一種抑制脲酶活性卵黃抗體的制備方法及應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物技術領域，適于預防和治療幽門螺桿菌感染引起的急慢性胃炎、消化性潰瘍等胃部疾病，具體為一種抑制脲酶活性卵黃抗體的制備方法及其應用。
【背景技術】
[0002]幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)與急慢性胃炎、消化性潰瘍、胃癌及胃MALT淋巴瘤等胃部疾病的發生密切相關。1994年世界衛生組織將其列為一類致癌因子。目前發達國家幽門螺桿菌感染率達到30%，發展中國家人群的Hp的感染率高達50%以上。根除HP后不僅能加速胃潰瘍愈合，而且能顯著降低胃炎復發率。但目前要徹底根除HP仍然很困難，還沒有一種單一的抗生素對HP感染的治療有效，必須采用多種抗生素聯合治療，如奧美拉唑、甲硝唑、阿莫西林、克拉霉素和鉍制劑等聯合使用。但聯合抗生素越多，副作用越大，抗藥性也變得更加復雜、病人治療費用高、依從性差、副反應多，Hp耐藥性顯著增強，停藥后易復發。Hp疫苗是被認為是預防人群Hp感染的最有前景的方法之一，但由于Hp感染在胃粘膜，常規疫苗免疫產生的體液免疫和細胞免疫難以達到該領域，其保護作用有限，也是迄今為止幽門螺桿菌及亞單位疫苗預防治療幽門螺桿菌致胃病難的主要原因，到目前為止并未有真正意義上的疫苗上市。Hp疫苗其主要在于預防，然而針對已感染人群或病人的治療是否有作用，目前沒有相關的研究報道。
[0003]脲酶分布于Hp表面，廣泛表達且高度保守，較大的相對分子質量和顆粒狀結構也有利于刺激機體產生免疫反應，可作為Hp疫苗的候選抗原。Hp脲酶由A、B兩個亞單位組成，呈六聚體。其中B亞單位相對分子質量約64000，抗原性強，且能使機體產生更有效的保護作用。本專利采用基因突變優化改造了 Hp脲酶B亞單位(Urease B subunit, UreB)DNA序列，并構建到原核表達載體，實現其在大腸桿菌中的高效可溶性表達，避免了無活性包涵體的形成。卵黃免疫球蛋白(IgY)由于其來源便宜，產量高，成本低，容易制備，具有熱穩定性、耐酸和耐蛋白酶等特點以及動物種系發生學距離的優勢，而被作為口服食品，預防和控制腸道、口腔細菌的感染，這些研究與應用為制備抗Hp的特，異性IgY抗體提供了可能，并為預防和治療Hp感染的胃病開辟了一條新路徑。
[0004]通過現有的文獻檢索發現，如陳喆等發表題為《幽門螺桿菌臨床菌株尿素酶B亞單位原核表達系統的構建及其重組蛋白免疫性的鑒定》(《浙江大學學報:醫學版》，2003，第1期(1):4-8)。從文中可知，脲酶原核表達多出現包涵體表達，而包涵體表達常導致蛋白變性失去原有天然結構，且蛋白復性耗時長且技術較復雜，明顯增加了蛋白表達純化成本。劉曉峰等題為《表達幽門螺桿菌尿素酶B亞單位的減毒鼠傷寒桿菌口服疫苗的制備》(《中華消化雜志》，2001, 09期(9): 522-525)，對脲酶B亞單位的原核表達和疫苗研究，但由于Hp感染在胃粘膜，常規疫苗免疫產生的體液免疫和細胞免疫難以達到該領域，其保護作用有限，也是迄今為止幽門螺桿菌及亞單位疫苗預防治療幽門螺桿菌致胃病難的主要原因，到目前為止并未有真正意義上的疫苗上市。Hp疫苗其主要在于預防，然而針對已感染人群或病人的治療是否有作用，目前沒有相關的研究報道。
[0005]經對現有的專利技術檢索發現，玉義勝等人在《對幽門螺桿菌定居具有抑制活性的糖蛋白》一文中，從牛奶和雞蛋中篩選出特異地結合幽門螺桿菌脲酶的糖蛋白，抑制菌的定生，但經過分析發現這種糖蛋白在原料中含量低，制備的糖蛋白產量低、成本高。邁耶等人在《幽門螺桿菌活疫苗》中將幽門螺桿菌脲酶基因插入減毒沙門氏菌細胞，制成疫苗，雖然可以產生免疫反應，但減毒沙門氏菌存在反毒和丟失脲酶基因的風險。根據美國食品與藥物管理機構(FDA)的規定，活疫苗中不能存在抗藥質粒，在人和動物體內也無法以抗生素來維持重組質粒的穩定性免疫應答反應。聶作明等人用將用超聲波粉碎幽門的幽門螺桿菌抗原和HP尿素脲酶的提取物作為混合(Urease)抗原的混合物免疫產蛋母雞，制備抗Hp的IgY抗體，但該抗原成分復雜，導致其免疫球蛋白的特異性和、針對性和抗體滴度不強高，往往由于菌體表面抗原的丟失或菌體突變，難以達到抑制幽門螺桿菌生長的目的產生的卵黃抗體；此外有人從幽門螺桿菌中分離脲酶，作為免疫原獲得抗體，然而該抗體不能抑制幽門螺桿菌的定植。綜上所述，需要新型抗體治療技術的篩選開發，以此實現對幽門螺桿菌的綜合防治。

【發明內容】

[0006]本發明正是針對現有技術中存在的不足和缺陷，提供一種安全、成本低、具有高效預防和治療幽門螺桿菌的一種抑制脲酶活性卵黃抗體的制備方法。
[0007]本發明的另外一個目的是提供以上所述的抑制脲酶活性卵黃抗體的應用。
[0008]本發明的具體技術方案如下:
[0009]—種抑制尿素酶脲酶活性卵黃抗體的制備方法，該方法包括以下步驟:先將幽門螺桿菌脲酶B亞基基因1710bp進行基因突變，再將其亞克隆到原核表達載體，并形成融合表達質粒pET32a-ureB ;將質粒pET32a_ureB轉化大腸桿菌中并形成基因工程菌(該基因工程菌的菌株保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，保藏日期為2015年10月15日，保藏編號為CGMCC N0:11509，分類命名為大腸埃希氏菌Escherichia coli)，將基因工程菌進行分離和純化，得幽門螺桿菌脲酶B亞基可溶性蛋白；再將幽門螺桿菌脲酶B亞基可溶性蛋白與佐劑混合，制成重組幽門螺桿菌脲酶B亞基微球疫苗，通過2-5點肌肉免疫3-4次產蛋雞；收集雞蛋，采用罐組式逆流提取蛋黃中卵黃抗體，用ELISA和Western blotting技術檢測卵黃抗體的滴度和特異性。
[0010]所述的大腸桿菌表達產物中80-95%的重組脲酶B蛋白是幽門螺桿菌脲酶B亞基可溶性蛋白，通過使用N1-NTA樹脂純化后的重組幽門螺桿菌脲酶B亞基可溶性蛋白，蛋白純度SDS-PAGE電泳后灰度掃描其純度在85-98%。
[0011]所述的佐劑中含胞壁酰二肽5-50ug/g、脂多糖5-40ug/g。
[0012]幽門螺桿菌B亞基片段微球疫苗的制備:所述的重組脲酶B亞基微球疫苗含有液體石錯和span 80，將液體石錯和span 80a按其體積比為5_9:1，并400_600rpm機械攪拌約8-12min，混合均勾制備油相。將純化蛋白抗原與胞壁酰二肽和脂多糖溶于20mg/ml的海藻酸鈉溶液中，純化蛋白抗原、胞壁酰二肽和脂多糖的終濃度分別為150-550ug/ml、5-50ug/ml和5_40ug/ml，混勾，通過直徑0.03-0.05mm的孔徑噴霧干燥器噴出，于上述液體石錯和span 80a的油相中攪拌，乳化3_6h，既得微球疫苗。
[0013]所述的雞蛋中，其抗脲酶卵黃抗體滴度達到1:10000以上。
[0014]所述的卵黃抗體的罐組式逆流提取，于30°C以下條件多罐逆流提取6_8h，提取率達到 90-98%。
[0015]所述的罐組式逆流提取蛋黃中卵黃抗體，第一次，在30°C以下取蛋黃液與UP水按1:2-5體積比混勻，緩慢攪拌l-2h, 12000rpm離心10_15min，收集上清液A。第二次，取第一次離心沉淀8-20倍重量的UP水重懸第一次離心沉淀，在30°C以下混勻，攪拌l-2h, 12000rpm離心10_15min，收集上清液。將此次的上清液與新鮮的蛋黃液按1:2-5比例在30°C以下混勻，用UP水補足上清液，攪拌l_2h，12000rpm離心10_15min，收集上清液B。第三次取8-20倍第二次離心獲得的沉淀重量的UP水重懸第二次離心獲得的沉淀，在30°C以下混勻，攪拌l_2h，12000rpm離心10_15min，收集上清液，沉淀另處理，此次獲得的上清液與第一次提取離心后的沉淀在30°C以下混勾，攪拌l-2h, 12000rpm離心10_15min，收集上清液。此次獲得的上清液與新鮮的蛋黃液按1:2-5體積比在30°C以下混勻，用UP水補足上清液，攪拌l_2h，12000rpm離心10_15min，收集上清液C。合并上清液A、上清液B和上清液C。用HCI調節pH至5-5.5，攪拌混勻，加入固體氯化鈉達到8-9.5%，4°C靜置6_10h，12000rpm離心10_15min，收集沉淀，純度達到80%以上，抗體滴度達1:104_1:106。將沉淀冷凍干燥形成干粉后保存，_20°C保存一年其活力保持在90%左右。
[0016]免疫產蛋雞:將制備的重組脲酶B亞基微球疫苗在胸部以2-5點肌肉注射免疫SPF級產蛋雞，初免劑量為200-400ug/只；間隔1-2周加強免疫一次，免疫劑量調整為100-200ug/只，第二次加強免疫后一周開始收集雞蛋；檢測抗體滴度，此后當卵黃抗體滴度低于104時可進行強化免疫，免疫劑量為200-600ug/只。通過SDS-PAGE、Western blot和ELISA等方法檢測抗體的純度、特異性及效價滴度后，收集達到要求的雞蛋。
[0017]本發明的積極效果體現在:
[0018](一)在制備疫苗過程中，采用基因工程技術實現了重組脲酶B亞基在體外大量的可溶性表達，克服了常規脲酶B亞基原核表達出現包涵體的狀況，保持幽門螺桿菌脲酶B亞基的天然構象，表達水平高，后續純化簡便。采用罐組式逆流提取技術，節能減排，節省了時間，降低了成本。制備的抗幽門螺桿菌脲酶B亞基的卵黃抗體，在體內對幽門螺桿菌感染的動物模型和病人，體現出很好的保護效果。
[0019]( 二 )將卵黃抗體與牛奶或酸牛奶混合，對幽門螺桿菌感染小鼠的治愈率達到94%