本發(fa)明(ming)(ming)涉及(ji)一種(zhong)用于調(diao)(diao)節(jie)受(shou)試者(zhe)(zhe)中(zhong)誘導(dao)(dao)型調(diao)(diao)節(jie)性t細(xi)胞數量水平的方法(fa)。本發(fa)明(ming)(ming)還涉及(ji)一種(zhong)用于治療(liao)受(shou)試者(zhe)(zhe)中(zhong)t細(xi)胞免疫(yi)介(jie)導(dao)(dao)的疾(ji)病的方法(fa)。本發(fa)明(ming)(ming)還涉及(ji)pd-1h激動(dong)(dong)劑(ji)(ji)或(huo)拮抗(kang)劑(ji)(ji)在制備(bei)用于調(diao)(diao)節(jie)受(shou)試者(zhe)(zhe)的誘導(dao)(dao)型調(diao)(diao)節(jie)性t細(xi)胞數量水平的藥物(wu)(wu)組合物(wu)(wu)中(zhong)的應用。本發(fa)明(ming)(ming)還涉及(ji)pd-1h激動(dong)(dong)劑(ji)(ji)或(huo)拮抗(kang)劑(ji)(ji)在制備(bei)用于治療(liao)受(shou)試者(zhe)(zhe)中(zhong)t細(xi)胞免疫(yi)介(jie)導(dao)(dao)的疾(ji)病的藥物(wu)(wu)組合物(wu)(wu)中(zhong)的應用。

背景技術：

調節性t細胞(treg)是cd4⁺t細胞的一個亞群，其具有從維持自身耐受性到調節免疫反應程度的廣泛功能。treg不是終末分化的細胞，并且可以在炎癥期間被轉化為其他cd4⁺t細胞亞群(包括th1和th17)。研究表明，轉錄因子foxp3在功能性定向調節性t細胞譜系的建立中起重要作用。foxp3⁺treg細(xi)(xi)胞(bao)可(ke)以(yi)通過tgf-β分為胸(xiong)腺衍(yan)生的(de)(de)天(tian)然treg細(xi)(xi)胞(bao)(ntreg)和誘(you)導型(xing)treg細(xi)(xi)胞(bao)(itreg)，tgf-β調節itreg細(xi)(xi)胞(bao)的(de)(de)分化(hua)和胸(xiong)腺衍(yan)生的(de)(de)ntreg穩定。在外周，itreg細(xi)(xi)胞(bao)的(de)(de)分化(hua)主(zhu)要是由微環(huan)境驅動的(de)(de)。例如，炎性(xing)細(xi)(xi)胞(bao)因子ifn-γ和il-4抑制(zhi)tgf-β誘(you)導的(de)(de)itreg細(xi)(xi)胞(bao)，而(er)il-6在tgf-β存(cun)在下引導th17細(xi)(xi)胞(bao)分化(hua)。因此，treg細(xi)(xi)胞(bao)的(de)(de)可(ke)塑性(xing)可(ke)決定正(zheng)在進行的(de)(de)免疫反應的(de)(de)方(fang)向并控制(zhi)炎癥，如在幾種小鼠模(mo)型(xing)(包括結腸炎模(mo)型(xing)、急(ji)性(xing)移植物抗宿(su)主(zhu)病(gvhd)模(mo)型(xing)和哮喘模(mo)型(xing))中所顯(xian)示的(de)(de)。

pd-1h(也稱為gi24、dies1、b7-h5、vista和(he)dd1)是(shi)具有免(mian)(mian)(mian)(mian)疫(yi)調(diao)節(jie)功能的(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)表面(mian)免(mian)(mian)(mian)(mian)疫(yi)球(qiu)蛋白超家族分(fen)子，其還(huan)在(zai)調(diao)節(jie)成(cheng)骨(gu)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、脂肪細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)和(he)胚胎干細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)分(fen)化以及細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)凋亡(wang)中扮演(yan)多種作(zuo)用。pd-1h在(zai)造(zao)血(xue)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(如t細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、nk細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、單(dan)核細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、nk細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)和(he)dc)上組成(cheng)型(xing)(xing)表達(b細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)除外(wai))。不同于ctla-4敲(qiao)除(ko)小鼠(shu)(其快速發展淋巴增(zeng)殖性(xing)(xing)(xing)表型(xing)(xing)和(he)致(zhi)命的(de)(de)(de)(de)全身性(xing)(xing)(xing)自(zi)身免(mian)(mian)(mian)(mian)疫(yi)性(xing)(xing)(xing)疾病)，pd-1h缺乏癥具有更(geng)加(jia)(jia)溫(wen)和(he)的(de)(de)(de)(de)表型(xing)(xing)：pd-1hko幼(you)鼠(shu)具有正常數量的(de)(de)(de)(de)t細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、nk細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、b細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、巨噬細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)和(he)單(dan)核細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)，而更(geng)老(lao)的(de)(de)(de)(de)小鼠(shu)經歷自(zi)發的(de)(de)(de)(de)t細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)活化，當小鼠(shu)老(lao)齡化時，觀察(cha)到(dao)記憶細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)水(shui)平增(zeng)加(jia)(jia)和(he)脾(pi)臟增(zeng)大。此外(wai)，如加(jia)(jia)速的(de)(de)(de)(de)cona誘導(dao)的(de)(de)(de)(de)急性(xing)(xing)(xing)肝(gan)炎和(he)gvhd中所示，pd-1h缺陷(xian)型(xing)(xing)小鼠(shu)對急性(xing)(xing)(xing)炎癥和(he)對抗(kang)(kang)原(yuan)的(de)(de)(de)(de)免(mian)(mian)(mian)(mian)疫(yi)應(ying)答(da)更(geng)敏感。pd-1h已(yi)(yi)在(zai)幾個(ge)體外(wai)和(he)體內研究中被證明(ming)分(fen)別作(zuo)為配體或受體在(zai)專職(zhi)抗(kang)(kang)原(yuan)呈遞細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(apc)和(he)t細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)中起作(zuo)用。與這些發現一(yi)致(zhi)的(de)(de)(de)(de)是(shi)，pd-1h激動型(xing)(xing)單(dan)克隆抗(kang)(kang)體已(yi)(yi)被證明(ming)是(shi)各種類型(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)對抗(kang)(kang)原(yuan)的(de)(de)(de)(de)免(mian)(mian)(mian)(mian)疫(yi)應(ying)答(da)的(de)(de)(de)(de)免(mian)(mian)(mian)(mian)疫(yi)抑(yi)制劑(ji)(ji)，而拮抗(kang)(kang)性(xing)(xing)(xing)mab顯示為免(mian)(mian)(mian)(mian)疫(yi)刺(ci)激劑(ji)(ji)。雖然(ran)pd-1h的(de)(de)(de)(de)反受體尚未(wei)被鑒定(ding)，但(dan)最近的(de)(de)(de)(de)一(yi)項研究表明(ming)，pd-1h/dd1α可以通過(guo)血(xue)友(you)病性(xing)(xing)(xing)相(xiang)互作(zuo)用(hemophilicinteraction)介(jie)導(dao)其作(zuo)用。

早期研究表明，pd-1h在treg上組成型表達，其后幾項研究表明其在treg功能調節中的作用。pd-1hig融合蛋白在體外能夠在tgf-β存在下促進小鼠和人cd4⁺t細胞中的foxp3⁺itreg的(de)誘(you)導。在b16-ova腫(zhong)瘤模型(xing)中(zhong)(zhong)，pd-1hmab的(de)給藥降低(di)了腫(zhong)瘤抗原特(te)異性itreg細(xi)(xi)(xi)胞的(de)分化。該結果被解釋為通過該mab阻斷(duan)pd-1h與(yu)其(qi)推定的(de)反(fan)受體之間的(de)相互作(zuo)用。然而，一個不同的(de)pd-1h激動型(xing)mab(mh5a)被證明(ming)可(ke)以在體外促進(jin)tgf-β誘(you)導的(de)treg細(xi)(xi)(xi)胞，并且(qie)輸注(zhu)mh5a可(ke)抑制(zhi)(zhi)小鼠(shu)模型(xing)中(zhong)(zhong)gvhd的(de)進(jin)展，并且(qie)伴隨著itreg的(de)擴增。雖然這些數據(ju)表明(ming)pd-1h在treg誘(you)導和功能中(zhong)(zhong)的(de)可(ke)能作(zuo)用，但(dan)尚(shang)未(wei)闡明(ming)pd-1h是(shi)否對treg細(xi)(xi)(xi)胞具(ju)有直接(jie)作(zuo)用。更重要的(de)是(shi)，pd-1h對treg細(xi)(xi)(xi)胞調節作(zuo)用的(de)機制(zhi)(zhi)尚(shang)不清楚。

技術實現要素：

在本發明中，發明人發現小鼠中pd-1h的遺傳消融阻斷了初始t細胞向foxp3⁺誘導型treg細胞(itreg)的分化，淋巴器官中itreg明顯減少。pd-1h的這種效應對于itreg是高度特異性的，因為在腸相關組織中的天然產生的itreg和tgf-β體外誘導的itreg都降低，而天然treg(ntreg)的生成保持正常。然而，itreg和ntreg的抑制功能不受pd-1h缺失的影響。除了生成量降低，pd-1h缺陷型itreg還可以在炎癥環境中迅速轉化為cd4⁺t輔助細胞1或t輔助細胞17。這些結果表明，通過促進其分化并防止其轉化為其他cd4⁺t細胞亞群，pd-1h可維持itreg細胞數量(liang)水平。這些(xie)發現可能對操縱treg來控制炎癥(zheng)具有重要(yao)意義。

在本發明的(de)(de)一(yi)個方(fang)面，本發明提供了一(yi)種用于調(diao)節受試者(zhe)中誘導(dao)型調(diao)節性t細(xi)胞的(de)(de)細(xi)胞水平(ping)方(fang)法。該方(fang)法包括向有需(xu)要的(de)(de)受試者(zhe)施用治療有效量的(de)(de)pd-1h激(ji)動(dong)劑或(huo)pd-1h拮(jie)抗劑。

在本發明的(de)(de)另一方(fang)面，本發明提(ti)供(gong)了pd-1h激動劑(ji)(ji)或pd-1h拮抗(kang)劑(ji)(ji)在制備(bei)用于(yu)調節(jie)受試者(zhe)中(zhong)(zhong)誘導型調節(jie)性t細(xi)胞的(de)(de)細(xi)胞水平(ping)的(de)(de)藥物組合(he)物中(zhong)(zhong)的(de)(de)用途。

在(zai)本(ben)發(fa)明的另一(yi)方面，本(ben)發(fa)明提(ti)供了治療受試(shi)者中t細(xi)胞(bao)免疫(yi)介導的疾病的方法。該方法包括向有(you)需要的受試(shi)者施用治療有(you)效量的pd-1h激動劑(ji)或pd-1h拮(jie)抗劑(ji)。

在(zai)本(ben)發明的(de)(de)另一方(fang)面，本(ben)發明提供(gong)了(le)pd-1h激(ji)動劑(ji)或pd-1h拮(jie)抗劑(ji)在(zai)制備用(yong)于治療受試者中(zhong)的(de)(de)t細胞免疫介導的(de)(de)疾(ji)病(bing)的(de)(de)藥物組(zu)合物中(zhong)的(de)(de)用(yong)途。

在(zai)本(ben)發明(ming)(ming)的(de)(de)一(yi)(yi)些(xie)(xie)實(shi)(shi)施方(fang)案中(zhong)(zhong)，pd-1h激動(dong)劑(ji)的(de)(de)施用(yong)導(dao)(dao)致受(shou)試(shi)者中(zhong)(zhong)誘導(dao)(dao)型調節(jie)(jie)性(xing)t細(xi)胞(bao)水平升(sheng)高。在(zai)本(ben)發明(ming)(ming)的(de)(de)一(yi)(yi)些(xie)(xie)實(shi)(shi)施方(fang)案中(zhong)(zhong)，pd-1h拮抗(kang)(kang)劑(ji)的(de)(de)施用(yong)導(dao)(dao)致受(shou)試(shi)者中(zhong)(zhong)誘導(dao)(dao)型調節(jie)(jie)性(xing)t細(xi)胞(bao)的(de)(de)水平降低。在(zai)本(ben)發明(ming)(ming)的(de)(de)一(yi)(yi)些(xie)(xie)實(shi)(shi)施方(fang)案中(zhong)(zhong)，所述施用(yong)是靜脈內給藥。在(zai)本(ben)發明(ming)(ming)的(de)(de)一(yi)(yi)些(xie)(xie)實(shi)(shi)施方(fang)案中(zhong)(zhong)，pd-1h激動(dong)劑(ji)是抗(kang)(kang)pd-1h的(de)(de)激動(dong)型單(dan)克(ke)隆抗(kang)(kang)體。在(zai)本(ben)發明(ming)(ming)的(de)(de)一(yi)(yi)些(xie)(xie)實(shi)(shi)施方(fang)案中(zhong)(zhong)，pd-1h拮抗(kang)(kang)劑(ji)選自靶向pd-1h編碼多核苷酸的(de)(de)dsrna、sirna和shrna的(de)(de)反義(yi)寡聚體。在(zai)本(ben)發明(ming)(ming)的(de)(de)一(yi)(yi)些(xie)(xie)實(shi)(shi)施方(fang)案中(zhong)(zhong)，所述受(shou)試(shi)者是人。在(zai)本(ben)發明(ming)(ming)的(de)(de)一(yi)(yi)些(xie)(xie)實(shi)(shi)施方(fang)案中(zhong)(zhong)，t細(xi)胞(bao)免(mian)疫(yi)介導(dao)(dao)的(de)(de)疾(ji)病(bing)包括炎(yan)癥(zheng)、自身免(mian)疫(yi)疾(ji)病(bing)和癌癥(zheng)。

本發明(ming)證明(ming)pd-1h在(zai)(zai)炎性環境中抑制(zhi)(zhi)itreg細胞(bao)轉(zhuan)化為(wei)th1和(he)(he)(he)th17細胞(bao)，至少部分(fen)是由于其在(zai)(zai)維持foxp3表(biao)達和(he)(he)(he)itreg表(biao)型中的(de)(de)(de)作用(yong)導致的(de)(de)(de)。這些發現對調節(jie)treg生長(chang)和(he)(he)(he)功能具有重(zhong)要意義。同時，如先前所示，pd-1h抑制(zhi)(zhi)初始t細胞(bao)的(de)(de)(de)激活(huo)以(yi)限制(zhi)(zhi)t細胞(bao)介(jie)(jie)導的(de)(de)(de)免(mian)(mian)疫(yi)(yi)(yi)應(ying)(ying)答(da)的(de)(de)(de)啟動(dong)，它促進免(mian)(mian)疫(yi)(yi)(yi)應(ying)(ying)答(da)期間itreg的(de)(de)(de)生長(chang)和(he)(he)(he)轉(zhuan)化。除(chu)了調節(jie)早(zao)期t細胞(bao)活(huo)化外(wai)，pd-1h似乎通過調節(jie)treg水平參與t細胞(bao)耐受性的(de)(de)(de)調節(jie)。因此，pd-1h途徑可能作為(wei)一種新的(de)(de)(de)靶標而被用(yong)來在(zai)(zai)炎癥、自身免(mian)(mian)疫(yi)(yi)(yi)疾病和(he)(he)(he)癌癥中控制(zhi)(zhi)和(he)(he)(he)操縱的(de)(de)(de)t細胞(bao)介(jie)(jie)導的(de)(de)(de)免(mian)(mian)疫(yi)(yi)(yi)。

附圖說明

圖1.pd-1h在foxp3⁺itreg細胞的新生成中的作用。(a)從wtot-ii或pd-1hkoot-ii小鼠純化的初始t細胞首先用5μmcfse標記，隨后以2×10⁶/小鼠i.v.轉移至b6小鼠。24小時后，在飲用水中喂食1.5％ova，喂養5天。通過流式細胞儀在代表性小鼠中分析門控cd4⁺cfse⁺vβ5.1/5.2tcr⁺上的(de)foxp3頻率。(b，c)實驗(yan)概要，每個符(fu)號代表單(dan)個小鼠(n＝5)。所(suo)顯示的(de)數(shu)據代表3個獨立實驗(yan)。

圖2.pd-1h對itreg的轉化和功能的影響。(a)腸道相關淋巴器官中itreg的天然發育中的pd-1h缺失。通過在流式細胞術中用特異性抗體來表征細胞表面cd25和細胞內foxp3表達，從而測定腸系膜淋巴結(mln)、payer氏集合淋巴結(pp)和固有層(lp)中cd25⁺foxp3⁺treg細胞的百分比。pd-1hko小鼠及其同窩wt仔鼠(每組n＝5)用于分析。左圖表示來自每組的配對單個小鼠，右圖是一個代表性實驗的總結(每組中n＝5)。(b)腸道相關淋巴器官中cd25⁺foxp3⁺treg的絕對數。(c)itreg的體外誘導。在存在或不存在5ng/mltgf-β的情況下，用抗-cd3/cd28刺激來自wt和pd-1hko小鼠的cd4⁺cd25^-cd62l^hi初始t細胞3-5天。通過細胞內染色測定cd25⁺foxp3⁺細胞的頻率。(d，e)itreg抑制功能的體外評價。如上所述，誘導來自wt或pd-1hkofoxp3(gfp)小鼠的初始cd4⁺t細胞成為foxp3(gfp⁺)itreg細胞。從b6小鼠中純化初始cd8⁺t細胞或cd4⁺t細胞，用cfse標記并與分選的gfp⁺itreg細胞在存在抗cd3的情況下以指定的treg/teff細胞比率共培養。通過與沒有添加itreg細胞的孔進行比較來確定包含itreg細胞時csfe的減少量。所顯示的數據代表至少3次獨立實驗。僅teff：沒有抗cd3刺激的t細胞；對照：具有抗cd3的teff細胞，不含有itreg細胞。(f)通過在流式細胞儀上門控cd4⁺foxp3(gfp⁺)來測定來自wt或(huo)pd-1hkofoxp3(gfp)小鼠的itreg上的cd25、gitr、lag-3、ctla-4、icos和pd-1的表達。

圖3.細胞因子環境對pd-1h介導itreg細胞轉化缺陷的影響。(a)在沒有pd-1h的情況下誘導itreg細胞的細胞因子譜。如上所述，將初始t細胞在體外誘導為itreg，并在第4天收集培養上清液，通過小鼠th1/th2/th17cba試劑盒測定細胞因子水平。(b)在培養開始時向培養物中加入ifn-γ和il4的中和mab以從wt或pd-1hko初始t細胞體外誘導itreg細胞。培養3-5天后評價cd25⁺foxp3⁺細胞。呈(cheng)現的(de)結果來自(zi)一對小(xiao)鼠(shu)。(c)來自(zi)(b)的(de)數(shu)(shu)據(ju)的(de)柱狀圖，數(shu)(shu)據(ju)來自(zi)一組5只小(xiao)鼠(shu)。所顯示的(de)數(shu)(shu)據(ju)代表至少3次獨立實驗。

圖4.pd-1h對eae模型中itreg細胞穩定性的影響。(a)來自wt或ko的cd45.2⁺foxp3(gfp⁺)itreg細胞在體外誘導后通過細胞分選獲得。將1×10⁶個wt或pd-1hkofoxp3(gfp⁺)itreg細胞i.v.轉移到cd45.1b6小鼠(n＝4或5每組)中，再用mog35-55肽免疫。對照小鼠用pbs接種。監測eae疾病進展和嚴重程度作為臨床評分(見方法部分)。*p<0.05，(雙向abova檢驗)。顯示的數據代表3次具有相似的結果和疾病表型的實驗中的1個。(b，c)在eae誘導的第13天，門控脾臟和引流ln(dln)細胞中的cd45.2⁺cd4⁺，并分析foxp3(gfp⁺)itreg細胞。(d)計數來自eae小鼠的脾臟和dln中的cd45.2⁺foxp3⁺的絕對數量。(e)使用pma/離子霉素/bfa離體將第13天的eae小鼠脾臟和dln細胞再次刺激4小時。門控cd4⁺cd45.2⁺gfp⁺細胞，用細胞內染色分析ifn-γ⁺或il-17⁺表(biao)達。顯(xian)示(shi)的(de)(de)數(shu)(shu)據來自代(dai)表(biao)性的(de)(de)一對(dui)小鼠。(f)在4只或5只小鼠組中顯(xian)示(shi)的(de)(de)(e)中的(de)(de)數(shu)(shu)據的(de)(de)圖表(biao)。所(suo)顯(xian)示(shi)的(de)(de)數(shu)(shu)據代(dai)表(biao)至少3次獨立實驗。

圖5.pd-1h促進itreg細胞的定型。(a)在第13天分析來自eae模型中各組的所轉移的itreg細胞(cd45.2⁺cd4⁺門控)。用具有(you)特異性mab的pstat3或pstat5對脾臟細(xi)(xi)胞和dln細(xi)(xi)胞進(jin)行細(xi)(xi)胞內染(ran)色。(b)與(yu)a相同，但(dan)轉移的itreg細(xi)(xi)胞上stat3和stat5的磷酸化以繪(hui)圖(tu)值顯示。(c)通過亞硫酸氫鹽測序確定cns2區域的dna甲基(ji)化狀態。每條線代表(biao)一(yi)個克(ke)隆(一(yi)個dna鏈)；空心圓(yuan)，非甲基(ji)化引物；實心圓(yuan)，甲基(ji)化引物。

圖6.pd-1h影響itreg細胞的從頭分化。(a)將wt和koot-iit細胞(cd25^-t細胞)分別轉移到宿主小鼠中。轉移的ot-iit細胞在轉移前用cfse標記。該圖顯示了cfse的稀釋和foxp3誘導。(b)wt(cd45.1/cd45.2)初始ot-iit細胞和ko(cd45.2)ot-ii初始t細胞以1:1的比例混合并共轉移到宿主小鼠(cd45.1)。用1.5％ova口服飼養宿主小鼠后，分析mln和pp，并通過細胞內染色測定foxp3的頻率。(c)計數所示器官中的foxp3⁺t細胞的絕對數量。

圖7.pd-1h調節淋巴細胞環境中itreg細胞的分化。(a)將來自wt小鼠(cd45.2)和pd-1hko小鼠(cd45.1)的初始cd4⁺cd62l^hit細胞以1:1的比例混合，將總共2百萬個細胞轉移到rag1ko小鼠(n＝4)并在20天后測定foxp3上調。該圖顯示轉移前后wt和kocd4⁺t細胞比例的變化。通過細胞內染色測定foxp3+細胞的頻率。(b)計數來自rag1ko小鼠的所示器官中的cd25⁺foxp3⁺t細胞的絕對數量。(c)分析轉移的初始cd4⁺t細(xi)(xi)胞(bao)(bao)的(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)因子的(de)(de)產生(sheng)。在pma/離子霉素/bfa存在下，將來(lai)自所示器官的(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)體外活化4小(xiao)時，然后通過(guo)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)內染色(se)進行分析。所顯(xian)示的(de)(de)數據(ju)代表2次獨立的(de)(de)實驗(yan)。

圖8.pd-1h對ntreg細胞的產生和抑制功能起著重要作用。(a)使用foxp3的細胞內染色和cd25的細胞表面染色，通過流式細胞術測定脾臟和ln中cd25⁺foxp3⁺ntreg的百分比。使用來自wt和pd-1hko小鼠的六周齡同窩出生小鼠(n＝5)。計數脾臟和ln中foxp3⁺cd25⁺t細胞的絕對數量。(b)通過流式細胞儀上門控cd4⁺foxp3(gfp⁺)測定來自wt或pd-1hkofoxp3(gfp)小鼠的ntreg上的cd25、gitr、lag-3、ctla-4、icos和pd-1的表達。(c)對來自wt或pd-1hkofoxp3(gfp)小鼠的foxp3(gfp⁺)ntreg進行分選，并在存在絲裂霉素c處理的脾細胞及抗cd3抗體的情況下以不同的treg/teff比率與cfse標記的cd8⁺teff細(xi)胞(bao)共培養(yang)3天。通過流式細(xi)胞(bao)術測定cfse稀釋度(du)。所顯示的數據(ju)代表至(zhi)少3次獨立實驗(yan)。

圖9.pd-1h決定了骨髓嵌合小鼠中treg細胞的水平。(a)將來自cd45.1wt小鼠和cd45.2小鼠的總數為1000萬各混合骨髓細胞轉移到亞致死性輻射處理的小鼠(cd45.1/cd45.2)中。重構后10周分析小鼠。顯示wt和kot細胞的門控策略。(b)通過細胞內染色測定所示器官中的foxp3頻率。(c)脾臟中的foxp3頻率，并顯示foxp3⁺細胞和foxp3^-細(xi)胞的絕對(dui)數量。所顯示的數據是兩個獨立實驗的其中一個。

圖10.pd-1h激動型mab輕微促進itreg細胞的分化。(a)從wtfoxp3(gfp)小鼠中分離初始t細胞，隨后在tgf-β存在下用對照小鼠igg或mam82用預包被的抗cd3刺激4天。通過流式細胞術分析cd25⁺foxp3(gfp⁺)itreg細(xi)胞。(b)顯(xian)(xian)示(shi)(shi)不同時間點誘導(dao)的(de)itreg細(xi)胞。顯(xian)(xian)示(shi)(shi)的(de)結果來自3個單獨的(de)實驗。所顯(xian)(xian)示(shi)(shi)的(de)數據代(dai)表至(zhi)少3次(ci)獨立實驗。

圖11.在eae模型中用wt或pd-1hkoitreg細胞轉染后，受試者中cd4⁺th1和th17細胞的分析。(a)來自wt或pd-1hkofoxp3(gfp)小鼠的初始t細胞如上所述在體外分化成itreg細胞。將ifn-γ和il-4中和mab加入到培養物中以促進itreg的產生。分離foxp3(gfp⁺)細胞，通過facs評估純度。(b，c)在轉移itreg細胞的eae模型中的受試者cd45.1⁺cd4⁺t細胞通過pma/離子霉素/bfa離體再刺激。通過門控cd45.2^-cd4⁺t細胞，通過細胞內染色測定受試者cd4⁺t細胞的ifn-γ⁺或il-17⁺細(xi)胞。來(lai)(lai)自代(dai)表性(xing)的(de)一對小鼠的(de)數(shu)(shu)據顯(xian)示(shi)在(b)中，顯(xian)示(shi)的(de)數(shu)(shu)據的(de)曲線圖來(lai)(lai)自4或5只(zhi)小鼠的(de)組(c)。所顯(xian)示(shi)的(de)數(shu)(shu)據代(dai)表至(zhi)少3次(ci)獨立(li)實驗。

圖12.pd-1h缺乏的itreg細胞不能保留其抑制功能和foxp3表達。(a)單獨或與來自wt或ko小鼠的cd45.2⁺foxp3(gfp⁺)itreg細胞一起轉移cd25^-cd45rb^hicd45.1t細胞后不同時間的rag1ko宿主小鼠的重量(每組n＝5)(見方法)。轉移后受體小鼠的體重變化被標準化至其在轉移前的初始體重。*p<0.05，(雙向abova檢驗)。(b)誘導結腸炎后(第10周，n＝5)，rag1ko宿主小鼠的結腸組織h&e染色(標尺：100μm)和臨床評分(c)。(d，e，f)分析來自rag1ko宿主小鼠的脾臟和dln中cd45.2treg細胞中foxp3⁺t細胞的百分比，并根據比例和活細胞計數foxp3⁺cd45.2t細(xi)(xi)(xi)胞(bao)的(de)(de)(de)(de)絕對(dui)數量。(g)流式(shi)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)術(shu)分析(xi)來自rag1ko小(xiao)鼠的(de)(de)(de)(de)所示(shi)器官(guan)中cd45.2treg細(xi)(xi)(xi)胞(bao)中ifn-γ和il-17的(de)(de)(de)(de)表(biao)(biao)(biao)達(da)。用pma/離(li)(li)子(zi)霉素/bfa在體(ti)外刺激(ji)脾細(xi)(xi)(xi)胞(bao)和dln細(xi)(xi)(xi)胞(bao)4小(xiao)時，并染色以測定(ding)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)內的(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)因子(zi)。(h)(g)中的(de)(de)(de)(de)數據(ju)總(zong)結，每個(ge)(ge)點代(dai)表(biao)(biao)(biao)一只小(xiao)鼠。(i)流式(shi)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)術(shu)分析(xi)來自rag1ko宿(su)主小(xiao)鼠的(de)(de)(de)(de)所示(shi)器官(guan)中的(de)(de)(de)(de)teff細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(cd45.1)中ifn-γ和il-17的(de)(de)(de)(de)表(biao)(biao)(biao)達(da)。用pma/離(li)(li)子(zi)霉素/bfa在體(ti)外刺激(ji)脾細(xi)(xi)(xi)胞(bao)和dln細(xi)(xi)(xi)胞(bao)4小(xiao)時，并染色以測定(ding)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)內的(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)因子(zi)。顯示(shi)的(de)(de)(de)(de)數據(ju)代(dai)表(biao)(biao)(biao)2個(ge)(ge)獨立實驗中的(de)(de)(de)(de)其中一個(ge)(ge)。

具體實施方式

定義

在本發(fa)(fa)明中，術(shu)語“治(zhi)療”是(shi)指療法上的(de)(de)以及預(yu)防(fang)性的(de)(de)措施，其阻(zu)止或(huo)減(jian)緩(huan)對象(xiang)發(fa)(fa)生不(bu)期望的(de)(de)生理學改變或(huo)病癥(zheng)，例如(ru)哮喘發(fa)(fa)作或(huo)癌癥(zheng)進展。有(you)利(li)或(huo)期望的(de)(de)臨(lin)床效果(guo)包(bao)括(kuo)，但不(bu)限于，癥(zheng)狀的(de)(de)緩(huan)解(jie)、疾(ji)(ji)(ji)病程度的(de)(de)降低、疾(ji)(ji)(ji)病狀態的(de)(de)穩(wen)定(ding)化(即不(bu)惡化)、疾(ji)(ji)(ji)病進展的(de)(de)延遲或(huo)減(jian)緩(huan)、疾(ji)(ji)(ji)病狀態的(de)(de)減(jian)輕或(huo)緩(huan)和以及疾(ji)(ji)(ji)病的(de)(de)部分或(huo)全部治(zhi)愈，不(bu)論上述效果(guo)是(shi)否可檢測到。“治(zhi)療”也可指與不(bu)治(zhi)療相(xiang)比(bi)生存期延長。需(xu)要(yao)治(zhi)療的(de)(de)對象(xiang)包(bao)括(kuo)已(yi)患有(you)該疾(ji)(ji)(ji)病或(huo)病癥(zheng)的(de)(de)對象(xiang)，以及有(you)可能患有(you)該疾(ji)(ji)(ji)病或(huo)病癥(zheng)的(de)(de)對象(xiang)，或(huo)要(yao)預(yu)防(fang)該疾(ji)(ji)(ji)病或(huo)病癥(zheng)的(de)(de)對象(xiang)。

“對(dui)象(xiang)(xiang)”或(huo)“患者(zhe)”、“個(ge)體”是(shi)指任何(he)期望進行診斷(duan)、預后或(huo)治療的(de)對(dui)象(xiang)(xiang)，特別是(shi)哺(bu)乳動物(wu)(wu)(wu)(wu)對(dui)象(xiang)(xiang)。哺(bu)乳動物(wu)(wu)(wu)(wu)包括人(ren)、家畜(chu)、農畜(chu)、動物(wu)(wu)(wu)(wu)園動物(wu)(wu)(wu)(wu)、競技(ji)動物(wu)(wu)(wu)(wu)或(huo)寵物(wu)(wu)(wu)(wu)，例如(ru)狗、貓、幾內(nei)亞豬、兔、大鼠、小鼠、馬、牛、奶牛等。本(ben)文所(suo)稱的(de)對(dui)象(xiang)(xiang)優(you)選是(shi)人(ren)。

本(ben)(ben)文所用(yong)的(de)術語“有(you)治(zhi)療(liao)(liao)(liao)需(xu)要的(de)患者”或“有(you)治(zhi)療(liao)(liao)(liao)需(xu)要的(de)對(dui)象”包括因施用(yong)本(ben)(ben)發明用(yong)于例如檢測、診斷和(he)/或治(zhi)療(liao)(liao)(liao)用(yong)途(tu)的(de)多肽或其(qi)組合物(wu)(wu)而(er)受益的(de)對(dui)象，如哺(bu)乳(ru)動物(wu)(wu)對(dui)象。

本文所(suo)用的(de)(de)術語“激動劑(ji)(ji)”是指任何能(neng)夠(gou)(gou)增(zeng)加pd-1h的(de)(de)水平(ping)和/或活性的(de)(de)試劑(ji)(ji)。例(li)如(ru)，術語“激動劑(ji)(ji)”是指使能(neng)夠(gou)(gou)使pd-1h的(de)(de)表(biao)達和/或活性增(zeng)加至少10％或更(geng)多(例(li)如(ru)10％或更(geng)多、50％或更(geng)多、100％或更(geng)多、200％或更(geng)多、500％或更(geng)多、1000％或更(geng)多)的(de)(de)試劑(ji)(ji)。pd-1h的(de)(de)激動劑(ji)(ji)的(de)(de)非限(xian)制性例(li)子可包(bao)括(kuo)pd-1h多肽(tai)或其激動劑(ji)(ji)片段以(yi)及編碼(ma)pd-1h多肽(tai)的(de)(de)核(he)酸。

如本文所用(yong)(yong)(yong)，術語“拮抗(kang)(kang)劑(ji)”是指降低(di)pd-1h的(de)(de)水平(ping)和/或(huo)(huo)活(huo)(huo)性的(de)(de)任(ren)何試劑(ji)。拮抗(kang)(kang)劑(ji)是與特(te)定蛋(dan)白(bai)(例如配體)競爭(zheng)(zheng)結(jie)合(he)(he)(he)(he)另(ling)一種(zhong)(zhong)蛋(dan)白(bai)質(例如受體)的(de)(de)化合(he)(he)(he)(he)物(wu)。這(zhe)種(zhong)(zhong)結(jie)合(he)(he)(he)(he)通(tong)常(chang)誘導被競爭(zheng)(zheng)性拮抗(kang)(kang)劑(ji)阻斷(duan)的(de)(de)特(te)異(yi)性生物(wu)反應或(huo)(huo)作(zuo)(zuo)用(yong)(yong)(yong)。拮抗(kang)(kang)劑(ji)具有親和力但對(dui)其(qi)同源(yuan)結(jie)合(he)(he)(he)(he)蛋(dan)白(bai)沒有功效，并且結(jie)合(he)(he)(he)(he)將破壞相(xiang)互作(zuo)(zuo)用(yong)(yong)(yong)并抑制(zhi)這(zhe)種(zhong)(zhong)同源(yuan)蛋(dan)白(bai)的(de)(de)功能。拮抗(kang)(kang)劑(ji)通(tong)過結(jie)合(he)(he)(he)(he)至任(ren)何同源(yuan)蛋(dan)白(bai)(或(huo)(huo)在(zai)適用(yong)(yong)(yong)情況下受體)上的(de)(de)活(huo)(huo)性(正(zheng)位體＝正(zheng)確的(de)(de)位置)位點或(huo)(huo)變構(＝其(qi)他位置)位點來(lai)調(diao)節其(qi)作(zuo)(zuo)用(yong)(yong)(yong)，或(huo)(huo)者它們(men)可能在(zai)通(tong)常(chang)不涉及的(de)(de)獨特(te)結(jie)合(he)(he)(he)(he)位點相(xiang)互作(zuo)(zuo)用(yong)(yong)(yong)。

本發明使用(yong)反(fan)義(yi)低聚物(wu)和(he)類似(si)物(wu)質(zhi)用(yong)于(yu)(yu)調節編(bian)碼pd-1h的(de)(de)核(he)酸(suan)分(fen)(fen)子(zi)(zi)的(de)(de)功能(neng)或(huo)作用(yong)。這通(tong)過提供與編(bian)碼pd-1h的(de)(de)一種(zhong)(zhong)或(huo)多種(zhong)(zhong)核(he)酸(suan)分(fen)(fen)子(zi)(zi)特異(yi)性雜(za)交(jiao)(jiao)的(de)(de)寡核(he)苷(gan)酸(suan)來實(shi)現。如本文(wen)所用(yong)，術語(yu)“靶(ba)核(he)酸(suan)”和(he)“編(bian)碼pd-1h的(de)(de)核(he)酸(suan)分(fen)(fen)子(zi)(zi)”被用(yong)于(yu)(yu)方(fang)便(bian)地包括編(bian)碼pd-1h的(de)(de)dna、從該dna轉錄的(de)(de)rna(包括前mrna和(he)mrna或(huo)其(qi)部(bu)分(fen)(fen))，以(yi)及(ji)衍生自(zi)(zi)這些rna的(de)(de)cdna。本發明的(de)(de)低聚物(wu)與其(qi)靶(ba)核(he)酸(suan)的(de)(de)雜(za)交(jiao)(jiao)通(tong)常(chang)稱(cheng)為“反(fan)義(yi)”。因(yin)此(ci)，被認為包括在本發明的(de)(de)一些優選實(shi)施(shi)方(fang)案中的(de)(de)優選機理在本文(wen)中稱(cheng)為“反(fan)義(yi)抑制(zhi)”。這種(zhong)(zhong)反(fan)義(yi)抑制(zhi)通(tong)常(chang)基于(yu)(yu)寡核(he)苷(gan)酸(suan)鏈或(huo)鏈段的(de)(de)基于(yu)(yu)氫鍵的(de)(de)雜(za)交(jiao)(jiao)，使得至少一個(ge)鏈或(huo)鏈段被切割、降解(jie)或(huo)以(yi)其(qi)它方(fang)式不可操(cao)作。在這方(fang)面，目前優選靶(ba)向特異(yi)性核(he)酸(suan)分(fen)(fen)子(zi)(zi)及(ji)其(qi)用(yong)于(yu)(yu)這種(zhong)(zhong)反(fan)義(yi)抑制(zhi)的(de)(de)功能(neng)。在一些實(shi)施(shi)方(fang)案中，反(fan)義(yi)寡聚物(wu)選自(zi)(zi)dna寡核(he)苷(gan)酸(suan)、rna寡核(he)苷(gan)酸(suan)(例如microrna)和(he)嵌合(he)寡核(he)苷(gan)酸(suan)。例如，反(fan)義(yi)寡聚物(wu)選自(zi)(zi)dsrna、sirna和(he)shrna。

本發明(ming)的(de)(de)一個方面提供一種調節(jie)對象的(de)(de)誘(you)(you)導(dao)型(xing)調節(jie)性t細(xi)胞(bao)的(de)(de)細(xi)胞(bao)水(shui)平(ping)的(de)(de)方法(fa)，包括向有(you)此需(xu)要的(de)(de)對象施用(yong)治(zhi)療(liao)有(you)效量(liang)的(de)(de)pd-1h激動劑或(huo)(huo)pd-1h拮抗劑或(huo)(huo)包含pd-1h激動劑或(huo)(huo)pd-1h拮抗劑的(de)(de)藥(yao)物組合物。本發明(ming)還提供上述pd-1h激動劑或(huo)(huo)pd-1h拮抗劑在調節(jie)對象的(de)(de)誘(you)(you)導(dao)型(xing)調節(jie)性t細(xi)胞(bao)的(de)(de)細(xi)胞(bao)水(shui)平(ping)的(de)(de)方法(fa)中(zhong)的(de)(de)應用(yong)。

在(zai)一(yi)些實施方式(shi)中，該pd-1h激動劑(ji)或pd-1h拮抗劑(ji)或其藥(yao)(yao)物(wu)(wu)組合物(wu)(wu)以(yi)腸胃(wei)外方式(shi)給(gei)藥(yao)(yao)，例如靜脈內(nei)(nei)、肌內(nei)(nei)、經皮(pi)或皮(pi)內(nei)(nei)給(gei)藥(yao)(yao)。

在某些(xie)實(shi)(shi)施方案中(zhong)(zhong)，pd-1h激動劑的(de)施用導(dao)致(zhi)受試(shi)者中(zhong)(zhong)誘(you)導(dao)型(xing)調(diao)節(jie)性(xing)t細(xi)(xi)胞(bao)(bao)水平(ping)的(de)增加，例(li)如itreg細(xi)(xi)胞(bao)(bao)的(de)擴增。在某些(xie)實(shi)(shi)施方案中(zhong)(zhong)，施用pd-1h拮抗(kang)劑導(dao)致(zhi)受試(shi)者中(zhong)(zhong)誘(you)導(dao)型(xing)調(diao)節(jie)性(xing)t細(xi)(xi)胞(bao)(bao)水平(ping)降(jiang)低(di)。在一些(xie)實(shi)(shi)施方案中(zhong)(zhong)，itreg細(xi)(xi)胞(bao)(bao)的(de)水平(ping)降(jiang)低(di)伴隨著th1和/或th17細(xi)(xi)胞(bao)(bao)的(de)產生增加。

在某(mou)些實施方(fang)案中(zhong)，本發明提供了用(yong)(yong)于治療(liao)或(huo)(huo)減輕t細(xi)胞(bao)免疫(yi)介(jie)(jie)導的(de)(de)疾(ji)(ji)病的(de)(de)方(fang)法。該(gai)方(fang)法包(bao)括向有(you)(you)需要的(de)(de)受試者(zhe)施用(yong)(yong)治療(liao)有(you)(you)效量的(de)(de)pd-1h激(ji)動劑(ji)或(huo)(huo)pd-1h拮抗(kang)劑(ji)或(huo)(huo)包(bao)含pd-1h激(ji)動劑(ji)或(huo)(huo)pd-1h拮抗(kang)劑(ji)的(de)(de)藥物組(zu)合物。本文(wen)使用(yong)(yong)的(de)(de)術語“t細(xi)胞(bao)免疫(yi)介(jie)(jie)導的(de)(de)疾(ji)(ji)病”是指與t細(xi)胞(bao)免疫(yi)相(xiang)關的(de)(de)疾(ji)(ji)病或(huo)(huo)病癥，包(bao)括炎癥、自(zi)身(shen)免疫(yi)性疾(ji)(ji)病和癌癥。

組合物

本(ben)發明的(de)(de)一個方(fang)面提供(gong)了(le)包含治療(liao)有效量的(de)(de)pd-1h激動(dong)劑(ji)或pd-1h拮抗(kang)劑(ji)和藥學(xue)上(shang)可接受的(de)(de)載(zai)體的(de)(de)藥物組(zu)合(he)(he)物。藥物組(zu)合(he)(he)物可用于調(diao)節受試者中誘導型調(diao)節性t細胞的(de)(de)水平。pd-1h激動(dong)劑(ji)或pd-1h拮抗(kang)劑(ji)可以(yi)在合(he)(he)適的(de)(de)藥學(xue)上(shang)可接受的(de)(de)載(zai)體或賦(fu)形(xing)劑(ji)中制備。

本文(wen)使(shi)用(yong)的(de)(de)(de)術語“載(zai)體(ti)(ti)”包(bao)括任(ren)何或所(suo)有的(de)(de)(de)溶劑(ji)(ji)(ji)、分散介(jie)(jie)質(zhi)、載(zai)體(ti)(ti)、包(bao)衣、稀釋劑(ji)(ji)(ji)、抗菌劑(ji)(ji)(ji)、抗真菌劑(ji)(ji)(ji)、等(deng)滲(shen)劑(ji)(ji)(ji)、吸附(fu)延緩劑(ji)(ji)(ji)、緩沖液(ye)、載(zai)體(ti)(ti)溶液(ye)、懸浮液(ye)、膠體(ti)(ti)等(deng)。這(zhe)些(xie)用(yong)于(yu)藥物活(huo)性(xing)成(cheng)分的(de)(de)(de)介(jie)(jie)質(zhi)和試(shi)劑(ji)(ji)(ji)的(de)(de)(de)使(shi)用(yong)在(zai)本領域是已知的(de)(de)(de)。除非已知任(ren)何常規介(jie)(jie)質(zhi)或試(shi)劑(ji)(ji)(ji)不(bu)能與該活(huo)性(xing)成(cheng)分配伍(wu)，否則(ze)本發明預(yu)期可在(zai)組(zu)合物中使(shi)用(yong)任(ren)何上述載(zai)體(ti)(ti)。

“藥學(xue)上可接受的(de)(de)”是指當(dang)施(shi)用至人體時不會產生過(guo)敏反應(ying)或(huo)類似的(de)(de)不期望的(de)(de)反應(ying)的(de)(de)分(fen)子和成分(fen)。本(ben)領域已知如何制(zhi)備包含作為(wei)活(huo)性組(zu)分(fen)的(de)(de)蛋白的(de)(de)水(shui)性組(zu)合物。通常(chang)，這些(xie)組(zu)合物被制(zhi)備成注射劑，例如液(ye)(ye)態(tai)溶(rong)(rong)液(ye)(ye)或(huo)懸(xuan)浮(fu)(fu)液(ye)(ye)；也可以制(zhi)備成適于在注射之前配制(zhi)成溶(rong)(rong)液(ye)(ye)或(huo)懸(xuan)浮(fu)(fu)液(ye)(ye)的(de)(de)固體形式。

實施例

材料和方法

小(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)鼠(shu)(shu)(shu)(shu)(shu)(shu)(shu)：8周齡(ling)的c57bl/6(b6)小(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)鼠(shu)(shu)(shu)(shu)(shu)(shu)(shu)購自(zi)中山(shan)大學動(dong)物供應(ying)中心。b6背景的pd-1h-ko小(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)鼠(shu)(shu)(shu)(shu)(shu)(shu)(shu)已有報(bao)道(dao)。轉基(ji)因品系cd45.1、ot-ii、foxp3(gfp)、rag1ko均購自(zi)thejacksonlaboratory。pd-1hko和野生型(對照小(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)鼠(shu)(shu)(shu)(shu)(shu)(shu)(shu))的同窩小(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)鼠(shu)(shu)(shu)(shu)(shu)(shu)(shu)由pd-1h雜合子產生并保(bao)持在(zai)相同的條件下。將foxp3(gfp)小(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)鼠(shu)(shu)(shu)(shu)(shu)(shu)(shu)和ot-ii小(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)鼠(shu)(shu)(shu)(shu)(shu)(shu)(shu)分別(bie)與pd-1hko小(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)鼠(shu)(shu)(shu)(shu)(shu)(shu)(shu)回交，產生pd-1h缺陷(xian)型foxp3(gfp)報(bao)道(dao)小(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)鼠(shu)(shu)(shu)(shu)(shu)(shu)(shu)和pd-1h缺陷(xian)型ot-ii小(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)鼠(shu)(shu)(shu)(shu)(shu)(shu)(shu)。將小(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)鼠(shu)(shu)(shu)(shu)(shu)(shu)(shu)保(bao)持在(zai)特定的無病原體設施中，所有動(dong)物實驗(yan)均按照“國家衛(wei)生研究院實驗(yan)動(dong)物護理和使用指南(nan)”進行，經中山(shan)大學科學調查委員會批準(zhun)(廣東，中國)。

抗體、試劑盒和流式細胞術分析：對于小鼠pd-1h的細胞表面染色，使用mh5a(倉鼠抗小鼠pd-1h)，之后使用抗倉鼠igg-pe(ebioscience)；倉鼠igg(ebioscience)被用作同種型對照。pd-1h激動劑mab克隆mam82(小鼠抗小鼠igg1)已有描述。所有其他熒光標記的抗體包括cd4、cd25、cd44、cd69、foxp3、tcrvβ5.1/5.2、p-stat3、p-stat5、ctla-4、lag-3、gitr、iocs、cd45.1和cd45.2從ebioscience和bdpharmingen購買。對于中和試驗，從r&dsystem購買抗-ifn-γ(克隆xmg1.2)、抗il-4(克隆11b11)，抗il-6(克隆mp5-20f3)中和抗體。根據bd的cytofix/cytoperm試劑盒手冊進行foxp3和其他細胞內細胞因子的細胞內染色。使用小鼠th1/th2/th17cba試劑盒(bdbioscience)進行細胞因子分析。小鼠pan-t分離試劑盒、cd8⁺t細胞分離試劑盒、cd4⁺t細胞分離試劑盒、cd25微珠試劑盒和初始cd4⁺t細(xi)(xi)胞(bao)(bao)分離試(shi)劑盒購自miltenyibiotec(cambridge，ma)。使用bdfacsverse(bdbiosciences)進(jin)行流(liu)式細(xi)(xi)胞(bao)(bao)術(shu)分析，并使用flowjo軟件(treestar)分析數據。

細胞分選和純化：收集脾臟和ln的單細胞懸浮液，使用初始cd4⁺t細胞分離試劑盒(miltenyibiotec)分離初始的cd4⁺cd25^-cd44^locd62^hit細胞。對于foxp3(gfp)敲入小鼠，在使用cd4⁺t細胞分離試劑盒純化后，通過facsaria(bdbiosciences)對cd4⁺cd25^-foxp3(gfp)t細胞和cd4⁺cd25⁺foxp3(gfp⁺)t細胞進行分選。在所示的實驗中，使用cd4⁺t細胞分離試劑盒首先富集cd4⁺t細胞，然后使用cd25微珠試劑盒(miltenyibiotec)去除cd25⁺t細胞，得到cd4⁺cd25^-t細(xi)胞。使用該方法分選的(de)細(xi)胞的(de)純度通常大于95％。

itreg細胞的體外轉化：使用結合至平板的抗cd3(克隆2c11，2μg/ml，ebioscience)和可溶性抗cd28(1μg/ml)在存在或不存在重組tgf-β(5ng/ml，r&dsystems)和il-2(5ng/ml，peprotech)的情況下在體外刺激分選的cd4⁺cd25^-foxp3(gfp^-)t細胞3-5天。然后通過流式細胞儀基于gfp的表達或foxp3的細胞內染色分析foxp3⁺treg細(xi)胞(bao)的(de)轉化(hua)。在(zai)所示實驗中，在(zai)用抗cd3(1μg/ml)包被平板之(zhi)后，將細(xi)胞(bao)在(zai)包被pd-1h激(ji)動劑mam82(10μg/ml)的(de)平板中培(pei)養(yang)。對(dui)于細(xi)胞(bao)因子(zi)(zi)中和實驗，在(zai)培(pei)養(yang)開(kai)始時向孔中加入10μg/ml的(de)il-4、il-6和ifn-γ的(de)mab。在(zai)所示時間(jian)點(dian)收集培(pei)養(yang)的(de)上清液進(jin)行細(xi)胞(bao)因子(zi)(zi)分析。

treg細胞的抑制試驗：按之前文獻所述方法進行treg細胞抑制功能試驗。簡言之，首先用1μmcfse(lifetechnologies)標記初始cd8⁺t細胞(在一些實驗中使用cd4⁺初始t細胞)，隨后在存在作為飼養細胞的1×10⁵絲裂霉素c處理的同基因脾細胞的情況下以1×10⁵共同培(pei)養細(xi)(xi)胞。在(zai)u底96孔板中以(yi)指(zhi)定的(de)比(bi)例向(xiang)培(pei)養物(wu)加(jia)(jia)入或不加(jia)(jia)入treg細(xi)(xi)胞并培(pei)養72小(xiao)時(shi)，隨后加(jia)(jia)入抗小(xiao)鼠(shu)cd3(1μg/ml)以(yi)進行刺激(ji)。通過cfse稀釋法(fa)測定t細(xi)(xi)胞的(de)增殖。在(zai)一些實驗(yan)中，向(xiang)培(pei)養物(wu)中加(jia)(jia)入可溶性小(xiao)鼠(shu)對(dui)照(zhao)igg或pd-1h激(ji)動劑mam82(10μg/ml)。在(zai)這(zhe)些情況下(xia)，飼(si)養細(xi)(xi)胞是(shi)pd-1hko脾(pi)細(xi)(xi)胞。

口服耐受小鼠模型：根據公開的方案進行foxp3⁺itreg細胞的全新生成。簡言之，如前所述，從ot-ii小鼠(或pd-1hkoot-ii小鼠)中分離初始cd4⁺cd25^-t細胞，并在過繼轉移前用5μmcfse標記。向wtb6小鼠靜脈內注射2×10⁶個細胞。24小時后，將籠中飲用水連續5天替換為1.5％ova溶液(v級；sigma-aldrich)。在第6天，收集腸系膜ln和pp，通過流式細胞術利用foxp3的細胞內染色測定tcr特異性foxp3⁺treg細胞。

骨髓嵌合體：將來自wt(cd45.1)和pd-1hko小鼠(cd45.2)的脛骨和股骨的骨髓以1:1的比例混合，并將總共1×10⁷個細胞轉移到亞致死性輻射處理的(6gy)同源wt小鼠(cd45.1/cd45.2)。重構10周后分析所示器官。通過細胞內染色測定foxp3⁺細胞的頻率。

eae疾病模型：按文獻方法進行實驗性自身免疫性腦脊髓炎(eae)模型。簡言之，將7-8周齡雌性小鼠s.c.免疫在完全弗氏佐劑(difco)中的200μgmog35-55(lifetechnologies)。在免疫后第0天和第2天，給小鼠腹腔注射在500μlpbs中的400ng百日咳毒素(listbiologicallabs)。對于過繼轉移，在第0天，進行免疫前，靜脈注射1×10⁶個wtfoxp3(gfp⁺)itreg細胞或pd-1hkofoxp3(gfp⁺)itreg細胞(bao)。wt小(xiao)鼠靜脈注射相同體積的(de)(de)pbs(鹽水)作為(wei)對(dui)照。每(mei)天觀察小(xiao)鼠，以0-5的(de)(de)等級確(que)定臨床評(ping)分(盲法)：0＝健康；1＝拖(tuo)尾；2＝拖(tuo)尾和(he)后(hou)肢無(wu)力(li)；3＝后(hou)肢癱瘓；4＝所有后(hou)肢癱瘓和(he)前肢無(wu)力(li)；5＝垂死(si)狀態。對(dui)于從(cong)eae小(xiao)鼠獲得的(de)(de)細胞(bao)的(de)(de)間接體內(nei)分析，收集(ji)每(mei)組的(de)(de)脾和(he)dln，并且(qie)用pma/離子(zi)霉(mei)素/bdgolgiplug再(zai)次刺激(ji)細胞(bao)懸浮(fu)液(ye)4小(xiao)時(shi)。使(shi)用細胞(bao)內(nei)染色(se)評(ping)估(gu)ifn-γ和(he)il-17的(de)(de)水平，并通過facs(bdcytofix/cytoperm試劑盒)分析。

慢性結腸炎的t細胞轉移模型：簡言之，如上所述制備和分選來自wt和pd-1hko小鼠的foxp3⁺itreg細胞。通過腹膜內，將同源cd4⁺cd45rb^hit細胞(cd45.1,4×10⁵)和或不和2x10⁵itreg細胞(cd45.2)一起共注射到rag1ko小鼠。每周稱重(zhong)一次小鼠，10周后，收集結腸組織(zhi)，用(yong)h&e進(jin)行組織(zhi)染色。收集脾臟和mln細胞，并使用(yong)pma/離子(zi)霉(mei)素/bfa離體活化4小時，然后分析細胞因子(zi)產量。

dna甲基化分析：分離foxp3(gfp⁺)itreg細胞(bao)，用(yong)dneasyblood&tissuekit(qiagen)純(chun)化(hua)基(ji)因組(zu)(zu)(zu)dna。使(shi)用(yong)ezdna甲基(ji)化(hua)-金試劑(ji)盒(zymo研(yan)究)進行(xing)(xing)dna的(de)亞硫酸氫鹽轉(zhuan)化(hua)。使(shi)用(yong)文獻報道的(de)引(yin)物組(zu)(zu)(zu)擴增foxp3增強子(zi)的(de)cns2區(qu)，并將(jiang)t/a克隆到pmd18-t載體(clonetech)中(zhong)。對每組(zu)(zu)(zu)10個插入的(de)質粒進行(xing)(xing)純(chun)化(hua)和測序，并通過(guo)biqanalyzer2.0分析甲基(ji)化(hua)結果(guo)。

圖表和(he)統(tong)計(ji)分(fen)(fen)析(xi)：圖形和(he)數據分(fen)(fen)析(xi)是(shi)使(shi)用graphpad軟件生成。進行(xing)非(fei)配(pei)對studentt檢(jian)驗(yan)的統(tong)計(ji)學分(fen)(fen)析(xi)，p值小于0.05被認為是(shi)顯著的。圖中的誤差(cha)條表示(shi)標準誤差(cha)(se)。對于疾病進展，使(shi)用雙因素方差(cha)分(fen)(fen)析(xi)(*p<0.05)進行(xing)分(fen)(fen)析(xi)。所有實驗(yan)重復至(zhi)少3次(ci)。

結果

pd-1h對于treg細胞的全新生成是必需的

發明人首先探索了pd-1h在口服耐受模型中的作用，在該模型中口服給予雞卵清蛋白(ova)顯示能夠促進itreg細胞在外周血中的擴增和全新生成。將ot-iitcr轉基因小鼠與pd-1hko小鼠回交得到新的koot-ii品系。從wtot-ii或koot-ii小鼠的脾細胞中純化cd4⁺t細胞，并去除cd25⁺t細胞(以避免ntreg污染)，隨后轉移到wtb6小鼠中。小鼠隨后在飲用水中連續5天加入1.5％ova(圖1a)。與之前公開的結果一致，foxp3⁺v5.1/5.2⁺ot-ii細胞可以在包括腸系膜淋巴結(mln)和派耶氏集合淋巴結(pp)的腸道相關淋巴器官中檢測到，而在脾臟、外周ln和椎板固有層(lp)中可檢測到較少的細胞(數據未顯示)，表明腸道相關淋巴器官對ova的treg反應。在不存在pd-1h的情況下，盡管mln和pp中wt和koot-ii細胞基于cfse稀釋度的分裂速度相當(圖6a)但與wtot-ii相比，mln和pp中的foxp3⁺v5.1/5.2⁺ot-ii細胞顯著降低(圖1b和1c)。當將初始wtot-ii細胞和koot-ii細胞共轉移到ova喂養小鼠中時，觀察到了類似的結果(圖6b和6c)。我們發現在相同的宿主小鼠中，與共轉移的wtot-ii細胞相比，ot-ii細胞上的pd-1h缺乏導致foxp3⁺t細(xi)胞的(de)分化受損(圖6b和6c)。我們的(de)研究結(jie)果表明pd-1h的(de)喪(sang)失影響(xiang)體內ova特異性itreg細(xi)胞的(de)誘導。

將初始cd4⁺t細胞轉移到淋巴球減少癥小鼠可實現其穩態增殖，該作用可以上調foxp3的表達，并且這些foxp3⁺itreg細胞在體外獲得抑制功能。為了確定pd-1h是否影響該過程，將來自wt(cd45.1)和ko(cd45.2)小鼠的初始cd4⁺t細胞以1:1的比例混合，并轉移到rag1ko小鼠中。3周后分析指示器官中cd25⁺foxp3⁺t細胞的百分數和絕對數量(圖7)。我們發現kocd4⁺t細胞的總數比脾臟中的wtcd4⁺t細胞增加了兩倍多(數據未顯示)。然而，與wtcd4⁺t細胞相比，在脾、ln和mln中發現kocd4⁺t細胞中的cd25⁺foxp3⁺itreg細胞的顯著更低。此外，盡管在脾臟中未觀察到明顯變化，但cd4⁺t細胞上的pd-1h損失也導致在ln和mln中比wtcd4⁺t細胞數量少的foxp3⁺itreg細胞(圖7b)。此外，與淋巴細胞環境中的wtcd4⁺t細胞相比，我們發現回收的kocd4⁺t細胞產生顯著更高的ifn-γ和il-17細胞因子(圖7c)。我們得出結論，pd-1h是foxp3⁺itreg細胞從頭(tou)生成(cheng)所必(bi)需的(de)。

pd-1h是itreg細胞的擴增是必需的，但非其產生和功能所必需

pd-1hko小(xiao)鼠(shu)在(zai)胸腺、脾臟和淋巴結中顯示出(chu)正常(chang)數量的(de)(de)ntreg細(xi)胞。此(ci)外，pd-1hko小(xiao)鼠(shu)中ntreg細(xi)胞的(de)(de)表(biao)型(xing)和抑制(zhi)功(gong)能也與wt同窩小(xiao)鼠(shu)相似(si)(圖8)。這些(xie)發現(xian)與以前的(de)(de)觀察結果一致，即幼年pd-1hko小(xiao)鼠(shu)沒(mei)有明顯的(de)(de)自(zi)身(shen)免疫樣表(biao)型(xing)。因此(ci)，pd-1h似(si)乎對于淋巴器(qi)官中ntreg的(de)(de)發育和功(gong)能成熟不是必(bi)需的(de)(de)。

因為itreg細胞主要在穩定狀態或炎癥的腸道中產生，我們接下來考察pd-1h的缺乏是否影響itreg的產生和功能。雖然在pd-1hko小鼠和wt同窩出生小鼠中都發現了在mln和pp中的相似比例的foxp3⁺treg細胞，但pd-1hko小鼠的lp中的foxp3⁺細胞顯著更低，盡管foxp3⁺細胞的絕對數量在不存在pd-1h的情況下不變(圖2a和2b)。當pd-1hko/wt小鼠回交到foxp3(gfp)小鼠(其中gfp基因處于foxp3啟動子的控制下)時，lp中也發現了類似的結果(數據未顯示)。這些數據表明在體內不存在pd-1h的情況下，itreg細胞的分化具有缺陷。為了進一步驗證我們在pd-1hko小鼠中的發現，我們創建了混合骨髓嵌合體。將來自wt(cd45.1)和ko小鼠(cd45.2)的混合骨髓過繼轉移至被亞致死量輻射的b6小鼠。10周后分析指示器官中foxp3⁺細胞的頻率。我們發現kot細胞總數比wtt細胞增加了近兩倍(圖9a)。相比之下，kofoxp3⁺t細胞顯著低于外周器官中的wtt細胞和受體t細胞(圖9b和9c)。在嵌合小鼠的脾臟中，kofoxp3⁺t細胞的絕對數量也低于wtt細胞，而foxp3^-效應t細胞(teff)則更加劇烈地擴增(圖9c)。這些數據表明pd-1h對t細胞的活化和穩態是共抑制的，但促進體內foxp3⁺treg細胞的發育。

接下來我們測試pd-1h的損失是否會影響體外itreg細胞的轉化。從wt和pd-1hko脾細胞純化得到初始cd4⁺cd25^-cd62l^hi細胞，并在tgf-β存在下用抗cd3/cd28刺激。從wt初始t細胞分化出的foxp3⁺itreg細胞的頻率顯著高于由ko初始t細胞分化出的foxp3⁺itreg細胞(bao)(圖2c)。綜上，我們得出結論，pd-1h對于itreg的從頭分化是必需的。

為了進一步測試pd-1h損失是否影響itreg功能，如上所述在體外誘導來自wt或pd-1hkofoxp3(gfp)小鼠的itreg細胞，并通過分選進行純化。通過抗cd3刺激純化的cd4⁺cd25^-cd62l^hi初(chu)始t細胞(bao)產生teff。在受輻射的(de)(de)(de)(de)脾細胞(bao)(作為(wei)抗(kang)原呈(cheng)遞細胞(bao))及(ji)可溶性(xing)抗(kang)cd3的(de)(de)(de)(de)存(cun)在下，將wt或koitreg細胞(bao)與效應細胞(bao)以(yi)(yi)指(zhi)定(ding)的(de)(de)(de)(de)treg/teff比共(gong)同培養(yang)(yang)3天。teff在共(gong)培養(yang)(yang)前被cfse標(biao)記，并(bing)且(qie)使用降低(di)的(de)(de)(de)(de)cfse稀釋液作為(wei)treg抑制的(de)(de)(de)(de)指(zhi)標(biao)。如圖2d和2e所示，來自wt和ko小鼠的(de)(de)(de)(de)itreg細胞(bao)以(yi)(yi)相當的(de)(de)(de)(de)活性(xing)抑制teff的(de)(de)(de)(de)增殖。與這些發現一致，我們未在wt與koitreg中發現激活標(biao)記物(wu)cd25、gitr、lag-3、ctla-4、icos或pd-1的(de)(de)(de)(de)表達的(de)(de)(de)(de)顯著(zhu)差異(圖2f)。因此(ci)，盡管對(dui)itreg的(de)(de)(de)(de)分化有影響，但pd-1h不影響itreg的(de)(de)(de)(de)抑制功能。

我們最后測試了pd-1h激動劑mabmam82對itreg擴增的影響。從wtfoxp3(gfp)敲入小鼠中分選初始t細胞，隨后在tgf-β存在下用抗cd3/cd28刺激。在刺激下測量gfp⁺cd25⁺itreg細胞的誘導。加入mam82輕微增加foxp3⁺cd25⁺itreg擴增(zeng)，盡管效果呈(cheng)現中(zhong)等水(shui)平(圖(tu)10a和10b)。然而，這(zhe)種中(zhong)等水(shui)平的(de)作(zuo)用(yong)可能是(shi)由于體外t細胞(bao)的(de)細胞(bao)表(biao)面pd-1h的(de)快速損失導(dao)致。總而言之(zhi)，我們的(de)數據(ju)表(biao)明，pd-1h是(shi)從初始t細胞(bao)產(chan)生itreg是(shi)必需的(de)，但不影響其抑制功(gong)能。

pd-1h通過細胞因子調節itreg分化

之前文獻報道活化的pd-1hkocd4⁺t細胞比wtt細胞在體外產生更高水平的ifn-γ和il-17。此外，將來自wt和ko小鼠的初始t細胞共轉染淋巴細胞小鼠導致ko與wtt細胞中的foxp3⁺t細胞減少并增加ifnγ⁺和il-17⁺細胞(圖7)。因此，細胞因子可能在不存在pd-1h的情況下調節itreg細胞的分化。為了驗證該推測，首先用抗cd3/cd28刺激純化的cd4⁺t細胞，并收集培養的上清液用于細胞因子檢測。與我們以前的發現一致，與wtcd4⁺t細胞相比，活化的kocd4⁺t細胞產生較高水平的ifn-γ和il-17(圖3a)。在tgf-β存在下，這些細胞因子的產生進一步增加，而tnf-α沒有變化(數據未顯示)。此外，pd-1hkocd4⁺t細胞產生更多il-4，伴隨tgf-β增加或不增加(圖3a)。因為這些細胞因子是由不同的cd4⁺t細(xi)胞(bao)亞群產生的(de)，所以我們的(de)發現支持pd-1h作為t輔助細(xi)胞(bao)的(de)泛抑制劑。

將(jiang)il-4和/或ifn-γ的中和mab加入到培養(yang)物中以利用這(zhe)些(xie)細胞(bao)(bao)因子在誘(you)導(dao)itreg細胞(bao)(bao)中的作用。如圖所(suo)示，與(yu)wt對(dui)照(zhao)相比，中和il-4或ifn-γ部分(fen)(fen)(fen)恢(hui)(hui)復(fu)pd-1hkoitreg細胞(bao)(bao)的分(fen)(fen)(fen)化，而(er)包含兩(liang)種mab恢(hui)(hui)復(fu)了(le)大部分(fen)(fen)(fen)活性(xing)。作為對(dui)照(zhao)，單獨或組合使用ifn-γ/il-4中和mab也(ye)可(ke)以增強itreg分(fen)(fen)(fen)化(圖3b和3c)。這(zhe)些(xie)研究結果(guo)表明，在不(bu)存在pd-1h的情(qing)況下，受損的itreg分(fen)(fen)(fen)化至少部分(fen)(fen)(fen)地是由于t細胞(bao)(bao)改變細胞(bao)(bao)因子產生而(er)導(dao)致的。

pd-1h的損失有助于在炎癥環境中itreg轉化為th17

隨后我們確定了pd-1h是否對已經分化的itreg細胞有直接作用。建立鼠實驗性自身免疫性腦脊髓炎(eae)模型，以測試foxp3⁺itreg細胞的穩定性。簡言之，如上所述產生wt或pd-1hkofoxp3(gfp⁺)itreg細胞，并通過基于gfp陽性的流式細胞術(>97％foxp3⁺，圖11a)進行分選。濃度為1×10⁶/小鼠的foxp3(gfp⁺)cd45.2⁺itreg細胞被靜脈內轉移到cd45.1⁺b6免疫前小鼠中，其中轉移的wtitreg的數目不足以阻止eae進展。然后用髓磷脂堿性蛋白質免疫小鼠以誘導eae。在這種情況下，與對照相比，wtitreg細胞的轉移稍微延遲了疾病的發病。然而，pd-1hkoitreg細胞的轉移導致更嚴重的疾病(如臨床評分所示)，盡管在疾病高峰期沒有發現顯著差異(圖4a)。有趣的是，eae小鼠脊髓的h&e染色顯示kotreg轉移的小鼠和wttreg轉移的小鼠之間的淋巴細胞浸潤具有微小差異(數據未顯示)。然后我們分析了在疾病進展期間轉移的treg細胞中foxp3表達的穩定性。與wt小鼠的itreg相比，koitreg的foxp3頻率(gfp⁺)在脾臟和dln中都降低了50％以上(圖4b和4c)。此外，dln中kofoxp3⁺細胞的絕對數量與dln中的wtfoxp3⁺細胞相比顯著減少，盡管脾臟中foxp3⁺t細(xi)胞的(de)數量(liang)相當(圖4c)。因(yin)此，我們的(de)研究結果表(biao)明(ming)了pd-1h在(zai)維持itreg表(biao)型和功能方面(mian)的(de)作用。

在treg向其他cd4⁺t細胞亞群的可轉換性方面，我們的研究結果表明了itreg向包括th1和th17在內的效應性t細胞亞群的轉化(在eae中被認為是致病性的)。為了驗證這種可能性，用pma/離子霉素在第13天刺激來自宿主小鼠的脾臟和dln細胞4小時，使用細胞內染色檢查cd45.2⁺cd4⁺門控細胞的gfp(foxp3表達的指標)、ifn-γ和il-17。與用wtitreg細胞轉移的小鼠相比，用pd-1hkoitreg細胞轉移的小鼠的脾臟和dln中觀察到轉化的th1樣細胞(ifn-γ⁺foxp3^-)的比例適度增加(圖4e)。然而，在這兩組小鼠中，轉化的th1樣細胞ifn-γ⁺細胞的絕對數量沒有顯著差異(圖4e)，表明itreg向th1的轉化非常少。然而，大部分pd-1hkoitreg細胞(脾臟中16.7％、dln中6.1％)轉化為il-17⁺細胞，并且從wtitreg細胞到il-17⁺細胞的轉化非常少(在脾臟和dln中均少于2％)(圖4e和4f)。使用相同的策略，我們分析了受試者cd4⁺t細胞(門控cd45.1⁺)，其顯示與wt或pd-1hkoitreg細胞轉移的兩組小鼠中ifn-γ⁺和il-17⁺細(xi)胞的(de)(de)(de)相當(dang)水平(ping)(圖11b和(he)11c)。這些結果(guo)表明(ming)，pd-1h的(de)(de)(de)損失促進了itreg在炎(yan)性環境(jing)中轉(zhuan)(zhuan)化為th17樣細(xi)胞。因(yin)此(ci)，pd-1hkoitreg細(xi)胞部分(fen)促進eae進展(zhan)的(de)(de)(de)作用(yong)(圖4a)可能是(shi)炎(yan)癥環境(jing)中itreg轉(zhuan)(zhuan)化為th17的(de)(de)(de)結果(guo)。

發明人還評估了pd-1hkotreg對慢性結腸炎t細胞轉移模型的影響。如上所述制備wt和kofoxp3(gfp⁺)treg(cd45.2)，分別與同種cd45.1teff(cd45rb^hicd25^-cd4⁺)混合，并且隨后轉移到rag1ko小鼠中。在這個實驗中，即使單獨轉移cd45rbhiteff，我們也沒有觀察到疾病進展期間明顯的體重減輕(圖12a)。然而，共轉移pd-1hkotreg/teff導致大量白細胞浸潤和結腸嚴重的組織損傷(通過h&e染色看出)，而wttreg/teff的共轉移顯示結腸組織沒有明顯的損傷(圖12b和12c)。為了確定pd-1hkotreg細胞減弱的抑制能力是否與foxp3表達的損失相關，我們評估了宿主rag1ko小鼠的脾臟和mln中的foxp3表達。與treg功能損失一致，與wttreg相比(脾臟17％，mln中為54％)，pd-1hkotreg中foxp3表達下調(脾臟11％，mln39％)(圖12d和12e)。然而，在pd-1hkotreg與wttreg共轉移小鼠之間，foxp3⁺t細胞的絕對數量沒有顯著差異(圖12f)。此外，用pd-1hkotreg轉移的小鼠(脾臟為30.7％，mln為14.9％)比用wttreg(脾臟為7％，mln為3.95％)轉移的小鼠具有顯著更多的ifn-γ⁺細胞(圖12g)。最后，pd-1hkotreg(脾臟為13.3％，mln為9.8％)轉移后比wttreg(脾臟3.64％，mln為4.44％)轉移后出現更多的il-17⁺t細胞(圖12g和12h)。在pd-1hkotreg/teff轉移和在wttreg/teff轉移之間未觀察到ifn-γ⁺和il-17⁺teff(cd45.1)在(zai)脾臟(zang)和mln中的(de)(de)(de)差(cha)異(圖(tu)12i)。我們的(de)(de)(de)研究結果表明，treg缺乏pd-1h導致(zhi)treg快速轉化為其他可能促進(jin)炎癥的(de)(de)(de)效應(ying)cd4細(xi)胞。因此(ci)，pd-1h對于維持treg細(xi)胞在(zai)炎癥下的(de)(de)(de)抑制功能和foxp3的(de)(de)(de)表達是必(bi)需的(de)(de)(de)。

在pd-1hkoitreg細胞中stat3活性和foxp3增強子甲基化增加

stat5激活驅動treg譜系定型，而stat3抑制foxp3表達(da)并促進th17細胞(bao)(bao)反應。為了檢查pd-1h的(de)(de)(de)損失是(shi)(shi)否形(xing)成了treg細胞(bao)(bao)中的(de)(de)(de)stat通路，我(wo)們分析(xi)了eae模(mo)型中stat-5和stat-3的(de)(de)(de)激活。pd-1hkoitreg細胞(bao)(bao)(高達(da)47％的(de)(de)(de)p-stat3)在eae小鼠(shu)的(de)(de)(de)脾和dln中比wtitreg細胞(bao)(bao)表達(da)顯著更高水平的(de)(de)(de)磷酸化stat-3(p-stat3)。然而，在wt和pd-1hkoitreg細胞(bao)(bao)中發現相當(dang)的(de)(de)(de)p-stat5水平(圖5a和5b)，暗示stat3(而不是(shi)(shi)stat5)在pd-1h功能中的(de)(de)(de)作用。

以前的(de)(de)(de)研究表(biao)明，foxp3增(zeng)強(qiang)子(zi)的(de)(de)(de)cns2(保守(shou)的(de)(de)(de)非(fei)編碼dna序列(lie)2)區域(yu)(yu)的(de)(de)(de)dna甲(jia)基(ji)化(hua)狀(zhuang)態對維持foxp3表(biao)達(da)特別重要。我(wo)們(men)(men)在(zai)(zai)本(ben)發明中確定了(le)pd-1hkoitreg細(xi)(xi)胞中cns2區域(yu)(yu)的(de)(de)(de)甲(jia)基(ji)化(hua)。如圖5c所示(shi)，體外誘導的(de)(de)(de)wtitreg顯(xian)示(shi)cns2區域(yu)(yu)的(de)(de)(de)幾乎一(yi)半(ban)被去甲(jia)基(ji)化(hua)(平均(jun)(jun)為40.8％)。然而(er)，pd-1hkoitreg細(xi)(xi)胞的(de)(de)(de)去甲(jia)基(ji)化(hua)顯(xian)著(zhu)減少(shao)(平均(jun)(jun)17.5％)，foxp3增(zeng)強(qiang)子(zi)cns2區域(yu)(yu)的(de)(de)(de)超甲(jia)基(ji)化(hua)平均(jun)(jun)為82.5％。這一(yi)觀察(cha)結果(guo)解釋(shi)了(le)pd-1hkoitreg細(xi)(xi)胞在(zai)(zai)foxp3表(biao)達(da)方面(mian)的(de)(de)(de)不(bu)穩定性(xing)。總之，我(wo)們(men)(men)的(de)(de)(de)數據表(biao)明，pd-1h缺乏對treg的(de)(de)(de)分化(hua)和表(biao)型穩定性(xing)具有顯(xian)著(zhu)影響(xiang)。

本發明的(de)(de)結(jie)果(guo)表(biao)明，pd-1h是一(yi)(yi)種關鍵的(de)(de)細(xi)胞(bao)表(biao)面信號分子，通過兩種不(bu)同的(de)(de)機制(zhi)(zhi)控(kong)制(zhi)(zhi)誘導性(xing)treg的(de)(de)細(xi)胞(bao)數量水平。第一(yi)(yi)，從初(chu)始(shi)t細(xi)胞(bao)產生itreg需要pd-1h。這(zhe)種作用主要是通過抑制(zhi)(zhi)炎性(xing)細(xi)胞(bao)因子(如(ru)ifn-γ、il-4和(he)(he)il-17)介(jie)導的(de)(de)。結(jie)果(guo)，響應環境(jing)刺激的(de)(de)itreg的(de)(de)數量減少。盡管pd-1h不(bu)影(ying)(ying)響itreg在(zai)每(mei)個細(xi)胞(bao)水平的(de)(de)抑制(zhi)(zhi)功能，但itreg水平的(de)(de)減少可能最終會影(ying)(ying)響免疫反應期(qi)間treg的(de)(de)整體抑制(zhi)(zhi)功能。第二，pd-1h信號傳導阻止在(zai)炎癥環境(jing)中(zhong)將itreg轉化(hua)為(wei)th1和(he)(he)th17。這(zhe)種作用可能是由于(yu)pd-1h對(dui)itreg細(xi)胞(bao)上的(de)(de)foxp3表(biao)達的(de)(de)直(zhi)接調(diao)節作用導致的(de)(de)。通過促進itreg的(de)(de)產生和(he)(he)防(fang)止itreg轉化(hua)為(wei)th1和(he)(he)th17，pd-1h有助于(yu)在(zai)炎癥期(qi)間保持(chi)恒(heng)定的(de)(de)itreg水平。據我們所知(zhi)，這(zhe)是描述pd-1h的(de)(de)調(diao)解機制(zhi)(zhi)和(he)(he)控(kong)制(zhi)(zhi)調(diao)節性(xing)t細(xi)胞(bao)的(de)(de)機制(zhi)(zhi)的(de)(de)第一(yi)(yi)次全面研究。

雖然pd-1h的共抑制功能已經在早期研究中得到證實，但這種作用所依賴的機制尚未闡明。wang及其同事表明，在tgf-β存在下，pd-1hig部分促進了itreg細胞的分化，這種作用可以在小鼠和人類cd4⁺t細(xi)胞(bao)(bao)(bao)中發(fa)現。此外，pd-1h的(de)(de)(de)單克隆(long)抗(kang)體降低腫瘤抗(kang)原特異性(xing)(xing)itreg細(xi)胞(bao)(bao)(bao)在體內(nei)的(de)(de)(de)分化。在這些研究(jiu)中，pd-1h被認為是一(yi)(yi)種(zhong)配體，它與(yu)treg上(shang)的(de)(de)(de)一(yi)(yi)個尚未鑒別的(de)(de)(de)抑制性(xing)(xing)受(shou)(shou)體結(jie)合，以(yi)調節這種(zhong)作(zuo)用(yong)(yong)。我們(men)使用(yong)(yong)pd-1h缺陷(xian)小鼠和(he)pd-1h激(ji)動(dong)劑mab的(de)(de)(de)結(jie)果顯示(shi)pd-1h作(zuo)為t細(xi)胞(bao)(bao)(bao)上(shang)的(de)(de)(de)共抑制受(shou)(shou)體。還應注意，pd-1h在抑制免疫應答(da)中的(de)(de)(de)作(zuo)用(yong)(yong)可(ke)(ke)能(neng)更復(fu)雜，并且可(ke)(ke)以(yi)通過多于(yu)一(yi)(yi)種(zhong)單一(yi)(yi)機(ji)制起作(zuo)用(yong)(yong)。我們(men)最近的(de)(de)(de)研究(jiu)表明，pd-1h介導(dao)的(de)(de)(de)對同(tong)種(zhong)異體抗(kang)原的(de)(de)(de)t細(xi)胞(bao)(bao)(bao)耐受(shou)(shou)性(xing)(xing)的(de)(de)(de)抑制是由兩(liang)種(zhong)不同(tong)的(de)(de)(de)機(ji)制介導(dao)的(de)(de)(de)：早(zao)期(qi)阻止細(xi)胞(bao)(bao)(bao)增殖和(he)晚期(qi)誘(you)導(dao)treg以(yi)維持移植(zhi)物耐受(shou)(shou)性(xing)(xing)。在本發(fa)明中，我們(men)揭(jie)示(shi)了pd-1h在控(kong)制treg細(xi)胞(bao)(bao)(bao)數(shu)量水平中的(de)(de)(de)關鍵作(zuo)用(yong)(yong)，這可(ke)(ke)能(neng)有(you)助(zhu)于(yu)誘(you)導(dao)t細(xi)胞(bao)(bao)(bao)反應的(de)(de)(de)長(chang)期(qi)耐受(shou)(shou)

pd-1h對(dui)treg的(de)(de)(de)(de)影響(xiang)是一個高(gao)度(du)選擇(ze)性的(de)(de)(de)(de)事件。雖然pd-1h對(dui)于從初始(shi)t細胞(bao)產生(sheng)itreg是必不(bu)可(ke)少的(de)(de)(de)(de)，但(dan)ntreg和itreg的(de)(de)(de)(de)抑(yi)制功能不(bu)受影響(xiang)。特(te)別是pd-1h對(dui)于通(tong)過自身抗原(yuan)選擇(ze)的(de)(de)(de)(de)、胸腺來(lai)源的(de)(de)(de)(de)ntreg細胞(bao)的(de)(de)(de)(de)產生(sheng)和抑(yi)制功能不(bu)是必需的(de)(de)(de)(de)(圖8)。這個結(jie)果可(ke)能部分解釋(shi)了(le)為什么在年(nian)幼pd-1hko小鼠中沒有觀(guan)察到自發性自身免疫疾病或淋巴組(zu)織增生(sheng)癥狀。然而(er)，在初始(shi)小鼠中自發產生(sheng)的(de)(de)(de)(de)itreg細胞(bao)明顯受到影響(xiang)(圖2a)，這在先前在tgf-β和視黃酸存在下在活化的(de)(de)(de)(de)cd4+t細胞(bao)中觀(guan)察到過，并且該(gai)群體主(zhu)要積(ji)聚在腸和皮膚(fu)中粘膜。

盡管發現foxp3⁺itreg細胞的頻率在腸內降低，特別是在pd-1hko小鼠的lp中，但lp中foxp3⁺itreg的絕對數量沒有變化(圖2a)。這可能部分解釋了為什么pd-1hko小鼠不會在腸道中發展自發性致病性疾病。我們還在pd-1hko小鼠驗證了這個結論，該小鼠與foxp3(gfp)小鼠(gfp表達在foxp3啟動子控制下)交配而產生pd-1hkofoxp3(gfp)小鼠(數據未顯示)。使用口服耐受模型進一步證實了這些發現，如前所述，該模型用于在體內從體內產生全新itreg細胞。與pd-1hko小鼠的腸道中的發現一致，pd-1h缺乏導致在mln和pp中抗原特異性foxp3⁺itreg細胞的全新生成受損(圖1a和1b)。此外，初始cd4⁺t細胞在tgf-β存在下體外轉化為itreg細胞進一步證明pd-1h缺乏可減少itreg細胞的分化(圖2c)。最后，與wtitreg細胞相比，itreg細胞的pd-1h缺乏表現出相似的抑制功能，盡管treg/teff比值較高時可以發現微小的差異(圖2d和2e)。此外，我們發現在淋巴細胞環境中，cd4⁺t細胞上pd-1h的損失導致平衡增殖后外周器官中foxp3⁺treg數(shu)量(liang)的減少，同時產(chan)生大(da)量(liang)的促(cu)炎(yan)(yan)細(xi)胞(bao)，這進一步阻(zu)礙(ai)了treg的體內分(fen)化(圖7)。在(zai)骨髓嵌合小(xiao)鼠中也發現了類似的發現，造血來源的細(xi)胞(bao)上(shang)的pd-1h的損(sun)失導致(zhi)骨髓細(xi)胞(bao)(如(ru)嗜中性(xing)粒細(xi)胞(bao)、巨(ju)噬細(xi)胞(bao))(數(shu)據(ju)未顯示)的更高的恢復，因(yin)(yin)此促(cu)炎(yan)(yan)細(xi)胞(bao)因(yin)(yin)子的產(chan)生可能(neng)阻(zu)礙(ai)外周treg細(xi)胞(bao)的數(shu)量(liang)水平(圖9)。因(yin)(yin)此，我們的研究結(jie)果支持pd-1h在(zai)產(chan)生itreg方面的高度(du)選擇性(xing)作用。

treg不是終末分化的，并且itreg可以通過特異性細胞因子或炎癥環境轉化成th1或th17亞類。treg細胞的這種可塑性使得在慢性炎癥期間難以研發出治療策略。本發明表明，pd-1h對于treg譜系的標志物foxp3的穩定性是必需的，并保持了treg的表型。pd-1h的損失導致各種體外和體內系統和模型中itreg的快速降低。我們的研究表明，在缺乏pd-1h的情況下，itreg細胞易于在炎癥狀態下重編程成為th17細胞，這可能解釋了pd-1hkoitreg的轉移不是抑制而是促進eae疾病的觀察結果。在這個模型中，itreg主要轉化為th17，很少轉化為th1。pd-1h也可能影響itreg向th1的轉化，因為在不存在pd-1h的情況下，在cd4⁺t細(xi)胞(bao)(bao)中檢測到高水平(ping)的(de)ifn-γ。有意思的(de)是，我(wo)們的(de)研究結果(guo)表明il-4水平(ping)也顯(xian)著增(zeng)加，這些數據(ju)暗示pd-1h在控制th2中的(de)可能作用。pd-1h在itreg向其他t細(xi)胞(bao)(bao)亞(ya)群的(de)調節(jie)和轉化(hua)中的(de)作用尚待(dai)闡明。

總之，本發(fa)明(ming)支持(chi)pd-1h在(zai)炎(yan)性環境中(zhong)抑(yi)制itreg細(xi)(xi)胞(bao)轉(zhuan)化為th1和(he)(he)(he)(he)th17細(xi)(xi)胞(bao)，至少部分是由于其(qi)在(zai)維持(chi)foxp3表達和(he)(he)(he)(he)itreg表型中(zhong)的(de)(de)(de)作用。這些發(fa)現(xian)對調節treg生長(chang)(chang)和(he)(he)(he)(he)功能具有(you)(you)重要(yao)意(yi)義(yi)。同時(shi)，如先前(qian)所示，pd-1h抑(yi)制初始t細(xi)(xi)胞(bao)的(de)(de)(de)激活以(yi)限制t細(xi)(xi)胞(bao)介(jie)(jie)導的(de)(de)(de)免疫(yi)應(ying)(ying)答的(de)(de)(de)啟(qi)動，它促進免疫(yi)應(ying)(ying)答期(qi)間itreg的(de)(de)(de)生長(chang)(chang)和(he)(he)(he)(he)轉(zhuan)化。除了(le)調節早期(qi)t細(xi)(xi)胞(bao)活化外，pd-1h似乎通過調節treg細(xi)(xi)胞(bao)數量水平參與t細(xi)(xi)胞(bao)耐受(shou)性的(de)(de)(de)調節。因此，pd-1h途徑(jing)可能一種(zhong)是在(zai)炎(yan)癥(zheng)、自身免疫(yi)疾病和(he)(he)(he)(he)癌癥(zheng)中(zhong)控制和(he)(he)(he)(he)操縱t細(xi)(xi)胞(bao)介(jie)(jie)導的(de)(de)(de)免疫(yi)方面(mian)有(you)(you)希望的(de)(de)(de)靶標。

本(ben)(ben)發(fa)明(ming)雖然已針(zhen)對(dui)具體實施(shi)方式做詳細的描述，但應當理解的是(shi)，本(ben)(ben)領域技術(shu)人(ren)員可在所公開的實施(shi)例的基(ji)礎上對(dui)本(ben)(ben)發(fa)明(ming)做出修改(gai)和(he)改(gai)進而不(bu)違背(bei)本(ben)(ben)發(fa)明(ming)的精神，而這些改(gai)進和(he)修改(gai)仍屬于本(ben)(ben)發(fa)明(ming)的范圍。