激活GLP-1受體和Amylin受體雙功能作用的融合蛋白制備及其用圖
【技術領域】
[0001]本發明設及基因工程領域，具體設及新型雙功能融合蛋白的制備及其用途。
【背景技術】
[0002]血糖的穩態受膜島素和體內多種激素嚴密調節，對維持機體的正常功能具有重要 作用。然而，由于膜島素分泌缺陷和/或膜島素作用障礙將導致W高血糖為特征的代謝性 疾病。持續高血糖與長期代謝素亂等可導致全身組織器官，特別是眼、腎、屯、血管及神經系 統的損害及其功能障礙和衰竭。其中體內天然存在的調節膜島素和血糖水平的激素有膜高 血糖素樣膚-1 (glucagon-likepeptide-l，GLP-l)和膜淀粉樣多膚（Amylin)。
[0003]GLP-1主要通過刺激膜島素分泌和抑制膜高血糖素分泌發揮調節血糖的作用，同 時，GLP-1也能抑制膜島0細胞調亡，促其再生；GLP-1也能減慢胃排空速度，并通過作用 下丘腦，抑制食欲。Amylin是一種由37個氨基酸殘基構成的多膚激素，與膜島素共分泌自 膜腺β細胞，主要生理功能為減緩胃排空和延遲葡萄糖吸收，還通過抑制膜高血糖素減少 肝糖的產生，減少食欲，輔助膜島素調節血糖水平。Amylin類似物"普蘭林膚"輔助膜島素 治療糖尿病的療效已得到證實；近年來，Amylin類似物的療效尤其對肥胖型糖尿病的療效 備受關注。GLP-1和Amylin在體內均能調節血糖水平，但二者在功能上有所不同，作用可 W互補。JamesL.Trevaskis任L0S0肥；October2013,Volume8,Issue10)等人W化學 合成的方式將二者融合，擬行使兩種激素的生理作用。動物實驗表明，融合膚優于兩種膚類 激素單獨作用的效果，在降低體重的效果尤為顯著。由于該融合膚分子仍然偏小，易于被體 內蛋白酶降解或腎小球濾過，導致體內半衰期短，因而限制了其臨床應用的價值。中國專利 "GLP-1類似物和amylin類似物的融合蛋白制備及其用途"（【申請號】201410357012.訝公 開了一種W基因工程技術將人IgGFc片段與GLP-1類似物和amylin類似物融合成一種長 效蛋白分子，然而，該融合蛋白所采用的GLP-1類似物的生物活性低于現有的GLP-1類似物 Dulaglutide(LY2189265)，后者為目前公認臨床治療糖尿病療效最好的長效制劑。
【發明內容】
[0004] 基于中國專利"GLP-1類似物和amylin類似物的融合蛋白制備及其用途"（申請 號：201410357012.訝中描述的融合蛋白GIA，本發明的目的是提供一系列效果更好的激活 GLP-1受體和Amylin受體雙功能作用的融合蛋白，該融合蛋白具有GLP-1和Amylin的雙重 生物活性，且具有長效功能，可實現協同降糖同時伴隨體重下降的作用。
[0005]本發明提供的雙融合蛋白由GLP-1類似物（G)、Amylin類似物（A)與人免疫球蛋 白Fc片段通過DNA重組技術或基因工程手段實現，并由W下通式表示：
[0006]雙功能融合蛋白GA1 :x-連接膚-X-連接膚-IgGFc片段-連接膚-Y-連接膚-Y;
[0007]雙功能融合蛋白GA2 :Υ-連接膚-Y-連接膚-IgGFc片段-連接膚-X-連接膚-X;
[0008]雙功能融合蛋白GA3 :X-連接膚-Y-連接膚-IgGFc片段-連接膚-X-連接膚-Y;
[0009] 雙功能融合蛋白GA4 :γ-連接膚-X-連接膚-IgGFc片段-連接膚-γ-連接膚-X;
[0010] 雙功能融合蛋白GA5 :Χ-連接膚-IgGFc片段-連接膚-Υ;
[00川雙功能融合蛋白GA6 :γ-連接膚-IgGFc片段-連接膚-X;
[0012] 雙功能融合蛋白GA7 :x-連接膚-Y-連接膚-IgGFc片段；
[001引其中，X為GLP-1類似物；連接膚為（GGGG巧η;Υ為Amylin類似物。
[0014] 本發明提供的雙功能融合蛋白，由GLP-1類似物（G)、Amylin類似物（A)與人免疫 球蛋白Fc片段連接形成融合蛋白，其具體序列如下：
[001引 GLP-1類似物的氨基酸如序列表中的SEQIDNO:1所述；
[0016]Amylin類似物的氨基酸如序列表中的SEQIDNO:3所述；
[0017]IgGlFc的氨基酸如序列表中的SEQIDNO :5所述；
[001引 IgG2 Fc的氨基酸如序列表中的SEQIDNO :7所述；
[0019]IgG3 Fc的氨基酸如序列表中的SEQIDNO :9所述；
[0020]IgG4 Fc的氨基酸如序列表中的SEQIDNO :11所述。
[0021]IgG2/4Fc的氨基酸如序列表中的沈QIDNO:13所述。
[0022] 雙功能融合蛋白GA1的氨基酸如序列表中的SEQIDNO: 15所述
[0023] 雙功能融合蛋白GA2的氨基酸如序列表中的SEQ ID NO : 17所述
[0024] 雙功能融合蛋白GA3的氨基酸如序列表中的SEQIDNO: 19所述 [00巧]雙功能融合蛋白GA4的氨基酸如序列表中的SEQIDNO:21所述
[0026] 雙功能融合蛋白GA5的氨基酸如序列表中的SEQIDNO:23所述
[0027] 雙功能融合蛋白GA6的氨基酸如序列表中的SEQIDNO:25所述 [002引雙功能融合蛋白GA7的氨基酸如序列表中的SEQIDNO:27所述
[0029] 編碼所述上述融合蛋白核巧酸序列如下：
[0030]GLP-1類似物的核巧酸如序列表中的SEQIDNO:2所述；
[0031]Amylin類似物的核巧酸如序列表中的SEQIDNO:4所述；
[003引 IgGlFc的核巧酸如序列表中的沈QIDNO :6所述；
[003引 IgG2 Fc的核巧酸如序列表中的沈QIDNO :8所述；
[0034] IgG3 Fc的核巧酸如序列表中的SEQIDNO :10所述；
[003引 IgG4 Fc的核巧酸如序列表中的沈QIDNO :12所述；
[0036]IgG2/4Fc的核巧酸如序列表中的沈QIDNO:14所述；
[0037] 雙功能融合蛋白GA1核巧酸如序列表中的SEQ ID NO : 16所述。
[0038] 雙功能融合蛋白GA2核巧酸如序列表中的SEQIDNO:18所述。
[0039] 雙功能融合蛋白GA3核巧酸如序列表中的SEQIDNO:20所述。
[0040] 雙功能融合蛋白GA4核巧酸如序列表中的SEQIDNO所述。
[0041] 雙功能融合蛋白GA5核巧酸如序列表中的SEQIDNO:24所述。
[0042] 雙功能融合蛋白GA6核巧酸如序列表中的SEQIDNO:26所述。
[0043] 雙功能融合蛋白GA7核巧酸如序列表中的SEQIDNO:28所述。
[0044]本發明同時提供了上述核酸序列的表達載體，其能在轉化的宿主細胞中復制表 達。
[0045] 本發明還提供了一種制備雙功能融合蛋白的方法，將上述表達載體引入合適的表 達系統，從而進行融合蛋白的表達。
[0046] 本發明雙功能融合蛋白的表達載體，可W是重組真核表達載體，優選哺乳動物細 胞表達載體；也可W是重組病毒表達載體，優選腺相關病毒或腺病毒載體。
[0047] 含有表達上述雙功能融合蛋白的宿主細胞，可W為(?0細胞及其亞系或293細胞 及其亞系，或經過基因工程改造的CH0細胞及其亞系或293細胞及其亞系。
【附圖說明】
[004引圖1GA融合蛋白對U2化/GLP-1R細胞cAMP生成的影響
[0049] 圖2GA融合蛋白對損傷的RIN-5F細胞修復的影響
[0050] 圖3GA融合蛋白對胎pG2細胞cAMP生成的影響
【具體實施方式】
[0051] 提供W下實施例對本發明作進一步闡釋。應當理解，運些實施例僅用于說明本發 明而非對本發明有任何限制。本領域技術人員在本說明書的啟示下對本發明實施中所作的 任何變動都將落在權利要求書的范圍內。
[0052] 實施例1融合蛋白的制備
[0053] 1、質粒構建
[0054] 1.1基因和引物合成
[00巧]表達序列通過下述合成的基因重組至表達載體。基因和引物由金唯智公司合 成，合成基因序列重組至質粒載體PUC19中，獲得包含目的基因的質粒分別為pUC-GAl、 PUC-GA2、PUC-GA3、PUC-GA4、PUC-GA5、PUC-GA6 和PUC-GA7 ;W下為合成基因片段序