一種雞傳染性支氣管炎卵黃抗體的提取方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及獸用生物制品技術領域，具體涉及一種雞傳染性支氣管炎卵黃抗體的提取方法。
【背景技術】
[0002]雞傳染性支氣管炎是由傳染性支氣管炎病毒引起的雞的一種急性高度接觸性呼吸道傳染病。傳染性支氣管炎病毒屬于尼多病毒目、冠狀病毒科、冠狀病毒屬、冠狀病毒III群的成員。本病主要通過空氣傳播，也可以通過飼料、飲水、墊料等傳播，產蛋雞感染通常變現產蛋量降低，蛋的品質下降。本病廣泛流行于世界各地，是養雞業的重要疫病。
[0003]雞卵黃抗體(Immunoglobulin of egg yolk, IgY)是由母禽血液中IgG轉移至其卵黃中對子代產生保護性作用的免疫球蛋白，是卵黃中存在的唯一一種免疫球蛋白，也稱卵黃免疫球蛋白。免疫雞蛋卵黃中含有大量來源于血清的IgG抗體(即IgY)，濃度遠高于血清，具有高度穩定性和生物學活性，這使雞卵黃抗體IgY 口服防病治病成為可能。
[0004]目前卵黃抗體的提取方法主要有水稀釋法、有機物沉淀法、有機溶劑抽提法和超臨界氣體提取法等。其中水稀釋法工藝比較簡單，抗體回收率較高，是目前應用較廣泛的分離方法。而這些方法存在諸如實驗不易操作、IgY提取的純度與得率均較低等缺點。因此，尋求一種相對簡單、實用、純度與得率均較高的提取卵黃免疫球蛋白IgY方法勢在必行。

【發明內容】

[0005]本發明旨在針對現有技術的技術缺陷，提供一種雞傳染性支氣管炎卵黃抗體的提取方法，以解決現有技術的相關方法收率和純度較低的技術問題。
[0006]本發明要解決的另一技術問題是現有技術的相關方法不易操作。
[0007]為實現以上技術目的，本發明采用以下技術方案:
[0008]—種雞傳染性支氣管炎卵黃抗體的提取方法，包括以下步驟:
[0009]1)取雞傳染性支氣管炎高免卵黃，與水按1:5?1:15 (w/w)的比例混合均勻，得到卵黃稀釋液；
[0010]2)向步驟1)所述卵黃稀釋液中加入10?30% (v/v)的飽和硫酸銨溶液和PEG，得到第一萃取體系，而后攪拌10?30min，再靜置10?20min，收集上相即為第一上相，所述第一萃取體系中PEG含量為8?20% (w/w)；
[0011 ] 3)向步驟2)所述第一上相中加入10?30% (v/v)的飽和硫酸銨溶液，得到第二萃取體系，而后攪拌10?30min，再靜置10?20min，收集上相即為第二上相；向所述第二上相中加入10?30% (v/v)的飽和硫酸銨溶液，得到第三萃取體系，調節其pH至5.0?5.4，而后攪拌10?30min，再靜置10?20min，收集下相；
[0012]4)取步驟3)所述下相超濾濃縮，即得到雞傳染性支氣管炎卵黃抗體濃縮液。
[0013]作為優選，步驟1)所述的水是由超純水系統制備的純化水。
[0014]作為優選，步驟2)所述的PEG是PEG2000。
[0015]作為優選，步驟3)中利用鹽酸調節第三萃取體系pH。
[0016]作為優選，步驟3)中調節第三萃取體系pH至5.2。
[0017]作為優選，步驟4)所述的超濾是利用雙效超濾系統執行的。
[0018]作為優選，步驟4)所述超濾的截留分子量為150kd?220kd。
[0019]作為優選，步驟4)中超濾濃縮至原體積的1/10?1/15。
[0020]作為優選，還包括步驟5):取步驟4)所述雞傳染性支氣管炎卵黃抗體濃縮液，冷凍干燥，制得雞傳染性支氣管炎卵黃抗體凍干粉。
[0021]作為優選，所述雞傳染性支氣管炎卵黃抗體濃縮液于4°C條件下密封保存。
[0022]在以上技術方案中，所述上相是指在萃取過程中，密度較小、處于體系上方的溶液；相對應的，所述下相是指在萃取過程中，密度較大、處于體系下方的溶液。此外，本發明所述的高免卵黃是用于提取卵黃抗體的原料，通常是以雞傳染性支氣管炎疫苗免疫雞后，取其所產雞蛋的卵黃，該卵黃中含有卵黃抗體；本發明中高免卵黃的獲取方法可以依照本技術領域的公知方法實施。
[0023]本發明技術方案先將高免卵黃加適量純化水稀釋，而后利用雙水相萃取方法初步萃取，再分兩次萃取純化，在此基礎上結合雙效超濾技術除鹽、濃縮，能最大限度的提純卵黃抗體，且不會對卵黃抗體造成破壞、不影響其生物活性，因此本發明方法制備的產品具有較高的純度和收率，同時生物活性較強，可制作成粉劑、溶液劑、噴霧劑、注射劑、注射用凍干粉等臨床適用劑型，易于推廣應用。
【具體實施方式】
[0024]以下將對本發明的【具體實施方式】進行詳細描述。為了避免過多不必要的細節，在以下實施例中對屬于公知的結構或功能將不進行詳細描述。
[0025]以下實施例中所使用的近似性語言可用于定量表述，表明在不改變基本功能的情況下可允許數量有一定的變動。因此，用“大約”、“左右”等語言所修正的數值不限于該準確數值本身。在一些實施例中，“大約”表示允許其修正的數值在正負百分之十(10%)的范圍內變化，比如，“大約100”表示的可以是90到110之間的任何數值。此外，在“大約第一數值到第二數值”的表述中，大約同時修正第一和第二數值兩個數值。在某些情況下，近似性語言可能與測量儀器的精度有關。
[0026]除有定義外，以下實施例中所用的技術和科學術語具有與本發明所屬領域技術人員普遍理解的相同含義。
[0027]以下實施例中所用的試驗試劑耗材，如無特殊說明，均為常規生化試劑；所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法；以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值；以下實施例中的％，如無特別說明，均為質量百分含量。
[0028]實施例1
[0029]取雞傳染性支氣管炎免疫母雞所產雞蛋，浸入42°C的0.1 %新潔爾滅水溶液中消毒15min，隨后將雞蛋浸入溫度為95°C以上的水中消毒5s，取出后于無菌條件下晾干或吹干，打蛋分離蛋清與卵黃，充分除去蛋清和卵黃系膜，將卵黃收集于一容器中，攪拌均勻，即得到雞傳染性支氣管炎高免卵黃。
[0030]1)原材料的預處理:將雞傳染性支氣管炎高免卵黃與純化水按一定的比例攪拌均勻；
[0031 ] 2)雙水相初步萃取:緩慢加入15 %體積的飽和硫酸銨溶液，加入PEG，使其質量分數達到12%，攪拌20min，靜置15min，收集上相；
[0032]3)雙水相萃取純化:向上述溶液中緩慢加入15 %體積的飽和硫酸銨溶液，攪拌20min，靜置15min，收集上相，向上相中加入20%體積的飽和硫酸錢溶液，用鹽酸調節PH至5.2，攪拌20min，靜置15min，收集下相；
[0033]4)卵黃抗體的濃縮:使用超濾系統進行除鹽，同時進行濃縮至原體積的1/10 ;
[0034]5)卵黃抗體的干燥:將卵黃濃縮液進行冷凍干燥，制成凍干粉，即為卵黃抗體產品Ο
[0035]實施例2
[0036]取雞傳染性支氣管炎免疫母雞所產雞蛋，浸入42°C的0.1 %新潔爾滅水溶液中消毒15min，隨后將雞蛋浸入溫度為95°C以上的水中消毒5s，取出后于無菌條件下晾干或吹干，打蛋分離蛋清與卵黃，充分除去蛋清和卵黃系膜，將卵黃收集于一容器中，攪拌均勻，即得到雞傳染性支氣管炎高免卵黃。
[0037]1)原材料的預處理:將雞傳染性支氣管炎高免卵黃與純化水按一定的比例攪拌均勻；
[0038]2)雙水相初步萃取:緩