嵌合抗原受體及其基因和重組表達載體、工程化her1靶向性的nkt細胞及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于腫瘤生物制品領域，具體地，涉及過繼免疫治療中的一種嵌合抗原受 體肥RlScFv-CD8-CD137-CD3ζ及其基因和重組表達載體、工程化肥R1祀向性的NKT細胞 (CARHER1-NKT細胞）及其應用。
【背景技術】
[0002] EGFR(epithelialgrowthfactorreceptor,表皮生長因子受體）即肥R1,是原癌 基因c-erbBl的表達產物，屬于人類表皮生長因子受體（肥時家族，其本身具有酪氨酶激酶 活性，一旦與表皮生長因子巧G巧組合可啟動細胞核內的有關基因，從而促進細胞分裂增 殖。肥R1在多種惡性腫瘤中高表達，研究發現肥R1表達于大多數肺癌患者，表達水平達到 80%，其表達水平與肺癌疾病的進展及轉移有關。盡管最近肺癌的治療已經獲得一定的進 展，但是仍然未提高患者的生存率，因此亟需探討新的療法來克服送一困擾。
[0003]目前，在治療進展期肥R1陽性肺癌患者時，肥R1酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinaseinhibitors,TKIs)已經處于臨床研究階段，但是，臨床結果表明，僅部分肺癌患者 采用肥R1酪氨酸激酶抑制劑治療有效，并且患者最終會產生一定的耐藥性，從而影響藥物 的療效。

【發明內容】

[0004] 本發明的目的是為了克服現有技術中采用肥R1酪氨酸激酶抑制劑治 療進展期HER1陽性肺癌患者時引起的耐藥性的缺陷，提供一種嵌合抗原受體 肥RlScFv-CD8-CD137-CD3ζ及其基因和重組表達載體、工程化肥R1祀向性的NKT細胞 (CAR肥R1-NKT細胞）及其應用，嵌合抗原受體肥RlScFv-CD8-CD137-CD3ζ修飾的ΝΚΤ細胞 在治療進展期肥R1陽性肺癌時，能夠有效避免采用肥R1酪氨酸激酶抑制劑時引起的耐藥 性，對肺癌細胞具有一定的特異祀向殺傷活性。
[0005] 本發明的發明人在研究中意外發現，采用嵌合抗原受體 肥RlScFv-CD8-CD137-CD3ζ修飾的ΝΚΤ細胞治療進展期肥R1陽性肺癌時，能夠有效避免采 用肥R1酪氨酸激酶抑制劑時引起的耐藥性，對肺癌細胞具有一定的特異祀向殺傷活性。
[0006]因此，為了實現上述目的，第一方面，本發明提供了一種嵌合抗原受體，所述嵌合 抗原受體為肥RlScFv-CD8-CD137-CD3ζ，由肥RlScFv、CD8的較鏈區化inge區）和跨膜區、 CD137的胞內信號結構域和CD3ζ的胞內信號結構域串聯構成。
[0007] 第二方面，本發明提供了編碼上述嵌合抗原受體的基因。
[0008] 第Η方面，本發明提供了含有上述基因的重組表達載體。
[0009] 第四方面，本發明提供了一種工程化肥R1祀向性的ΝΚΤ細胞，所述ΝΚΤ細胞是上 述嵌合抗原受體肥RlScFv-CD8-CD137-CD3ζ修飾的ΝΚΤ細胞。
[0010] 第五方面，本發明提供了上述工程化肥R1祀向性的ΝΚΤ細胞在制備用于治療腫瘤 的制劑中的應用。
[0011] 在治療進展期肥R1陽性肺癌時，本發明的嵌合抗原受體 肥RlScFv-CD8-CD137-CD3ζ修飾的NKT細胞，即工程化肥R1祀向性的NKT細胞能夠特異 性結合肥R1抗原，明顯延長免疫細胞在患者體內的存活時間，增強免疫細胞祀向識別肺癌 細胞表面HER1抗原的能力，加強對肺癌細胞的特異殺傷活性，而且確實能夠有效避免采用 肥R1酪氨酸激酶抑制劑時引起的耐藥性。本發明的工程化肥R1祀向性的ΝΚΤ細胞為治療 進展期肥R1陽性肺癌提供了一種新的選擇，具有良好的產業應用前景。
[0012] 本發明的其它特征和優點將在隨后的【具體實施方式】部分予W詳細說明。
【附圖說明】
[0013]圖1為流式細胞術對分離培養的ΝΚΤ細胞表型分析的結果。
[0014] 圖2為本發明的慢病毒表達載體PWPT-CD8-CD137-CD3ζ的限制性內切酶Mlul/ Sail雙酶切片段的電泳鑒定圖。
[001引 圖3為本發明的慢病毒表達載體pWPT-HERlScFv-CD8-CD137-CD3ζ的限制性內切 酶BamHI/Sall雙酶切片段的電泳鑒定圖。
[0016] 圖4為本發明的慢病毒表達載體pWPT-HERlScFv-CD8-CD137-CD3ζ的結構示意 圖，其中，逆時針序列為正向基因片度，順時針為反向基因片段。
[0017] 圖5為流式細胞術檢測含有嵌合抗原受體肥RlScFv-CD8-CD137-CD3ζ的病毒濃 縮液對ΝΚΤ細胞的感染效率。
[0018] 圖6為流式細胞術檢測嵌合抗原受體肥RlScFv-CD8-CD137-CD3ζ修飾的ΝΚΤ細 胞（CARHER1-NKT細胞）表型鑒定的結果。
[0019] 圖7為本發明的CARHER1-NKT細胞對人肺癌細胞殺傷作用的細胞毒性分析圖。
[0020] 圖8為本發明的CAR肥R1-NKT細胞對進展期肥R1陽性肺癌患者治療過程中，患者 病灶部位肥R1陽性肺癌細胞數目的變化。
[002。 圖9為本發明的CAR肥R1-NKT細胞對進展期肥R1陽性肺癌患者治療過程中，患者 病灶部位影像圖變化。
【具體實施方式】
[0022] W下對本發明的【具體實施方式】進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的具體 實施方式僅用于說明和解釋本發明，并不用于限制本發明。
[0023] 本發明提供了 一種嵌合抗原受體，所述嵌合抗原受體為 肥RlScFv-CD8-CD137-CD3ζ，由肥RlScFv、CD8的較鏈區和跨膜區、CD137的胞內信號結構 域和〔03ζ的胞內信號結構域串聯構成。優選情況下，嵌合抗原受體的氨基酸序列如SEQ IDNO. 1 所示。
[0024] 本發明提供了編碼上述嵌合抗原受體的基因。優選情況下，編碼上述嵌合抗原受 體的基因的核巧酸序列如SEQIDNO. 2所示。
[0025] 本發明提供了含有上述基因的重組表達載體。優選情況下，重組表達載體為慢病 毒表達載體。對于慢病毒表達載體沒有特別的限定，只要能夠與輔助載體共轉染包裝細胞 如293T包裝細胞，獲得病毒濃縮液及嵌合抗原受體肥RlScFv-CD8-CD137-CD3ζ修飾的NTK 細胞即可，優選情況下，慢病毒表達載體為pWPT-HERlScFv-CD8-CD137-CD3ζ。
[0026] 對于慢病毒表達載體ρΚΡΤ-ΗΕΚ15οΡν-〔08-〔0137-〔03ζ的制備方法沒有特 別的限定，可W為本領域技術人員能夠想到的各種方法，優選情況下，慢病毒表達載體 pWPT-HERlScFv-CD8-CD137-CD3ζ的制備方法包括W下步驟：
[0027] (1)從ΝΚΤ細胞cDNA中分別擴增CD8的hinge區和跨膜區、CD137的胞 內信號結構域和〔03ζ的胞內信號結構域，并克隆至載體pWPT-GFP中，構建得到 PWPT-CD8-CD137-CD3ζ；
[002引 似合成編碼大鼠生長激素信號膚和肥RlScFv的核巧酸序 列，并克隆至PWPT-CD8-CD137-CD3 ζ中，經測序驗證后得到序列正確的pWPT-HERlScFv-CD8-CD137-CD3 ζ。
[002引步驟（1)中，對于從ΝΚΤ細胞cDNA中分別擴增CD8的hinge區和跨膜區、CD137的 胞內信號結構域和CD3ζ的胞內信號結構域的方法沒有特別的限定，可W為本領域常用的 各種方法，例如可W為RT-PCR法。其中，ΝΚΤ細胞可W通過分離人靜脈血中的單個核細胞， 然后進行培養獲得。
[0030] 具體地，得到PWPT-CD8-CD137-CD3ζ的方法可W包括；提取ΝΚΤ細胞的總RNA， 逆轉錄獲得ΝΚΤ細胞cDNA，W得到的ΝΚΤ細胞cDNA為模板，利用引物Ρ1(SEQIDNO. 11)和 P2(SEQIDNO. 12)進行PCR擴增獲得CD8基因的hinge區和跨膜區（SE