (3) Stimulation Buffer (SB):試劑盒自帶。
[0018] (4)主要儀器：C02培養箱；384 孔板；Paradigm ? Detection Platform。
[0019] 2.建立及培養穩定轉染趨化因子受體2b的CHO CCR2B細胞株。
[0020] 3.激動劑模型建立及陽性藥驗證，確定激動劑的ECS。：
[0021 ] (1)配制MCP-1梯度稀釋液：確定最佳細胞數時需要用MCP-1對細胞進行刺激，所 以應首先將11494nM的MCP-1母液（使用含不低于0. 1 % BSA的PBS配制）用SB逐級稀釋 為工作濃度的2倍。
[0022] (2)配制不同濃度的細胞稀釋液：用SB將細胞分別稀釋為4000〇cells/well、 30000cells/well 及 20000cells/well。
[0023] (3)加樣：將3· (1)中稀釋好的MCP-1溶液按每個濃度2個復孔，5 μ L每孔加入 384孔板中。接著向不同濃度的MCP-1溶液中加入3. (2)配制好的不同濃度的細胞稀釋液 各5 μ L。將384孔板在500rpm下離心15s，使10 μ L試劑混合均勻以充分反應。為防止試 劑蒸發造成損失，將TopSeal-A膜貼于板面并將板放于室溫下使之孵育60min。
[0024] (4)終止試劑：用 Lysis buffer(LB)將 IPl-d2 及 anti-IPl 稀釋 33 倍，按 1 : 1 混勾后加入各孔，每孔10 μ L。將384孔板在500rpm下離心15s，使20 μ L試劑混合均勾以 充分反應。重新貼上TopSeal-A膜并將板放于室溫下繼續孵育60min。
[0025] (5)檢測：孵育時間到達后，揭去TopSeal-A膜，將板放于設定好程序的Paradigm? Detection Platform上檢測。處理數據，確定最佳細胞數及MCP-1的ECS0〇
[0026] 4.拮抗劑驗證
[0027] (1) CCR2b拮抗劑BMS CCR2 22使用DMS0配制成0. 5mM儲備液，用SB逐級稀釋為 最終濃度的2倍。
[0028] (2)配制含最佳細胞數的溶液：用SB將細胞稀釋為3. (5)中得到的最佳細胞濃 度。
[0029] (3)加樣：將4· (1)中稀釋好的BMS CCR2 22溶液按每個濃度2個復孔，2. 5 μ L每 孔加入384孔板中。將4. (2)配制的細胞溶液按每孔5 μ L加入384孔板中。將384孔板 在500rpm下離心15s，使7. 5 μ L試劑混合均勾以充分反應。為防止試劑蒸發造成損失，將 TopSeal-A膜貼于板面并將板放于室溫下使之孵育60min。
[0030] (4)將MCP-1母液稀釋成3. (5)中測定的ECS。，每孔2. 5 μ 1加入對應的含BMS CCR2 22的384孔板中。將384孔板在500rpm下離心lmin，使10 μ L試劑混合均勻以充分反應。 為防止試劑蒸發造成損失，將TopSeal-A膜貼于板面并將板放于37°C /5% C02下使之孵育 60min〇
[0031] (5)按3.⑷配制終止試劑。向每孔加入10yL IPl-d2/anti-IPl溶液（1 : 1)。 將384孔板在500rpm下離心15s，使20 μ L試劑混合均勻以充分反應。重新貼上TopSeal-A 膜并將板放于室溫下繼續孵育60min。
[0032] (6)孵育時間到達后，揭去TopSeal-A膜，將板放于設定好程序的Paradigm? Detection Platform上檢測。處理數據，確定詰抗劑的IC5。。
[0033] 5.采用摸索的最佳檢測條件在穩轉細胞中對趨化因子受體2b拮抗劑進行初篩與 復篩。處理數據，計算所篩選化合物IC5。。
[0034] 趨化因子受體2b受體活性篩選實驗結果
[0035] 篩選得到的趨化因子受體2b拮抗劑為木犀草素類化合物，其結構式與IC5。如下：
[0037] 先導化合物對趨化因子受體2b拮抗活性：
【主權項】
1. 式（I)的化合物或其藥學上可以接受的鹽在趨化因子受體2b拮抗劑的用途；2. 按照權利要求1的用途，作為趨化因子受體2b拮抗劑，用于治療炎癥的用途。
【專利摘要】本發明涉及式(I)的趨化因子受體2b拮抗劑或其藥學上可接受的鹽。此類化合物可以拮抗趨化因子受體2b，有效地產生抗炎作用。
【IPC分類】A61P29/00, A61K31/352
【公開號】CN105287494
【申請號】CN201510828307
【發明人】嚴明, 汪豪, 高鵬, 張陸勇
【申請人】中國藥科大學
【公開日】2016年2月3日
【申請日】2015年11月20日