人源抗唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素-9的抗體IgG及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于單克隆抗體藥物技術領域，設及一種抗唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集 素-9(thesurfacemoleculesialicacid-bindingimmunoglobulin-likelectin-9， Siglec-9)的全分子人源單克隆抗體及其被編碼的DM分子，W及該全分子人源單克隆抗 體在制備治療重癥哮喘、慢性阻塞性肺病、自身免疫性疾病和腫瘤等疾病藥物中的應用。
【背景技術】
[0002] 唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素（thesurfacemoleculesialicacid-binding immunoglobulin-1化electin,Siglec)是免疫球蛋白超家族的重要成員，可通過識別含有 唾液酸的糖鏈結構介導細胞與細胞或病原體間的相互作用。最近幾年研究顯示，siglec家 族在細胞活化、增殖W及細胞調亡發揮重要作用，同時，在固有免疫和適應性免疫中也發揮 重要的調控作用，此外也可W參與免疫耐受的調控。
[0003] Siglecs是免疫球蛋白超家族成員，其分子結構共同特點是具有結合誕酸的能 力。唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素，表達于免疫細胞表面，介導抑制性信號。與其他抑 制性免疫受體家族相似，如殺傷細胞免疫球蛋白樣受體和白細胞免疫蛋白樣受體，siglecs 是跨膜分子，在胞質尾區包含免疫受體酪氨酸抑制基序ITIMs(immunorecepto;rtyrosine basedinhibitorymotifs，ITIMs)，在胞外存在免疫球蛋白超家族區域。與其他免疫球蛋 白超家族相比，siglecs的特性是其高特異性的配體唾液酸化的碳水化合物，不同于大部 分其他免疫受體結合蛋白。人類已經發現14種siglec:唾液酸粘附素（sigleclCD169)， CD22(siglec2)，CD33(siglec3)和髓憐脂相關的糖蛋白（MAGsiglec4)W及新近的cd33相 關的siglec(siglec5-ll)。除了siglec4表達于神經細胞，大部分siglecs家族表達于造 血細胞。
[0004] 唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素9 (siglec9)是I型跨膜蛋白，免疫球蛋白超級族 的重要成員，主要是由胞外一個N末端的V區和兩個C區免疫球蛋白樣結構域，跨膜區和胞 質內區構成，N-末端免疫球蛋白樣結構域V區介導唾液酸（SIA)的識別，胞質內區含有兩個 免疫酪氨酸抑制基序（ITIM)。近膜基序ITIM酪氨酸憐酸化，募集抑制性憐酸酶類，如Src 同源區2包括酪氨酸憐酸醋酶1 (SHP-1)、SHP-2和SH2肌醇憐酸酶（SHIP)，從而介導下游 酪氨酸激酶憐酸化，并向胞內傳遞抑制性或是致死性信號。 陽0化]Siglec-9在中性粒細胞和單核細胞高表達，在NK細胞、CD4+和CD8叮細胞的某些 亞群低表達。在骨髓造血干細胞分化的中晚期，中幼粒細胞膜表面即可出現Siglec-9的表 達，Siglec-9參與中性粒細胞的分化、發育和死亡等多個生理過程，是調節中性粒細胞固有 免疫的重要功能受體。肺組織大量嗜酸性粒細胞浸潤伴中性粒細胞增多是重癥哮喘重要的 病理生理特點，抗Siglec-9抗體的替代治療兼顧兩者PCD，可能在重癥哮喘、慢性阻塞性肺 病、自身免疫性疾病、腫瘤等疾病的治療中具有潛在的治療價值。

【發明內容】

[0006] 解決的技術問題：本發明提供一種人源抗唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素-9的 抗體IgG及其應用。 陽007] 技術方案：人源抗唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素-9的抗體IgG，所述抗體的\ 鏈的互補決定區具有W下的CDRs氨基酸序列：
[0008] 沈QIDNO. 10 所示的Vl-CDR1 ;
[0009] 沈QIDNO. 11 所示的Vl-CDR2 ;
[0010] SEQIDNO. 12 所示的Vl_CDR3 ;
[0011] 并且所述抗體的Vh鏈的互補決定區具有W下的CDRs氨基酸序列：
[0012] 沈QIDNO. 3 所示的Vh-CDR1 ;
[0013] 沈QIDNO. 4 所示的Vh-CDR2 ;
[0014] 沈QIDNO. 5 所示的Vh-CDR3。
[0015] 人源抗唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素-9的抗體IgG，重鏈可變區的氨基酸序列 如SEQIDNO. 2所示；輕鏈可變區的氨基酸序列如SEQIDNO. 9所示。W及上述序列經一 個或多個氨基酸添加、刪除、替換、修飾的保守性突變而獲得的保守性變異體。
[0016] 人源抗唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素-9的抗體IgG，重鏈恒定區的氨基酸序列 如SEQIDNO. 7所示；輕鏈恒定區的氨基酸序列如SEQIDNO. 14所示。W及上述序列經一 個或多個氨基酸添加、刪除、替換、修飾的保守性突變而獲得的保守性變異體。
[0017] 編碼人源抗唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素-9的抗體IgG的核巧酸序列，編碼重 鏈可變區的核酸序列為SEQIDNO. 1所示，編碼輕鏈可變區的核酸序列為SEQIDNO. 8所 /J、- 〇
[0018] 編碼人源抗唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素-9的抗體IgG的核巧酸序列，編碼重 鏈恒定區的核酸序列為SEQIDNO. 6所示，編碼輕鏈恒定區的核酸序列為SEQIDNO. 13所 /J、-〇
[0019] 上述人源抗唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素-9的抗體IgG在制備預防或治療重 癥哮喘、慢性阻塞性肺病、自身免疫性疾病和/或腫瘤藥物中的應用。
[0020] 一種預防或治療重癥哮喘的藥物，有效成分為所述的人源抗唾液酸結合免疫球蛋 白樣凝集素-9的抗體IgG。
[0021] 一種預防或治療慢性阻塞性肺病的藥物，有效成分為所述的人源抗唾液酸結合免 疫球蛋白樣凝集素-9的抗體IgG。
[0022] 一種預防或治療自身免疫性疾病的藥物，有效成分為所述的人源抗唾液酸結合免 疫球蛋白樣凝集素-9的抗體IgG。
[0023] 一種預防或治療腫瘤的藥物，有效成分為所述的人源抗唾液酸結合免疫球蛋白樣 凝集素-9的抗體IgG。
[0024] 有益效果：本發明提供了一種具有高保護性、高特異性、良好親和力的抗唾液酸結 合免疫球蛋白樣凝集素-9的人源單克隆抗體。對該全分子人源抗體做功能鑒定，結果顯示 該人源抗體能夠與唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素-9特異性結合；體外細胞實驗結果證 實，人源抗唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素-9抗體能夠有效誘導唾液酸結合免疫球蛋白 樣凝集素-9陽性細胞的調亡，抑制細胞因子的分泌，因此本發明的單克隆抗體可應用于重 癥哮喘、慢性阻塞性肺病、自身免疫性疾病、腫瘤等相關疾病的臨床治療及預防。
【附圖說明】
[0025] 圖1純化后抗體IgG的SDS-PAGE檢測； 陽0%] 圖2抗Siglec-9抗體的ELISA檢測；
[0027]圖 3 抗Siglec-9 抗體的Westernblot檢測；
[0028] 圖4抗Siglec-9抗體與抗原結合的親和力檢測； 陽029] 圖5抗Siglec-9抗體誘導的中性粒細胞調亡檢測；
[0030] 圖6FACS檢測抗Siglec-9抗體誘導的中性粒細胞R0S。
【具體實施方式】
[0031] 需要說明的是，該抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區均為人源抗體，并將其與人源 抗體的恒定區連接，因此稱之為全分子人源抗體。
[0032] 本發明W唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素-9為祀分子，在隧菌體抗體庫技術的 基礎上制備人源抗唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素-9抗體IgG。下面結合具體實施例來進 一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但是應理解所述實施例 僅是范例性的，不對本發明的保護范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不 偏離本發明的精神下可W對技術方案的細節和形式進行修改或替換，但運些修改或替換均 落入本發明的保護范圍。 陽〇3引 實施例1
[0034] 人源抗唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素-9抗體F油的篩選
[0035] 1)用純化的重組人唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素-9蛋白包被固相篩選化ISA 板，每孔2μg，洗涂，加封閉液，洗涂，加入隧菌體抗體庫抗體，洗涂去除未結合的隧菌體抗 體。
[0036] 2)加入膜蛋白酶，洗脫特異性結合的隧菌體抗體，加入輔助隧菌體VCSM13超感 染。
[0037] 3)重復W上篩選步驟，共進行四輪"吸附-洗脫-擴增"富集篩選。
[003引 4)將最后一輪篩選且增值得到的隧菌體稀釋后鋪于加入100μg/血的氨節青霉 素培養板上培養過夜，挑取80個單菌落于細胞培養板中，振搖培養過夜。
[0039] 5)過夜后從第一塊板各孔中分別轉移5μL菌液至第二塊板，振搖培養。
[0040] 6)加輔助隧菌體VCSM13超感染，振搖培養；離屯、，培養基重懸沉淀，振搖培養過 夜。
[0041] 7)離屯、取上清進行化ISA檢測，測定每孔450皿和650皿吸光值，按Α450皿~ A650nm計算每孔吸光值。當P/N值（Positive/^egative)大于6時，該菌株為陽性單克隆 隧菌體菌株。
[0042] 8)將陽性克隆進行核酸序列分析，編碼重鏈可變區的核酸序列為序列表中的SEQ IDNO. 1所示，編碼輕鏈可變區的核酸序列為序列表中的SEQIDNO.8所示，從而得到一種 基因序列正確的F油。
[0043] 人源抗唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素-9的抗體IgG的制備 W44] 1)根據已獲得抗體的可變區序列，設計In化Sion PCR的引物
[0045] 根據In化Sion PCR原理設計抗體的重、輕鏈PCR擴增引物，此引物需要包括表達 載體上的15bp的堿基W及插入目的片段的至少15bp堿基，插入目的片段處堿基按照普通 引物設計的原則設計。
[0046] 重、輕鏈PCR擴增引物：
[0047] 重鏈擴增引物：
[0048] HF: 5，-GGTGTCCACTCGCTACAGGTGCAGCTGGTGCAGTCT-3，
[0049]皿：5 > -GCCCTTGGTGGATGCTGAGGAGACGGTGAC-3 >
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