一種熊果酸前列腺素受體2拮抗劑的抗炎用圖
【技術領域】
[0001] 本發明涉及熊果酸對前列腺素E2受體2拮抗劑的抗炎用途。
【背景技術】
[0002] 前列腺素E2 (PGE2)通過作用于4種功能相互拮抗的受體廣泛地參與了機體及細 胞代謝過程。這4種PGE2受體分別被命名為EP1、EP2、EP3和EP4。所有的這些PGE2受體 均是G-蛋白偶聯受體，但具有不同的組織定位和表達調控方式，并介導不同的信號傳導通 路和生理學作用。在這4種受體中，EP2和EP4與同一種類型的G蛋白（激活型G蛋白，Gs) 偶聯，激活后都能增加細胞內的cAMP，因此它們的功能具有一定的重疊性，但在某些生理過 程中它們又發揮著截然不同的作用。
[0003] 炎癥是具有血管系統的活體組織對損傷因子所發生的防御反應為炎癥。血管反應 是炎癥過程的中心環節。炎癥是臨床常見的一個病理過程，可以生于機體各部位的組織和 各器官。急性炎癥平時具有紅、腫、熱、痛、機能掩藏等變化，同隨時常伴有發熱、白細胞增多 等全身反應。是機體對于刺激的一種防御反應。
[0004] 花生四烯酸的代謝產物PGE2 -直被認為在急性炎癥中起著重要作用，在炎癥中 明顯升高。PGE2 -直被認為通過作用于外周循環系統引發充血和腫脹，在急性炎癥中起著 重要作用。PGE2與EP受體結合后，產生促進細胞增殖抑制凋亡的作用，選擇性EP2受體激 動劑常用于青光眼治療以及缺血性中風，同時，有大量證據表明EP2起著中樞神經系統疾 病促進作用，包括阿爾茨海默氏病，帕金森病，肌萎縮側索硬化癥和癲癇，對持續性疾病，如 類風濕關節炎，炎性腸病和癌癥均有促進。
【發明內容】
[0005] 為了開發前列腺素E2受體2拮抗劑從而為炎癥的治療尋找新的候選藥物，本發明 在采用前列腺素E2受體2拮抗劑高通量篩選模型，通過功能性驗證尋找先導化合物，發現 了一類熊果酸類前列腺素E2受體2拮抗劑，為新型的抗炎藥開發提供先導化合物。本發明 可為此類臨床炎癥治療藥物的開發提供先導化合物，為新型抗炎藥物開發提供線索和實驗 依據。
[0006] 本發明的技術方案為：在HEK293內穩定轉染前列腺素E2受體2,建立前列腺素E2受體2拮抗劑靶向激動劑高通量篩選模型，初篩，復篩，構效關系分析，得到一類具有抗 炎作用的候選藥物。具體步驟如下：
[0007] 步驟一：建立及培養穩定轉染前列腺素E2受體2的293細胞株。
[0008] 步驟二：激動劑模型建立及陽性藥驗證，確定激動劑的ECS。。
[0009] 步驟三：拮抗劑模型建立及陽性性藥驗證。
[0010] 步驟四：采用穩轉細胞株和實驗確定的最佳檢測條件對化合物進行前列腺素E2 受體2拮抗劑的高通量篩選，得到有明顯量效關系的化合物。
【附圖說明】：
[0011] 圖1 :激動劑對照量效關系
[0012] 圖2 :詰抗劑對照量效曲線
[0013] 圖3:先導化合物量效曲線
【具體實施方式】
[0014] 以下結合【附圖說明】本發明的【具體實施方式】：
[0015]1.實驗材料：
[0016] (1)完全培養：DMEM;10%FBS;1%青霉素鏈霉素混合液。
[0017] (2)StimulationBuffer(SB):含ImMIBMX的DMEM〇
[0018] (3)主要儀器：C02培養箱；384 孔板；Paradigm?DetectionPlatform。
[0019] 2.建立及培養穩定轉染前列腺素E2受體2的HEK293EP2細胞株。
[0020] 3.最佳細胞數確定
[0021] (1)配制Forskolin梯度稀釋液：需要用Forskolin對細胞進行刺激，所以應將 Forskolin儲備液逐級稀釋為最終濃度的2倍。
[0022] (2)配制不同濃度的細胞稀釋液：用SB將1. (7)中重懸好的細胞分別稀釋為 200cells/yL、400cells/yL及 800cells/yL。
[0023] (3)加樣：將3. (1)中稀釋好的Forskolin溶液按每個濃度2個復孔，5μL每孔加 入384孔板中，再加入2孔每孔各5yL的SB作為cellnegativecontrol(CNC)。接著向 不同濃度的Forskolin溶液及CNC中加入3. (2)配制好的不同濃度的細胞稀釋液各5μL。 將384孔板在500rpm下離心15s，使10μL試劑混合均勻以充分反應。為防止試劑蒸發造 成損失，將TopSeal-A膜貼于板面并將板放于室溫下使之孵育45min。
[0024] (4)終止試劑：用Lysisbuffer(LB)將cAMP-d2 稀釋 40 倍，將anti-cAMP稀釋 20 倍。取適量LB與稀釋好的anti-cAMP溶液按1 : 1混合，向CNC中每孔各加入10μL;將 剩余cAMP-d2溶液與anti-cAMP溶液按1 : 1混勻后加入到其余各孔，每孔10μL。將384 孔板在500rpm下離心15s，使20μL試劑混合均勻以充分反應。重新貼上TopSeal-A膜并 將板放于室溫下繼續孵育60min。
[0025] (5)檢測：孵育時間到達后，揭去TopSeal-A膜，將板放于設定好程序的Paradigm? DetectionPlatform上檢測。處理數據，確定最佳細胞數及Forskolin的ECS。。
[0026]4.激動劑模型建立及陽性藥驗證，確定激動劑的ECS。：
[0027] (1)EP2激動劑ProstaglandinE2使用DMS0配制成ImM儲備液，因S1P1 偶聯Gai， 需加入Forskolin刺激cAMP產生。首先根據3. (5)中Forskolin的ECS。配制FSB，再用FSB 逐級稀釋為最終濃度的2倍。
[0028] (2)配制含最佳細胞數的溶液：用SB將細胞稀釋為3. (5)中得到的最佳細胞濃 度。
[0029] (3)加樣：將4. (1)中稀釋好的ProstaglandinE2溶液按每個濃度2個復孔， 5yL每孔加入384孔板中，再加入4孔每孔各5yL的SB，其中2孔作為CNC，另2孔作為 non-stimulatedcontrol(NSC)。將4. (2)配制的細胞溶液按每孔5yL加入384孔板中。 將384孔板在500rpm下離心15s，使10μL試劑混合均勻以充分反應。為防止試劑蒸發造 成損失，將TopSeal-A膜貼于板面并將板放于室溫下使之孵育45min。
[0030] (4)按3.⑷配制終止試劑。向CNC中每孔加入10 μ L LB/anti-cAMP溶液（1 : 1)， 向NSC及其余各孔每孔加入10yL cAMP-d2/anti-cAMP溶液（1 :1)。將384孔板在500rpm下離心15s使20 μ L試劑混合均勻以充分反應。重新貼上TopSeal-A膜并將板放于室溫下 繼續孵育60min。
[0031] (5)孵育時間到達后，揭去TopSeal-A膜，將板放于設定好程序的Beckman Paradigm上檢測。處理數據，確定CS 2100的EC5。及ECs。。
[0032] 5.拮抗劑驗證
[0033] (1) ΕΡ2拮抗劑PF 04418948使用DMS0溶液配制成ImM儲備液，以SB逐級稀釋為 最終濃度的4倍。
[0034] (2)配制含最佳細胞數的溶液：用SB將細胞稀釋為3. (5)中得到的最佳細胞濃 度。
[0035] (3)加樣：將5· (1)中稀釋好的PF04418948溶液按每個濃度2個復孔，2. 5μL每 孔加入384孔板中，再加入4孔每孔各5μL的SB，其中2孔作為CNC，另2孔作為NSC，再 加入2孔每孔各2.5yL的SB，作為cellpositivecontrol(CPC)。將5. (2)配制的細胞 溶液按每孔5μL加入384孔板中。將384孔板在500rpm下離心15s，使7. 5μL試劑（CNC 及NSC為10μL)混合均勻以充分反應。為防止試劑蒸發造成損失，將TopSeal-A膜貼于板 面并將板放于室溫下使之孵育30min。
[0036] (4)根據 3. (5)中Forskolin的EC8。配制FSB，用FSB按 4. (5)中Prostaglandin E2的ECS。配制ProstaglandinE2溶液。向CPC中加入FSB，每孔2. 5μL;其余各孔加入CS 2100溶液，每孔2. 5μL;CNC及NSC不加操作。將384孔板在500rpm下離心15s，使10μL 試劑混合均勻以充分反應。重新貼上TopSeal-A膜并將板放于室溫下繼續孵育45min。
[0037] (5)按3.⑷配制終止試劑。向CNC中每孔加入10μLLB/anti-cAMP溶液（1 : 1)， 向吧(：、0?(：及其余各孔每孔加入1(^1^〇41^-(12/^1^1-〇41^溶液（1:1)。將384孔板在 500rpm下離心15s使20μL試劑混合均勻以充分反應。重新貼上TopSeal-A膜并將板放于 室溫下繼續孵育60min。
[0038] (6)孵育時間到達后，揭去TopSeal-A膜，將板放于設定好程序的Paradigm? DetectionPlatform上檢測。處理數據，確定詰抗劑的IC5。。
[0039] 6.采用摸索的最佳檢測條件在穩轉細胞中對前列腺素E2受體2拮抗劑進行初篩 與復篩。處理數據，計算所篩選化合物IC5。。
[0040] 前列腺素E2受體2活性篩選實驗結果
[0041] 篩選得到的前列腺素E2受體2拮抗劑為熊果酸類化合物，其結構式與IC5。如下：
[0042]
【主權項】
1. 式（I)的化合物或其藥學上可以接受的鹽用于制備前列腺素E2受體2拮抗劑的用 途；2. 按照權利要求1的用途，作為前列腺素E2受體2拮抗劑，用于治療炎癥的用途。
【專利摘要】本發明涉及式(I)的前列腺素E2受體2拮抗劑或其藥學上可接受的鹽。此類化合物可以拮抗前列腺素E2受體2，有效地產生抗炎作用。
【IPC分類】A61K31/56, C12Q1/02, A61P29/00
【公開號】CN105250318
【申請號】CN201510828308
【發明人】嚴明, 汪豪, 高鵬, 張陸勇
【申請人】中國藥科大學
【公開日】2016年1月20日
【申請日】2015年11月20日