雷酚內酯作為雄激素受體拮抗劑的應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及中藥提取物領域，具體地說，設及雷公藤根提取物雷酪內醋在作為雄 激素受體括抗劑方面的應用。
【背景技術】
[0002] 雄激素（Androgen)，如雄酬（Testosterone，T)、二氨雄酬（Dihy化otestosterone， DHT)和腎上腺雄酬等，是人體內一類重要的醬體類性激素，通過與雄激素受體(Arulrogen Receptor, AR)結合促進細胞分化和組織生長，參與眾多關鍵生理功能。男性或女性體內都 存在一定比例的雄激素。在前列腺和皮膚中，雄酬T被5a-還原酶轉化為DHT，且與T相比，DHT 對AR的親和力要高出3-5倍。
[0003] AR是核受體超家族的一個成員，屬配體激活的轉錄因子，廣泛分布于增殖和非增 殖組織。AR蛋白具有S個結構域：N端結構域（N termina 1 domain，NTD)、DNA結合域（DNA binding domain,D抓)和配體結合域(Xigan化inding domain，LBD)。其中在LBD結合域有一 個激素結合口袋化Ormone binding pocket，皿P)，雄激素結合于皿P時，AR的化Iixl2發生 構象變化而成為激動構象(Agonistic conformation)，形成二聚化結構，進入細胞核中與 位于祀基因啟動子區的雄激素應答原件(An化Ogen response element ,ARE)結合，起到激 活或抑制祀基因表達的作用，從而調控祀組織的生理功能。雄激素受體括抗劑，即為能夠和 雄激素競爭占據皿P，并阻止化lix-12處于活性位置的分子。很多AR相關疾病的產生，或是 由于激素水平失常，或是因為受體功能素亂，破壞了正常的相互作用平衡關系。在患病個體 中，藥物通過加強或抑制受體活化水平可達到治療相關疾病的效果。因此，在治療與雄激素 作用相關的多種疾病和癥狀當中，AR是重要的祀標。其中雄激素亢奮為男性前列腺癌、前列 腺增生癥、性欲亢進等疾病;女性瘦瘡，脂溢性皮炎，多毛癥，脫發等疾病的重要因素，因而 雄激素受體括抗劑是治療上述疾病尤其是前列腺癌的重要藥物。
[0004] 雄激素受體括抗劑是目前治療前列腺癌的主體藥物。運類藥物可分為醬類與非醬 類兩種。醬類抗雄激素藥物W醋酸環丙孕酬(CPA)為代表，還包括醋酸甲地孕酬和醋酸甲徑 孕酬。非醬類抗雄激素藥物（Nonsteroidal antiandorgens ,NSAA)有一代的氣他胺 (f Iutamide，FLU)、比卡魯胺（bicalutamide，BIC)和二代的恩雜魯胺（enzalutaimide， ENZ)、阿比特龍（abiraterone)。但在治療中產生的耐藥性問題嚴重影響了運些藥物的療 效，甚至會促進前列腺癌細胞的生長。因而，尋找治療新型的雄激素受體括抗劑迫在眉睫。

【發明內容】

[0005] 為了解決現有技術中存在的問題，本發明的目的是提供一種新型雄激素受體括抗 劑一一雷酪內醋。
[0006] 為了實現本發明目的，本發明的技術方案如下：
[0007] 第一方面，本發明提供了雷酪內醋(CAS號：74285-86-2)作為雄激素受體括抗劑的 應用。
[0008] 雷酪內醋為一種已知化合物，可購自市售產品，也可從雷公藤中提取分離得到，具 體的獲取手段為現有技術，本發明對此不作特別限定。
[0009] 雷酪內醋可W抑制野生型W及突變型雄激素受體的活性。突變型雄激素受體包括 877位蘇氨酸(T)^丙氨酸(A)，741位色氨酸(W)^亮氨酸化)或者半脫氨酸(C)，876位苯丙 氨酸(F)^亮氨酸化）。其是通過AR基因的點突變而導致了相關氨基酸的突變。該突變的產 生使得藥物與AR結合時，AR的構象由括抗劑狀態轉變為激動劑狀態，從而對藥物產生耐藥 性，制約了相關藥物的使用，所W其對克服抗前列腺癌的耐藥性問題具有重要意義。
[0010] 發明人經過試驗發現，雷酪內醋對T877A突變型受體具有良好的抑制作用。因此作 為優選，將雷酪內醋作為T877A突變雄激素受體括抗劑。T877A突變型受體與氣他胺的耐藥 性相關，雷酪內醋可通過抑制T877A突變型受體的活性，達到治療氣他胺耐藥的前列腺癌的 目的。
[0011] 發明人經過試驗發現，雷酪內醋對F87化突變型受體具有良好的抑制作用。因此作 為優選，將雷酪內醋作為F87化突變雄激素受體括抗劑。F87化突變型受體與恩雜魯胺的耐 藥性相關，雷酪內醋可通過抑制F87化突變型受體的活性，達到治療恩雜魯胺耐藥的前列腺 癌的目的。
[0012] 第二方面，本發明提供了雷酪內醋在制備治療雄激素失調疾病的藥物中的應用。
[0013] 本發明所述的治療雄激素失調疾病的藥物W雷酪內醋為活性成分制備而成，具體 為本領域技術人員所掌握。
[0014] 更具體而言，本發明提供的雷酪內醋主要針對由雄激素亢奮引起的疾病，包括男 性前列腺增生癥或前列腺癌、性欲亢進、女性瘦瘡、脂溢性皮炎、多毛癥、脫發等。
[0015] 可選的，所述雄激素失調疾病為前列腺增生癥或前列腺癌。需要特別強調的是，由 于前列腺癌的致病機理主要是雄激素受體信號通路發生異常活化。其信號通路過程為雄激 素與AR結合，AR被激活并二聚化憐酸化，進入細胞核中，與特異的DNA部位(AR Response Element ,ARE)結合，募集RNA聚合酶等轉錄元件，調控祀基因的轉錄表達，如前列腺特異性 抗原(PSA)、TMPRSS2、F邸P5等基因（圖1)。該信號通路正常情況下可W促進前列腺上皮細胞 的分化，而持續激活情況下則會調節細胞增殖、存活等，從而形成腫瘤并惡化。本發明提供 的雷酪內醋正是作用于AR,抑制異常活化的雄激素受體信號通路，從而抑制腫瘤的惡化。因 此，本發明所述的雷酪內醋可對前列腺癌具有顯著療效。
[0016] 可選的，所述雄激素失調疾病為男性性欲亢進。由于男性性欲亢進同樣是由雄激 素亢奮引起的疾病，本發明提供的雷酪內醋可通過抑制雄激素受體的活性，達到治療該疾 病的目的。
[0017] 可選的，所述雄激素失調疾病為女性瘦瘡、脂溢性皮炎、多毛癥、脫發等。當上述疾 病確由雄激素通路亢奮引起時，本發明所述的雷酪內醋，可有效的對上述疾病進行治療。
[0018] 第S方面，本發明提供了雷酪內醋在制備男性避孕藥物方面的應用。
[0019] 由于雷酪內醋可抑制野生型和突變型雄激素受體的活性，調控雄激素受體信號通 路，從而通過反饋調節對雄激素分泌起到抑制作用。因此，本發明所述的雷酪內醋可作為男 性避孕藥物的活性成分，在男性避孕方面有效的實現避孕效果。
[0020] 本發明的有益效果在于：
[0021] 天然產物是藥物開發的重要來源，諸多藥物如青葛素、奎寧W及紫杉醇都是從天 然產物中發現的。雷公藤作為一味重要的中藥，在中藥中廣泛使用。通過前期篩選和后期機 審Ij研究，本發明發現雷公藤根提取物的單體一雷酪內醋，可W選擇性抑制AR依賴的LNCaP細 胞的增殖，對內源性AR及AR-F87化突變體的轉錄、AR蛋白的表達、AR的核定位均具有很好的 抑制作用，是新型的雄激素受體括抗劑。
[0022]本發明通過構建可靠雄激素活性篩選方法，測試了多類中藥提取物對雄激素受體 活性的抑制作用，最后發現雷公藤跟根提取物單體雷酪內醋是一類新型的雄激素受體括抗 劑，可W抑制野生型W及突變性雄激素受體的活性。進一步地，本發明測試了雷酪內醋的抗 前列腺癌的活性，發現雷酪內醋對于A郎日性的前列腺癌細胞如LNCaPW及22RV1具有較好的 活性。
【附圖說明】
[002引圖巧本發明實施例1中雷酪內醋對PC-3中過表達的野生型AR轉錄活性的影響。
[0024] 圖2為本發明實施例2中雷酪內醋對LNCaP、22RVl細胞內源性的AR轉錄活性的影 響。
[0025] 圖3為本發明實施例3中雷酪內醋對在PC-3中表達的877位氨基酸突變的AR轉錄活 性的影響。
[0026] 圖4為本發明實施例4中雷酪內醋對在PC-3中表達的876位氨基酸突變的AR轉錄活 性的影響。
[0027] 圖5為本發明實施例5中雷酪內醋競爭性結合AR的巧光極化(FP)實驗結果。
[0028] 圖6為本發明實施例6中雷酪內醋的細胞增殖實驗(MTT);其中：A圖是在PC-3細胞 中，B圖是在22RV1細胞中，C圖是在LNCaP細胞中，各組實驗均設了S組平行。
【具體實施方式】
[0029] 下面將結合實施例對本發明的優選實施方式進行詳細說明。需要理解的是W下實 施例的給出僅是為了起到說明的目的，并不是用于對本發明的范圍進行限制。本領域的技 術人員在不背離本發明的宗旨和精神的情況下，可W對本發明進行各種修改和替換。
[0030] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0031] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0032] 實施例1雷公藤單體雷酪內醋可抑制野生型雄激素受體的活性
[00削將1.4X IO5個/mL的PC-3細胞懸液，按照每孔500化接種于24孔板中。待細胞長至 80 %時，每孔共轉染IOOng PSA-Iuc、20ngAR-WT和Ing pCMV-Reni 1 Ia質粒。轉染后化將培養 基換成含lO^charcoal-stripped FBS的曲enol red-free RPMI 1640培養基；轉染24h后， 其中一組按照每孔InM的DHT+相應濃度的雷酪內醋或恩雜魯胺各加入化L，另一組按照每孔 DMSO或相應濃度的雷酪內醋或恩雜魯胺加入化L，繼續培養2地。最后將培養基吸掉，每孔加 入10化L的1 X化B裂解20min，收集細胞裂解物到干凈的EP管中，離屯、，取上清20化到干凈的 白色96孔板中，按照Promega公司的Dual-Glo愈Luciferase Assay System試劑盒的說明 書，用Centro XS3 LB 960酶標儀測定巧光值。實驗設置了 =組平行，并進行了統計學分析， 其中沖<0.05是WDMSO組為參照，Ap<0 . 05，^P<0.01WDHT組為參照。實驗數據W ^ ± 5表 示，并用GraphPad Prism 5.0進行作圖（見圖1)和統計學分析。
[0034] 該實驗原理是將AR的祀基因前列腺特異性抗原（prostate specific antigen, PSA)的啟動子和蛋火蟲巧光素酶基因偶聯，W校準后的蛋火蟲巧光素酶活性(相對巧光值， 化U)來反映AR的轉錄活性。實驗結果顯示，雷酪內醋對野生型的AR轉錄活性具有很好的抑 制作用，在50nM、500nM、5iiMS個濃度下呈現劑量依賴關系。在±DHT的作用下，50nM的雷酪 內醋就可W顯著抑制AR-WT的轉錄活性，其在