發明領域

本發明涉及(ji)包含nmda受體(ti)拮抗劑的組合物，其用(yong)于治療戈謝(xie)病的神經(jing)病性(xing)形(xing)式。

發明背景

戈謝病

溶酶體(ti)(ti)貯(zhu)積(ji)病(lsd)涵蓋(gai)約(yue)50種不同(tong)的(de)遺傳疾病。它(ta)們由溶酶體(ti)(ti)酶或轉運蛋白(bai)的(de)缺陷引起，導致未(wei)降解代謝(xie)物的(de)溶酶體(ti)(ti)內(nei)積(ji)累。雖然lsd是個體(ti)(ti)罕見的(de)，但總(zong)體(ti)(ti)而言，它(ta)們在人(ren)群中具有約(yue)1/7000新生兒(er)的(de)非常(chang)高(gao)的(de)流行率(lv)(fuller等人(ren)，2006)。這個頻(pin)率(lv)與最常(chang)見的(de)遺傳疾病的(de)頻(pin)率(lv)相當(walker，2007；ratjen和doring，2003)。

在lsd中，戈謝病(gd)是(shi)最(zui)普(pu)遍(bian)的(de)(de)(de)(de)(de)，總體頻(pin)率為(wei)40000之(zhi)一(yi)，而(er)在阿什肯納茲猶太人(ren)中，多達500之(zhi)一(yi)受影響(fuller等人(ren)，2006)。gd是(shi)由編(bian)碼β-葡糖腦(nao)苷(gan)(gan)脂酶(mei)(也稱(cheng)為(wei)酸性β-葡糖苷(gan)(gan)酶(mei)、d-糖基(ji)-n-酰(xian)基(ji)鞘氨(an)醇葡糖水解(jie)酶(mei)，或(huo)gcase)的(de)(de)(de)(de)(de)gba1基(ji)因中的(de)(de)(de)(de)(de)突變(bian)引起(qi)的(de)(de)(de)(de)(de)，其是(shi)需要通過水解(jie)切割葡糖神經酰(xian)胺(glccer，也稱(cheng)為(wei)葡糖腦(nao)苷(gan)(gan)脂)的(de)(de)(de)(de)(de)β-糖苷(gan)(gan)鍵的(de)(de)(de)(de)(de)具(ju)有葡糖神經酰(xian)胺酶(mei)活性的(de)(de)(de)(de)(de)溶酶(mei)體酶(mei)，葡糖神經酰(xian)胺是(shi)糖脂代謝中的(de)(de)(de)(de)(de)中間(jian)體。因此，細胞積累大量的(de)(de)(de)(de)(de)glccer，并(bing)最(zui)終死(si)亡。

從臨床角度看，gd可以基(ji)于(yu)發病(bing)(bing)(bing)年(nian)齡(ling)(ling)(ling)和(he)(he)神(shen)(shen)經(jing)(jing)系(xi)統(tong)參與的(de)跡象分(fen)為三個亞(ya)型(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)。1型(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)的(de)主(zhu)要癥(zheng)(zheng)狀是脾和(he)(he)肝的(de)腫大、貧血、血小板減(jian)少(shao)和(he)(he)骨骼病(bing)(bing)(bing)變(bian)。2型(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)和(he)(he)3型(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)是gd的(de)神(shen)(shen)經(jing)(jing)病(bing)(bing)(bing)性(xing)(xing)形式(ngd)，根據神(shen)(shen)經(jing)(jing)系(xi)統(tong)癥(zheng)(zheng)狀發病(bing)(bing)(bing)時間和(he)(he)進展速(su)率進行分(fen)類。2型(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)，急(ji)性(xing)(xing)神(shen)(shen)經(jing)(jing)病(bing)(bing)(bing)性(xing)(xing)形式，通常(chang)指在(zai)6個月齡(ling)(ling)(ling)之前顯示(shi)神(shen)(shen)經(jing)(jing)系(xi)統(tong)異常(chang)并且(qie)在(zai)2-4歲年(nian)齡(ling)(ling)(ling)死亡(wang)的(de)兒童。在(zai)3型(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)中，即亞(ya)急(ji)性(xing)(xing)、慢性(xing)(xing)神(shen)(shen)經(jing)(jing)病(bing)(bing)(bing)性(xing)(xing)形式，患者(zhe)表(biao)現出與2型(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)中觀察到的(de)那些相(xiang)似(si)的(de)癥(zheng)(zheng)狀，但具有(you)較晚的(de)發病(bing)(bing)(bing)和(he)(he)嚴(yan)重(zhong)程度(cox，2010)。

戈謝病治療

1型患(huan)者可(ke)以用酶替代療(liao)法(ert)進行治(zhi)療(liao)。該疾(ji)病最常見(jian)的(de)形式gd1型的(de)治(zhi)療(liao)和(he)藥物可(ke)能(neng)根據(ju)每位患(huan)者的(de)疾(ji)病嚴重程(cheng)度(du)和(he)由醫生確定的(de)治(zhi)療(liao)過程(cheng)而(er)變化。

有三種可用于治療gd的ert和一種口服藥物，其可以被18歲以上和/或具有gd的輕度形式的那些患者服用。在1991年，genzyme公司與nih合作開發了第一個獲fda批準的gd靶向ert。隨著1994年引入人β-葡糖腦苷脂酶的冷凍干燥類似物(商品名稱)及其即用型制劑(伊米苷酶(imiglucerase))，臨床醫生已經能夠自己解決疾病過程本身，并因此緩解和甚至逆轉1型gd的許多影響。療法不是gd的治愈；也就是說，它不能糾正潛在的遺傳缺陷。為了繼續從治療中受益，有癥狀的患者在其剩下的生命中必須接受靜脈輸注。最近對和(he)(he)伊(yi)米(mi)苷酶(mei)在治療gd中的歷(li)史和(he)(he)現有(you)認識(deegan和(he)(he)cox，2012)進行了綜述。

用于注射的taliglucerasealfa(商品名elelyso^tm)是一種源自植物的水解溶酶體葡糖腦苷脂特異性酶，被指示用于確診為1型gd的成年人的長期ert。elelyso^tm于(yu)2012年5月1日被(bei)美國食品(pin)和藥物管(guan)理局(fda)批(pi)準，并且是第(di)一種(zhong)被(bei)指(zhi)示用于(yu)治(zhi)療(liao)1型gd的基于(yu)植物細胞的fda批(pi)準的ert。最(zui)近(jin)綜述了taliglucerasealfa在(zai)治(zhi)療(liao)gd患者中的益處(hollak，2012)。

velaglucerasealfa(商品名)是水解溶酶體(ti)葡(pu)糖腦苷(gan)脂特異性酶，其被(bei)(bei)指示用(yong)于患有(you)1型(xing)gd的(de)(de)(de)兒(er)科和(he)(he)成(cheng)年患者的(de)(de)(de)長期ert。velaglucerasealfa衍(yan)生自人細胞系，并且被(bei)(bei)設計為具(ju)有(you)與天(tian)然存在(zai)(zai)的(de)(de)(de)人β-葡(pu)糖腦苷(gan)脂酶蛋白類似的(de)(de)(de)氨基(ji)酸序列(lie)。2010年2月26日被(bei)(bei)fda批準使用(yong)。最近發表了(le)在(zai)(zai)gd中使用(yong)velaglucerasealfa的(de)(de)(de)ert的(de)(de)(de)一項(xiang)隨機、雙盲、多國、第三期研(yan)究的(de)(de)(de)結果(guo)(gonzalez等人，2013)。此研(yan)究中velaglucerasealfa的(de)(de)(de)安全(quan)性和(he)(he)功效結果(guo)支(zhi)持了(le)在(zai)(zai)美(mei)國和(he)(he)歐洲(zhou)對velaglucerasealfa的(de)(de)(de)批準，和(he)(he)用(yong)于1型(xing)gd患者的(de)(de)(de)有(you)價值的(de)(de)(de)治療方案的(de)(de)(de)出現。

除了上述ert藥物之外，美格魯特(ogt918，n-丁基-脫氧野尻霉素，)是用于患有輕度至中度1型gd的成人口服的處方底物減少療法(srt)藥物。僅用于不能用ert治療的患者。通(tong)過(guo)減少身(shen)體產生(sheng)的(de)(de)(de)(de)鞘糖(tang)脂(zhi)(gsl)的(de)(de)(de)(de)量，來減少全身(shen)的(de)(de)(de)(de)gsl的(de)(de)(de)(de)有(you)害積聚。用于1型(xing)gd的(de)(de)(de)(de)美(mei)格(ge)魯特(te)的(de)(de)(de)(de)回顧性分析已經(jing)發現，聯合(he)療法可(ke)以(yi)(yi)為gd患者提(ti)(ti)供更好的(de)(de)(de)(de)疾病控制(zhi)(通(tong)過(guo)使(shi)用多于一種(zhong)的(de)(de)(de)(de)作用機制(zhi)來抵抗葡糖(tang)神經(jing)酰胺在細胞中(zhong)的(de)(de)(de)(de)積累)，可(ke)以(yi)(yi)通(tong)過(guo)使(shi)用減少劑量的(de)(de)(de)(de)ert和美(mei)格(ge)魯特(te)兩者而是成(cheng)本有(you)效的(de)(de)(de)(de)，并且可(ke)以(yi)(yi)提(ti)(ti)供可(ke)接受的(de)(de)(de)(de)生(sheng)活質量(machaczka等人，2012)。

全基因組關聯研究

基(ji)因型(xing)-表(biao)型(xing)相關性對于(yu)gd來說相當差，因此(ci)預測(ce)患者將要發展的(de)gd的(de)亞型(xing)是一個主要挑戰(goker-alpan等(deng)人(ren)(ren)，2005)；例如，具有相同(tong)基(ji)因型(xing)的(de)兄弟姐妹可以呈現出廣泛不同(tong)的(de)表(biao)型(xing)(eyal等(deng)人(ren)(ren)1991，amato等(deng)人(ren)(ren)2004)。因此(ci)，已提出修(xiu)飾基(ji)因的(de)作用作為表(biao)型(xing)變異的(de)基(ji)礎(chu)(goker-alpan等(deng)人(ren)(ren)，2005)。

修飾(shi)基因(yin)可以(yi)通過至少兩(liang)個獨(du)立的(de)策略來鑒定：

i)檢索(suo)參與特定(ding)癥(zheng)狀發展的(de)基因的(de)變化。使用(yong)這種策略，scarb2被鑒定(ding)為(wei)一對具有不一致癲癇表型的(de)兄弟姐妹的(de)gd的(de)修(xiu)飾基因(velayati等人，2011)；和

ii)全(quan)基(ji)因(yin)組(zu)關(guan)聯(lian)(lian)研(yan)究。全(quan)基(ji)因(yin)組(zu)關(guan)聯(lian)(lian)研(yan)究(gwa研(yan)究或gwas)也被(bei)稱(cheng)為(wei)全(quan)部基(ji)因(yin)組(zu)關(guan)聯(lian)(lian)研(yan)究(wga研(yan)究或wgas)，是對不(bu)同(tong)個體(ti)中許多常(chang)見遺傳變(bian)(bian)體(ti)的(de)檢查(cha)，以(yi)了解任(ren)何變(bian)(bian)體(ti)是否與性(xing)狀相關(guan)。gwas通(tong)常(chang)關(guan)注于單核苷酸多態性(xing)(snp)與性(xing)狀如(ru)(ru)主要疾(ji)(ji)病(bing)(bing)之間的(de)關(guan)聯(lian)(lian)。gwas通(tong)常(chang)比較(jiao)兩組(zu)參與者的(de)dna：患(huan)有疾(ji)(ji)病(bing)(bing)的(de)人(ren)(病(bing)(bing)例(li))和沒有疾(ji)(ji)病(bing)(bing)的(de)類似人(ren)群(對照)。每個人(ren)給(gei)出一(yi)個dna樣品(pin)，從中讀取數(shu)百萬個遺傳變(bian)(bian)體(ti)。如(ru)(ru)果一(yi)種類型(xing)的(de)變(bian)(bian)體(ti)(一(yi)個等位基(ji)因(yin))在患(huan)有該(gai)疾(ji)(ji)病(bing)(bing)的(de)人(ren)中更頻繁，則認為(wei)該(gai)snp與該(gai)疾(ji)(ji)病(bing)(bing)“相關(guan)聯(lian)(lian)”。然后，將(jiang)相關(guan)聯(lian)(lian)的(de)snp視為(wei)標記影響(xiang)疾(ji)(ji)病(bing)(bing)風險的(de)人(ren)基(ji)因(yin)組(zu)區域。

gwas方法最(zui)近用于研究(jiu)患有(you)1型gd(gd1)的阿什肯納茲猶猶太gd患者，其中n370s突變是純合的。該(gai)研究(jiu)揭示了(le)cln8基因作(zuo)為導致極端表型變異的遺傳修飾物的候(hou)選物(zhang，2012)。

nmda受體

nmda受(shou)體(ti)(ti)(ti)是兩(liang)個(ge)(ge)(ge)必要的(de)(de)(de)(de)glun1(也(ye)(ye)稱(cheng)為nr1)和(he)(he)兩(liang)個(ge)(ge)(ge)區域(yu)局部化的(de)(de)(de)(de)glun2亞(ya)(ya)基(ji)(ji)(ji)(ji)(也(ye)(ye)稱(cheng)為nr2)之間(jian)的(de)(de)(de)(de)異(yi)四(si)聚體(ti)(ti)(ti)。具有(you)不(bu)同腦(nao)(nao)分(fen)布和(he)(he)功(gong)能(neng)特性(xing)的(de)(de)(de)(de)多個(ge)(ge)(ge)受(shou)體(ti)(ti)(ti)同種型(xing)通過(guo)(guo)nr1轉錄物的(de)(de)(de)(de)選擇性(xing)剪接和(he)(he)nr2亞(ya)(ya)基(ji)(ji)(ji)(ji)的(de)(de)(de)(de)差異(yi)表達產生(sheng)。雖然在(zai)無脊(ji)椎生(sheng)物內發(fa)現(xian)了單個(ge)(ge)(ge)的(de)(de)(de)(de)nr2亞(ya)(ya)基(ji)(ji)(ji)(ji)，nr2亞(ya)(ya)基(ji)(ji)(ji)(ji)的(de)(de)(de)(de)四(si)個(ge)(ge)(ge)不(bu)同同種型(xing)在(zai)脊(ji)椎動(dong)物中表達，并被(bei)(bei)命名為nr2a至d(分(fen)別由(you)基(ji)(ji)(ji)(ji)因grin2a、grin2b、grin2c和(he)(he)grin2d編(bian)碼(ma))。而(er)(er)nr2b在(zai)早期出生(sheng)后的(de)(de)(de)(de)腦(nao)(nao)中占主(zhu)導地(di)位，nr2a亞(ya)(ya)基(ji)(ji)(ji)(ji)的(de)(de)(de)(de)數目增加，并最終(zhong)nr2a亞(ya)(ya)基(ji)(ji)(ji)(ji)的(de)(de)(de)(de)數目超過(guo)(guo)nr2b。這被(bei)(bei)稱(cheng)為nr2b-nr2a發(fa)育開(kai)關(guan)，并且由(you)于(yu)每個(ge)(ge)(ge)nr2亞(ya)(ya)基(ji)(ji)(ji)(ji)對受(shou)體(ti)(ti)(ti)的(de)(de)(de)(de)動(dong)力學不(bu)同而(er)(er)顯著(liu等人，2004)。nr2b蛋白(bai)有(you)幾個(ge)(ge)(ge)同義詞，如(ru)nmdar2b；谷氨(an)酸(suan)(suan)(suan)[nmda]受(shou)體(ti)(ti)(ti)亞(ya)(ya)基(ji)(ji)(ji)(ji)ε-2；谷氨(an)酸(suan)(suan)(suan)受(shou)體(ti)(ti)(ti)亞(ya)(ya)基(ji)(ji)(ji)(ji)ε-2；谷氨(an)酸(suan)(suan)(suan)受(shou)體(ti)(ti)(ti)，離子型(xing)，n-甲基(ji)(ji)(ji)(ji)-d-天冬(dong)氨(an)酸(suan)(suan)(suan)2b；grin2b；hnr3；mgc142178；mgc142180；n-甲基(ji)(ji)(ji)(ji)-d-天冬(dong)氨(an)酸(suan)(suan)(suan)受(shou)體(ti)(ti)(ti)亞(ya)(ya)型(xing)2b；n-甲基(ji)(ji)(ji)(ji)-d-天冬(dong)氨(an)酸(suan)(suan)(suan)受(shou)體(ti)(ti)(ti)亞(ya)(ya)基(ji)(ji)(ji)(ji)3；nmde2或nr3。該蛋白(bai)包含1484個(ge)(ge)(ge)氨(an)基(ji)(ji)(ji)(ji)酸(suan)(suan)(suan)，其中前26個(ge)(ge)(ge)氨(an)基(ji)(ji)(ji)(ji)酸(suan)(suan)(suan)被(bei)(bei)認為起潛(qian)在(zai)的(de)(de)(de)(de)信號肽的(de)(de)(de)(de)作用。

谷氨酸和nmda受(shou)體

谷氨(an)(an)酸是大(da)腦(nao)中主(zhu)要(yao)(yao)的(de)(de)興奮(fen)性(xing)氨(an)(an)基(ji)酸神(shen)經(jing)遞質(nicholls等(deng)(deng)人，2012)。在生(sheng)理條件(jian)下(xia)，谷氨(an)(an)酸通過活化(hua)谷氨(an)(an)酸受體(ti)(ti)(ti)(glur)(traynelis等(deng)(deng)人，2010)在腦(nao)交(jiao)流(liu)和(he)(he)可塑性(xing)中起著重要(yao)(yao)作用(bliss和(he)(he)collingridge1993；cooke和(he)(he)bliss2006)。神(shen)經(jing)損傷(shang)過程中glur的(de)(de)過度活化(hua)，主(zhu)要(yao)(yao)通過稱為(wei)nmda受體(ti)(ti)(ti)的(de)(de)glur亞(ya)型產(chan)生(sheng)過量的(de)(de)向細(xi)(xi)胞(bao)內的(de)(de)鈣流(liu)入，導(dao)致神(shen)經(jing)元損傷(shang)和(he)(he)最終細(xi)(xi)胞(bao)死亡，其(qi)稱為(wei)興奮(fen)性(xing)毒(du)性(xing)的(de)(de)過程(mehta等(deng)(deng)人，2013)。nmda受體(ti)(ti)(ti)根據其(qi)在神(shen)經(jing)元中的(de)(de)分布可以分為(wei)2組：突觸(chu)(chu)和(he)(he)突觸(chu)(chu)外。突觸(chu)(chu)受體(ti)(ti)(ti)促進存(cun)活信號級聯，而突觸(chu)(chu)外受體(ti)(ti)(ti)介導(dao)興奮(fen)性(xing)毒(du)性(xing)的(de)(de)毒(du)性(xing)作用(parsons和(he)(he)raymond，2014)。由于(yu)過量的(de)(de)谷氨(an)(an)酸釋(shi)放導(dao)致的(de)(de)興奮(fen)性(xing)毒(du)性(xing)發生(sheng)在幾種神(shen)經(jing)性(xing)病(bing)癥(zheng)中，如缺血性(xing)卒中(kostandy，2005)、自閉癥(zheng)(essa等(deng)(deng)人，2013)、肌萎縮側索(suo)硬化(hua)(costa等(deng)(deng)人，2010)、帕金森病(bing)(caudle和(he)(he)zhang，2009)和(he)(he)阿爾茨海(hai)默病(bing)(kostandy，2005)。

美金(jin)剛和nmda受(shou)體(ti)

美金(jin)剛是通過阻斷nmda受(shou)體(ti)作(zuo)(zuo)用(yong)(yong)于(yu)(yu)谷氨酸能系統的(de)(de)(de)(de)(de)新一(yi)類(lei)阿爾茨海(hai)默病(bing)藥物中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)第(di)一(yi)個。它是由elililly公司于(yu)(yu)1968年首次合成(cheng)的(de)(de)(de)(de)(de)。已顯示美金(jin)剛在(zai)中(zhong)度(du)至(zhi)(zhi)重(zhong)度(du)阿爾茨海(hai)默病(bing)和路易(yi)體(ti)癡(chi)呆中(zhong)具(ju)有適度(du)的(de)(de)(de)(de)(de)作(zuo)(zuo)用(yong)(yong)，并被批準(zhun)這些用(yong)(yong)于(yu)(yu)人。美國專利號5,061,703描(miao)述了美金(jin)剛(和其它金(jin)剛烷衍生物)在(zai)預(yu)防腦缺(que)血(xue)性損害中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)用(yong)(yong)途。美國專利號us8,168,209和us8,329,752描(miao)述了美金(jin)剛的(de)(de)(de)(de)(de)延時釋(shi)放口(kou)服劑型。2003年，美國食品和藥物管理局(fda)批準(zhun)美金(jin)剛(以(yi)商品名(ming)namenda)用(yong)(yong)于(yu)(yu)治療(liao)中(zhong)度(du)至(zhi)(zhi)重(zhong)度(du)阿爾茨海(hai)默型癡(chi)呆。

總之(zhi)，ert目(mu)(mu)前靜脈內施用(yong)于gd1型(xing)和3型(xing)的(de)非神(shen)經性表現(xian)(xian)，并(bing)且目(mu)(mu)前還沒(mei)有治療方法可用(yong)于2型(xing)，其為最致命的(de)疾病形式，在嬰(ying)兒期呈現(xian)(xian)，并(bing)在首兩年至三年內造成死亡。

因此，在治(zhi)療(liao)模式的(de)(de)領域中仍然存在未(wei)能滿足(zu)的(de)(de)醫(yi)療(liao)需求，所述治(zhi)療(liao)將延遲、改善或減少在gd的(de)(de)神經(jing)病性(xing)(xing)形式中顯現(xian)其自身的(de)(de)神經(jing)性(xing)(xing)癥狀。

技術實現要素：

本發(fa)明提供用于治療戈(ge)謝病(bing)(bing)(gd)的(de)(de)神(shen)經(jing)病(bing)(bing)性(xing)(xing)(xing)形式(shi)的(de)(de)組合物和方法，其包含(han)作為活(huo)性(xing)(xing)(xing)成分的(de)(de)至(zhi)少一種類型的(de)(de)nmda受體拮(jie)(jie)抗(kang)劑(ji)。本發(fa)明提供了有(you)效地(di)(至(zhi)少部(bu)分地(di))改善疾病(bing)(bing)的(de)(de)神(shen)經(jing)性(xing)(xing)(xing)發(fa)病(bing)(bing)和/或(huo)(huo)進(jin)展(zhan)的(de)(de)組合物和方法。特(te)(te)(te)別地(di)，本發(fa)明的(de)(de)組合物減少或(huo)(huo)預防該疾病(bing)(bing)的(de)(de)神(shen)經(jing)性(xing)(xing)(xing)癥狀。根據(ju)(ju)一些(xie)實(shi)施方案(an)(an)，nmda拮(jie)(jie)抗(kang)劑(ji)是(shi)谷氨酸能神(shen)經(jing)傳遞的(de)(de)特(te)(te)(te)異性(xing)(xing)(xing)抑制劑(ji)。根據(ju)(ju)一些(xie)實(shi)施方案(an)(an)，nmda拮(jie)(jie)抗(kang)劑(ji)可以(yi)是(shi)作用于其它神(shen)經(jing)傳遞途徑的(de)(de)較不(bu)具特(te)(te)(te)異性(xing)(xing)(xing)的(de)(de)拮(jie)(jie)抗(kang)劑(ji)。根據(ju)(ju)一些(xie)實(shi)施方案(an)(an)，nmda拮(jie)(jie)抗(kang)劑(ji)可具有(you)另外的(de)(de)活(huo)性(xing)(xing)(xing)，例如5-羥色胺能、膽(dan)堿能或(huo)(huo)多(duo)巴胺能拮(jie)(jie)抗(kang)劑(ji)或(huo)(huo)激動劑(ji)活(huo)性(xing)(xing)(xing)。

本發明至(zhi)少(shao)部分地基(ji)于近交小(xiao)鼠中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)gd模型，其首次公開了編(bian)碼(ma)nmda谷氨酸(suan)受體的(de)(de)(de)(de)(de)亞基(ji)b的(de)(de)(de)(de)(de)基(ji)因(yin)grin2b的(de)(de)(de)(de)(de)多態性與gd進展相關聯。為了發現涉(she)及gd進展的(de)(de)(de)(de)(de)新(xin)基(ji)因(yin)，通過注射環(huan)己烯四醇b環(huan)氧化(hua)物(cbe)，其為一(yi)種不可逆的(de)(de)(de)(de)(de)葡糖(tang)腦(nao)苷脂酶(gba)抑制劑，在近交小(xiao)鼠品系中(zhong)(zhong)誘導gd，并進行全基(ji)因(yin)組關聯研(yan)究(gwas)。gwas分析鑒定了編(bian)碼(ma)nmda谷氨酸(suan)受體的(de)(de)(de)(de)(de)亞基(ji)b的(de)(de)(de)(de)(de)基(ji)因(yin)grin2b作為gd進展的(de)(de)(de)(de)(de)潛在修飾(shi)基(ji)因(yin)。

因此，在一個(ge)方(fang)面(mian)，本發明提供包含至少一種nmda受(shou)體(ti)拮抗劑或(huo)其藥(yao)學上可接受(shou)的(de)鹽、水合(he)物(wu)或(huo)藥(yao)學上活性的(de)對映異構體(ti)的(de)藥(yao)物(wu)組合(he)物(wu)，用于(yu)治療戈謝病(gd)的(de)神經病性形式(shi)。

根(gen)據本發明的一些實施方案的一個方面，提供(gong)了用于治療(liao)戈謝病(bing)(gd)的神經病(bing)性形(xing)式(shi)的nmda受(shou)體(ti)拮抗劑。

在另一(yi)方面，本發明(ming)進(jin)一(yi)步提(ti)供了(le)治療(liao)在有其需要的(de)(de)(de)患者中的(de)(de)(de)gd的(de)(de)(de)神(shen)經病(bing)性形(xing)式的(de)(de)(de)方法，其包(bao)(bao)括(kuo)向患者施用包(bao)(bao)含至少一(yi)種nmda受體拮抗劑或(huo)其藥(yao)學(xue)上(shang)(shang)可(ke)接受的(de)(de)(de)鹽、水合物或(huo)藥(yao)學(xue)上(shang)(shang)活性的(de)(de)(de)對(dui)映異構體的(de)(de)(de)藥(yao)物組合物的(de)(de)(de)步驟，從(cong)而治療(liao)gd的(de)(de)(de)神(shen)經病(bing)性形(xing)式。

根據本(ben)發明(ming)的一(yi)些實施方案的一(yi)個方面，提供(gong)了治(zhi)療(liao)在有其需要的患者中(zhong)的戈謝病(gd)的神(shen)經(jing)病性形式(shi)的方法(fa)，包括向患者施用治(zhi)療(liao)有效量的nmda受體拮抗劑(ji)，從而治(zhi)療(liao)gd的神(shen)經(jing)病性形式(shi)。

在(zai)一(yi)(yi)方面(mian)，本(ben)發明還提供(gong)至少一(yi)(yi)種nmda受(shou)體(ti)拮抗劑或其藥學上可接(jie)受(shou)的(de)鹽、水(shui)合物或藥學上活性(xing)(xing)的(de)對映(ying)異構體(ti)在(zai)制備(bei)用(yong)(yong)于治療gd的(de)神經病性(xing)(xing)形(xing)式的(de)藥物中的(de)用(yong)(yong)途。

根據本發明的(de)一(yi)些實施方案的(de)一(yi)個方面(mian)，提供(gong)了(le)至少一(yi)種nmda受體拮抗劑在制備(bei)用于治療戈謝病(gd)的(de)神經病性形式的(de)藥(yao)物中的(de)用途。

在另一方面，本發明(ming)進一步提供了一種試劑盒(he)，其包含(han)至少一個包含(han)藥(yao)物(wu)(wu)組合物(wu)(wu)的(de)容器，所(suo)述藥(yao)物(wu)(wu)組合物(wu)(wu)包含(han)至少一種用于(yu)治療gd的(de)神經(jing)病性形式的(de)nmda受(shou)體拮抗劑或其藥(yao)學(xue)上可接受(shou)的(de)鹽、水(shui)合物(wu)(wu)或藥(yao)學(xue)上活性的(de)對映異構(gou)體。

根據(ju)本發明的一些實施(shi)方案，nmda受體(ti)拮抗劑(ji)或(huo)所述(shu)用途包括選自酶替代(dai)治療劑(ji)、底(di)物減少治療劑(ji)和藥理學分子伴侶治療劑(ji)的藥劑(ji)。

根據本(ben)發明的一些實(shi)施(shi)方案，該方法包(bao)括向患者施(shi)用治(zhi)療有效(xiao)量的藥劑(ji)(ji)(ji)，所(suo)述藥劑(ji)(ji)(ji)選自酶替代治(zhi)療劑(ji)(ji)(ji)、底物減(jian)少(shao)治(zhi)療劑(ji)(ji)(ji)和藥理(li)學分子伴(ban)侶治(zhi)療劑(ji)(ji)(ji)。

根據(ju)本發明的(de)一(yi)(yi)些實(shi)施方案的(de)一(yi)(yi)個方面，提供了經鑒定用于治療(liao)(liao)戈謝病(gd)的(de)神經病性形(xing)式的(de)試劑(ji)(ji)盒(he)，其包(bao)含包(bao)裝(zhuang)nmda受體(ti)拮抗(kang)劑(ji)(ji)和選自酶替代治療(liao)(liao)劑(ji)(ji)、底物減(jian)少治療(liao)(liao)劑(ji)(ji)和藥(yao)理學分子伴侶治療(liao)(liao)劑(ji)(ji)的(de)藥(yao)劑(ji)(ji)的(de)包(bao)裝(zhuang)材料。

根(gen)據本發(fa)明(ming)的一些實施方案，nmda受體是(shi)突觸外nmda受體。

根據本(ben)發明的一些實施(shi)方(fang)案，nmda受(shou)體(ti)包含(han)nr2b亞基。

在某(mou)些(xie)實(shi)施方案中(zhong)，nmda受體拮抗劑優先結合突觸外nmda受體。在某(mou)些(xie)實(shi)施方案中(zhong)，突觸外nmda受體包含nr2b亞基。

在某(mou)(mou)些實施(shi)方案中(zhong)(zhong)，相對于(yu)相應(ying)的(de)(de)健康神經元(yuan)細(xi)胞，nmda受(shou)體(ti)拮抗劑與具有β-葡糖腦苷脂酶活性缺乏的(de)(de)神經元(yuan)細(xi)胞的(de)(de)nmda受(shou)體(ti)結合。在某(mou)(mou)些實施(shi)方案中(zhong)(zhong)，所(suo)述細(xi)胞包含gba1基因中(zhong)(zhong)的(de)(de)突(tu)變。在某(mou)(mou)些實施(shi)方案中(zhong)(zhong)，所(suo)述細(xi)胞表達突(tu)變的(de)(de)β-葡糖腦苷脂酶。在某(mou)(mou)些實施(shi)方案中(zhong)(zhong)，所(suo)述神經元(yuan)細(xi)胞是中(zhong)(zhong)樞(shu)神經系統(tong)(cns)神經元(yuan)。

在某些實施方案中，nmda受體拮抗劑(ji)選(xuan)自美金(jin)(jin)剛(gang)(memantine)、硝基(ji)美金(jin)(jin)剛(gang)(nitromemantine)、neramexane、氯(lv)胺(an)酮(tong)(ketamine)、金(jin)(jin)剛(gang)烷胺(an)(amantadine)、右美沙芬(dextromethorphan)、l-687,384、阿米替林(amitriptyline)、1-芐(xia)基(ji)-6’-甲氧基(ji)-6’,7’-二氫螺(luo)[哌啶-4,4’-噻吩并[3.2-c]吡喃]、艾芬地爾(ifenprodil)、奧芬那君(orphenadrine)、犬(quan)尿喹啉酸(suan)(kynurenicacid)、非(fei)氨(an)酯(zhi)(zhi)(felbamate)、d(-)-ap-5、(±)-cpp、eaa-090、tcn-201、ap-5、azd6765、sdz220-581、(±)-去(qu)甲氯(lv)胺(an)酮(tong)、依利(li)羅(luo)地(eliprodil)、右啡烷(dextrorphan)、5,7-二氯(lv)犬(quan)尿喹啉酸(suan)一水合(he)(he)物、[glu3,4,7,10,14]-芋螺(luo)抑制肽g([glu3,4,7,10,14]-conantoking)、d-ap-7、md-ada、ap-7、ro8-4304、精胺(an)(spermine)、ro25-6981、dcqx、曲索羅(luo)地(traxoprodil)、mdl105,519、法那帕奈(fanapanel)、metaphit、ro25-6981、naag、5-氟吲(yin)哚-2-羧酸(suan)、(s)-(-)-4-氧代(dai)-2-氮雜(za)環丁烷羧酸(suan)、(s)-(-)-4-氧代(dai)-2-氮雜(za)環丁烷羧酸(suan)芐(xia)酯(zhi)(zhi)和(he)(±)-α-氨(an)基(ji)-3-甲酯(zhi)(zhi)基(ji)-5-甲基(ji)異噁(wu)唑-4-丙酸(suan)，及其藥學上可接受的(de)鹽、水合(he)(he)物和(he)藥學上活性的(de)對映異構體。每個可能性代(dai)表本發(fa)明的(de)單(dan)獨(du)實施方案。

在某些實(shi)施方案中，所(suo)述nmda受體拮抗劑選自(zi)美(mei)金剛、硝基(ji)美(mei)金剛、neramexane、氯胺酮、金剛烷胺、右美(mei)沙芬、l-687,384、阿(a)米替林、1-芐基(ji)-6’-甲氧(yang)基(ji)-6’,7’-二氫(qing)螺[哌啶-4,4’-噻(sai)吩并(bing)[3.2-c]吡喃(nan)]、依利羅地、艾芬地爾(er)、奧芬那(nei)君、犬尿喹啉酸、非(fei)氨酯及其藥(yao)學上可接受的鹽(yan)、水合物和藥(yao)學上活性的對映異構體。每個可能(neng)性代表本發明的單(dan)獨(du)實(shi)施方案。

在某些實施方案中，所述nmda受(shou)體拮抗劑(ji)選自美金剛(gang)、硝基美金剛(gang)、neramexane及其藥學上(shang)(shang)可接受(shou)的(de)鹽、水(shui)合物和藥學上(shang)(shang)活性(xing)的(de)對(dui)映異構體。每個可能性(xing)代表本(ben)發明的(de)單獨實施方案。

根據本(ben)發明的(de)(de)(de)一(yi)些實施方案，所(suo)述(shu)nmda受體拮抗劑選(xuan)自美金剛、依(yi)利羅(luo)地(di)和(he)艾(ai)芬地(di)爾或其藥學上可(ke)接(jie)受的(de)(de)(de)鹽、水合物或藥學上活性的(de)(de)(de)對(dui)映異構體。

在某些實施方案中，所述nmda受體拮抗劑是美(mei)金剛(gang)(3,5-二甲基-1-金剛(gang)烷胺鹽酸鹽)或其藥學(xue)(xue)上(shang)可接受的(de)鹽、水(shui)合物或藥學(xue)(xue)上(shang)活(huo)性的(de)對映異構體。

在某些實(shi)施(shi)方案中，所(suo)述nmda受體(ti)拮(jie)抗(kang)(kang)(kang)劑(ji)也(ye)具有5-羥色胺能活性。在某些實(shi)施(shi)方案中，所(suo)述nmda受體(ti)拮(jie)抗(kang)(kang)(kang)劑(ji)也(ye)是5-ht3受體(ti)拮(jie)抗(kang)(kang)(kang)劑(ji)。

在某些實施(shi)方案中(zhong)，所(suo)(suo)述nmda受(shou)體拮抗(kang)劑也(ye)具有膽(dan)堿(jian)能活(huo)性。在某些實施(shi)方案中(zhong)，所(suo)(suo)述nmda受(shou)體拮抗(kang)劑也(ye)是煙堿(jian)樣乙酰(xian)膽(dan)堿(jian)受(shou)體(nachr)拮抗(kang)劑。

在(zai)某些實施方(fang)案中，具有nachr拮(jie)抗劑活性(xing)的(de)nmda受(shou)體拮(jie)抗劑選自(zi)金剛烷胺和右美沙芬及其藥(yao)(yao)學上(shang)可接受(shou)的(de)鹽(yan)、水合(he)物和藥(yao)(yao)學上(shang)活性(xing)的(de)對映(ying)異(yi)構體。每個可能性(xing)代表本發明的(de)單獨實施方(fang)案。

在(zai)某些(xie)實施方(fang)案(an)中(zhong)，所述nmda受(shou)體(ti)拮抗劑(ji)也(ye)具有多巴(ba)胺(an)能活性。在(zai)某些(xie)實施方(fang)案(an)中(zhong)，所述nmda受(shou)體(ti)拮抗劑(ji)也(ye)是多巴(ba)胺(an)d2受(shou)體(ti)激動劑(ji)。

在(zai)某些實(shi)施方案(an)中，所述(shu)nmda受(shou)體(ti)拮(jie)抗劑也(ye)具(ju)有神經保護活性。在(zai)某些實(shi)施方案(an)中，所述(shu)nmda受(shou)體(ti)拮(jie)抗劑也(ye)是(shi)σ-1受(shou)體(ti)激動(dong)劑。

在某些實施方案中，具(ju)有σ-1受(shou)體(ti)激動劑活(huo)性(xing)(xing)的nmda受(shou)體(ti)拮(jie)抗劑選自l-687,384、阿(a)米替林(lin)和1-芐(xia)基(ji)-6’-甲氧(yang)基(ji)-6’,7’-二氫螺[哌啶-4,4’-噻吩并[3.2-c]吡喃]及其藥(yao)(yao)學上(shang)可(ke)接(jie)受(shou)的鹽、水合物和藥(yao)(yao)學上(shang)活(huo)性(xing)(xing)的對映(ying)異構(gou)體(ti)。每個可(ke)能性(xing)(xing)代表本發(fa)明(ming)的單獨實施方案。

在某些實(shi)施方案中，所述nmda受體拮抗劑具有神(shen)經保護(hu)活性(xing)。

在某些(xie)實施方案中，上述(shu)藥物組合物用于治療(liao)亞(ya)急(ji)性、慢性神經(jing)病性gd3型(xing)。

根據本發明的一(yi)些(xie)實施方(fang)案，所(suo)述gd是亞急性、慢(man)性神(shen)經病性gd3型。

在(zai)某些(xie)實(shi)施例中，所述gd3型(xing)是(shi)gd3a型(xing)。

在某些實施例中，所述(shu)gd3型(xing)(xing)是gd3b型(xing)(xing)。

根據(ju)本發明的一些實施方案，將所(suo)述nmda受(shou)體拮抗劑配制成用于口服遞送。

在某(mou)些(xie)實施(shi)方案中，將(jiang)上(shang)述藥(yao)物(wu)組合物(wu)配(pei)制(zhi)(zhi)成用(yong)于口服遞送(song)。在某(mou)些(xie)實施(shi)方案中，用(yong)于口服遞送(song)的(de)組合物(wu)被配(pei)制(zhi)(zhi)用(yong)于持續(xu)釋放。

根據(ju)本發明的一些實施(shi)方(fang)案，將nmda受(shou)體拮抗劑配制成用于注射。

在(zai)某些實施方(fang)案中，將上(shang)述藥物組合(he)物配制成用于注(zhu)射(she)。

根據本發明的(de)(de)(de)(de)一些實(shi)施方(fang)(fang)案的(de)(de)(de)(de)一個方(fang)(fang)面，提供了(le)一種(zhong)診(zhen)斷患(huan)者(zhe)(zhe)中的(de)(de)(de)(de)戈謝病(bing)(gd)的(de)(de)(de)(de)神經病(bing)性(xing)形(xing)式的(de)(de)(de)(de)方(fang)(fang)法(fa)，所(suo)述方(fang)(fang)法(fa)包括在(zai)患(huan)者(zhe)(zhe)的(de)(de)(de)(de)生物(wu)(wu)樣(yang)品中確定(ding)(ding)影(ying)響grin2b基因的(de)(de)(de)(de)表(biao)達產物(wu)(wu)的(de)(de)(de)(de)量(liang)(liang)的(de)(de)(de)(de)序(xu)(xu)列變異(yi)和/或(huo)grin2b基因的(de)(de)(de)(de)表(biao)達產物(wu)(wu)的(de)(de)(de)(de)量(liang)(liang)，其(qi)中相對于健康患(huan)者(zhe)(zhe)或(huo)診(zhen)斷患(huan)有gdi型的(de)(de)(de)(de)患(huan)者(zhe)(zhe)的(de)(de)(de)(de)生物(wu)(wu)樣(yang)品，序(xu)(xu)列變異(yi)的(de)(de)(de)(de)存(cun)在(zai)、高于預定(ding)(ding)水平(ping)的(de)(de)(de)(de)表(biao)達產物(wu)(wu)的(de)(de)(de)(de)量(liang)(liang)和/或(huo)表(biao)達產物(wu)(wu)的(de)(de)(de)(de)增加的(de)(de)(de)(de)量(liang)(liang)指示gd的(de)(de)(de)(de)神經病(bing)性(xing)形(xing)式，由此診(zhen)斷患(huan)者(zhe)(zhe)中的(de)(de)(de)(de)gd的(de)(de)(de)(de)神經病(bing)性(xing)形(xing)式。

根(gen)據(ju)本發明的(de)一些實施方案，序列(lie)變異(yi)在grin2b基因的(de)非編碼(ma)序列(lie)中。

根(gen)據本發明的一些實施(shi)方案(an)，使用dna測序(xu)確(que)定(ding)序(xu)列變異。

根據本發明的(de)一些(xie)實施方(fang)案，使用rna和/或蛋(dan)白檢測方(fang)法(fa)確定表(biao)達量(liang)。

根據本發明的一些實施方案，所述檢測方法(fa)選(xuan)自pcr、寡核(he)苷酸微陣列、免(mian)疫沉淀法(fa)、蛋白印跡分析和facs。

根據本發明的(de)(de)(de)一些實施方案，通過(guo)將(jiang)患者的(de)(de)(de)生(sheng)物樣(yang)品或(huo)其(qi)(qi)部分或(huo)其(qi)(qi)提取(qu)物與(yu)寡(gua)核苷酸雜交來確定表達(da)水平(ping)(ping)，所述寡(gua)核苷酸與(yu)由(you)grin2b基(ji)(ji)因表達(da)的(de)(de)(de)多(duo)(duo)核苷酸特異(yi)性(xing)雜交，和/或(huo)通過(guo)使患者的(de)(de)(de)生(sheng)物樣(yang)品或(huo)其(qi)(qi)部分或(huo)其(qi)(qi)提取(qu)物與(yu)特異(yi)性(xing)結合由(you)grin2b基(ji)(ji)因表達(da)的(de)(de)(de)多(duo)(duo)肽的(de)(de)(de)抗體接觸來確定表達(da)水平(ping)(ping)。

根(gen)據本發明的一(yi)些實(shi)施方案(an)，患者被(bei)診斷患有gd。

根據本(ben)發明的(de)一些實施方(fang)案的(de)一個方(fang)面，提供了一種物質的(de)組合物，其包含被診(zhen)斷(duan)患有戈謝病(bing)(gd)的(de)患者的(de)多核(he)苷(gan)酸(suan)樣品；以及能夠與(yu)由grin2b基因表達(da)的(de)多核(he)苷(gan)酸(suan)特異性雜(za)交的(de)寡(gua)核(he)苷(gan)酸(suan)，并且任(ren)選地，其中所述寡(gua)核(he)苷(gan)酸(suan)被標記。

根據本發明(ming)的(de)(de)一(yi)(yi)些(xie)實施方(fang)案的(de)(de)一(yi)(yi)個方(fang)面，提供了一(yi)(yi)種物(wu)質的(de)(de)組合(he)物(wu)，其包含被(bei)診斷患(huan)有戈謝病(gd)的(de)(de)患(huan)者的(de)(de)多(duo)(duo)肽樣品；以及(ji)能夠特異性結合(he)由grin2b基因(yin)表達的(de)(de)多(duo)(duo)肽的(de)(de)抗體(ti)和任(ren)選地第二(er)抗體(ti)。

根據(ju)本發明的一些實施方案(an)，提供(gong)了一種治療被(bei)診斷患有戈(ge)謝病(gd)的神經病性形式的患者的方法(fa)，該方法(fa)包括：

(a)按照(zhao)該方法診斷患(huan)者(zhe)；并且其中指示，相對(dui)于健康(kang)患(huan)者(zhe)或診斷患(huan)有(you)gdi型的(de)(de)患(huan)者(zhe)的(de)(de)生物樣品，存在序列變異和/或表(biao)達產物的(de)(de)量高于預定水(shui)平和/或增加(jia)的(de)(de)量的(de)(de)表(biao)達產物，

(b)用nmda受體拮抗劑治療患者，

從而治療被診斷患(huan)有gd的神經病性(xing)形式的患(huan)者。

根據下(xia)文給出的(de)(de)詳細描(miao)述，本(ben)發明(ming)的(de)(de)其它實施(shi)方案(an)和(he)適用性的(de)(de)全(quan)部(bu)范圍(wei)將變得(de)顯(xian)而(er)易(yi)見。然而(er)，應當理解，在說明(ming)本(ben)發明(ming)的(de)(de)優選實施(shi)方案(an)時的(de)(de)詳細描(miao)述和(he)具體實施(shi)例僅(jin)以說明(ming)的(de)(de)方式給出，因為在本(ben)發明(ming)的(de)(de)精神和(he)范圍(wei)內的(de)(de)各種改變和(he)修改對于本(ben)領域(yu)技術(shu)人員(yuan)而(er)言(yan)通過該(gai)詳細的(de)(de)描(miao)述將是顯(xian)而(er)易(yi)見的(de)(de)。

附(fu)圖(tu)的若(ruo)干視圖(tu)的簡述

圖1a-c顯(xian)(xian)示(shi)不同(tong)的(de)(de)小(xiao)鼠(shu)(shu)品(pin)系(xi)(xi)(xi)對cbe處理(li)表現出不同(tong)的(de)(de)敏感(gan)性。圖1a是從kirby等人，genetics.2010年7月；185(3):1081-95改編的(de)(de)圖，顯(xian)(xian)示(shi)94個(ge)小(xiao)鼠(shu)(shu)品(pin)系(xi)(xi)(xi)的(de)(de)系(xi)(xi)(xi)統樹。本申(shen)請中使用(yong)的(de)(de)品(pin)系(xi)(xi)(xi)以(yi)粗線(xian)突出顯(xian)(xian)示(shi)。圖1b是例示(shi)15種不同(tong)的(de)(de)經cbe處理(li)的(de)(de)小(xiao)鼠(shu)(shu)品(pin)系(xi)(xi)(xi)的(de)(de)存活(huo)曲線(xian)的(de)(de)kaplan-meier存活(huo)曲線(xian)。從出生(sheng)后第(p)8天(tian)開始(shi)每天(tian)用(yong)cbe(25mg/kg)處理(li)小(xiao)鼠(shu)(shu)。圖1c顯(xian)(xian)示(shi)pbs(對照(zhao)，黑線(xian))或cbe(灰線(xian))施用(yong)后代表性小(xiao)鼠(shu)(shu)品(pin)系(xi)(xi)(xi)中運動協調的(de)(de)進展，如通過吊線(xian)測試評估。數(shu)據(ju)以(yi)平均(jun)值±sem(n＝4-5)表示(shi)，*p<0.05。

圖2是象形圖，說明cbe誘導的腦病理學是品系特異性的。用cbe處理akr/j和btbrt^+itpr3tf/j小鼠。分別在p22和p208處死小鼠，并分析腦皮質層v中cd68-陽性細胞的存在。akr/j小鼠發展出更快速的腦部疾病，而btbrt^+itpr3tf/j小鼠具有抗性。

圖(tu)3a-f顯示(shi)了大腦gba1活性和(he)(he)脂質組(zu)學分析。圖(tu)3a是顯示(shi)在p18時收獲的(de)(de)(de)pbs-處(chu)理(li)(li)(對照，黑條)或(huo)cbe-處(chu)理(li)(li)(灰(hui)色條)的(de)(de)(de)小(xiao)鼠(shu)腦中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)gba1活性的(de)(de)(de)條圖(tu)。數據以(yi)平均值(zhi)±sem(n＝2，重復)表示(shi)。圖(tu)3b是顯示(shi)cbe處(chu)理(li)(li)后(hou)的(de)(de)(de)gba1活性與(yu)小(xiao)鼠(shu)壽(shou)(shou)命之間(jian)缺(que)乏(fa)相關性的(de)(de)(de)圖(tu)。圖(tu)3c-f是顯示(shi)在p18時進行(xing)評估的(de)(de)(de)pbs-處(chu)理(li)(li)(對照，黑條)和(he)(he)cbe-處(chu)理(li)(li)(灰(hui)色條)品(pin)系的(de)(de)(de)腦中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)glccer水平(圖(tu)3c)、glcso水平(圖(tu)3d)、galcer水平(圖(tu)3e)和(he)(he)galso水平(圖(tu)3f)的(de)(de)(de)條圖(tu)。每個小(xiao)組(zu)都有(you)一個插(cha)圖(tu)，顯示(shi)cbe處(chu)理(li)(li)后(hou)各脂質和(he)(he)小(xiao)鼠(shu)壽(shou)(shou)命之間(jian)缺(que)乏(fa)相關性。數據以(yi)平均值(zhi)±sem(n＝2)表示(shi)。

圖(tu)4a是使(shi)用emma在15個不同(tong)小鼠品系中鑒定的snp產生的曼哈頓(dun)圖(tu)。圖(tu)4b是圖(tu)3a的曼哈頓(dun)圖(tu)的分解(jie)圖(tu)，集中在染色(se)體6上的位置(zhi)130000000至(zhi)140000000。

圖(tu)5a顯(xian)示(shi)(shi)了通(tong)過qpcr評估的(de)(de)(de)源自pbs-處理或cbe-處理的(de)(de)(de)小鼠在(zai)(zai)p18時的(de)(de)(de)皮質勻漿中的(de)(de)(de)grin2b的(de)(de)(de)皮質mrna水平。指(zhi)示(shi)(shi)存在(zai)(zai)于grin2b基因內的(de)(de)(de)rs29869040中的(de)(de)(de)snp的(de)(de)(de)基因型(xing)。a/j和(he)(he)c57bl/6/jolahsd(表示(shi)(shi)為(wei)(wei)c57)代表短期存活(huo)品系(xi)，而nzw和(he)(he)fvb代表長(chang)期存活(huo)品系(xi)。結(jie)果表示(shi)(shi)為(wei)(wei)平均(jun)值(zhi)±sem(n＝3)。循環(huan)閾值(zhi)(ct)被歸一化為(wei)(wei)tata盒結(jie)合(he)蛋白(tbp)的(de)(de)(de)水平。短期和(he)(he)長(chang)期存活(huo)的(de)(de)(de)品系(xi)之(zhi)(zhi)間*p<0.05，pbs和(he)(he)cbe-處理的(de)(de)(de)組織(zhi)之(zhi)(zhi)間#p<0.05。

圖5b顯(xian)示(shi)通過對(dui)照、1型gd和2型gd患者(zhe)的額(e)葉、枕(zhen)葉、頂葉皮質(zhi)和小腦的蛋(dan)(dan)白印跡分析評估的nr2b蛋(dan)(dan)白水(shui)平。gapdh水(shui)平用作加載對(dui)照。

圖(tu)(tu)6是說明阻斷nmda受體(ti)如(ru)何(he)延長c3h小鼠存活的(de)線圖(tu)(tu)。從(cong)p8開始每天(tian)用cbe(25mg/kg天(tian))(黑線)或cbe(25mg/kg天(tian))加上mk-801(0.3mg/kg天(tian))(灰線)處理來(lai)自c3h/hej(c3h)品系的(de)雄性小鼠。

圖7顯示了說明活化nmda受體如何降低小鼠存活的線圖。從p8開始每天用cbe(25mg/kg天)(黑線)或cbe(25mg/kg天)加上d-環絲氨酸(200mg/kg天)(灰線)處理來自balb/cj、fvb/nj、129s1/svimj和btbrt⁺itpr3^tf/j品系的雄性小鼠。

圖(tu)8a-c顯示(shi)(shi)了(le)說明(ming)nmda受體拮抗劑美(mei)金(jin)剛(gang)(gang)(gang)如(ru)何延長神經病性gd小鼠(shu)壽命的(de)(de)(de)線(xian)圖(tu)。圖(tu)8a顯示(shi)(shi)了(le)從p8開(kai)始每天(tian)用cbe(25mg/kg天(tian))(cbe，黑線(xian))或cbe(25mg/kg)加(jia)上(shang)美(mei)金(jin)剛(gang)(gang)(gang)(3mg/kg天(tian))(cbe-m，灰線(xian))處理的(de)(de)(de)a/j(aj)、c3h/hej(c3h)、dba/2j(dba)和(he)c57bl6/jolahsd(c57)品(pin)系的(de)(de)(de)雄性小鼠(shu)的(de)(de)(de)kaplan-meier存(cun)活(huo)曲線(xian)。圖(tu)8b-c顯示(shi)(shi)了(le)從p8開(kai)始每天(tian)用cbe(50mg/kg天(tian))(n＝5)或cbe(50mg/kg天(tian))加(jia)上(shang)美(mei)金(jin)剛(gang)(gang)(gang)3mg/kg(表(biao)示(shi)(shi)為(wei)1x，n＝3)或cbe加(jia)上(shang)美(mei)金(jin)剛(gang)(gang)(gang)30mg/kg天(tian)(表(biao)示(shi)(shi)為(wei)x10，n＝4)處理的(de)(de)(de)a/j小鼠(shu)的(de)(de)(de)kaplan-meier存(cun)活(huo)曲線(xian)(圖(tu)8b)和(he)平均(jun)存(cun)活(huo)時(shi)間(圖(tu)8c)。圖(tu)8c中的(de)(de)(de)結果表(biao)示(shi)(shi)為(wei)平均(jun)值(zhi)±sem。*p<0.05。

圖9a顯示a/jpbs-處理的(de)小鼠(shu)(黑色連續線)(n＝5)、a/jcbe-處理的(de)小鼠(shu)(灰(hui)點)(n＝4)和a/jcbe-美金剛(虛線)(n＝5)中的(de)運動協調的(de)進展，如通過吊線測試評估(gu)。結果為平(ping)均值(zhi)±sem。與(yu)pbs對照相比*p<0.05。

圖9b是顯示在p18或(huo)p70時收獲的(de)a/j小鼠腦中用pbs、cbe或(huo)cbe加上美金剛處理(li)后的(de)腦gba1活性的(de)條圖。數據(ju)表示為平(ping)均(jun)值(zhi)±sem，n＝2個(ge)(ge)生(sheng)物(wu)重(zhong)復和(he)2個(ge)(ge)技術(shu)重(zhong)復*p<0.001。

圖10a-b顯示了gba^flox/flox的kaplan-meier存活(huo)(huo)曲線(圖(tu)10b)和平均存活(huo)(huo)時間(圖(tu)10b)；從(cong)p8開(kai)始每天用(yong)pbs(對照，n＝9)、美金剛3mg/kg(表示為1x，n＝4)或美金剛30mg/kg天(表示為10x，n＝6)處理巢蛋白-cre小鼠。圖(tu)10b中的結果表示為平均值±sem。*p<0.05。

圖11顯示從p8開始(shi)每天(tian)用cbe(25mg/kg天(tian)，黑線(xian))或cbe(25mg/kg天(tian))加上艾芬地爾(灰線(xian))處理的(de)a/j小鼠的(de)kaplan-meier存活曲線(xian)。

發明詳述

本(ben)發(fa)明(ming)涉及(ji)用于治(zhi)療被診(zhen)斷(duan)處于發(fa)展為戈謝病(gd)的神(shen)經病性形式(shi)的風險或(huo)患(huan)有戈謝病(gd)的神(shen)經病性形式(shi)的受(shou)試者(zhe)(zhe)的手段和(he)方(fang)法。本(ben)發(fa)明(ming)的方(fang)法包括(kuo)向受(shou)試者(zhe)(zhe)施用有效抑制或(huo)阻斷(duan)nmda受(shou)體(ti)活性的治(zhi)療有效量的nmda受(shou)體(ti)拮抗劑。本(ben)發(fa)明(ming)適(shi)用于gd的所有神(shen)經病性形式(shi)，包括(kuo)2型(xing)、3a型(xing)和(he)3b型(xing)。

迄今為(wei)(wei)止可用(yong)于(yu)由酶(mei)(mei)缺乏引起的(de)溶酶(mei)(mei)體貯(zhu)積病(bing)(包(bao)括1型(xing)(xing)gd)的(de)治(zhi)療(liao)是非常(chang)昂貴(gui)的(de)并且并不總是有效的(de)。對(dui)于(yu)2型(xing)(xing)和3型(xing)(xing)gd，不存在用(yong)于(yu)治(zhi)療(liao)這(zhe)些病(bing)癥的(de)有效治(zhi)療(liao)方(fang)法。對(dui)于(yu)導致神(shen)經病(bing)性(也稱為(wei)(wei)神(shen)經元病(bing)變)gd(ngd)的(de)病(bing)理事件的(de)生物化(hua)學途徑(jing)知(zhi)之甚(shen)少。

臨床上，gd是非常多種多樣的(de)，并且在(zai)(zai)(zai)溶酶體葡糖腦苷脂酶(gba1)基因中具有(you)相同(tong)突變的(de)患者可呈現完全(quan)不同(tong)的(de)表現形式(shi)，表明存在(zai)(zai)(zai)修飾基因。本(ben)發明的(de)發明人在(zai)(zai)(zai)此(ci)首(shou)次顯示，編碼nmda谷(gu)氨酸受體的(de)亞基b的(de)grin2b基因與患有(you)gd的(de)小鼠的(de)gd進展相關聯。此(ci)外(wai)，本(ben)發明現在(zai)(zai)(zai)顯示，當(dang)用(yong)nmda受體拮抗劑治療(liao)時，證實(shi)有(you)gd的(de)小鼠表現出壽命延長。因此(ci)，根據本(ben)發明，nmda的(de)序列變異和mrna和/或蛋白水(shui)平可用(yong)于(yu)ngd診斷；和能夠抑制nmda受體活性的(de)化(hua)合物適(shi)用(yong)于(yu)治療(liao)ngd。

如(ru)下文(wen)和下文(wen)實(shi)施例部分(fen)(fen)所示(shi)，本發明人表(biao)(biao)明，不同的(de)(de)小(xiao)鼠(shu)品系不同地響應于通過cbe的(de)(de)gd誘導，這是(shi)與(yu)其遺傳背景相(xiang)關(guan)的(de)(de)響應。此(ci)外(wai)，表(biao)(biao)現(xian)出(chu)(chu)短(duan)的(de)(de)壽命的(de)(de)小(xiao)鼠(shu)品系也表(biao)(biao)現(xian)出(chu)(chu)腦(nao)病(bing)理學和運動功能障礙，并因(yin)此(ci)可用作神經(jing)病(bing)性戈謝病(bing)(ngd)的(de)(de)小(xiao)鼠(shu)模(mo)型(實(shi)施例1，圖1a-c和2和表(biao)(biao)2)。重要(yao)的(de)(de)是(shi)，小(xiao)鼠(shu)的(de)(de)生存率與(yu)腦(nao)gba1活性以及(ji)與(yu)glccer、glcso、galcer和galso脂質(zhi)水平(實(shi)施例2，圖3a-f)之間沒有相(xiang)關(guan)性，表(biao)(biao)明修飾基(ji)因(yin)參與(yu)了ngd病(bing)理學。gwas分(fen)(fen)析已經(jing)將編碼nmda谷氨酸(suan)受體的(de)(de)亞基(ji)b的(de)(de)基(ji)因(yin)grin2b鑒定為ngd進(jin)展的(de)(de)潛(qian)在修飾基(ji)因(yin)(實(shi)施例4圖4a-b和5a-b)。具體而言，本發明人已經(jing)揭示(shi)了與(yu)ngd相(xiang)關(guan)的(de)(de)grin2b基(ji)因(yin)的(de)(de)非編碼序列中的(de)(de)單核苷酸(suan)變異(snpidrs29869040)。

本發明人進(jin)一(yi)步表明，nmda受(shou)體的(de)激(ji)動劑(例(li)如d-環(huan)絲(si)氨酸)降低了gd小(xiao)鼠的(de)存活，和nmda受(shou)體的(de)拮抗劑(例(li)如mk801、美金剛(gang)和艾(ai)芬地(di)爾)增加(jia)了ngd小(xiao)鼠的(de)期(qi)望壽命并延遲ngd小(xiao)鼠的(de)運動功能障(zhang)礙的(de)進(jin)展，而不影響腦gba1抑制(zhi)(實施例(li)4-5，圖6-7，8a-c，9a-b，10a-b和11)。

因此，本教導提供了包含(han)用(yong)于治療(liao)(liao)戈謝病的(de)(de)神經病性形式(ngd)的(de)(de)nmda受體(ti)拮抗(kang)劑的(de)(de)組合物和(he)診斷ngd的(de)(de)方(fang)法。受這些令(ling)人(ren)驚奇的(de)(de)發(fa)(fa)現(xian)的(de)(de)啟(qi)發(fa)(fa)，在一(yi)方(fang)面，本發(fa)(fa)明提供包含(han)至少一(yi)種nmda受體(ti)拮抗(kang)劑或其藥學上(shang)可接受的(de)(de)鹽、水(shui)合物或藥學上(shang)活性的(de)(de)對(dui)映異構體(ti)的(de)(de)藥物組合物，用(yong)于治療(liao)(liao)gd的(de)(de)神經病性形式。

根據本發(fa)明(ming)的另一方面，提供了用于(yu)治療gd的神經病性形式的nmda受體拮抗劑。

不希望受任(ren)何理論或(huo)(huo)作用機制的(de)(de)約束，所(suo)(suo)述nmda受體拮抗(kang)劑(ji)具(ju)有神經(jing)(jing)(jing)保護活性。本文所(suo)(suo)用的(de)(de)術語“神經(jing)(jing)(jing)保護活性”是指(zhi)減少或(huo)(huo)改善神經(jing)(jing)(jing)損(sun)傷，以(yi)及保護或(huo)(huo)恢復已遭受神經(jing)(jing)(jing)損(sun)傷的(de)(de)神經(jing)(jing)(jing)元(yuan)細胞(bao)的(de)(de)作用。如(ru)本文所(suo)(suo)用，術語“神經(jing)(jing)(jing)損(sun)傷”是指(zhi)由諸如(ru)代謝、毒性、神經(jing)(jing)(jing)毒性和化學(xue)原因的(de)(de)各(ge)種原因導致的(de)(de)對神經(jing)(jing)(jing)元(yuan)細胞(bao)或(huo)(huo)組織的(de)(de)任(ren)何損(sun)害(hai)。

另一方面，本發明進一步提供了用于(yu)治療在有其需要(yao)的患(huan)者(zhe)中的gd的神(shen)經(jing)(jing)病性(xing)形(xing)式(shi)的方法(fa)，其包(bao)括向(xiang)患(huan)者(zhe)施用包(bao)含至少一種nmda受體拮(jie)抗劑或其藥(yao)(yao)學(xue)上可接(jie)受的鹽、水合物或藥(yao)(yao)學(xue)上活性(xing)的對映異構(gou)體的藥(yao)(yao)物組(zu)合物的步驟，從(cong)而治療gd的神(shen)經(jing)(jing)病性(xing)形(xing)式(shi)。

根據本發明的(de)另一方面，提供了(le)用于(yu)治療(liao)在有其(qi)需要的(de)患者中的(de)gd的(de)神經病(bing)性形式的(de)方法(fa)，包括向患者施用治療(liao)有效量的(de)nmda受體拮抗劑，從而治療(liao)gd的(de)神經病(bing)性形式。

在(zai)一方面，本發明還提供至(zhi)少一種nmda受(shou)體(ti)拮抗劑或其藥學上(shang)可接受(shou)的鹽、水合物或藥學上(shang)活(huo)性(xing)的對映異構體(ti)在(zai)制備用于(yu)治療gd的神經病性(xing)形式的藥物中的用途。

根據本發明(ming)的(de)(de)(de)另一(yi)(yi)方面，提(ti)供至少一(yi)(yi)種nmda受(shou)體拮抗劑在(zai)制(zhi)備用(yong)于治(zhi)療gd的(de)(de)(de)神經(jing)病性形式的(de)(de)(de)藥(yao)物中的(de)(de)(de)用(yong)途。

在(zai)另一(yi)方面，本(ben)發(fa)明進(jin)一(yi)步提供了一(yi)種試劑盒(he)，其(qi)包含(han)至(zhi)少一(yi)個包含(han)藥物組合物的(de)容器，所述藥物組合物包含(han)至(zhi)少一(yi)種用于治(zhi)療gd的(de)神經病性(xing)(xing)形(xing)式的(de)nmda受(shou)體拮(jie)抗劑或其(qi)藥學(xue)上可接受(shou)的(de)鹽、水合物或藥學(xue)上活(huo)性(xing)(xing)的(de)對映異構體。

本文所(suo)用(yong)的(de)術語“治療”(treating)和“治療”(treatment)是指(zhi)撤消、基本上抑制、減(jian)緩或逆(ni)轉病(bing)癥(zheng)(zheng)的(de)進展，基本上延(yan)遲病(bing)癥(zheng)(zheng)的(de)臨床(chuang)(chuang)癥(zheng)(zheng)狀的(de)出(chu)現，基本上改善病(bing)癥(zheng)(zheng)的(de)臨床(chuang)(chuang)癥(zheng)(zheng)狀或基本上防(fang)止出(chu)現病(bing)癥(zheng)(zheng)的(de)臨床(chuang)(chuang)癥(zheng)(zheng)狀。本文所(suo)用(yong)的(de)術語“治療”還指(zhi)延(yan)長遭(zao)受病(bing)癥(zheng)(zheng)的(de)患(huan)者的(de)存活(huo)或延(yan)遲遭(zao)受病(bing)癥(zheng)(zheng)的(de)患(huan)者的(de)死亡。

如本(ben)文(wen)所使用(yong)的(de)，在本(ben)文(wen)中可以互換使用(yong)的(de)短語“有(you)其需要的(de)患者(zhe)(zhe)”和“有(you)其需要的(de)受試者(zhe)(zhe)”是(shi)指(zhi)被診(zhen)斷患有(you)病(bing)癥(即神經病(bing)性(xing)(xing)gd)的(de)哺(bu)乳動物雄性(xing)(xing)或(huo)雌(ci)性(xing)(xing)受試者(zhe)(zhe)(例如，人)。在一個(ge)特定的(de)實(shi)施方案中，該術語包(bao)括處于(yu)發展病(bing)癥的(de)風險(xian)的(de)個(ge)體。患者(zhe)(zhe)可以是(shi)任(ren)何(he)性(xing)(xing)別或(huo)任(ren)何(he)年齡，包(bao)括新生(sheng)兒、嬰兒、少年、青年、成人和老年人。根據本(ben)發明的(de)一些實(shi)施方案，為了(le)診(zhen)斷目的(de)，所述受試者(zhe)(zhe)進一步定義如下。

本文所用的(de)(de)術語“戈謝氏病(gd)”或“戈謝病”是(shi)指一種溶(rong)酶(mei)(mei)(mei)體貯(zhu)積病(lsd)，其特征為(wei)細胞(bao)(bao)內特別(bie)是(shi)單核細胞(bao)(bao)譜系的(de)(de)細胞(bao)(bao)內的(de)(de)葡(pu)(pu)(pu)糖(tang)(tang)(tang)神經(jing)酰(xian)(xian)胺(an)(glccer，也稱(cheng)為(wei)葡(pu)(pu)(pu)糖(tang)(tang)(tang)腦苷脂)的(de)(de)積累。葡(pu)(pu)(pu)糖(tang)(tang)(tang)神經(jing)酰(xian)(xian)胺(an)可(ke)以在脾、肝、腎、肺、腦和(he)骨髓中聚集。這種疾病是(shi)由酶(mei)(mei)(mei)葡(pu)(pu)(pu)糖(tang)(tang)(tang)腦苷脂酶(mei)(mei)(mei)(也稱(cheng)為(wei)β-葡(pu)(pu)(pu)糖(tang)(tang)(tang)苷酶(mei)(mei)(mei)、d-糖(tang)(tang)(tang)基-n-酰(xian)(xian)基鞘(qiao)氨醇葡(pu)(pu)(pu)糖(tang)(tang)(tang)水(shui)解酶(mei)(mei)(mei)，gcd或gcase；ec3.2.1.45)的(de)(de)缺乏(fa)引起的(de)(de)，葡(pu)(pu)(pu)糖(tang)(tang)(tang)腦苷脂酶(mei)(mei)(mei)是(shi)具有葡(pu)(pu)(pu)糖(tang)(tang)(tang)神經(jing)酰(xian)(xian)胺(an)酶(mei)(mei)(mei)活性(xing)的(de)(de)溶(rong)酶(mei)(mei)(mei)體酶(mei)(mei)(mei)，其需要通過水(shui)解切割(ge)葡(pu)(pu)(pu)糖(tang)(tang)(tang)神經(jing)酰(xian)(xian)胺(an)的(de)(de)β-葡(pu)(pu)(pu)糖(tang)(tang)(tang)苷鍵。

gd根據疾(ji)病(bing)(bing)的具(ju)體癥狀分為兩種主要類型：神經(jing)(jing)病(bing)(bing)性和非(fei)神經(jing)(jing)病(bing)(bing)性疾(ji)病(bing)(bing)。在非(fei)神經(jing)(jing)病(bing)(bing)性疾(ji)病(bing)(bing)中，大多(duo)數器(qi)官和組(zu)織都可(ke)以參(can)與，而(er)不是腦。在神經(jing)(jing)病(bing)(bing)性疾(ji)病(bing)(bing)(ngd)中，腦也參(can)與其中。

i型(xing)(或(huo)非神經病性類(lei)型(xing)，gd1)是(shi)最常見(jian)的疾病形式，在大(da)約50000活產之一(yi)中發生。它最常發生在具有猶太血統(tong)的人中。癥狀可(ke)能(neng)在生命早期或(huo)成年期開始，并且包括肝腫(zhong)大(da)和肉眼可(ke)見(jian)的脾(pi)腫(zhong)大(da)(共(gong)同(tong)稱為“肝脾(pi)腫(zhong)大(da)”)；脾(pi)可(ke)能(neng)破(po)裂并引起另(ling)外的并發癥。脾(pi)腫(zhong)大(da)和骨(gu)(gu)髓替換導致貧血、血小(xiao)板減少(shao)(shao)(shao)和白細(xi)胞減少(shao)(shao)(shao)。骨(gu)(gu)骼虛弱(ruo)和骨(gu)(gu)病可(ke)能(neng)是(shi)廣泛(fan)的。腦不受病理影響，但可(ke)能(neng)有肺損害，以及很少(shao)(shao)(shao)有腎損害。該組患者(zhe)通常容(rong)易產生青腫(zhong)(由于血小(xiao)板的低水平)，并且由于紅細(xi)胞數目少(shao)(shao)(shao)而經歷疲(pi)勞。根(gen)據疾病的發病和嚴重程度，1型(xing)患者(zhe)可(ke)能(neng)良好地活到成年期。一(yi)些患者(zhe)有輕度形式的疾病或(huo)可(ke)能(neng)不會(hui)顯(xian)現任何癥狀。

本文(wen)所用的神(shen)經病(bing)性gd(ngd)包括2型和3型gd兩者。

gd2型也稱為急性(xing)嬰幼(you)兒神經病性(xing)gd，通常在出生后6個月(yue)內開始(shi)，并且具有(you)約100000活產(chan)之一的(de)發病率。癥狀包括(kuo)肝(gan)和脾腫大、廣泛性(xing)和進行性(xing)腦損害(hai)、眼運動(dong)障(zhang)礙、痙攣狀態、癲癇發作、肢體(ti)僵硬(ying)，以及吸吮和吞咽能(neng)力差(cha)。受(shou)影響的(de)兒童通常到二(er)歲時死亡。

根據特定的實施方案，所述神經病性gd是(shi)gd2型。

gd3型(xing)也稱(cheng)為慢性神經(jing)病(bing)性gd，可以在(zai)兒(er)童期或甚至成年(nian)期的(de)(de)任何時間開始，并在(zai)約100000活產之一中發生。與(yu)急性或2型(xing)形式(shi)相比，其特(te)征是緩慢進(jin)行性，但(dan)較輕微的(de)(de)神經(jing)性癥狀(zhuang)。gd3型(xing)已(yi)分為兩種變型(xing)，稱(cheng)為3b型(xing)和3a型(xing)。3b型(xing)的(de)(de)大面積(ji)肝和脾(pi)的(de)(de)發病(bing)更早(zao)，并且(qie)患者(zhe)也可能經(jing)歷肺的(de)(de)直(zhi)接(jie)參與(yu)和快速進(jin)行性骨疾病(bing)。主(zhu)要癥狀(zhuang)包(bao)括脾(pi)和/或肝腫大、癲癇發作、協調不(bu)良、骨骼不(bu)規(gui)則、眼運動(dong)障礙(ai)、包(bao)括貧血在(zai)內的(de)(de)血液病(bing)，以及呼(hu)吸問題。患者(zhe)通常(chang)活到青(qing)少年(nian)早(zao)期和成年(nian)期。

根據特定的實施(shi)方(fang)案(an)，神經(jing)病(bing)(bing)性gd是亞急性、慢(man)性神經(jing)病(bing)(bing)性gd3型。在某些實施(shi)方(fang)案(an)中，所述(shu)gd3型是gd3a型。在某些實施(shi)方(fang)案(an)中，所述(shu)gd3型是gd3b型。

在某(mou)些實(shi)施(shi)方(fang)案中，nmda受(shou)體拮抗(kang)(kang)劑或包(bao)含nmda受(shou)體拮抗(kang)(kang)劑的(de)藥物(wu)組(zu)合物(wu)用于(yu)治(zhi)療與gd的(de)神(shen)經病性(xing)(xing)形(xing)式(shi)相關的(de)至(zhi)少一種癥(zheng)狀(zhuang)。在某(mou)些實(shi)施(shi)方(fang)案中，所述癥(zheng)狀(zhuang)選自驚厥(jue)、張(zhang)力(li)亢進、精(jing)神(shen)發育遲緩(huan)、呼(hu)吸暫(zan)停、廣(guang)泛性(xing)(xing)和(he)進行(xing)性(xing)(xing)腦損傷、眼運動障礙、痙(jing)攣、癲癇發作、肢體僵(jiang)硬、吸吮和(he)吞(tun)咽能力(li)差、協調不(bu)(bu)良、骨(gu)骼(ge)不(bu)(bu)規則、血液病、貧(pin)血、肌顫搐(肌陣攣)、驚厥(jue)、癡呆(dai)、眼肌失(shi)用癥(zheng)、呼(hu)吸系統疾病及(ji)其任何組(zu)合。每(mei)個可能性(xing)(xing)代表本發明的(de)不(bu)(bu)同(tong)實(shi)施(shi)方(fang)案。

如本文所用，術語(yu)“nmda受(shou)(shou)體”(也稱(cheng)為n-甲基(ji)-d-天冬氨酸(suan)受(shou)(shou)體)是(shi)(shi)(shi)指谷(gu)氨酸(suan)受(shou)(shou)體和離子(zi)(zi)通(tong)道蛋白，其是(shi)(shi)(shi)具(ju)有至少一個(ge)nr1亞(ya)基(ji)(也稱(cheng)為glun1)和至少一個(ge)nr2亞(ya)基(ji)(也稱(cheng)為glun2)的(de)異四聚體分(fen)子(zi)(zi)。nmda受(shou)(shou)體根據(ju)其在神(shen)經(jing)元中(zhong)的(de)分(fen)布(bu)可以分(fen)為2組：突(tu)觸(chu)(chu)(chu)和突(tu)觸(chu)(chu)(chu)外(wai)。通(tong)常(chang)，突(tu)觸(chu)(chu)(chu)受(shou)(shou)體促進存活信號級聯，而突(tu)觸(chu)(chu)(chu)外(wai)受(shou)(shou)體介導興(xing)奮性毒性的(de)毒性作用。根據(ju)特定的(de)實施(shi)方(fang)案，所述nmda受(shou)(shou)體是(shi)(shi)(shi)突(tu)觸(chu)(chu)(chu)外(wai)nmda受(shou)(shou)體。

具有不同腦分(fen)(fen)布和(he)(he)功能特性的多(duo)種(zhong)受體同種(zhong)型通過nr1轉(zhuan)錄物(wu)的選擇(ze)性剪接(jie)和(he)(he)nr2亞基(ji)(ji)的差異表達產生。雖然在無脊椎(zhui)生物(wu)中發現(xian)了單(dan)個(ge)的nr2亞基(ji)(ji)，nr2亞基(ji)(ji)的四個(ge)不同同種(zhong)型在脊椎(zhui)動物(wu)中表達，并(bing)被命名為nr2a至d(分(fen)(fen)別由基(ji)(ji)因grin2a、grin2b、grin2c和(he)(he)grin2d編碼)。

如下(xia)面(mian)的(de)(de)實(shi)(shi)施(shi)(shi)例部(bu)分所(suo)詳述，發現(xian)編碼nmda谷(gu)氨酸受(shou)體的(de)(de)亞(ya)基b(nr2b)的(de)(de)基因(yin)grin2b是gd進展的(de)(de)潛(qian)在修(xiu)飾基因(yin)。因(yin)此，在某些(xie)實(shi)(shi)施(shi)(shi)方案中，所(suo)述nmda受(shou)體(突(tu)(tu)觸(chu)或突(tu)(tu)觸(chu)外(wai))包含nr2b亞(ya)基。在特(te)定的(de)(de)實(shi)(shi)施(shi)(shi)方案中，突(tu)(tu)觸(chu)外(wai)nmda受(shou)體包含nr2b亞(ya)基。

如(ru)本文(wen)所用，術語“nr2b”，也稱為nmdar2b；谷氨酸(suan)[nmda]受(shou)體亞(ya)基(ji)(ji)(ji)epsilon-2；谷氨酸(suan)受(shou)體亞(ya)基(ji)(ji)(ji)epsilon-2；谷氨酸(suan)受(shou)體、離子型(xing)、n-甲基(ji)(ji)(ji)d-天(tian)冬氨酸(suan)2b；grin2b；hnr3；mgc142178；mgc142180；n-甲基(ji)(ji)(ji)d-天(tian)冬氨酸(suan)受(shou)體亞(ya)型(xing)2b；n-甲基(ji)(ji)(ji)-d-天(tian)冬氨酸(suan)受(shou)體亞(ya)基(ji)(ji)(ji)3；nmde2，或nr3，是(shi)(shi)指grin2b基(ji)(ji)(ji)因的(de)表達產物。根(gen)(gen)據特定的(de)實(shi)施(shi)(shi)方案，所述grin2b基(ji)(ji)(ji)因是(shi)(shi)指如(ru)下(xia)列基(ji)(ji)(ji)因id號(hao)(hao)中(zhong)提(ti)(ti)供(gong)的(de)人(ren)基(ji)(ji)(ji)因：2904(seqidno：6)。根(gen)(gen)據其(qi)它特定的(de)實(shi)施(shi)(shi)方案，所述grin2b基(ji)(ji)(ji)因是(shi)(shi)指如(ru)下(xia)列基(ji)(ji)(ji)因id號(hao)(hao)中(zhong)提(ti)(ti)供(gong)的(de)小鼠(shu)(shu)基(ji)(ji)(ji)因：14812(seqidno：7)。根(gen)(gen)據一(yi)個特定的(de)實(shi)施(shi)(shi)方案，所述nr2b蛋白(bai)是(shi)(shi)指人(ren)蛋白(bai)，例(li)如(ru)下(xia)列genbank編號(hao)(hao)np_000825(seqidno：8)中(zhong)提(ti)(ti)供(gong)的(de)。根(gen)(gen)據一(yi)個特定的(de)實(shi)施(shi)(shi)方案，所述nr2b蛋白(bai)是(shi)(shi)指小鼠(shu)(shu)蛋白(bai)，例(li)如(ru)下(xia)列genbank號(hao)(hao)np_032197(seqidno：9)中(zhong)提(ti)(ti)供(gong)的(de)。

如本文使(shi)用的術語(yu)“nmda受(shou)體(ti)拮抗劑”是指阻(zu)止(zhi)和/或抑制(zhi)n-甲(jia)基-d-天冬氨(an)酸受(shou)體(ti)(nmdar)的生物學功(gong)能和/或表達的分子。

拮抗(kang)劑(ji)可以是(shi)可逆的(de)或不可逆的(de)拮抗(kang)劑(ji)。

拮抗劑可以是競(jing)爭性(xing)或非競(jing)爭性(xing)拮抗劑。

根據特定(ding)的實(shi)施方案，所述(shu)拮抗劑(ji)是非競(jing)爭性拮抗劑(ji)。

根據其它特(te)定的(de)實(shi)施方案，所述(shu)拮抗(kang)(kang)劑抑制(zhi)受體(ti)的(de)生(sheng)(sheng)物(wu)學功能(例如(ru)(ru)配體(ti)結合，離子通道的(de)開放)，如(ru)(ru)通過例如(ru)(ru)電生(sheng)(sheng)理(li)記錄、鈣(gai)染料或鈣(gai)信號傳導檢測(ce)。與不存在拮抗(kang)(kang)劑的(de)情況(kuang)相比(bi)，降低可以是至(zhi)(zhi)(zhi)少(shao)10％，至(zhi)(zhi)(zhi)少(shao)20％，至(zhi)(zhi)(zhi)少(shao)30％，至(zhi)(zhi)(zhi)少(shao)40％，至(zhi)(zhi)(zhi)少(shao)50％，至(zhi)(zhi)(zhi)少(shao)60％，至(zhi)(zhi)(zhi)少(shao)70％，至(zhi)(zhi)(zhi)少(shao)80％，至(zhi)(zhi)(zhi)少(shao)90％，至(zhi)(zhi)(zhi)少(shao)95％或至(zhi)(zhi)(zhi)少(shao)99％。根據特(te)定的(de)實(shi)施方案，所述(shu)拮抗(kang)(kang)劑完全阻止受體(ti)的(de)生(sheng)(sheng)物(wu)學功能(例如(ru)(ru)配體(ti)結合，離子通道的(de)開放)。

根據(ju)特定(ding)的(de)實施方案，所述拮(jie)抗劑直接結(jie)合(he)受(shou)體(ti)，從而(er)阻(zu)止和/或(huo)抑制受(shou)體(ti)的(de)活性和/或(huo)表達(da)。結(jie)合(he)測(ce)定(ding)法是本領(ling)域熟(shu)知的(de)，且包括例如biacore、高效液相色譜法(hplc)或(huo)流式細胞術(shu)。

根據其它特定的(de)實施方案(an)，所述(shu)拮抗劑通過經由中間(jian)分(fen)子的(de)作用間(jian)接地結(jie)合(he)(he)(he)nmda受體(ti)，例如拮抗劑結(jie)合(he)(he)(he)或(huo)調節一分(fen)子，該分(fen)子又結(jie)合(he)(he)(he)或(huo)調節nmda受體(ti)。

如(ru)上所(suo)述(shu)，已知nmda受(shou)體(ti)(ti)可(ke)以分為(wei)2組，突觸受(shou)體(ti)(ti)，其促(cu)(cu)進存活信號(hao)級聯；和突觸外(wai)受(shou)體(ti)(ti)，其介導興奮性(xing)(xing)(xing)毒性(xing)(xing)(xing)的毒性(xing)(xing)(xing)作用(parsons和raymond，2014)。因此(ci)，推(tui)測，不限于任何理論(lun)或(huo)機制，可(ke)以通過(guo)特異性(xing)(xing)(xing)靶向興奮性(xing)(xing)(xing)毒性(xing)(xing)(xing)促(cu)(cu)進的突觸外(wai)受(shou)體(ti)(ti)來實(shi)現神(shen)經保護。因此(ci)，在某(mou)些實(shi)施方案中，nmda受(shou)體(ti)(ti)拮(jie)抗劑優先結合突觸外(wai)nmda受(shou)體(ti)(ti)。

因此，根據特(te)定的(de)實(shi)施方案，所述nmda受體拮抗劑經由nmda受體阻止和/或抑制過量的(de)鈣流(liu)入。

某些(xie)nmda受(shou)體拮抗劑，如(ru)mk-801，由于(yu)其相關的(de)(de)毒性，不(bu)能用于(yu)治療人患者(zhe)，其不(bu)僅(jin)經由突觸外受(shou)體阻(zu)斷了(le)過量的(de)(de)鈣流入(ru)的(de)(de)毒性作用，而且阻(zu)斷了(le)谷氨酸信(xin)號傳導的(de)(de)關鍵正常功(gong)能。

因此，根據特(te)定的實(shi)施方案，所(suo)述nmda受體拮抗劑不經(jing)由(you)nmda受體干擾(rao)谷氨酸信(xin)號傳(chuan)導。

此外(wai)，確保(bao)使用沒有(you)不可接受(shou)(shou)的(de)(de)副作(zuo)用如引起幻覺作(zuo)用的(de)(de)nmda受(shou)(shou)體(ti)(ti)拮抗劑(ji)。因此，由于其特(te)異(yi)性(xing)和安全(quan)性(xing)，其它nmda受(shou)(shou)體(ti)(ti)拮抗劑(ji)，例(li)如優先阻斷突觸(chu)外(wai)nmda受(shou)(shou)體(ti)(ti)的(de)(de)美(mei)金剛是有(you)利(li)的(de)(de)。

如本文使用的(de)術語“優(you)先結(jie)合(he)突(tu)觸外nmda受(shou)體(ti)”是指任(ren)何nmda受(shou)體(ti)拮抗(kang)劑，其結(jie)合(he)突(tu)觸外nmda受(shou)體(ti)而(er)不干擾(rao)谷氨酸信號傳導的(de)正常(chang)功能。

在某(mou)些(xie)實(shi)施(shi)方案(an)中(zhong)(zhong)，所(suo)(suo)述(shu)(shu)nmda受體(ti)(ti)拮(jie)抗劑(ji)優先(xian)(xian)結合(he)nr2亞基(ji)的子集。在某(mou)些(xie)實(shi)施(shi)方案(an)中(zhong)(zhong)，所(suo)(suo)述(shu)(shu)nmda受體(ti)(ti)拮(jie)抗劑(ji)優先(xian)(xian)結合(he)nr2b亞基(ji)。在某(mou)些(xie)實(shi)施(shi)方案(an)中(zhong)(zhong)，所(suo)(suo)述(shu)(shu)nmda受體(ti)(ti)拮(jie)抗劑(ji)特(te)異(yi)性結合(he)nr2b亞基(ji)，而(er)與其它nr2亞基(ji)沒有(you)交叉反應性。

在某些(xie)實(shi)施(shi)方案中，相對(dui)于相應的(de)健康(kang)神(shen)經(jing)元(yuan)(yuan)(yuan)細胞(bao)(bao)(bao)，nmda受(shou)體拮抗劑與具有β-葡(pu)(pu)糖腦苷(gan)(gan)脂酶(mei)(mei)活(huo)(huo)性(xing)(xing)缺乏的(de)神(shen)經(jing)元(yuan)(yuan)(yuan)細胞(bao)(bao)(bao)的(de)nmda受(shou)體結(jie)合。本文所用的(de)短語“具有β-葡(pu)(pu)糖腦苷(gan)(gan)脂酶(mei)(mei)活(huo)(huo)性(xing)(xing)缺陷的(de)神(shen)經(jing)元(yuan)(yuan)(yuan)細胞(bao)(bao)(bao)”還指具有比正常(chang)健康(kang)神(shen)經(jing)元(yuan)(yuan)(yuan)細胞(bao)(bao)(bao)中β-葡(pu)(pu)糖腦苷(gan)(gan)脂酶(mei)(mei)活(huo)(huo)性(xing)(xing)顯著更低的(de)β-葡(pu)(pu)糖腦苷(gan)(gan)脂酶(mei)(mei)活(huo)(huo)性(xing)(xing)的(de)神(shen)經(jing)元(yuan)(yuan)(yuan)細胞(bao)(bao)(bao)。

使用干擾受(shou)體的(de)轉錄(lu)(lu)和(he)(he)(he)/或翻譯的(de)多種(zhong)分子，阻(zu)止(zhi)和(he)(he)(he)/或抑制nmda受(shou)體的(de)生(sheng)物(wu)學功能可以在蛋白水平(ping)上實現(xian)，而且也(ye)可以在基因(yin)組(zu)和(he)(he)(he)/或轉錄(lu)(lu)水平(ping)上實現(xian)。

因此，根據本(ben)發明的(de)一些實(shi)施(shi)方案可(ke)以(yi)使用的(de)拮抗劑(ji)(ji)的(de)非限制(zhi)性(xing)實(shi)例包(bao)括(kuo)小分子、抗體、抑制(zhi)肽、切(qie)(qie)割多肽的(de)酶、適配(pei)體同源重(zhong)組劑(ji)(ji)、位點(dian)特異性(xing)內(nei)切(qie)(qie)核酸酶和rna沉默劑(ji)(ji)。

用(yong)于(yu)通過血(xue)腦屏障(bbb)的(de)(de)平臺技術是可利用(yong)的(de)(de)并且是本(ben)領域已知(zhi)的(de)(de)，并且包(bao)括但不限(xian)于(yu)定向脂(zhi)質體(ti)、納米(mi)顆粒(li)、微泡、通過鼻施(shi)用(yong)的(de)(de)噬菌體(ti)、外來體(ti)、前藥和(he)肽掩蔽(bi)。藥物遞送至中樞神經系統(cns)的(de)(de)其它示例性方法在下文進(jin)一步(bu)描述。

下面(mian)將詳細描述可用作(zuo)拮抗劑的藥劑的非限制性實(shi)例。

在多肽水平抑制(zhi)生物學功能

根(gen)據特定的(de)實施方案(an)(an)，所述拮抗劑是通(tong)過結合和/或(huo)切割受體而干擾(rao)受體功能(neng)(例(li)如催化(hua)或(huo)相互(hu)作用)的(de)分子(zi)(zi)。這樣的(de)分子(zi)(zi)可以是但(dan)不限于小分子(zi)(zi)、抑制肽、切割受體的(de)酶、adnectin、親合體(affibody)、avimer、anticalin，四連接素(tetranectin)、darpin和經工程改造的(de)kunitz-型抑制劑，其中每種可能(neng)性是本發明的(de)一個單獨的(de)實施方案(an)(an)。

根據一個特定的實施方案，所述拮抗劑是小分子。

根據(ju)一(yi)個特定的實施方案(an)，所述拮抗(kang)劑是肽分子。

將理解(jie)，抑制(zhi)肽的(de)至少(shao)催(cui)化或結(jie)合部(bu)分的(de)非功能性類似物(wu)也可以用作拮抗劑。

用作nmda受體拮(jie)抗劑(ji)(ji)的(de)(de)許多化(hua)合(he)物(wu)在本(ben)領域中(zhong)是已知的(de)(de)，因此(ci)以下(xia)指定(ding)的(de)(de)特定(ding)的(de)(de)nmda受體拮(jie)抗劑(ji)(ji)絕不(bu)限制本(ben)發(fa)明的(de)(de)范圍。

表1提供了幾(ji)種已知(zhi)的(de)nmda受體拮抗(kang)劑的(de)列表。

表1.

在某些實施方(fang)案中，所述至(zhi)少(shao)一(yi)種nmda受(shou)體(ti)拮抗劑選自(zi)美金剛(gang)、硝基(ji)美金剛(gang)，neramexane、氯(lv)胺(an)酮、金剛(gang)烷(wan)胺(an)、右美沙芬(fen)、l-687,384、阿米(mi)替林、1-芐基(ji)-6’-甲(jia)氧基(ji)-6’,7’-二(er)氫(qing)螺[哌啶-4,4’-噻吩并[3.2-c]吡(bi)喃]、艾芬(fen)地爾、奧芬(fen)那君、犬(quan)尿喹啉(lin)酸(suan)、非氨(an)酯(zhi)、d(-)-ap-5、(±)-cpp、eaa-090、tcn-201、ap-5、azd6765、sdz220-581、(±)-去甲(jia)氯(lv)胺(an)酮、依利羅地、右啡烷(wan)、5,7-二(er)氯(lv)犬(quan)尿喹啉(lin)酸(suan)一(yi)水合物、[glu3,4,7,10,14]-芋螺抑(yi)制(zhi)肽g、d-ap-7、md-ada、ap-7、ro8-4304、精胺(an)、ro25-6981、dcqx、曲索羅地、mdl105,519、法(fa)那帕奈、metaphit、ro25-6981、naag、5-氟(fu)吲哚-2-羧(suo)酸(suan)、(s)-(-)-4-氧代(dai)-2-氮雜環(huan)丁烷(wan)羧(suo)酸(suan)、(s)-(-)-4-氧代(dai)-2-氮雜環(huan)丁烷(wan)羧(suo)酸(suan)芐酯(zhi)和(±)-α-氨(an)基(ji)-3-甲(jia)酯(zhi)基(ji)-5-甲(jia)基(ji)異(yi)噁唑-4-丙酸(suan)，及其藥(yao)學上可接(jie)受(shou)的鹽、水合物和藥(yao)學上活性(xing)的對映異(yi)構體(ti)。每個(ge)可能性(xing)代(dai)表本發明(ming)的單獨實施方(fang)案。

在某些(xie)實(shi)施方案中，至少一種(zhong)nmda受(shou)體拮抗(kang)劑選自(zi)美(mei)金剛、硝基(ji)美(mei)金剛，neramexane、氯胺(an)酮、金剛烷胺(an)、右(you)美(mei)沙芬(fen)(fen)、l-687,384、阿(a)米替(ti)林、1-芐基(ji)-6’-甲氧基(ji)-6’,7’-二氫螺[哌啶(ding)-4,4’-噻(sai)吩并(bing)[3.2-c]吡喃]、艾(ai)芬(fen)(fen)地爾(er)、依利羅地、奧芬(fen)(fen)那(nei)君(jun)、犬尿喹(kui)啉酸(suan)、非氨酯(zhi)及其藥學(xue)上(shang)可(ke)接(jie)受(shou)的(de)(de)鹽、水(shui)合物和(he)藥學(xue)上(shang)活性(xing)的(de)(de)對映異構(gou)體。每個可(ke)能(neng)性(xing)代表本發(fa)明的(de)(de)單獨(du)實(shi)施方案。

在某些(xie)實施方案中，至(zhi)少一種(zhong)nmda受(shou)體(ti)拮(jie)抗劑選自(zi)美金(jin)剛、硝基美金(jin)剛、neramexane及(ji)其(qi)藥學上可接(jie)受(shou)的鹽、水合物和(he)藥學上活性的對映異構體(ti)。每個可能性代表本(ben)發明的單(dan)獨(du)實施方案。

根(gen)據(ju)特定的實施方案，所(suo)述nmda受體拮抗(kang)劑(ji)選自選自美金剛、依利羅地(di)和艾芬地(di)爾或其藥學(xue)上(shang)可接受的鹽、水(shui)合(he)物或藥學(xue)上(shang)活性的對(dui)映異(yi)構體。

在某些實施方案中(zhong)，所(suo)述nmda受(shou)體拮抗劑是(shi)美金剛(3,5-二甲基-1-金剛烷胺(an)鹽酸鹽)或(huo)其藥學(xue)上可(ke)接受(shou)的(de)鹽、水合物(wu)或(huo)藥學(xue)上活性的(de)對(dui)映異構體。每個可(ke)能(neng)性代表本發(fa)明(ming)的(de)單獨(du)實施方案。

根(gen)據特(te)定的實施方(fang)案，所(suo)述拮(jie)抗劑是(shi)抗體(ti)。根(gen)據特(te)定的實施方(fang)案，所(suo)述拮(jie)抗性抗體(ti)特(te)異性結合nmda受體(ti)的至少一(yi)個表位。根(gen)據特(te)定的實施方(fang)案，所(suo)述抗體(ti)可以穿過bbb。

如本(ben)文所用，術語“表(biao)位”是指抗體(ti)的(de)互(hu)補位與其結合(he)的(de)抗原上的(de)任(ren)何抗原決定(ding)簇(cu)。表(biao)位決定(ding)簇(cu)通常由諸(zhu)如氨基酸或碳水化(hua)(hua)合(he)物側鏈的(de)分(fen)子的(de)化(hua)(hua)學活性表(biao)面分(fen)組組成，并且通常具有特定(ding)的(de)三(san)維結構特征，以(yi)及特定(ding)的(de)電荷特征。

如本發明(ming)中使用的(de)術(shu)語“抗(kang)體”包括(kuo)完整分(fen)子及其功能片(pian)段，例如fab、f(ab’)2、fv、scfv、dsfv或單結構域(yu)分(fen)子，例如vh和(he)vl，其能夠(gou)(gou)與(yu)抗(kang)原的(de)表(biao)(biao)位(wei)(wei)結合(he)。所述(shu)抗(kang)體可(ke)以是單特異(yi)性(xing)的(de)(能夠(gou)(gou)識別一個表(biao)(biao)位(wei)(wei)或蛋(dan)(dan)白)、雙特異(yi)性(xing)(能夠(gou)(gou)結合(he)兩個表(biao)(biao)位(wei)(wei)或蛋(dan)(dan)白)或多特異(yi)性(xing)(能夠(gou)(gou)識別多個表(biao)(biao)位(wei)(wei)或蛋(dan)(dan)白)。

用(yong)于實(shi)施(shi)本(ben)發明的(de)一些實(shi)施(shi)方案的(de)合適的(de)抗體片(pian)段包括免疫(yi)球(qiu)蛋白輕(qing)鏈(lian)(lian)(本(ben)文(wen)中稱為“輕(qing)鏈(lian)(lian)”)的(de)互(hu)補決(jue)定區(qu)(cdr)、免疫(yi)球(qiu)蛋白重(zhong)(zhong)鏈(lian)(lian)(本(ben)文(wen)中稱為“重(zhong)(zhong)鏈(lian)(lian)”)的(de)互(hu)補決(jue)定區(qu)、輕(qing)鏈(lian)(lian)的(de)可變區(qu)、重(zhong)(zhong)鏈(lian)(lian)的(de)可變區(qu)、輕(qing)鏈(lian)(lian)、重(zhong)(zhong)鏈(lian)(lian)、fd片(pian)段，和(he)(he)包含(han)輕(qing)鏈(lian)(lian)和(he)(he)重(zhong)(zhong)鏈(lian)(lian)兩者的(de)基本(ben)上(shang)整個可變區(qu)的(de)抗體片(pian)段，例(li)如(ru)fv、單鏈(lian)(lian)fv(scfv)、二硫(liu)鍵穩定的(de)fv(dsfv)、fab、fab’和(he)(he)f(ab’)2。

如本文所用(yong)，術語“互補決定區”或(huo)“cdr”可互換使用(yong)，是(shi)指(zhi)在重鏈(lian)和輕鏈(lian)多肽的可變區內發現的抗原結合(he)區。通(tong)常(chang)，抗體在每(mei)個(ge)vh中包含三(san)個(ge)cdr(cdrhi或(huo)hi；cdrh2或(huo)h2；和cdrh3或(huo)h3)，并且每(mei)個(ge)vl中包含三(san)個(ge)cdr(cdrli或(huo)li；cdrl2或(huo)l2；和cdrl3或(huo)l3)。

構成可變區或cdr的特定抗體中的氨基酸殘基的同一性可以使用本領域熟知的方法確定，包括諸如由kabat等人定義的序列變異性的方法(參見例如kabat等人，1992，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，第5版，publichealthservice，nih，washingtond.c.)，由chothia等人定義的結構環區的位置(參見例如chothia等人，nature342：877-883,1989)，kabat和chothia之間的折衷使用oxfordmolecular'sabm抗體建模軟件(現參(can)見(jian)martin等(deng)(deng)人(ren)，1989，proc.natlacadsciusa.86:9268；以及萬維網www.bioinf-org.uk/abs)，如接觸(chu)定義來定義的(de)可用的(de)復合物(wu)晶體結構(gou)(參(can)見(jian)maccallum等(deng)(deng)人(ren)，j.mol.biol.262:732-745,1996)，“構(gou)象定義”(參(can)見(jian)例如makabe等(deng)(deng)人(ren)，journalofbiologicalchemistry，283:1156-1166,2008)和(he)imgt[lefrancmp等(deng)(deng)人(ren)(2003)imgtuniquenumberingforimmunoglobulinandtcellreceptorvariabledomainsandigsuperfamilyv-likedomains.devcompimmunol27:55-77]。

如本(ben)文所用，“可變區(qu)”和“cdr”可以指由本(ben)領(ling)域(yu)已(yi)知的(de)任何方(fang)法(fa)定義的(de)可變區(qu)和cdr，所述(shu)方(fang)法(fa)包括方(fang)法(fa)的(de)組(zu)合。

包含輕鏈和重鏈兩者的(de)整個或基(ji)本上整個可變區的(de)功能性抗(kang)體片段定義如下：

(i)fv，定義(yi)為由輕鏈(lian)(lian)(vl)的(de)(de)可變區和重鏈(lian)(lian)(vh)的(de)(de)可變區組成的(de)(de)經基因工程改造的(de)(de)片段(duan)，其表示為兩條鏈(lian)(lian)；

(ii)單鏈(lian)(lian)fv(“scfv”)，包括輕鏈(lian)(lian)的可(ke)變區(qu)和重鏈(lian)(lian)的可(ke)變區(qu)的經(jing)基因(yin)工程改造的單鏈(lian)(lian)分(fen)子，通過合適(shi)的多(duo)肽(tai)接頭(tou)連接成為基因(yin)融合的單鏈(lian)(lian)分(fen)子。

(iii)二(er)硫(liu)鍵穩定的fv(“dsfv”)，其是經基因工程改(gai)造的抗體，包括通過經基因工程改(gai)造的二(er)硫(liu)鍵連接的輕鏈(lian)的可變(bian)區(qu)和重鏈(lian)的可變(bian)區(qu)。

(iv)fab，含有抗(kang)體分子的(de)單價抗(kang)原結合(he)部分的(de)抗(kang)體分子的(de)片(pian)段，其(qi)可(ke)以通(tong)過(guo)用木瓜蛋白酶(mei)處理全(quan)抗(kang)體以產生完整的(de)輕鏈(lian)和(he)重鏈(lian)的(de)fd片(pian)段獲(huo)得，所述重鏈(lian)的(de)fd片(pian)段由其(qi)可(ke)變結構域和(he)ch1結構域組成；

(v)fab’，含(han)有抗體分子的(de)單價(jia)抗原結合(he)部分的(de)抗體分子的(de)片(pian)段，其可以通過用(yong)胃蛋白酶(mei)處理全抗體，然(ran)后通過還原(每個抗體分子獲得兩個fab'片(pian)段)來(lai)獲得；

(vi)f(ab’)2，含(han)有抗體(ti)(ti)分子的單價抗原結合部分的抗體(ti)(ti)分子的片段，其可以通過(guo)用胃蛋白(bai)酶(mei)處理全抗體(ti)(ti)獲得(即，通過(guo)兩(liang)個二硫鍵將fab'片段的二聚體(ti)(ti)保持在一起)；和

(vii)單結(jie)構域抗(kang)體(ti)或納(na)米抗(kang)體(ti)由對抗(kang)原(yuan)表現出足(zu)夠(gou)親和力的單個vh或vl結(jie)構域組成。

所(suo)述抗體可以是(shi)單克隆(long)或多克隆(long)的(de)。

生產多克隆和(he)單(dan)克隆抗體及(ji)其片段的(de)方法是本領域眾所周知的(de)(參見例(li)如，harlow和(he)lane，antibodies：alaboratorymanual，coldspringharborlaboratory，newyork，1988，通過引用(yong)并入本文)。

根據本(ben)發明的(de)(de)(de)一(yi)些實(shi)施方(fang)(fang)案(an)的(de)(de)(de)抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)片(pian)(pian)(pian)(pian)(pian)(pian)段(duan)(duan)(duan)可以(yi)(yi)通(tong)過抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)的(de)(de)(de)蛋(dan)白(bai)酶(mei)(mei)水解或(huo)(huo)(huo)(huo)(huo)通(tong)過在大腸桿菌或(huo)(huo)(huo)(huo)(huo)哺乳動物細(xi)胞(例(li)如(ru)中(zhong)國倉鼠卵巢細(xi)胞培養(yang)物或(huo)(huo)(huo)(huo)(huo)其(qi)它蛋(dan)白(bai)表(biao)(biao)達系統(tong))中(zhong)的(de)(de)(de)編碼(ma)該(gai)(gai)片(pian)(pian)(pian)(pian)(pian)(pian)段(duan)(duan)(duan)的(de)(de)(de)dna表(biao)(biao)達來制備。借(jie)助常規方(fang)(fang)法可以(yi)(yi)通(tong)過胃(wei)蛋(dan)白(bai)酶(mei)(mei)或(huo)(huo)(huo)(huo)(huo)木瓜(gua)蛋(dan)白(bai)酶(mei)(mei)消化(hua)全(quan)(quan)抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)獲得抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)片(pian)(pian)(pian)(pian)(pian)(pian)段(duan)(duan)(duan)。例(li)如(ru)，可以(yi)(yi)通(tong)過用(yong)(yong)胃(wei)蛋(dan)白(bai)酶(mei)(mei)酶(mei)(mei)切抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)來產生(sheng)抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)片(pian)(pian)(pian)(pian)(pian)(pian)段(duan)(duan)(duan)，以(yi)(yi)提供(gong)表(biao)(biao)示(shi)為f(ab’)2的(de)(de)(de)5s片(pian)(pian)(pian)(pian)(pian)(pian)段(duan)(duan)(duan)。可以(yi)(yi)使用(yong)(yong)硫(liu)醇還原劑(ji)和(he)任選(xuan)的(de)(de)(de)由二硫(liu)鍵斷裂產生(sheng)的(de)(de)(de)巰基的(de)(de)(de)封(feng)閉基團進一(yi)步切割該(gai)(gai)片(pian)(pian)(pian)(pian)(pian)(pian)段(duan)(duan)(duan)，以(yi)(yi)產生(sheng)3.5sfab’單(dan)價(jia)片(pian)(pian)(pian)(pian)(pian)(pian)段(duan)(duan)(duan)。或(huo)(huo)(huo)(huo)(huo)者，使用(yong)(yong)胃(wei)蛋(dan)白(bai)酶(mei)(mei)的(de)(de)(de)酶(mei)(mei)切直接(jie)產生(sheng)兩個單(dan)價(jia)fab’片(pian)(pian)(pian)(pian)(pian)(pian)段(duan)(duan)(duan)和(he)fc片(pian)(pian)(pian)(pian)(pian)(pian)段(duan)(duan)(duan)。這(zhe)些方(fang)(fang)法例(li)如(ru)由goldenberg，美國專(zhuan)利號4,036,945和(he)4,331,647以(yi)(yi)及其(qi)中(zhong)包括(kuo)的(de)(de)(de)參(can)考文(wen)獻描述(shu)，這(zhe)些專(zhuan)利以(yi)(yi)其(qi)全(quan)(quan)部(bu)內容通(tong)過引(yin)用(yong)(yong)并(bing)入(ru)本(ben)文(wen)。另見porter,r.r.[biochem.j.73:119-126(1959)]。也可以(yi)(yi)使用(yong)(yong)切割抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)的(de)(de)(de)其(qi)它方(fang)(fang)法，例(li)如(ru)分離重鏈以(yi)(yi)形成單(dan)價(jia)輕-重鏈片(pian)(pian)(pian)(pian)(pian)(pian)段(duan)(duan)(duan)，進一(yi)步切割片(pian)(pian)(pian)(pian)(pian)(pian)段(duan)(duan)(duan)，或(huo)(huo)(huo)(huo)(huo)其(qi)它酶(mei)(mei)學(xue)、化(hua)學(xue)或(huo)(huo)(huo)(huo)(huo)基因(yin)技(ji)術，只要該(gai)(gai)片(pian)(pian)(pian)(pian)(pian)(pian)段(duan)(duan)(duan)與被完整的(de)(de)(de)抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)識別的(de)(de)(de)抗(kang)(kang)原結合。

fv片段(duan)包(bao)含(han)vh和vl鏈(lian)的(de)(de)(de)締合。該締合可能是非共價的(de)(de)(de)，如(ru)inbar等(deng)(deng)人[proc.nat'lacad.sci.usa69:2659-62(19720]中(zhong)所述。或者(zhe)，可變鏈(lian)可通過(guo)分子間二硫鍵(jian)連接(jie)(jie)或通過(guo)諸如(ru)戊二醛的(de)(de)(de)化學物質(zhi)進行(xing)交聯。優選(xuan)地(di)，fv片段(duan)包(bao)含(han)通過(guo)肽(tai)接(jie)(jie)頭(tou)連接(jie)(jie)的(de)(de)(de)vh和vl鏈(lian)。通過(guo)構(gou)(gou)建包(bao)含(han)通過(guo)寡核苷酸連接(jie)(jie)的(de)(de)(de)編碼(ma)vh和vl結(jie)構(gou)(gou)域的(de)(de)(de)dna序列的(de)(de)(de)結(jie)構(gou)(gou)基因來制備這些單鏈(lian)抗原(yuan)結(jie)合蛋白(sfv)。將(jiang)該結(jie)構(gou)(gou)基因插入表(biao)達載體(ti)中(zhong)，隨后(hou)將(jiang)所述表(biao)達載體(ti)導入宿主細胞，例如(ru)大腸桿菌。重(zhong)組(zu)宿主細胞合成具有橋接(jie)(jie)兩個(ge)v結(jie)構(gou)(gou)域的(de)(de)(de)接(jie)(jie)頭(tou)肽(tai)的(de)(de)(de)單個(ge)多肽(tai)鏈(lian)。用(yong)(yong)于(yu)(yu)產(chan)生sfv的(de)(de)(de)方法(fa)描(miao)述于(yu)(yu)例如(ru)[whitlow和filpula，methods2：97-105(1991)；bird等(deng)(deng)人，science242：423-426(1988)；pack等(deng)(deng)人，bio/technology11：1271-77(1993)；和美國專利號4,946,778，其全部內(nei)容(rong)通過(guo)引用(yong)(yong)并(bing)入本文。

抗(kang)體片段(duan)的(de)另一種形式(shi)是(shi)編碼單個互補(bu)決定區(qu)(qu)(cdr)的(de)肽(tai)。可(ke)以(yi)通(tong)過構(gou)建編碼目標抗(kang)體的(de)cdr的(de)基(ji)(ji)因來獲得cdr肽(tai)(“最小識別單位(wei)”)。這樣的(de)基(ji)(ji)因例(li)如(ru)通(tong)過使(shi)用聚合酶鏈式(shi)反應以(yi)從產(chan)生抗(kang)體的(de)細胞(bao)的(de)rna合成可(ke)變區(qu)(qu)來制備。參(can)見例(li)如(ru)larrick和fry[methods，2：106-10(1991)]。

應當理解，對于(yu)(yu)人(ren)(ren)(ren)(ren)類治(zhi)療或診(zhen)斷，優選(xuan)使用人(ren)(ren)(ren)(ren)源(yuan)(yuan)(yuan)化(hua)(hua)(hua)抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)。非(fei)人(ren)(ren)(ren)(ren)(例如(ru)，鼠)抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)的(de)人(ren)(ren)(ren)(ren)源(yuan)(yuan)(yuan)化(hua)(hua)(hua)形式是(shi)免(mian)(mian)(mian)疫(yi)(yi)球(qiu)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)、免(mian)(mian)(mian)疫(yi)(yi)球(qiu)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)鏈(lian)或其片段(如(ru)fv、fab、fab’、f(ab’).sub.2或抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)的(de)其它抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)原結合子(zi)序(xu)(xu)列(lie))的(de)嵌合分(fen)子(zi)，其含(han)有(you)來自非(fei)人(ren)(ren)(ren)(ren)免(mian)(mian)(mian)疫(yi)(yi)球(qiu)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)的(de)最(zui)小(xiao)序(xu)(xu)列(lie)。人(ren)(ren)(ren)(ren)源(yuan)(yuan)(yuan)化(hua)(hua)(hua)抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)包括人(ren)(ren)(ren)(ren)免(mian)(mian)(mian)疫(yi)(yi)球(qiu)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)(接(jie)受體(ti)(ti)(ti)抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti))，其中形成接(jie)受體(ti)(ti)(ti)的(de)互補決定(ding)區(qu)(cdr)的(de)殘基(ji)被來自具有(you)所(suo)(suo)需的(de)特異性(xing)、親和(he)力和(he)容量(liang)的(de)非(fei)人(ren)(ren)(ren)(ren)物種(zhong)如(ru)小(xiao)鼠、大鼠或兔的(de)cdr(供體(ti)(ti)(ti)抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti))的(de)殘基(ji)替代。在一(yi)些(xie)情況下(xia)，人(ren)(ren)(ren)(ren)免(mian)(mian)(mian)疫(yi)(yi)球(qiu)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)的(de)fv框(kuang)架殘基(ji)被相應的(de)非(fei)人(ren)(ren)(ren)(ren)殘基(ji)替代。人(ren)(ren)(ren)(ren)源(yuan)(yuan)(yuan)化(hua)(hua)(hua)抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)還可以包含(han)既不(bu)在接(jie)受體(ti)(ti)(ti)抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)中也不(bu)在輸入的(de)cdr或框(kuang)架序(xu)(xu)列(lie)中發(fa)現的(de)殘基(ji)。通常(chang)，人(ren)(ren)(ren)(ren)源(yuan)(yuan)(yuan)化(hua)(hua)(hua)抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)將包含(han)至少一(yi)個，且通常(chang)為兩個可變結構域(yu)的(de)基(ji)本上所(suo)(suo)有(you)，其中所(suo)(suo)有(you)或基(ji)本上所(suo)(suo)有(you)的(de)cdr區(qu)域(yu)對應于(yu)(yu)非(fei)人(ren)(ren)(ren)(ren)免(mian)(mian)(mian)疫(yi)(yi)球(qiu)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)的(de)那些(xie)，和(he)所(suo)(suo)有(you)或基(ji)本上所(suo)(suo)有(you)的(de)fr區(qu)域(yu)是(shi)人(ren)(ren)(ren)(ren)免(mian)(mian)(mian)疫(yi)(yi)球(qiu)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)共有(you)序(xu)(xu)列(lie)的(de)那些(xie)。人(ren)(ren)(ren)(ren)源(yuan)(yuan)(yuan)化(hua)(hua)(hua)抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)最(zui)理想地還將包含(han)免(mian)(mian)(mian)疫(yi)(yi)球(qiu)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)恒(heng)定(ding)區(qu)(fc)的(de)至少一(yi)部分(fen)，通常(chang)為人(ren)(ren)(ren)(ren)免(mian)(mian)(mian)疫(yi)(yi)球(qiu)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)的(de)恒(heng)定(ding)區(qu)(fc)[jones等人(ren)(ren)(ren)(ren)，nature，321：522-525(1986)；riechmann等人(ren)(ren)(ren)(ren)，nature，332：323-329(1988)；和(he)presta，curr.op.struct.biol.,2:593-596(1992)]。

用于人(ren)(ren)源(yuan)化(hua)非(fei)人(ren)(ren)抗(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)的(de)(de)(de)(de)方法(fa)是(shi)本(ben)領域(yu)熟知的(de)(de)(de)(de)。通(tong)常(chang)，人(ren)(ren)源(yuan)化(hua)抗(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)具有(you)從非(fei)人(ren)(ren)的(de)(de)(de)(de)來(lai)源(yuan)引入其中的(de)(de)(de)(de)一個或多個氨(an)基(ji)(ji)酸(suan)殘(can)基(ji)(ji)。這(zhe)些(xie)(xie)非(fei)人(ren)(ren)氨(an)基(ji)(ji)酸(suan)殘(can)基(ji)(ji)通(tong)常(chang)被稱(cheng)為輸(shu)入殘(can)基(ji)(ji)，其通(tong)常(chang)取(qu)(qu)自(zi)輸(shu)入可(ke)(ke)變(bian)(bian)結(jie)構域(yu)。人(ren)(ren)源(yuan)化(hua)可(ke)(ke)以基(ji)(ji)本(ben)上按照(zhao)winter和(he)(he)共事(shi)者的(de)(de)(de)(de)方法(fa)進(jin)行[jones等(deng)人(ren)(ren)，nature，321：522-525(1986)；riechmann等(deng)人(ren)(ren)，nature332：323-327(1988)；verhoeyen等(deng)人(ren)(ren)，science，239：1534-1536(1988)]，通(tong)過用嚙齒類動物cdr或cdr序列(lie)(lie)取(qu)(qu)代人(ren)(ren)抗(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)的(de)(de)(de)(de)相應序列(lie)(lie)。因此，這(zhe)樣的(de)(de)(de)(de)人(ren)(ren)源(yuan)化(hua)抗(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)是(shi)嵌合抗(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)(美國專利號4,816,567)，其中基(ji)(ji)本(ben)上小于完(wan)整的(de)(de)(de)(de)人(ren)(ren)可(ke)(ke)變(bian)(bian)結(jie)構域(yu)已被來(lai)自(zi)非(fei)人(ren)(ren)物種(zhong)的(de)(de)(de)(de)相應序列(lie)(lie)所取(qu)(qu)代。在實(shi)踐中，人(ren)(ren)源(yuan)化(hua)抗(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)通(tong)常(chang)是(shi)人(ren)(ren)抗(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)，其中一些(xie)(xie)cdr殘(can)基(ji)(ji)和(he)(he)可(ke)(ke)能(neng)的(de)(de)(de)(de)一些(xie)(xie)fr殘(can)基(ji)(ji)被來(lai)自(zi)嚙齒類動物抗(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)中的(de)(de)(de)(de)類似位(wei)點的(de)(de)(de)(de)殘(can)基(ji)(ji)取(qu)(qu)代。

也可(ke)(ke)以使(shi)用本領域已知的各種技術來生產人(ren)(ren)抗體(ti)，包(bao)括噬菌體(ti)展(zhan)示文庫[hoogenboom和(he)(he)(he)(he)winter，j.mol.biol.，227:381(1991)；marks等(deng)人(ren)(ren)，j.mol.biol.，222:581(1991)]。cole等(deng)人(ren)(ren)和(he)(he)(he)(he)boerner等(deng)人(ren)(ren)的技術也可(ke)(ke)用于制(zhi)備人(ren)(ren)單克隆(long)抗體(ti)(cole等(deng)人(ren)(ren)，monoclonalantibodiesandcancertherapy，alanr.liss，p.77(1985)和(he)(he)(he)(he)boerner等(deng)人(ren)(ren)，j.immunol.，147(1):86-95(1991)]。類似(si)地，人(ren)(ren)抗體(ti)可(ke)(ke)以通過將人(ren)(ren)免(mian)疫(yi)球蛋(dan)白基因(yin)座引入轉(zhuan)基因(yin)動物(wu)，例如其中內源(yuan)性(xing)免(mian)疫(yi)球蛋(dan)白基因(yin)已部分或(huo)完全(quan)失活的小鼠來制(zhi)備。在攻擊時觀(guan)察到人(ren)(ren)抗體(ti)產生，其在所(suo)(suo)有方(fang)面都非常(chang)類似(si)于人(ren)(ren)中所(suo)(suo)見，包(bao)括基因(yin)重排、裝配和(he)(he)(he)(he)抗體(ti)譜。這種方(fang)法描述(shu)于例如美國(guo)專利(li)號5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016和(he)(he)(he)(he)以下科學出(chu)版物(wu)：marks等(deng)人(ren)(ren)，bio/technology10：779-783(1992)；lonberg等(deng)人(ren)(ren)，nature368：856-859(1994)；morrison，nature368812-13(1994)；fishwild等(deng)人(ren)(ren)，naturebiotechnology14,845-51(1996)；neuberger，naturebiotechnology14：826(1996)；和(he)(he)(he)(he)lonberg和(he)(he)(he)(he)huszar，intern.rev.immunol.13,65-93(1995)。

一旦得到抗體，就可以測(ce)試(shi)其活性(xing)，例如(ru)通過elisa。

可(ke)以用作本(ben)(ben)發明的(de)(de)一(yi)些實(shi)施方(fang)案的(de)(de)拮抗劑(ji)的(de)(de)另一(yi)種藥(yao)劑(ji)是(shi)適(shi)體。如本(ben)(ben)文(wen)所用，術(shu)語“適(shi)體”是(shi)指結(jie)合特定(ding)分子靶(ba)標(例如蛋白)的(de)(de)雙鏈或單鏈rna分子。本(ben)(ben)領域(yu)已(yi)知(zhi)各種方(fang)法(fa)可(ke)用于設計蛋白特異性適(shi)體。本(ben)(ben)領域(yu)技術(shu)人(ren)員(yuan)可(ke)以如stoltenburgr，reinemannc和strehlitzb(biomolecularengineering(2007)24(4)：381-403)中所述地使用selex(指數富集的(de)(de)配體系統進(jin)化)來進(jin)行有效的(de)(de)選擇。

在核酸水平抑制(zhi)生物學功能

核(he)(he)酸(suan)(suan)水(shui)平(ping)的下調(diao)通常使用具有(you)核(he)(he)酸(suan)(suan)主鏈、dna、rna、其模擬物或(huo)其組合(he)的核(he)(he)酸(suan)(suan)藥劑來(lai)實現。該核(he)(he)酸(suan)(suan)藥劑可(ke)以從dna分子編碼或(huo)提供(gong)給(gei)細胞(bao)本身(shen)。

因(yin)此(ci)，本發(fa)明的(de)(de)一些實施方案的(de)(de)拮抗(kang)劑可以是(shi)rna沉默劑。如(ru)本文所(suo)用，短語“rna沉默”是(shi)指一組(zu)由rna分子介導的(de)(de)調節機制(zhi)(zhi)(zhi)[例如(ru)，rna干擾(rao)(rnai)，轉錄基因(yin)沉默(tgs)，轉錄后(hou)基因(yin)沉默(ptgs)，壓(ya)制(zhi)(zhi)(zhi)，共抑制(zhi)(zhi)(zhi)和翻譯抑制(zhi)(zhi)(zhi)]，其導致相應的(de)(de)編(bian)碼(ma)蛋(dan)白的(de)(de)基因(yin)表達的(de)(de)抑制(zhi)(zhi)(zhi)或“沉默”。已(yi)經在許多類(lei)型的(de)(de)生物(wu)體包括植物(wu)、動物(wu)和真(zhen)菌中(zhong)觀察到rna沉默。

如(ru)本(ben)文所用，術語“rna沉(chen)默劑(ji)(ji)”是指能夠使靶基因表(biao)達(da)特(te)異性(xing)抑制或“沉(chen)默”的(de)rna。在某些(xie)實施方案中，所述rna沉(chen)默劑(ji)(ji)能夠通過轉錄后沉(chen)默機制來(lai)阻止mrna分子的(de)完全加工(例(li)如(ru)全翻譯和/或表(biao)達(da))。rna沉(chen)默劑(ji)(ji)包括(kuo)非編(bian)碼rna分子，例(li)如(ru)包含配對鏈的(de)rna雙鏈體，以及(ji)從(cong)其(qi)可產生這(zhe)種小的(de)非編(bian)碼rna的(de)前體rna。示例(li)性(xing)的(de)rna沉(chen)默劑(ji)(ji)包括(kuo)dsrna，例(li)如(ru)sirna、mirna和shrna。

在一個實(shi)施(shi)方案中，所述rna沉默劑能夠誘導rna干擾。

在(zai)另一(yi)個實施(shi)方案中，所述(shu)rna沉默劑能(neng)夠介導翻譯抑制。

根(gen)據(ju)本發(fa)明的(de)(de)一(yi)個實施(shi)方(fang)案，所(suo)述(shu)rna沉默劑(ji)對靶(ba)rna(例如grin2b)是特異(yi)性的(de)(de)，并且不交叉抑制或(huo)(huo)沉默其它(ta)靶(ba)標(biao)或(huo)(huo)者剪(jian)接(jie)變體，所(suo)述(shu)剪(jian)接(jie)變體表現出(chu)與(yu)靶(ba)基因的(de)(de)99％或(huo)(huo)更小的(de)(de)總(zong)體同(tong)源性，例如與(yu)靶(ba)基因的(de)(de)小于98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％的(de)(de)總(zong)體同(tong)源性；如通過pcr、蛋白(bai)印跡、免疫組織化學和/或(huo)(huo)流式細胞術測定。

rna干擾(rao)是指由(you)短干擾(rao)rna(sirna)介(jie)導(dao)的(de)動(dong)物中序列特異性轉錄后基因(yin)沉默的(de)過程。

以(yi)(yi)下是對可以(yi)(yi)根據本發(fa)明的(de)特定實施方(fang)案使用的(de)rna沉默劑的(de)詳細描述。

dsrna、sirna和(he)shrna-細胞中(zhong)長dsrna的(de)存在刺(ci)激被稱為(wei)切酶的(de)核(he)糖(tang)核(he)酸(suan)酶iii酶的(de)活(huo)性(xing)。切酶參與(yu)將dsrna加工成稱為(wei)短干擾(rao)rna(sirna)的(de)短小片段(duan)dsrna。衍生自(zi)切酶活(huo)性(xing)的(de)短干擾(rao)rna通常(chang)長度為(wei)約(yue)21至約(yue)23個核(he)苷(gan)酸(suan)并且包含(han)約(yue)19個堿(jian)基對(dui)雙鏈(lian)體。rnai反(fan)應還具有內切核(he)酸(suan)酶復合物，通常(chang)稱為(wei)rna誘導(dao)的(de)沉默(mo)復合物(risc)，其介導(dao)具有與(yu)sirna雙鏈(lian)體的(de)反(fan)義鏈(lian)互補(bu)的(de)序(xu)列的(de)單鏈(lian)rna的(de)切割(ge)。靶rna的(de)切割(ge)發生在與(yu)sirna雙鏈(lian)體的(de)反(fan)義鏈(lian)互補(bu)的(de)區域的(de)中(zhong)間。

因此，本發明的一些實施方案(an)預(yu)期使用dsrna從mrna下(xia)調(diao)蛋白表達。

根(gen)據一個實施方(fang)案，使用(yong)長于(yu)30bp的dsrna。各種(zhong)研(yan)究表明長的dsrna可用(yong)于(yu)使基因表達沉默而不誘導應激反(fan)應或(huo)引起顯著的脫(tuo)靶效(xiao)應-參(can)見例(li)如[strat等人，nucleicacidsresearch，2006，第(di)(di)34卷，第(di)(di)13期3803-3810；bhargavaa等人brainres.protoc.2004；13:115–125；diallom.，等人，oligonucleotides.2003；13:381–392；paddisonp.j.，等人，proc.natl.acad.sci.usa.2002；99：1443-1448；trann.，等人，febslett.2004；573：127-134]。

根據(ju)本發明的一些實施方案，在(zai)干(gan)擾素(su)途徑未被(bei)活化的細胞中(zhong)提供(gong)dsrna，參見例如billy等人(ren)，pnas2001，第98卷(juan)，第14428-14433頁。和(he)diallo等人(ren)，oligonucleotides，2003年(nian)10月1日，13(5)：381-392。doi：10.1089/2617069。

根據(ju)本(ben)發(fa)明的(de)(de)一(yi)個實施方(fang)案，長(chang)dsrna被(bei)特異地(di)設(she)計為不(bu)誘(you)導用(yong)于下調基因(yin)(yin)表達的(de)(de)干擾素和(he)pkr途(tu)徑。例(li)如，shinagwa和(he)ishii[genes&dev.17(11)：1340-1345,2003]已開(kai)發(fa)了(le)一(yi)種名為pdecap的(de)(de)載體，以從rna聚合(he)酶(mei)ii(polii)啟(qi)動子表達長(chang)雙鏈(lian)rna。因(yin)(yin)為pdecap的(de)(de)轉(zhuan)錄(lu)物缺乏促(cu)進ds-rna輸出到(dao)細胞質的(de)(de)5’-帽結(jie)構和(he)3’-聚(a)尾，所以來自pdecap的(de)(de)長(chang)ds-rna不(bu)會誘(you)導干擾素反應。

在哺(bu)乳動物系統中逃避干擾素和pkr途徑的另一種方法是通過(guo)轉染或內(nei)源表達(da)引入小的抑(yi)制性rna(sirna)。

術語(yu)“sirna”是(shi)(shi)指誘(you)導rna干擾(rao)(rnai)途徑的(de)小的(de)抑(yi)制(zhi)性(xing)rna雙(shuang)(shuang)鏈(lian)體(ti)(ti)(ti)(通常在(zai)18-30個堿(jian)基(ji)對之間)。盡(jin)管最近已經描述(shu)了(le)25-30個堿(jian)基(ji)長度的(de)化(hua)學合成(cheng)的(de)rna雙(shuang)(shuang)鏈(lian)體(ti)(ti)(ti)可以具有與同一(yi)位置的(de)21聚(ju)(ju)(ju)體(ti)(ti)(ti)相(xiang)比效(xiao)力增加100倍之多(duo)，通常，sirna經化(hua)學合成(cheng)為(wei)具有中心(xin)19bp雙(shuang)(shuang)鏈(lian)體(ti)(ti)(ti)區域和在(zai)末端的(de)對稱(cheng)的(de)2-堿(jian)基(ji)3’-突出端的(de)21聚(ju)(ju)(ju)體(ti)(ti)(ti)。觀察到的(de)使用更長的(de)rna在(zai)觸發rnai中獲得的(de)增加的(de)效(xiao)力被認為(wei)是(shi)(shi)由向切酶提供底物(27聚(ju)(ju)(ju)體(ti)(ti)(ti))而(er)不是(shi)(shi)產(chan)物(21聚(ju)(ju)(ju)體(ti)(ti)(ti))產(chan)生的(de)，并(bing)且(qie)這提高(gao)了(le)sirna雙(shuang)(shuang)鏈(lian)體(ti)(ti)(ti)進入risc的(de)速率(lv)(lv)或效(xiao)率(lv)(lv)。

已(yi)經發現3’-突(tu)出端的位置影響sirna的效力和(he)在(zai)反(fan)義(yi)(yi)鏈(lian)上具(ju)有3’-突(tu)出端的不對(dui)稱(cheng)雙鏈(lian)體通常比在(zai)有義(yi)(yi)鏈(lian)上具(ju)有3'-突(tu)出端的那些更有效(rose等人，2005)。這(zhe)可以歸因于不對(dui)稱(cheng)鏈(lian)加載成risc，因為當靶向反(fan)義(yi)(yi)轉(zhuan)錄物時觀察到相反(fan)的功效模式。

雙鏈干擾rna(例如sirna)的(de)(de)鏈可(ke)以(yi)連(lian)接以(yi)形成發夾(jia)或莖(jing)環(huan)結構(例如shrna)。因此，如上所述，本(ben)發明一些(xie)實施方案的(de)(de)rna沉默劑也(ye)可(ke)以(yi)是短發夾(jia)rna(shrna)。

如本文所(suo)(suo)用的(de)(de)術(shu)語“shrna”是指具(ju)有莖(jing)-環(huan)結(jie)構(gou)(gou)(gou)的(de)(de)rna藥劑，其包含互補序列(lie)的(de)(de)第一(yi)(yi)和第二區(qu)(qu)域，所(suo)(suo)述(shu)區(qu)(qu)域的(de)(de)互補性(xing)和定向足以使得(de)堿(jian)基(ji)配對發生在所(suo)(suo)述(shu)區(qu)(qu)域，即由環(huan)區(qu)(qu)連(lian)接的(de)(de)第一(yi)(yi)和第二區(qu)(qu)域之(zhi)間，所(suo)(suo)述(shu)環(huan)由環(huan)區(qu)(qu)內(nei)的(de)(de)核(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(或(huo)(huo)核(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)類似物)之(zhi)間缺乏堿(jian)基(ji)配對而(er)產生。環(huan)中(zhong)的(de)(de)核(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)數目為3至(zhi)23，或(huo)(huo)5至(zhi)15，或(huo)(huo)7至(zhi)13，或(huo)(huo)4至(zhi)9，或(huo)(huo)9至(zhi)11之(zhi)間(包括(kuo)端點)的(de)(de)數字。環(huan)中(zhong)的(de)(de)一(yi)(yi)些核(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)可(ke)與(yu)環(huan)中(zhong)其它核(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)參與(yu)堿(jian)基(ji)對相(xiang)互作用。可(ke)用于形成環(huan)的(de)(de)寡核(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)序列(lie)的(de)(de)實例包括(kuo)5'-caagaga-3'和5'-uuacaa-3'(國際(ji)專利申請號wo2013126963和wo2014107763)。本領(ling)域技術(shu)人員將(jiang)認(ren)識到，所(suo)(suo)得(de)單鏈寡核(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)形成包含能夠與(yu)rnai機構(gou)(gou)(gou)相(xiang)互作用的(de)(de)雙鏈區(qu)(qu)的(de)(de)莖(jing)環(huan)或(huo)(huo)發夾結(jie)構(gou)(gou)(gou)。

適用(yong)于本發明一(yi)些實施方案(an)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)rna沉(chen)默劑(ji)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)合成可如(ru)下(xia)實現。首(shou)先，將受體或受體亞基(例如(ru)grin2b)mrna序列在aug起始(shi)密碼子的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)下(xia)游(you)掃描(miao)aa二(er)核(he)(he)苷(gan)酸(suan)序列。每個aa和(he)3'相鄰的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)19個核(he)(he)苷(gan)酸(suan)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)出(chu)現記錄(lu)為潛在的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)sirna靶位點(dian)。優(you)選(xuan)地(di)，sirna靶位點(dian)從開放閱(yue)讀框中(zhong)選(xuan)擇，因為非(fei)翻(fan)(fan)譯區(qu)(utr)在調節蛋(dan)白(bai)(bai)結合位點(dian)中(zhong)更富集。utr結合蛋(dan)白(bai)(bai)和(he)/或翻(fan)(fan)譯起始(shi)復合物可能干擾sirna內切核(he)(he)酸(suan)酶復合物的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)結合[tuschlchembiochem.2：239-245]。然而應當理解，在非(fei)翻(fan)(fan)譯區(qu)引導的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)sirna也可以是(shi)有效的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)，如(ru)用(yong)于gapdh所(suo)證實的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)，其中(zhong)定向在5'utr的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)sirna介導細胞gapdhmrna的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)約90％的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)降低并在蛋(dan)白(bai)(bai)水平完(wan)全消除(chu)(www.ambion.com/techlib/tn/91/912.html)。

其次，使(shi)用任何序列比(bi)對軟件(例如(ru)可從ncbi服務器獲得的(de)blast軟件(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/))將潛在(zai)靶位(wei)點(dian)與適當(dang)的(de)基(ji)因組(zu)數據庫(例如(ru)，人，小鼠，大鼠等)進行比(bi)較(jiao)。與其它編(bian)碼序列顯(xian)示顯(xian)著同源性的(de)推定(ding)靶位(wei)點(dian)被過濾(lv)掉。

選擇(ze)合(he)格的(de)靶(ba)序列(lie)作(zuo)為sirna合(he)成的(de)模板。優選的(de)序列(lie)是那些包括(kuo)低g/c含(han)(han)(han)量(liang)的(de)序列(lie)，因為與(yu)g/c含(han)(han)(han)量(liang)高于55％的(de)那些相比，這(zhe)些低g/c含(han)(han)(han)量(liang)的(de)序列(lie)被(bei)證(zheng)明在(zai)介導基因沉(chen)默中更有效。優選沿著(zhu)靶(ba)基因的(de)長度選擇(ze)幾個靶(ba)位點(dian)用(yong)于評(ping)價。為了更好(hao)地(di)評(ping)估(gu)所選擇(ze)的(de)sirna，優選結合(he)使用(yong)陰性對(dui)照。陰性對(dui)照sirna優選包括(kuo)與(yu)sirna相同的(de)核苷酸組(zu)成，但與(yu)基因組(zu)缺(que)乏顯(xian)著(zhu)的(de)同源性。因此，優選使用(yong)sirna的(de)加擾核苷酸序列(lie)，條(tiao)件是其不顯(xian)示與(yu)任何其它基因的(de)任何顯(xian)著(zhu)的(de)同源性。

例(li)如，針對grin2b引導的合適的sirna可以(yi)從例(li)如sigma獲得。

應(ying)當理解(jie)，并且如上所述(shu)，本發明的(de)一些實(shi)施(shi)方案的(de)rna沉默劑不需(xu)要限于(yu)僅含有(you)rna的(de)那(nei)些分子(zi)，而(er)是進一步包括經化學修飾的(de)核苷(gan)酸和非核苷(gan)酸。

根據另一個實施方案，所(suo)述rna沉(chen)默劑可以是(shi)mirna。

術(shu)語“微小rna”、“mirna”和“mir”是同義詞，是指約19-28個(ge)核苷(gan)酸長度的(de)非編碼單鏈rna分子的(de)集合，其調節基因表達(da)。發現mirna在廣泛(fan)的(de)生物體(病毒、fwdarw.人)中存在，并且(qie)已顯示(shi)在發育、體內平衡和疾病病因學中起作(zuo)用(yong)。

以下是mirna活性機制的簡(jian)要說明(ming)。

編(bian)碼mirna的(de)(de)基因被轉錄(lu)，導致產(chan)生稱為pri-mirna的(de)(de)mirna前體。pri-mirna可以(yi)形成具有莖(jing)和環的(de)(de)發(fa)夾。

pri-mirna的發夾結構被drosha識別，drosha是rnaseiii內切核酸酶。drosha通常識別pri-mirna中的末端環，并以典型的rna酶iii內切核酸酶的交錯切割來切割pri-mirna，產生具有5’磷酸和個(ge)核(he)苷(gan)酸3'突出端(duan)的(de)pre-mirna莖環(huan)。然(ran)后通過(guo)ran-gtp和輸(shu)出受體ex-portin-5將pre-mirna從細胞核(he)活躍(yue)地轉運(yun)到細胞質。

雙鏈莖或pre-mirna的莖環的基部處的5'磷酸和3'突出端然后被切酶識別，切酶也是rnaseiii內切核酸酶。然后，切酶從莖環的基部切除末端環兩個螺旋轉角，留下另外的5'磷酸和個核苷酸3'突出端。可(ke)能(neng)包(bao)含錯配的所得(de)sirna樣雙鏈體包(bao)含成熟mirna和稱為mirna*的相似大小的片(pian)段。mirna*序(xu)列可(ke)以在(zai)克隆的mirna的文(wen)庫(ku)中發現，但通常以比mirna更低的頻率存在(zai)。

盡管(guan)最(zui)初與mirna*作為(wei)(wei)雙鏈物(wu)種存在，但mirna最(zui)終作為(wei)(wei)單(dan)鏈rna并入被稱(cheng)為(wei)(wei)rna誘導的(de)沉默復合(he)物(wu)(risc)的(de)核糖核蛋白復合(he)物(wu)，而mirna*被去除和降(jiang)解。

基(ji)(ji)于mirna和(he)mrna之間(jian)的(de)(de)高水平互(hu)補性，特別是mirna的(de)(de)核(he)苷(gan)酸(suan)2-7，risc鑒定靶核(he)酸(suan)。一(yi)(yi)些研(yan)究(jiu)已(yi)經查看了mirna與其(qi)mrna靶標之間(jian)的(de)(de)堿基(ji)(ji)配對要求(qiu)，以實現翻譯的(de)(de)有效抑制(bartel綜述，2004，cell116-281)。在(zai)哺乳動物細胞中(zhong)，mirna的(de)(de)前8個核(he)苷(gan)酸(suan)可能很(hen)重(zhong)要(doench&sharp2004genesdev2004-504)。然而，微小rna的(de)(de)其(qi)它(ta)部分(fen)也(ye)可以參與mrna結(jie)合(he)。此外，在(zai)3’處(chu)的(de)(de)充(chong)分(fen)的(de)(de)堿基(ji)(ji)配對可補償5'處(chu)的(de)(de)不充(chong)分(fen)配對(brennecke等人，2005plos3-e85)。分(fen)析在(zai)全基(ji)(ji)因組上的(de)(de)mirna結(jie)合(he)的(de)(de)計(ji)算研(yan)究(jiu)已(yi)表明，mirna的(de)(de)5’處(chu)的(de)(de)堿基(ji)(ji)2-7在(zai)靶結(jie)合(he)上的(de)(de)特定作用(yong)，但是通(tong)常被(bei)發現是“a”的(de)(de)第一(yi)(yi)核(he)苷(gan)酸(suan)的(de)(de)作用(yong)也(ye)被(bei)認可(lewis等人，2005cell120-15)。類似地，krek等人使用(yong)核(he)苷(gan)酸(suan)1-7或2-8來(lai)鑒定和(he)驗證靶標(2005，natgenet37-495)。

mrna中(zhong)(zhong)的(de)靶位點可以在(zai)5’utr、3'utr中(zhong)(zhong)或編碼區中(zhong)(zhong)。

mirna可(ke)以通過以下(xia)兩種機制中的(de)任一(yi)種來引導risc下(xia)調基因表(biao)達(da)：mrna切(qie)割或翻譯(yi)抑(yi)制。如果(guo)mrna與mirna具(ju)有一(yi)定程度的(de)互(hu)補(bu)性，則mirna可(ke)以指定mrna的(de)切(qie)割。當mirna指導切(qie)割時，切(qie)口(kou)通常在與mirna的(de)殘基10和11配對的(de)核苷酸之間。或者，如果(guo)mirna不具(ju)有與mirna的(de)必要程度的(de)互(hu)補(bu)性，則mirna可(ke)抑(yi)制翻譯(yi)。

從上文提供(gong)的描述可以(yi)理(li)解(jie)，細(xi)(xi)胞與mirna的接觸可以(yi)通過用例如成熟(shu)的雙鏈mirna、pre-mirna或pri-mirna轉染/加載細(xi)(xi)胞來實現。

pre-mirna序(xu)列(lie)可以包含45-90、60-80或60-70個核苷(gan)酸。

pri-mirna序列可以包含45-30000、50-25000、100-20000、1000-1500或80-100個(ge)核(he)苷酸(suan)。

反(fan)義(yi)-反(fan)義(yi)是設計用于通過與其mrna特(te)(te)異性雜交(jiao)來阻止(zhi)或抑制(zhi)基(ji)因表(biao)達的單鏈rna。可以使用能夠與編碼(ma)受體或受體亞(ya)基(ji)(例如grin2b)的mrna轉錄(lu)物特(te)(te)異性雜交(jiao)的反(fan)義(yi)多核(he)苷酸來實現受體的下調。

必須在考慮對反(fan)義方法重要的(de)(de)兩個方面(mian)時實現(xian)可用于有效下(xia)調(diao)受體的(de)(de)反(fan)義分(fen)子的(de)(de)設(she)計(ji)。第(di)一方面(mian)是將寡核(he)(he)苷酸遞送到適當細胞(bao)的(de)(de)細胞(bao)質中，而第(di)二方面(mian)是以抑(yi)制其翻(fan)譯的(de)(de)方式特(te)異性結(jie)合細胞(bao)內的(de)(de)指(zhi)定mrna的(de)(de)寡核(he)(he)苷酸的(de)(de)設(she)計(ji)。

現有技術教導可用于將寡核苷酸有效地遞送到多種細胞類型中的許多遞送策略[參見例如等(deng)人(ren)(ren)cellmolbiollett.(2002)7(2):236-7；gait,cellmollifesci.(2003)60(5):844-53；martino等(deng)人(ren)(ren)jbiomedbiotechnol.(2009)2009：410260；grijalvo等(deng)人(ren)(ren)expertopintherpat.(2014)24(7):801-19；falzarano等(deng)人(ren)(ren)，nucleicacidther.(2014)24(1)：87-100；shilakari等(deng)人(ren)(ren)biomedresint.(2014)2014:526391；prakash等(deng)人(ren)(ren)nucleicacidsres.-2014)42(13):8796-807和asseline等(deng)人(ren)(ren)jgenemed.(2014)16(7-8):157-65]。

另外，基于(yu)(yu)解(jie)釋(shi)靶mrna和寡(gua)核(he)苷酸兩者(zhe)中的(de)結構改變的(de)力能學的(de)熱力學循(xun)環，用(yong)于(yu)(yu)鑒定對其靶mrna具有(you)最高(gao)預測(ce)結合親和力的(de)那(nei)些(xie)序列的(de)算法也是可(ke)用(yong)的(de)[參見(jian)例如walton等人(ren)biotechnolbioeng65：1-9(1999)]。這些(xie)算法已成功(gong)地用(yong)于(yu)(yu)在細胞中實(shi)施(shi)反義方法。

此(ci)外，還公(gong)開了使(shi)用(yong)體外系(xi)統設計和預測特(te)異(yi)性寡核(he)苷酸的效率(lv)的幾種(zhong)方法(fa)(matveeva等人，naturebiotechnology16：1374-1375(1998)]。

因此，產生高度準確(que)的(de)反義(yi)設計算法和多種寡核苷酸遞(di)送系(xi)統能夠使普通技術人(ren)員設計和實(shi)施適(shi)用(yong)于下調已(yi)知(zhi)序列表達的(de)反義(yi)方法，而不必訴諸(zhu)于不適(shi)當的(de)試驗和錯誤實(shi)驗。

如(ru)下文(wen)所總結，核酸藥劑也可以在dna水平操作。

抑制受體(ti)的(de)生物學功(gong)能還可以通過引(yin)入基(ji)因(yin)結構(gou)中涉及功(gong)能喪失(shi)改變(bian)的(de)靶向(xiang)突變(bian)(例(li)如點突變(bian)、缺失(shi)和(he)插入)而使(shi)基(ji)因(yin)(例(li)如，grin2b)失(shi)活來(lai)實(shi)現。

如(ru)本文所用，短(duan)語“功能(neng)(neng)喪失(shi)(shi)改(gai)變(bian)(bian)(bian)(bian)(bian)”是指(zhi)基(ji)因的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)dna序(xu)列(lie)(lie)中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)任何突(tu)(tu)(tu)(tu)(tu)(tu)變(bian)(bian)(bian)(bian)(bian)，其(qi)(qi)導(dao)(dao)致(zhi)(zhi)表達產物，即(ji)(ji)mrna轉(zhuan)錄物和(he)/或(huo)(huo)(huo)(huo)(huo)(huo)翻譯的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)表達水平(ping)和(he)/或(huo)(huo)(huo)(huo)(huo)(huo)活(huo)(huo)性(xing)(xing)下調。這種功能(neng)(neng)喪失(shi)(shi)變(bian)(bian)(bian)(bian)(bian)化(hua)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)非(fei)限(xian)制性(xing)(xing)實(shi)例(li)(li)(li)包括錯(cuo)義(yi)突(tu)(tu)(tu)(tu)(tu)(tu)變(bian)(bian)(bian)(bian)(bian)，即(ji)(ji)，使用另一(yi)個(ge)氨(an)(an)基(ji)酸(suan)(suan)殘(can)(can)基(ji)改(gai)變(bian)(bian)(bian)(bian)(bian)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)氨(an)(an)基(ji)酸(suan)(suan)殘(can)(can)基(ji)并(bing)由此消(xiao)除該蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)酶(mei)(mei)活(huo)(huo)性(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)突(tu)(tu)(tu)(tu)(tu)(tu)變(bian)(bian)(bian)(bian)(bian)；無義(yi)突(tu)(tu)(tu)(tu)(tu)(tu)變(bian)(bian)(bian)(bian)(bian)，即(ji)(ji)，在蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)中(zhong)引入(ru)終(zhong)(zhong)止(zhi)密(mi)碼(ma)(ma)(ma)(ma)(ma)子(zi)(zi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)突(tu)(tu)(tu)(tu)(tu)(tu)變(bian)(bian)(bian)(bian)(bian)，所述終(zhong)(zhong)止(zhi)密(mi)碼(ma)(ma)(ma)(ma)(ma)子(zi)(zi)例(li)(li)(li)如(ru)早(zao)期(qi)終(zhong)(zhong)止(zhi)密(mi)碼(ma)(ma)(ma)(ma)(ma)子(zi)(zi)，其(qi)(qi)導(dao)(dao)致(zhi)(zhi)缺(que)(que)乏(fa)酶(mei)(mei)活(huo)(huo)性(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)較短(duan)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)；移(yi)碼(ma)(ma)(ma)(ma)(ma)突(tu)(tu)(tu)(tu)(tu)(tu)變(bian)(bian)(bian)(bian)(bian)，即(ji)(ji)突(tu)(tu)(tu)(tu)(tu)(tu)變(bian)(bian)(bian)(bian)(bian)，通常為，改(gai)變(bian)(bian)(bian)(bian)(bian)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)閱讀(du)(du)框(kuang)(kuang)架的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)核酸(suan)(suan)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)缺(que)(que)失(shi)(shi)或(huo)(huo)(huo)(huo)(huo)(huo)插入(ru)，并(bing)且(qie)可(ke)能(neng)(neng)通過將終(zhong)(zhong)止(zhi)密(mi)碼(ma)(ma)(ma)(ma)(ma)子(zi)(zi)引入(ru)閱讀(du)(du)框(kuang)(kuang)架來導(dao)(dao)致(zhi)(zhi)早(zao)期(qi)終(zhong)(zhong)止(zhi)(例(li)(li)(li)如(ru)，缺(que)(que)乏(fa)酶(mei)(mei)活(huo)(huo)性(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)截短(duan)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai))，或(huo)(huo)(huo)(huo)(huo)(huo)在影響蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)二級或(huo)(huo)(huo)(huo)(huo)(huo)三級結構的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)較長氨(an)(an)基(ji)酸(suan)(suan)序(xu)列(lie)(lie)(例(li)(li)(li)如(ru)，連(lian)續蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai))中(zhong)，并(bing)且(qie)導(dao)(dao)致(zhi)(zhi)缺(que)(que)乏(fa)非(fei)突(tu)(tu)(tu)(tu)(tu)(tu)變(bian)(bian)(bian)(bian)(bian)多肽的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)酶(mei)(mei)活(huo)(huo)性(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)非(fei)功能(neng)(neng)性(xing)(xing)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)；由于(yu)移(yi)碼(ma)(ma)(ma)(ma)(ma)突(tu)(tu)(tu)(tu)(tu)(tu)變(bian)(bian)(bian)(bian)(bian)或(huo)(huo)(huo)(huo)(huo)(huo)修飾的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)終(zhong)(zhong)止(zhi)密(mi)碼(ma)(ma)(ma)(ma)(ma)子(zi)(zi)突(tu)(tu)(tu)(tu)(tu)(tu)變(bian)(bian)(bian)(bian)(bian)(即(ji)(ji)當(dang)終(zhong)(zhong)止(zhi)密(mi)碼(ma)(ma)(ma)(ma)(ma)子(zi)(zi)被突(tu)(tu)(tu)(tu)(tu)(tu)變(bian)(bian)(bian)(bian)(bian)成氨(an)(an)基(ji)酸(suan)(suan)密(mi)碼(ma)(ma)(ma)(ma)(ma)子(zi)(zi)時)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)連(lian)續突(tu)(tu)(tu)(tu)(tu)(tu)變(bian)(bian)(bian)(bian)(bian)，具有消(xiao)除的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)酶(mei)(mei)活(huo)(huo)性(xing)(xing)；啟(qi)動(dong)子(zi)(zi)突(tu)(tu)(tu)(tu)(tu)(tu)變(bian)(bian)(bian)(bian)(bian)，即(ji)(ji)啟(qi)動(dong)子(zi)(zi)序(xu)列(lie)(lie)中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)突(tu)(tu)(tu)(tu)(tu)(tu)變(bian)(bian)(bian)(bian)(bian)，通常為5’至基(ji)因的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)轉(zhuan)錄起始位(wei)(wei)點，其(qi)(qi)導(dao)(dao)致(zhi)(zhi)特異性(xing)(xing)基(ji)因產物的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)下調；調節突(tu)(tu)(tu)(tu)(tu)(tu)變(bian)(bian)(bian)(bian)(bian)，即(ji)(ji)在上游(you)或(huo)(huo)(huo)(huo)(huo)(huo)下游(you)或(huo)(huo)(huo)(huo)(huo)(huo)基(ji)因內(nei)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)區域中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)突(tu)(tu)(tu)(tu)(tu)(tu)變(bian)(bian)(bian)(bian)(bian)，其(qi)(qi)影響基(ji)因產物的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)表達；缺(que)(que)失(shi)(shi)突(tu)(tu)(tu)(tu)(tu)(tu)變(bian)(bian)(bian)(bian)(bian)，即(ji)(ji)缺(que)(que)失(shi)(shi)基(ji)因序(xu)列(lie)(lie)中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)編(bian)(bian)碼(ma)(ma)(ma)(ma)(ma)核酸(suan)(suan)并(bing)且(qie)可(ke)能(neng)(neng)導(dao)(dao)致(zhi)(zhi)移(yi)碼(ma)(ma)(ma)(ma)(ma)突(tu)(tu)(tu)(tu)(tu)(tu)變(bian)(bian)(bian)(bian)(bian)或(huo)(huo)(huo)(huo)(huo)(huo)符(fu)合讀(du)(du)框(kuang)(kuang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)突(tu)(tu)(tu)(tu)(tu)(tu)變(bian)(bian)(bian)(bian)(bian)(在編(bian)(bian)碼(ma)(ma)(ma)(ma)(ma)序(xu)列(lie)(lie)內(nei)，一(yi)個(ge)或(huo)(huo)(huo)(huo)(huo)(huo)多個(ge)氨(an)(an)基(ji)酸(suan)(suan)密(mi)碼(ma)(ma)(ma)(ma)(ma)子(zi)(zi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)缺(que)(que)失(shi)(shi))的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)突(tu)(tu)(tu)(tu)(tu)(tu)變(bian)(bian)(bian)(bian)(bian)；插入(ru)突(tu)(tu)(tu)(tu)(tu)(tu)變(bian)(bian)(bian)(bian)(bian)，即(ji)(ji)，將編(bian)(bian)碼(ma)(ma)(ma)(ma)(ma)或(huo)(huo)(huo)(huo)(huo)(huo)非(fei)編(bian)(bian)碼(ma)(ma)(ma)(ma)(ma)核酸(suan)(suan)插入(ru)基(ji)因序(xu)列(lie)(lie)中(zhong)，并(bing)且(qie)可(ke)能(neng)(neng)導(dao)(dao)致(zhi)(zhi)一(yi)個(ge)或(huo)(huo)(huo)(huo)(huo)(huo)多個(ge)氨(an)(an)基(ji)酸(suan)(suan)密(mi)碼(ma)(ma)(ma)(ma)(ma)子(zi)(zi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)移(yi)碼(ma)(ma)(ma)(ma)(ma)突(tu)(tu)(tu)(tu)(tu)(tu)變(bian)(bian)(bian)(bian)(bian)或(huo)(huo)(huo)(huo)(huo)(huo)符(fu)合讀(du)(du)框(kuang)(kuang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)插入(ru)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)突(tu)(tu)(tu)(tu)(tu)(tu)變(bian)(bian)(bian)(bian)(bian)；倒位(wei)(wei)，即(ji)(ji)導(dao)(dao)致(zhi)(zhi)反向編(bian)(bian)碼(ma)(ma)(ma)(ma)(ma)或(huo)(huo)(huo)(huo)(huo)(huo)非(fei)編(bian)(bian)碼(ma)(ma)(ma)(ma)(ma)序(xu)列(lie)(lie)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)突(tu)(tu)(tu)(tu)(tu)(tu)變(bian)(bian)(bian)(bian)(bian)；剪接突(tu)(tu)(tu)(tu)(tu)(tu)變(bian)(bian)(bian)(bian)(bian)，即(ji)(ji)導(dao)(dao)致(zhi)(zhi)異常剪接或(huo)(huo)(huo)(huo)(huo)(huo)剪接不良的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)突(tu)(tu)(tu)(tu)(tu)(tu)變(bian)(bian)(bian)(bian)(bian)；以及(ji)重復突(tu)(tu)(tu)(tu)(tu)(tu)變(bian)(bian)(bian)(bian)(bian)，即(ji)(ji)導(dao)(dao)致(zhi)(zhi)重復的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)編(bian)(bian)碼(ma)(ma)(ma)(ma)(ma)或(huo)(huo)(huo)(huo)(huo)(huo)非(fei)編(bian)(bian)碼(ma)(ma)(ma)(ma)(ma)序(xu)列(lie)(lie)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)突(tu)(tu)(tu)(tu)(tu)(tu)變(bian)(bian)(bian)(bian)(bian)，其(qi)(qi)可(ke)能(neng)(neng)是符(fu)合讀(du)(du)框(kuang)(kuang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)或(huo)(huo)(huo)(huo)(huo)(huo)可(ke)能(neng)(neng)引起移(yi)碼(ma)(ma)(ma)(ma)(ma)。

根據特定的(de)實(shi)施方案，基(ji)因(yin)的(de)功能喪失改(gai)變(bian)可(ke)以(yi)包含該基(ji)因(yin)的(de)至少一個等位基(ji)因(yin)。

如本文所(suo)用的(de)術語“等(deng)(deng)位(wei)基因”是指基因座的(de)一(yi)個或多個替代(dai)形(xing)式中的(de)任何一(yi)個，所(suo)有這些(xie)等(deng)(deng)位(wei)基因都(dou)與性狀或特征有關(guan)。在(zai)二倍(bei)體(ti)細胞或生物體(ti)中，給定基因的(de)兩(liang)個等(deng)(deng)位(wei)基因占據一(yi)對同源染色體(ti)上相應的(de)基因座。

根據其它特定的(de)實施方案，基(ji)(ji)(ji)因的(de)功能喪失改變包括基(ji)(ji)(ji)因的(de)兩個等位基(ji)(ji)(ji)因。

將核酸改變引(yin)入(ru)目標基因的方法在本領(ling)域是熟知的[參(can)見(jian)例如(ru)menked.genesis(2013)51：-188；capecchi，science(1989)244：1288-1292；santiago等人procnatlacadsciusa(2008)105：5809-5814；國際(ji)專(zhuan)(zhuan)利申(shen)請號wo2014085593，wo2009071334和(he)(he)(he)wo2011146121；美國專(zhuan)(zhuan)利號8,771,945、8,586,526、6,774,279和(he)(he)(he)up專(zhuan)(zhuan)利申(shen)請公開號20030232410、20050026157、us20060014264；其內容通(tong)過引(yin)用整體并入(ru)]，并且(qie)包括靶(ba)向同源重組(zu)(zu)(例如(ru)“命中和(he)(he)(he)運行”，“雙重替換”)，位點特異性重組(zu)(zu)酶(mei)(mei)(例如(ru)cre重組(zu)(zu)酶(mei)(mei)和(he)(he)(he)flp重組(zu)(zu)酶(mei)(mei))，pb轉座酶(mei)(mei)(例如(ru)sleepingbeauty，piggybac，tol2或(huo)frogprince)，通(tong)過工程改造的核酸酶(mei)(mei)的基因組(zu)(zu)編輯(例如(ru)大范圍(wei)核酸酶(mei)(mei)，鋅指核酸酶(mei)(mei)(zfn)，轉錄活化劑如(ru)效應(ying)子核酸酶(mei)(mei)(talen)和(he)(he)(he)crispr/cas系統)和(he)(he)(he)使用重組(zu)(zu)腺伴隨病毒(raav)平臺的基因組(zu)(zu)編輯。用于向目標基因引(yin)入(ru)核酸改變的藥劑可以從公眾可獲(huo)(huo)得的來源設計，或(huo)者可以從transposagen、addgene和(he)(he)(he)sangamobiosciences商業(ye)獲(huo)(huo)得。

用(yong)于定性功效和(he)檢(jian)測序列改(gai)變(bian)的(de)(de)方法是本領域熟知的(de)(de)，且(qie)包(bao)括(kuo)但不限(xian)于dna測序、電泳、基于酶的(de)(de)錯配檢(jian)測測定和(he)雜交(jiao)測定如pcr、rt-pcr、rna酶保(bao)護、原位(wei)雜交(jiao)、引物(wu)延伸、dna印跡(ji)、rna印跡(ji)和(he)斑點印跡(ji)分析(xi)。

特定基因中的序列改(gai)變(bian)也可(ke)以(yi)使用例如色譜法(fa)(fa)、電泳方法(fa)(fa)、免疫檢(jian)測測定法(fa)(fa)，如elisa和蛋(dan)白(bai)質印跡分(fen)析和免疫組織化學在蛋(dan)白(bai)水平上(shang)確定。

gd的主要表現之一是大量葡(pu)糖神(shen)經(jing)酰(xian)胺(glccer)在神(shen)經(jing)元細胞中的病理積累。因此(ci)，在某些實(shi)施方案(an)中，β-葡(pu)糖腦苷脂酶活性缺陷(xian)表現為(wei)glccer在神(shen)經(jing)元中的升高和(he)/或病理學積累。

gd2型(xing)(xing)和3型(xing)(xing)與(yu)gd1型(xing)(xing)區別的(de)(de)關(guan)鍵(jian)標準之一是中樞神經系統(cns)的(de)(de)參與(yu)和cns相關(guan)癥狀(zhuang)的(de)(de)出(chu)現。因此，在某些(xie)實施方案中，神經元(yuan)(yuan)細胞是中樞神經系統(cns)神經元(yuan)(yuan)。

如現(xian)在已知的(de)是(shi)，甚至在載體中發(fa)(fa)現(xian)的(de)gba1突(tu)變是(shi)帕金(jin)森氏病(bing)的(de)高危因素(su)，預期(qi)用根據本發(fa)(fa)明的(de)nmda拮抗劑的(de)治療(liao)甚至對于這(zhe)類(lei)易患pd的(de)具有gba1突(tu)變的(de)患者也(ye)是(shi)有益(yi)的(de)。不希望(wang)受(shou)任何理論或作(zuo)用機制的(de)約束(shu)，預期(qi)這(zhe)種(zhong)治療(liao)可(ke)能會延緩疾病(bing)的(de)發(fa)(fa)病(bing)。

根(gen)據(ju)特定的(de)實施(shi)方案，nmda受(shou)(shou)(shou)體(ti)拮抗(kang)劑特異(yi)性結合nmda受(shou)(shou)(shou)體(ti)，與其它(ta)受(shou)(shou)(shou)體(ti)沒有交叉反應性。

已知許多(duo)充當nmda受體拮抗(kang)劑的(de)化合物具有其(qi)它(ta)生(sheng)物活(huo)性(如例如上文表1中所示)。因(yin)此(ci)，根據其(qi)它(ta)特定(ding)的(de)實(shi)施方案，所述nmda受體拮抗(kang)劑可以調節(jie)其(qi)它(ta)受體的(de)活(huo)性。

如(ru)本文所用，術語“調節”是指通(tong)過抑制(即拮(jie)抗劑(ji))或通(tong)過活化(即激動劑(ji))活性(xing)和/或受體表(biao)達來改變活性(xing)。

根據特定的(de)實施方案，調節活性(xing)(xing)和(he)/或表(biao)達(da)是抑(yi)制(zhi)活性(xing)(xing)和(he)/或表(biao)達(da)。

根據特定的實施方案(an)，調(diao)節活(huo)性和/或表(biao)達(da)是活(huo)化活(huo)性和/或表(biao)達(da)。

因此，在某些(xie)實施(shi)方案中，nmda受體拮(jie)(jie)抗劑也具有(you)5-羥(qian)色(se)胺能活(huo)性。如本文所用的術語(yu)“5-羥(qian)色(se)胺能活(huo)性”是指(zhi)nmda受體拮(jie)(jie)抗劑也調節(jie)5-ht受體家(jia)族的受體的活(huo)性的能力(li)。

如(ru)本文所用(yong)，術語“5-ht受(shou)(shou)(shou)體家族”是指(zhi)用(yong)作5-羥色胺受(shou)(shou)(shou)體的(de)(de)(de)一組蛋(dan)白(bai)(bai)。該組含有由在推(tui)定的(de)(de)(de)跨(kua)膜區域內的(de)(de)(de)它們(men)的(de)(de)(de)推(tui)斷(duan)的(de)(de)(de)氨基(ji)酸(suan)序列中顯(xian)示彼(bi)此(ci)大于72％或(huo)更高的(de)(de)(de)同(tong)源(yuan)性的(de)(de)(de)基(ji)因編碼的(de)(de)(de)蛋(dan)白(bai)(bai)亞組(由帶電荷或(huo)極性氨基(ji)酸(suan)界定的(de)(de)(de)疏水性氨基(ji)酸(suan)的(de)(de)(de)線性連續的(de)(de)(de)一段序列，足夠長以形成跨(kua)越脂質雙層的(de)(de)(de)二級蛋(dan)白(bai)(bai)結構(gou))。迄今已(yi)知四種人(ren)5-ht受(shou)(shou)(shou)體亞家族：5-ht1、5-ht2、5-ht3和5-ht4。

在某些實施方(fang)案中(zhong)，所(suo)述(shu)nmda受(shou)體(ti)拮(jie)抗(kang)劑也是5-ht3受(shou)體(ti)拮(jie)抗(kang)劑。

在某些實(shi)(shi)施(shi)方(fang)案中，具有5-ht3受體(ti)拮(jie)抗劑(ji)活性(xing)的nmda受體(ti)拮(jie)抗劑(ji)是氯胺酮(tong)或其藥學(xue)上可接(jie)受的鹽、水合物(wu)或藥學(xue)上活性(xing)的對(dui)映異構體(ti)。每個可能性(xing)代表本發明的單(dan)獨實(shi)(shi)施(shi)方(fang)案。

在(zai)某些實施方案(an)中(zhong)(zhong)，所述nmda受(shou)(shou)(shou)體拮(jie)抗(kang)劑(ji)也具有膽堿(jian)能(neng)活性。如(ru)本文(wen)所用的(de)術語“膽堿(jian)能(neng)活性”是(shi)指nmda受(shou)(shou)(shou)體拮(jie)抗(kang)劑(ji)也能(neng)調節煙堿(jian)乙酰(xian)膽堿(jian)受(shou)(shou)(shou)體(nachr)家族(zu)的(de)受(shou)(shou)(shou)體的(de)活性的(de)能(neng)力。在(zai)某些實施方案(an)中(zhong)(zhong)，所述nmda受(shou)(shou)(shou)體拮(jie)抗(kang)劑(ji)也是(shi)煙堿(jian)乙酰(xian)膽堿(jian)受(shou)(shou)(shou)體(nachr)拮(jie)抗(kang)劑(ji)。

如本文(wen)所(suo)用，術語“煙堿乙酰膽(dan)(dan)堿受體(ti)(ti)(nachr)家族”是(shi)指用作乙酰膽(dan)(dan)堿受體(ti)(ti)的(de)一組蛋(dan)白，其是(shi)在配體(ti)(ti)結合時肌肉收縮的(de)信號。在某些實施(shi)方(fang)案(an)中，具有(you)nachr拮抗(kang)劑活(huo)(huo)性的(de)nmda受體(ti)(ti)拮抗(kang)劑選自金(jin)剛烷胺和右美沙芬及其藥學上(shang)可接受的(de)鹽、水(shui)合物和藥學上(shang)活(huo)(huo)性的(de)對映(ying)異構體(ti)(ti)。每個可能性代表本發(fa)明的(de)單(dan)獨實施(shi)方(fang)案(an)。

在某些實(shi)施方案中(zhong)，所述nmda受體(ti)拮抗劑(ji)也(ye)(ye)具(ju)有多(duo)巴胺能活(huo)性。如本文所用的(de)術語“多(duo)巴胺能活(huo)性”是指nmda受體(ti)拮抗劑(ji)也(ye)(ye)調(diao)節多(duo)巴胺受體(ti)家族的(de)受體(ti)的(de)活(huo)性的(de)能力。

如本文所(suo)用，術語“多(duo)(duo)巴(ba)胺(an)(an)受(shou)體(ti)(ti)(ti)家族”是指用作多(duo)(duo)巴(ba)胺(an)(an)受(shou)體(ti)(ti)(ti)的(de)(de)(de)(de)一(yi)組蛋白。該組含有(you)由(you)在推定的(de)(de)(de)(de)跨膜區域(由(you)帶電荷或極性(xing)(xing)氨(an)基(ji)酸(suan)界(jie)定的(de)(de)(de)(de)疏水性(xing)(xing)氨(an)基(ji)酸(suan)的(de)(de)(de)(de)線性(xing)(xing)連續(xu)的(de)(de)(de)(de)一(yi)段序(xu)列，足夠長以形成跨越脂質雙層的(de)(de)(de)(de)二級蛋白結(jie)構)內的(de)(de)(de)(de)它們的(de)(de)(de)(de)推斷(duan)的(de)(de)(de)(de)氨(an)基(ji)酸(suan)序(xu)列中顯示出(chu)彼此大于65％的(de)(de)(de)(de)同源性(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)基(ji)因編(bian)碼的(de)(de)(de)(de)蛋白亞組。迄今已知三種(zhong)人多(duo)(duo)巴(ba)胺(an)(an)受(shou)體(ti)(ti)(ti)亞家族：多(duo)(duo)巴(ba)胺(an)(an)d1受(shou)體(ti)(ti)(ti)、多(duo)(duo)巴(ba)胺(an)(an)d2受(shou)體(ti)(ti)(ti)和多(duo)(duo)巴(ba)胺(an)(an)d3受(shou)體(ti)(ti)(ti)。

在某些實施(shi)方案中，nmda受體拮抗劑也是(shi)多巴胺d2受體激動(dong)劑。

在某些(xie)實(shi)施方案中，具有多巴胺(an)d2受(shou)(shou)(shou)體激動劑活性(xing)(xing)的nmda受(shou)(shou)(shou)體拮抗劑是氯胺(an)酮或其藥學上可接受(shou)(shou)(shou)的鹽、水合物或藥學上活性(xing)(xing)的對映(ying)異構體。每個可能性(xing)(xing)代表本發明的單獨(du)實(shi)施方案。

在(zai)某(mou)些(xie)實施方(fang)案中(zhong)，nmda受體拮(jie)抗劑也具有神(shen)(shen)經(jing)(jing)保護(hu)(hu)活(huo)性(xing)(xing)。如(ru)本文(wen)所(suo)用(yong)的(de)術(shu)語“神(shen)(shen)經(jing)(jing)保護(hu)(hu)活(huo)性(xing)(xing)”是(shi)(shi)指減少或(huo)改(gai)善(shan)神(shen)(shen)經(jing)(jing)損(sun)傷以及保護(hu)(hu)或(huo)恢復已遭(zao)受神(shen)(shen)經(jing)(jing)損(sun)傷的(de)神(shen)(shen)經(jing)(jing)元細(xi)(xi)胞(bao)的(de)作(zuo)用(yong)。如(ru)本文(wen)所(suo)用(yong)，術(shu)語“神(shen)(shen)經(jing)(jing)損(sun)傷”是(shi)(shi)指由諸如(ru)代(dai)謝、毒性(xing)(xing)、神(shen)(shen)經(jing)(jing)毒性(xing)(xing)和化學原因的(de)各種原因導致(zhi)的(de)對(dui)神(shen)(shen)經(jing)(jing)元細(xi)(xi)胞(bao)或(huo)組(zu)織的(de)任何損(sun)害。在(zai)某(mou)些(xie)實施方(fang)案中(zhong)，nmda受體拮(jie)抗劑也是(shi)(shi)σ-1受體激動劑。

如本文所(suo)用，術(shu)語“σ-1受體(ti)”是指sigmar1基(ji)因(yin)的表達產物，所(suo)述基(ji)因(yin)編碼通過ip3受體(ti)調節鈣信號傳導(dao)的在內質網(er)處的伴侶蛋白。

在某些實施方(fang)案中，具(ju)有(you)σ-1受體(ti)激動劑活(huo)性(xing)的(de)nmda受體(ti)拮抗劑選自l-687,384、阿米替林(lin)和(he)1-芐基-6’-甲(jia)氧基-6’,7’-二氫螺[哌啶-4,4’噻(sai)吩并[3.2-c]吡喃]及其藥學(xue)上(shang)可接(jie)受的(de)鹽、水合(he)物和(he)藥學(xue)上(shang)活(huo)性(xing)的(de)對映異構(gou)體(ti)。每個可能性(xing)代(dai)表(biao)本(ben)發明的(de)單獨實施方(fang)案。

本(ben)發(fa)明還預期包(bao)含(han)本(ben)文所述(shu)的(de)nmda受體拮抗劑與治(zhi)療(liao)gd的(de)標準(zhun)方(fang)法(fa)(fa)(fa)的(de)組合療(liao)法(fa)(fa)(fa)。治(zhi)療(liao)gd的(de)標準(zhun)方(fang)法(fa)(fa)(fa)的(de)非限制(zhi)性實例包(bao)括各(ge)種疼(teng)痛減輕療(liao)法(fa)(fa)(fa)、輸(shu)血，用于涉及骨(gu)和關節的(de)矯形(xing)手(shou)術(shu)(shu)、骨(gu)髓(sui)移植(zhi)(zhi)、干細胞移植(zhi)(zhi)、脾切除術(shu)(shu)、基因(yin)治(zhi)療(liao)、酶替代(dai)療(liao)法(fa)(fa)(fa)(ert)、底物減少療(liao)法(fa)(fa)(fa)(srt)和藥理學伴侶治(zhi)療(liao)劑。

根據特定的(de)實施方案，將nmda受體(ti)拮抗劑(ji)治療與選自酶替代(dai)治療劑(ji)、底物減少治療劑(ji)和藥理(li)學(xue)伴侶治療劑(ji)的(de)藥劑(ji)組合。

如本(ben)文所(suo)用“酶替代療法(ert)”是(shi)指外源性施用葡糖(tang)腦苷(gan)脂酶(gcd)。市場上可獲得許多衛生監(jian)管機構批準的gcd形式。實例(li)包括但不限于elelyso(taliglucerase)、cerezyme(伊米苷(gan)酶(imiglucerase))、vpriv(velaglucerase)和(he)ceredase(阿糖(tang)腦苷(gan)酶(alglucerase))。

如本文所用，術語“底物減少治療(srt)劑”是指抑制gcd的天然底物，葡糖神經酰胺(或gl1)的合成的藥劑(例如小分子)。市場上可獲得許多衛生監管機構批準的srt形式。實例包括但不限于美格魯特(miglustat)和依(yi)利格魯司特(eliglustattartrate)。

如(ru)本文所用(yong)，術語“藥(yao)理學伴侶治療劑”(pct)是指可(ke)以促(cu)進正(zheng)確折(zhe)(zhe)疊并穩定突變形式的(de)(de)gcd的(de)(de)藥(yao)劑(例如(ru)小(xiao)分子(zi))，從而(er)拯救突變的(de)(de)酶免(mian)于可(ke)能在內質網(er)或其它細胞蛋(dan)白降解(jie)/處(chu)置(zhi)系統中的(de)(de)降解(jie)和/或阻(zu)止錯折(zhe)(zhe)疊的(de)(de)蛋(dan)白在細胞中的(de)(de)積累。藥(yao)理學伴侶可(ke)以設計(ji)用(yong)于穿過血腦屏障(bbb)，使其成(cheng)為治療對ert無(wu)反應的(de)(de)gd神(shen)經元病性形式的(de)(de)候選藥(yao)物。

本(ben)發明一些(xie)實施方案(an)的nmda拮抗劑和(he)/或藥(yao)(yao)劑可以施用于生物(wu)體(ti)本(ben)身，或在(zai)藥(yao)(yao)物(wu)組合(he)(he)物(wu)中，其中與合(he)(he)適(shi)的載體(ti)或賦形(xing)劑混合(he)(he)。

如本文所用的(de)術(shu)語(yu)“藥物(wu)(wu)(wu)組合(he)物(wu)(wu)(wu)”是指(zhi)包含至少(shao)一種(zhong)藥學(xue)活(huo)性成(cheng)分和至少(shao)一種(zhong)藥學(xue)上可接受(shou)的(de)載體(ti)的(de)任何組合(he)物(wu)(wu)(wu)。藥物(wu)(wu)(wu)組合(he)物(wu)(wu)(wu)的(de)目的(de)是促進化合(he)物(wu)(wu)(wu)施用于生物(wu)(wu)(wu)體(ti)。在本文中，術(shu)語(yu)“活(huo)性成(cheng)分”是指(zhi)起生物(wu)(wu)(wu)效應作用的(de)nmda受(shou)體(ti)拮抗劑。

在本文中，可(ke)以互換使用(yong)的(de)術語“藥學(xue)上(shang)可(ke)接(jie)受(shou)的(de)載體(ti)”和(he)“生(sheng)(sheng)理上(shang)可(ke)接(jie)受(shou)的(de)載體(ti)”是指任何(he)類型的(de)無毒固(gu)體(ti)、半固(gu)體(ti)或(huo)液體(ti)填料、載體(ti)稀釋劑或(huo)賦形劑，其不產生(sheng)(sheng)對生(sheng)(sheng)物(wu)體(ti)的(de)顯著刺激并且不會消除(chu)所施用(yong)化合物(wu)的(de)生(sheng)(sheng)物(wu)活性(xing)和(he)性(xing)質。這些短語包括佐劑。

本文中，術語“賦形(xing)(xing)劑”是指(zhi)(zhi)添加(jia)到藥(yao)(yao)物(wu)組合物(wu)中以進(jin)一步促進(jin)活(huo)性(xing)成分的(de)(de)施用(yong)的(de)(de)惰(duo)性(xing)物(wu)質。賦形(xing)(xing)劑的(de)(de)非限(xian)制性(xing)實例(li)包括碳酸鈣(gai)、磷酸鈣(gai)、各種(zhong)糖類和(he)各種(zhong)類型的(de)(de)淀粉、纖維素(su)衍生物(wu)、明膠、植物(wu)油和(he)聚乙二醇。本文所用(yong)的(de)(de)術語“藥(yao)(yao)學上活(huo)性(xing)的(de)(de)對映(ying)異(yi)(yi)構體(ti)”是指(zhi)(zhi)具(ju)有指(zhi)(zhi)定(ding)的(de)(de)生物(wu)活(huo)性(xing)或(huo)(huo)功(gong)能的(de)(de)指(zhi)(zhi)定(ding)分子的(de)(de)一種(zhong)或(huo)(huo)多種(zhong)立體(ti)異(yi)(yi)構體(ti)。舉例(li)來說(shuo)，nmda受體(ti)拮抗劑可(ke)(ke)用(yong)作(zuo)外消旋混合物(wu)，或(huo)(huo)作(zuo)為富集或(huo)(huo)純化(hua)(s)或(huo)(huo)(r)手性(xing)藥(yao)(yao)物(wu)。每種(zhong)立體(ti)異(yi)(yi)構體(ti)的(de)(de)相對活(huo)性(xing)可(ke)(ke)以使用(yong)本領(ling)域已知的(de)(de)標準(zhun)技術來確(que)定(ding)。

藥物的配(pei)制(zhi)和施用(yong)技術可見“remington'spharmaceuticalsciences”，mackpublishingco.，easton，pa，最新(xin)版本(ben)，其通(tong)過引用(yong)并入本(ben)文。

合(he)適的施用(yong)途徑可以例如包括口服、直(zhi)(zhi)腸(chang)、經粘膜(mo)，特別是經鼻(bi)、腸(chang)或(huo)胃腸(chang)外遞送，包括肌肉內(nei)、皮下和髓內(nei)注射，以及鞘(qiao)內(nei)、直(zhi)(zhi)接心室內(nei)、心內(nei)，例如進(jin)入右心室或(huo)左心室，進(jin)入總冠狀動脈(mo)、靜脈(mo)內(nei)、腹膜(mo)內(nei)、鼻(bi)內(nei)或(huo)眼內(nei)注射。

在(zai)某些實(shi)施方(fang)案中，將(jiang)nmda受體拮(jie)(jie)抗(kang)(kang)劑(ji)和(he)/或(huo)(huo)上(shang)述藥(yao)劑(ji)配制成用(yong)于口服遞送。在(zai)某些實(shi)施方(fang)案中，將(jiang)nmda受體拮(jie)(jie)抗(kang)(kang)劑(ji)和(he)/或(huo)(huo)藥(yao)劑(ji)配制成用(yong)于持(chi)續釋放。在(zai)某些實(shi)施方(fang)案中，將(jiang)nmda受體拮(jie)(jie)抗(kang)(kang)劑(ji)和(he)/或(huo)(huo)上(shang)述藥(yao)劑(ji)配制成用(yong)于注(zhu)射。

用(yong)(yong)于藥(yao)物(wu)遞(di)送(song)至中(zhong)樞神經系統(cns)的(de)(de)(de)常規(gui)方法(fa)包(bao)括：神經外科策略(例(li)(li)(li)如腦(nao)內注(zhu)射或腦(nao)室(shi)內輸(shu)注(zhu))；藥(yao)劑(ji)的(de)(de)(de)分(fen)子(zi)操作(例(li)(li)(li)如，包(bao)含對內皮(pi)細胞表面(mian)分(fen)子(zi)具(ju)有(you)親(qin)和性(xing)(xing)(xing)的(de)(de)(de)轉運肽與本身不能(neng)穿過bbb的(de)(de)(de)藥(yao)劑(ji)組合(he)的(de)(de)(de)嵌合(he)融合(he)蛋(dan)白的(de)(de)(de)產生(sheng)(sheng))，試圖(tu)利用(yong)(yong)bbb的(de)(de)(de)內源性(xing)(xing)(xing)轉運途徑(jing)之一；設計用(yong)(yong)于增加藥(yao)劑(ji)的(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)質溶(rong)解(jie)度的(de)(de)(de)藥(yao)理學策略(例(li)(li)(li)如，水溶(rong)性(xing)(xing)(xing)藥(yao)劑(ji)與脂(zhi)(zhi)質或膽固(gu)醇(chun)載(zai)(zai)體的(de)(de)(de)綴合(he))；以及通過高滲性(xing)(xing)(xing)破壞bbb的(de)(de)(de)完整性(xing)(xing)(xing)的(de)(de)(de)短暫(zan)破壞(由將(jiang)甘(gan)露醇(chun)溶(rong)液(ye)注(zhu)入(ru)頸動脈或使(shi)用(yong)(yong)生(sheng)(sheng)物(wu)活性(xing)(xing)(xing)劑(ji)如血管(guan)緊張(zhang)素肽引起(qi))。然(ran)而，這些(xie)策略中(zhong)的(de)(de)(de)每(mei)一個都具(ju)有(you)局限(xian)(xian)性(xing)(xing)(xing)，例(li)(li)(li)如與侵入(ru)性(xing)(xing)(xing)外科手術相關(guan)的(de)(de)(de)固(gu)有(you)風險(xian)，由內源性(xing)(xing)(xing)轉運系統固(gu)有(you)的(de)(de)(de)限(xian)(xian)制所限(xian)(xian)定的(de)(de)(de)大小限(xian)(xian)制，與全身施用(yong)(yong)嵌合(he)分(fen)子(zi)(由可能(neng)在cns外部有(you)活性(xing)(xing)(xing)的(de)(de)(de)載(zai)(zai)體基序(xu)組成)相關(guan)的(de)(de)(de)潛在的(de)(de)(de)不希望的(de)(de)(de)生(sheng)(sheng)物(wu)學副作用(yong)(yong)，以及在bbb被破壞的(de)(de)(de)腦(nao)區域內的(de)(de)(de)腦(nao)損傷的(de)(de)(de)可能(neng)風險(xian)，這使(shi)得它(ta)不是最佳的(de)(de)(de)遞(di)送(song)方法(fa)。

或(huo)者(zhe)，可以(yi)以(yi)局部而(er)非全身(shen)方(fang)式施用藥(yao)物(wu)(wu)組(zu)合物(wu)(wu)，例如通(tong)過將藥(yao)物(wu)(wu)組(zu)合物(wu)(wu)直接注射(she)到患者(zhe)的組(zu)織區域(yu)中。

本(ben)發(fa)明的(de)一些實(shi)施方案的(de)藥物組(zu)合物可以通過本(ben)領域熟知的(de)方法制(zhi)備，例如通過常規的(de)混(hun)合、溶解、制(zhi)粒(li)、制(zhi)成糖丸(wan)、研磨(mo)、乳化、包(bao)(bao)封、包(bao)(bao)埋或凍干工藝。

因此(ci)，使(shi)用包含(han)賦形劑(ji)和助劑(ji)的(de)一種(zhong)或多(duo)種(zhong)生理學上可接受的(de)載體，根(gen)據本(ben)發明(ming)的(de)一些實施方案使(shi)用的(de)藥(yao)(yao)物(wu)組(zu)合物(wu)可以(yi)以(yi)常規方式配制，所述載體促進將活(huo)性(xing)成分加工成藥(yao)(yao)學上可使(shi)用的(de)制劑(ji)。適當的(de)制劑(ji)取決于(yu)所選(xuan)擇的(de)施用途(tu)徑。

對于注(zhu)射(she)，藥物(wu)組合物(wu)的(de)活性成分可以配制在水溶液(ye)(ye)(ye)中，優選在生(sheng)理(li)學(xue)上(shang)相(xiang)容的(de)緩(huan)沖液(ye)(ye)(ye)如(ru)hank’s溶液(ye)(ye)(ye)、‘林格氏液(ye)(ye)(ye)或(huo)生(sheng)理(li)鹽緩(huan)沖液(ye)(ye)(ye)中。對于經粘膜施用(yong)，在制劑(ji)中使用(yong)適合滲透屏障的(de)滲透劑(ji)。這種滲透劑(ji)在本(ben)領域(yu)中通常是已知(zhi)的(de)。

對于口服(fu)施用(yong)，可(ke)以通過將活(huo)性化(hua)合(he)(he)(he)物(wu)(wu)(wu)與本領(ling)域(yu)熟(shu)知的(de)(de)(de)藥(yao)學(xue)(xue)上可(ke)接(jie)受(shou)的(de)(de)(de)載體(ti)(ti)組合(he)(he)(he)來容易地配制藥(yao)物(wu)(wu)(wu)組合(he)(he)(he)物(wu)(wu)(wu)。這樣的(de)(de)(de)載體(ti)(ti)使(shi)得藥(yao)物(wu)(wu)(wu)組合(he)(he)(he)物(wu)(wu)(wu)可(ke)以配制成片(pian)劑(ji)、丸(wan)(wan)劑(ji)、糖(tang)(tang)衣丸(wan)(wan)、膠(jiao)(jiao)囊、液體(ti)(ti)、凝(ning)膠(jiao)(jiao)、糖(tang)(tang)漿(jiang)、漿(jiang)液、懸浮液等，用(yong)于患者的(de)(de)(de)口服(fu)攝取(qu)。口服(fu)使(shi)用(yong)的(de)(de)(de)藥(yao)理學(xue)(xue)制劑(ji)可(ke)以使(shi)用(yong)固體(ti)(ti)賦形劑(ji)制備，任選地研磨所(suo)得混(hun)合(he)(he)(he)物(wu)(wu)(wu)，并且如(ru)(ru)果(guo)需(xu)要(yao)(yao)，在加(jia)(jia)入合(he)(he)(he)適的(de)(de)(de)助劑(ji)之后，加(jia)(jia)工顆粒混(hun)合(he)(he)(he)物(wu)(wu)(wu)以獲(huo)得片(pian)劑(ji)或糖(tang)(tang)衣丸(wan)(wan)芯。合(he)(he)(he)適的(de)(de)(de)賦形劑(ji)特別是填料如(ru)(ru)糖(tang)(tang)，包括乳糖(tang)(tang)、蔗糖(tang)(tang)、甘露(lu)醇或山梨糖(tang)(tang)醇；纖(xian)(xian)維(wei)素制劑(ji)，諸如(ru)(ru)，例如(ru)(ru)玉(yu)米淀(dian)(dian)粉、小麥淀(dian)(dian)粉、大米淀(dian)(dian)粉、馬鈴薯淀(dian)(dian)粉、明(ming)膠(jiao)(jiao)、黃蓍膠(jiao)(jiao)、甲基纖(xian)(xian)維(wei)素、羥(qian)丙基甲基纖(xian)(xian)維(wei)素、羧甲基纖(xian)(xian)維(wei)素鈉(na)；和/或生理上可(ke)接(jie)受(shou)的(de)(de)(de)聚(ju)合(he)(he)(he)物(wu)(wu)(wu)如(ru)(ru)聚(ju)乙烯(xi)吡咯(ge)烷酮(pvp)。如(ru)(ru)果(guo)需(xu)要(yao)(yao)，可(ke)以加(jia)(jia)入崩解(jie)劑(ji)，例如(ru)(ru)交聯的(de)(de)(de)聚(ju)乙烯(xi)吡咯(ge)烷酮、瓊(qiong)脂或海藻(zao)酸或其鹽如(ru)(ru)藻(zao)酸鈉(na)。

向糖(tang)衣(yi)(yi)丸(wan)芯提供合(he)(he)適的涂層。為此(ci)目的，可以使用(yong)濃縮糖(tang)溶(rong)液(ye)，其可以任選地含有(you)阿拉伯樹(shu)膠(jiao)、滑石、聚(ju)乙烯吡(bi)咯(ge)烷酮、卡波姆凝膠(jiao)、聚(ju)乙二(er)醇(chun)、二(er)氧化鈦、漆(qi)溶(rong)液(ye)和合(he)(he)適的有(you)機溶(rong)劑或(huo)溶(rong)劑混合(he)(he)物。可將(jiang)染(ran)料或(huo)顏料加入到片劑或(huo)糖(tang)衣(yi)(yi)丸(wan)包衣(yi)(yi)中(zhong)用(yong)于鑒定或(huo)表征活性化合(he)(he)物劑量的不(bu)同組合(he)(he)。

可以(yi)口(kou)服使用的(de)(de)藥物組合(he)(he)物包括由(you)明(ming)(ming)膠(jiao)制(zhi)成(cheng)(cheng)的(de)(de)推(tui)入(ru)式膠(jiao)囊(nang)以(yi)及由(you)明(ming)(ming)膠(jiao)和增塑(su)劑(ji)(ji)如(ru)甘油(you)或山梨糖醇制(zhi)成(cheng)(cheng)的(de)(de)軟的(de)(de)密(mi)封膠(jiao)囊(nang)。推(tui)入(ru)式膠(jiao)囊(nang)可以(yi)含有與(yu)填(tian)料如(ru)乳糖，粘合(he)(he)劑(ji)(ji)如(ru)淀(dian)粉(fen)，潤滑劑(ji)(ji)如(ru)滑石或硬脂酸(suan)鎂，以(yi)及任選的(de)(de)穩定劑(ji)(ji)混合(he)(he)的(de)(de)活性(xing)成(cheng)(cheng)分。在軟膠(jiao)囊(nang)中(zhong)，所(suo)述(shu)活性(xing)成(cheng)(cheng)分可以(yi)溶解或懸浮在合(he)(he)適的(de)(de)液體(ti)中(zhong)，例如(ru)脂肪油(you)，液體(ti)石蠟或液體(ti)聚乙二醇。此外，可以(yi)加入(ru)穩定劑(ji)(ji)。用于口(kou)服施(shi)(shi)用的(de)(de)所(suo)有制(zhi)劑(ji)(ji)應該是適合(he)(he)所(suo)選施(shi)(shi)用途徑的(de)(de)劑(ji)(ji)量。

對于口腔(qiang)施用，組(zu)合物可以采用以常規方式(shi)配制(zhi)的(de)片劑或錠劑的(de)形式(shi)。

對(dui)于通過(guo)鼻吸(xi)入施用，根據本(ben)發(fa)明的(de)一些實施方案使用的(de)活性成(cheng)分可以使用合適的(de)推(tui)進劑(ji)，例(li)如(ru)二氯二氟(fu)甲(jia)(jia)烷、三(san)氯氟(fu)甲(jia)(jia)烷、二氯四氟(fu)乙烷或(huo)二氧化(hua)碳(tan)從加壓包或(huo)霧(wu)化(hua)器呈(cheng)遞的(de)氣溶(rong)膠(jiao)(jiao)噴霧(wu)形式便(bian)利遞送(song)。在加壓氣溶(rong)膠(jiao)(jiao)的(de)情(qing)況下，劑(ji)量(liang)單位可以通過(guo)提供閥來遞送(song)計量(liang)的(de)量(liang)來確定。用于分配器中(zhong)的(de)例(li)如(ru)明膠(jiao)(jiao)的(de)膠(jiao)(jiao)囊和(he)藥筒可以配制成(cheng)含有化(hua)合物和(he)合適的(de)粉末基質(zhi)如(ru)乳糖(tang)或(huo)淀粉的(de)粉末混合物。

本(ben)文所(suo)述的藥物組合(he)物可以配制(zhi)用于胃腸外施(shi)用，例(li)如(ru)通(tong)過推(tui)注或(huo)連續輸注。用于注射的制(zhi)劑(ji)(ji)可以以單位劑(ji)(ji)量(liang)形式存在(zai)，例(li)如(ru)在(zai)任(ren)選添加防腐劑(ji)(ji)的安瓿或(huo)多劑(ji)(ji)量(liang)容(rong)器中(zhong)。組合(he)物可以是(shi)在(zai)油性或(huo)水性載體中(zhong)的懸浮液、溶液或(huo)乳液，并且可以含有配制(zhi)劑(ji)(ji)，例(li)如(ru)懸浮劑(ji)(ji)、穩定劑(ji)(ji)和/或(huo)分(fen)散劑(ji)(ji)。

用(yong)于(yu)胃腸外施用(yong)的(de)藥物組合物包(bao)括(kuo)水溶(rong)性形(xing)式的(de)活(huo)(huo)性制劑的(de)水溶(rong)液(ye)(ye)。此外，活(huo)(huo)性成(cheng)分(fen)的(de)懸(xuan)浮液(ye)(ye)可以適(shi)當地(di)制備(bei)為(wei)油(you)性或水基注射懸(xuan)浮液(ye)(ye)。合適(shi)的(de)親脂性溶(rong)劑或載體包(bao)括(kuo)脂肪(fang)油(you)如(ru)芝麻油(you)，或合成(cheng)脂肪(fang)酸酯(zhi)如(ru)油(you)酸乙酯(zhi)、甘油(you)三酯(zhi)或脂質體。水性注射懸(xuan)浮液(ye)(ye)可以含(han)有增加懸(xuan)浮液(ye)(ye)粘度(du)的(de)物質，例(li)如(ru)羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇(chun)或葡聚糖。任選地(di)，懸(xuan)浮液(ye)(ye)還(huan)可含(han)有合適(shi)的(de)穩(wen)定劑或藥劑，其增加活(huo)(huo)性成(cheng)分(fen)的(de)溶(rong)解(jie)度(du)以允許(xu)制備(bei)高度(du)濃(nong)縮的(de)溶(rong)液(ye)(ye)。

或者(zhe)，活性成(cheng)(cheng)分可以是(shi)粉末形式，用于在使(shi)用之前用合適的載體(ti)例(li)如(ru)無(wu)菌、無(wu)致熱原的水(shui)基溶液(ye)構成(cheng)(cheng)。

本發明的一些實施方案(an)的藥(yao)物(wu)組合(he)物(wu)還可以(yi)使用例如常規栓劑(ji)(ji)(ji)基質如可可脂或其它(ta)甘油酯(zhi)以(yi)直腸組合(he)物(wu)如栓劑(ji)(ji)(ji)或保留灌腸劑(ji)(ji)(ji)配制(zhi)。

適(shi)用于(yu)本(ben)發(fa)明一些實施(shi)方案的(de)情況的(de)藥物組(zu)合(he)物包括其中(zhong)含(han)有以有效達到預期目的(de)的(de)量的(de)活性(xing)(xing)成分的(de)組(zu)合(he)物。更具體而言，治(zhi)療有效量是指有效預防、減輕或(huo)(huo)改(gai)善病(bing)癥(zheng)(zheng)癥(zheng)(zheng)狀(例如gd，例如3型gd)或(huo)(huo)延長(chang)被治(zhi)療的(de)受(shou)試者的(de)存活的(de)活性(xing)(xing)成分(例如nmda受(shou)體拮抗劑)的(de)量。

治療(liao)有效量(liang)的(de)確定在本領域技術(shu)人員的(de)能力范(fan)圍(wei)內，特(te)別是(shi)鑒于本文提供的(de)詳細公開內容。

對(dui)于(yu)用(yong)于(yu)本發明方法中的任何制劑(ji)(ji)，可以從(cong)體外和細胞培(pei)養測定法開(kai)始估算治(zhi)療有(you)效(xiao)量(liang)或劑(ji)(ji)量(liang)。例(li)如，可以在動(dong)物模型中配制劑(ji)(ji)量(liang)以達(da)到所需濃度或滴度。這些信(xin)息可用(yong)于(yu)更(geng)精確地(di)確定人中的有(you)用(yong)劑(ji)(ji)量(liang)。

本文所(suo)述的(de)(de)(de)活(huo)性(xing)成分的(de)(de)(de)毒性(xing)和治(zhi)療功效(xiao)可以通(tong)過(guo)體(ti)外、細胞培養(yang)或(huo)實驗動物中的(de)(de)(de)標準藥學(xue)方法來確(que)定(ding)。從這些體(ti)外和細胞培養(yang)測(ce)定(ding)和動物研(yan)究中獲得的(de)(de)(de)數據可用于(yu)配制(zhi)用于(yu)人(ren)(ren)的(de)(de)(de)劑量范圍。劑量可以根據使用的(de)(de)(de)劑型(xing)和使用的(de)(de)(de)施(shi)用途(tu)徑而(er)變化。鑒于(yu)患者(zhe)的(de)(de)(de)病癥，個(ge)體(ti)醫師可以選擇確(que)切的(de)(de)(de)配方、施(shi)用途(tu)徑和劑量。(參(can)見例如，fingl等人(ren)(ren)，1975，“thepharmacologicalbasisoftherapeutics”，第1章第1頁(ye))。

可以分別(bie)調整劑(ji)量和(he)間(jian)隔，以提供活(huo)性成分的水(shui)平足以誘導或抑制生物(wu)效應(ying)(最小有效濃度(du)，mec)。mec將因每種制劑(ji)而異，但可以從體外數據估(gu)算(suan)。實現mec所需的劑(ji)量將取(qu)決于個(ge)體特征(zheng)和(he)施用(yong)途(tu)徑。檢測(ce)測(ce)定(ding)法可用(yong)于確定(ding)血(xue)漿濃度(du)。

取決(jue)于(yu)待治療的病癥的嚴(yan)重性和(he)反應性，給藥可以是(shi)單次或(huo)多次施用，治療過程持續數(shu)天(tian)至數(shu)周或(huo)直(zhi)到實(shi)現治愈(yu)或(huo)達(da)到疾病狀(zhuang)態的減(jian)少(shao)。

當然，待施用(yong)的組合物(wu)的量將取決于被治療(liao)的受試者(zhe)、痛苦的嚴(yan)重程度、施用(yong)方式、處方醫師的判斷(duan)等。

如(ru)果(guo)需要，本發(fa)明(ming)的(de)(de)(de)(de)一些實(shi)施(shi)方案的(de)(de)(de)(de)組(zu)合物(wu)(wu)可以(yi)(yi)存在(zai)于(yu)包(bao)裝(zhuang)(zhuang)(zhuang)或(huo)(huo)(huo)分(fen)配(pei)(pei)(pei)器裝(zhuang)(zhuang)(zhuang)置中(zhong)，例如(ru)fda批(pi)準的(de)(de)(de)(de)試(shi)劑(ji)盒中(zhong)，其可以(yi)(yi)包(bao)含(han)含(han)有活性成(cheng)分(fen)的(de)(de)(de)(de)一種(zhong)或(huo)(huo)(huo)多種(zhong)單位劑(ji)型。所(suo)述包(bao)裝(zhuang)(zhuang)(zhuang)可以(yi)(yi)例如(ru)包(bao)括金屬或(huo)(huo)(huo)塑料箔，例如(ru)泡罩包(bao)裝(zhuang)(zhuang)(zhuang)。包(bao)裝(zhuang)(zhuang)(zhuang)或(huo)(huo)(huo)分(fen)配(pei)(pei)(pei)器裝(zhuang)(zhuang)(zhuang)置可以(yi)(yi)附有用(yong)(yong)于(yu)施(shi)用(yong)(yong)的(de)(de)(de)(de)說明(ming)書。包(bao)裝(zhuang)(zhuang)(zhuang)或(huo)(huo)(huo)分(fen)配(pei)(pei)(pei)器也(ye)可以(yi)(yi)由管(guan)理制造、使用(yong)(yong)或(huo)(huo)(huo)銷售藥(yao)(yao)物(wu)(wu)的(de)(de)(de)(de)政(zheng)府機構規定(ding)的(de)(de)(de)(de)形式的(de)(de)(de)(de)容器相關聯的(de)(de)(de)(de)通(tong)知來容納，該通(tong)知反映了該機構批(pi)準的(de)(de)(de)(de)組(zu)合物(wu)(wu)形式或(huo)(huo)(huo)人或(huo)(huo)(huo)獸醫管(guan)理。例如(ru)，這種(zhong)通(tong)知可以(yi)(yi)是美國食品(pin)和藥(yao)(yao)物(wu)(wu)管(guan)理局(ju)批(pi)準的(de)(de)(de)(de)用(yong)(yong)于(yu)處方藥(yao)(yao)的(de)(de)(de)(de)標簽或(huo)(huo)(huo)批(pi)準的(de)(de)(de)(de)產品(pin)插頁。也(ye)可以(yi)(yi)制備包(bao)含(han)配(pei)(pei)(pei)制在(zai)相容的(de)(de)(de)(de)藥(yao)(yao)物(wu)(wu)載體中(zhong)的(de)(de)(de)(de)本發(fa)明(ming)的(de)(de)(de)(de)制劑(ji)的(de)(de)(de)(de)組(zu)合物(wu)(wu)，放(fang)置在(zai)適當(dang)的(de)(de)(de)(de)容器中(zhong)，并標記用(yong)(yong)于(yu)治療指定(ding)的(de)(de)(de)(de)病癥，如(ru)上文進一步詳述。

根據本發明的(de)另一方面，提(ti)供(gong)了鑒定用于治(zhi)療(liao)戈謝病(bing)(gd)的(de)神(shen)經病(bing)性形式的(de)試劑(ji)(ji)盒，其包(bao)含包(bao)裝nmda受體拮(jie)抗劑(ji)(ji)和選自酶替代治(zhi)療(liao)劑(ji)(ji)、底物(wu)減少(shao)治(zhi)療(liao)劑(ji)(ji)和藥理學伴侶(lv)治(zhi)療(liao)劑(ji)(ji)的(de)藥劑(ji)(ji)的(de)包(bao)裝材料(liao)。

如(ru)以(yi)下實施例部分的(de)實施例4進一步(bu)所示，發明人已經發現，grin2b基因的(de)非編碼(ma)序列中單核苷酸變異(snpidrs29869040)中鳥(niao)嘌(piao)呤(ling)的(de)存在與ngd相(xiang)關，而腺嘌(piao)呤(ling)在該snp中的(de)存在與gd的(de)相(xiang)對cbe不敏感性和更緩和的(de)表型相(xiang)關；此外，grin2bmrna和蛋(dan)白表達水平與嚴重的(de)ngd相(xiang)關。

因(yin)此(ci)，本發明的(de)(de)教導也可(ke)用于通過確(que)定grin2b基因(yin)中的(de)(de)序列變(bian)異(yi)或grin2b基因(yin)的(de)(de)表達產物的(de)(de)量來(lai)診斷(duan)患者的(de)(de)gd的(de)(de)神(shen)經病性形式。

因此，根據(ju)本發明的一(yi)個方(fang)面，提供了(le)一(yi)種診斷患者(zhe)中戈謝病(bing)(gd)的神(shen)經病(bing)性形式的方(fang)法(fa)，所述方(fang)法(fa)包括

在患者(zhe)的(de)(de)(de)(de)生(sheng)物樣品中(zhong)確定影響grin2b基因的(de)(de)(de)(de)表(biao)(biao)達(da)(da)產物的(de)(de)(de)(de)量(liang)(liang)的(de)(de)(de)(de)序列變異和(he)/或grin2b基因的(de)(de)(de)(de)表(biao)(biao)達(da)(da)產物的(de)(de)(de)(de)量(liang)(liang)，且其中(zhong)相(xiang)對于(yu)健康(kang)患者(zhe)或診(zhen)斷(duan)患有gdi型的(de)(de)(de)(de)患者(zhe)的(de)(de)(de)(de)生(sheng)物樣品，存(cun)在序列變異、表(biao)(biao)達(da)(da)產物的(de)(de)(de)(de)量(liang)(liang)高于(yu)預定水平和(he)/或表(biao)(biao)達(da)(da)產物的(de)(de)(de)(de)增加的(de)(de)(de)(de)量(liang)(liang)指示gd的(de)(de)(de)(de)神(shen)經病(bing)性(xing)形式(shi)，從而診(zhen)斷(duan)患者(zhe)的(de)(de)(de)(de)gd的(de)(de)(de)(de)神(shen)經病(bing)性(xing)形式(shi)。

根據特(te)定的實施(shi)方案，所述患者(zhe)(zhe)或受試(shi)者(zhe)(zhe)被(bei)診斷患有gd。

根(gen)據本發明的(de)(de)另一方(fang)面，提(ti)供了一種治療被(bei)診斷患有戈謝病(gd)的(de)(de)神經病性形式的(de)(de)患者(zhe)的(de)(de)方(fang)法，該(gai)方(fang)法包括(kuo)：

(a)根據本(ben)發明(ming)的(de)一些實施(shi)方(fang)案的(de)方(fang)法診斷患者(zhe)；并且其中(zhong)指(zhi)出，相對(dui)于健康患者(zhe)或診斷患有gdi型的(de)患者(zhe)的(de)生(sheng)物樣(yang)品(pin)，存在(zai)序列(lie)變異和(he)/或表達(da)產(chan)物的(de)量高于預定水(shui)平的(de)和(he)/或增加(jia)的(de)量的(de)表達(da)產(chan)物，

(b)用nmda受體拮抗劑治療患者，

從而治療診(zhen)斷患(huan)(huan)有gd的(de)神經病性(xing)形式(shi)的(de)患(huan)(huan)者。

為了(le)測定(ding)(ding)序列(lie)變異，首先從測試對(dui)象的生物(wu)樣品獲得dna。根(gen)據本發明的特定(ding)(ding)實(shi)施(shi)方案(an)可以使用的生物(wu)樣品包括但(dan)不限于(yu)體(ti)液(ye)，例如全(quan)血、血清、血漿、腦脊液(ye)、尿液(ye)、淋巴液(ye)和呼(hu)吸道(dao)(dao)、腸道(dao)(dao)和生殖泌尿道(dao)(dao)的各種外部分泌物(wu)，眼(yan)淚，唾液(ye)，乳汁(zhi)以及白細胞，惡(e)性組(zu)織(zhi)，羊水和絨(rong)(rong)毛膜絨(rong)(rong)毛，以及細胞或組(zu)織(zhi)活檢(例如腦活檢)。

一(yi)旦獲得(de)樣品(pin)，使(shi)(shi)用本領域(yu)熟(shu)知的方法提(ti)取dna。如(ru)上(shang)所述，檢(jian)(jian)測序(xu)列(lie)變(bian)(bian)異(yi)(yi)(yi)的方法是本領域(yu)熟(shu)知的，包(bao)括但不限于dna測序(xu)、電(dian)泳(yong)、基(ji)于酶(mei)的錯配檢(jian)(jian)測測定(ding)(ding)(ding)和雜交測定(ding)(ding)(ding)如(ru)pcr、rt-pcr、rna酶(mei)保護、原位雜交、引物延伸、dna印跡、rna印跡和斑(ban)點印跡分(fen)析。特定(ding)(ding)(ding)基(ji)因(yin)的序(xu)列(lie)變(bian)(bian)異(yi)(yi)(yi)也可以在蛋白(bai)水平上(shang)使(shi)(shi)用例如(ru)色譜法、電(dian)泳(yong)方法、免疫檢(jian)(jian)測測定(ding)(ding)(ding)，如(ru)elisa和蛋白(bai)印跡分(fen)析和免疫組織化學來(lai)確定(ding)(ding)(ding)。根據特定(ding)(ding)(ding)的實(shi)施方案，使(shi)(shi)用基(ji)因(yin)組序(xu)列(lie)分(fen)析確定(ding)(ding)(ding)序(xu)列(lie)變(bian)(bian)異(yi)(yi)(yi)(例如(ru)snp)。

根(gen)據本(ben)發(fa)(fa)明的(de)(de)特(te)定(ding)實施方(fang)(fang)案，通(tong)過將生(sheng)物(wu)(wu)(wu)樣品(pin)、細胞或(huo)(huo)其部分或(huo)(huo)其提(ti)取(qu)物(wu)(wu)(wu)與探(tan)(tan)(tan)針(zhen)(例如(ru)(ru)寡核苷(gan)(gan)酸(suan)探(tan)(tan)(tan)針(zhen)或(huo)(huo)引物(wu)(wu)(wu))雜(za)交(jiao)(jiao)來(lai)進行序(xu)列(lie)(lie)變(bian)異(yi)(yi)的(de)(de)檢測(ce)，所述探(tan)(tan)(tan)針(zhen)與包(bao)含該(gai)序(xu)列(lie)(lie)變(bian)異(yi)(yi)(例如(ru)(ru)snp)的(de)(de)多核苷(gan)(gan)酸(suan)特(te)異(yi)(yi)性雜(za)交(jiao)(jiao)。以下進一步提(ti)供可用于(yu)本(ben)發(fa)(fa)明的(de)(de)探(tan)(tan)(tan)針(zhen)的(de)(de)詳細描述。根(gen)據特(te)定(ding)的(de)(de)實施方(fang)(fang)案，雜(za)交(jiao)(jiao)在允(yun)許形(xing)成包(bao)含含有存在于(yu)細胞中的(de)(de)序(xu)列(lie)(lie)變(bian)異(yi)(yi)(例如(ru)(ru)snp)的(de)(de)dna和探(tan)(tan)(tan)針(zhen)的(de)(de)復合物(wu)(wu)(wu)的(de)(de)條件下實現。

根(gen)據本發明的(de)(de)其(qi)它(ta)特定的(de)(de)實施(shi)方案，通過使(shi)生物樣品(pin)、細胞或其(qi)部分或其(qi)提取(qu)物與特異(yi)性(xing)結合包含序列變(bian)(bian)異(yi)(例如(ru)snp)的(de)(de)多(duo)肽的(de)(de)抗(kang)體(ti)接觸(chu)來進行序列變(bian)(bian)異(yi)的(de)(de)檢測(ce)。根(gen)據特定的(de)(de)實施(shi)方案，接觸(chu)在(zai)(zai)允許形成(cheng)包含含有存在(zai)(zai)于細胞中的(de)(de)序列變(bian)(bian)異(yi)(例如(ru)snp)的(de)(de)多(duo)肽和抗(kang)體(ti)的(de)(de)復合物(即(ji)免疫復合物)的(de)(de)條件下實現。

核苷(gan)酸/探針復(fu)合(he)物或免疫復(fu)合(he)物可以(yi)在(zai)多種溫(wen)度(du)、鹽(yan)濃(nong)度(du)和(he)(he)ph值下(xia)形(xing)成(cheng)，所(suo)述溫(wen)度(du)、鹽(yan)濃(nong)度(du)和(he)(he)ph值可以(yi)根(gen)據所(suo)使用的方(fang)法和(he)(he)生物樣品而(er)變化(hua)，并(bing)且本領域技(ji)術人員能(neng)夠調節(jie)適合(he)于(yu)形(xing)成(cheng)每(mei)個復(fu)合(he)物的條件(jian)。

根據(ju)特定(ding)的(de)實施方案，序列變異是snp。

根據特定的(de)(de)實施方案，序列變異是在grin2b基因(yin)的(de)(de)非編碼序列中。

如本文所用的短語“表(biao)達水平”和“表(biao)達量”是指生物(wu)樣(yang)品中基(ji)因表(biao)達和/或基(ji)因產(chan)物(wu)活性的程(cheng)度。例如，各種(zhong)基(ji)因的上調(diao)或下調(diao)可以(yi)影響(xiang)基(ji)因產(chan)物(wu)的水平(即rna和/或蛋(dan)白)。

應當注意，表達水平(ping)可以以任意絕(jue)對(dui)單位(wei)或以歸(gui)(gui)(gui)一化(hua)單位(wei)(相(xiang)對(dui)于對(dui)照參考的已知表達水平(ping))來確(que)定。例(li)如，當使(shi)用(yong)dna芯(xin)片時，表達水平(ping)根據芯(xin)片的內部(bu)對(dui)照或通過使(shi)用(yong)分位(wei)數(shu)歸(gui)(gui)(gui)一化(hua)如rma進行歸(gui)(gui)(gui)一化(hua)。

根據(ju)特(te)定的實(shi)施方案(an)，使用rna和/或蛋白檢(jian)測(ce)方法(fa)確定表達量。

根據特(te)定的實施方案，所述檢測方法選自pcr、寡核苷(gan)酸(suan)微陣列、免疫(yi)沉淀法、蛋白印跡分析和facs。

根據本發明(ming)的一些實施方案，從受試者的細胞(bao)中(zhong)提(ti)取(qu)rna或(huo)(huo)蛋(dan)白分子。因此，根據特定的實施方案，該方法還包括(kuo)在比較之前從細胞(bao)中(zhong)提(ti)取(qu)rna或(huo)(huo)蛋(dan)白。

從受試(shi)者的(de)(de)(de)(de)細胞中提(ti)取rna或蛋(dan)白(bai)分子的(de)(de)(de)(de)方法是本領(ling)(ling)域(yu)熟知的(de)(de)(de)(de)。提(ti)取的(de)(de)(de)(de)rna可(ke)以進一步(bu)加工成cdna。用(yong)(yong)于將rna轉(zhuan)化為cdna的(de)(de)(de)(de)方法和(he)商業可(ke)得的(de)(de)(de)(de)試(shi)劑盒是本領(ling)(ling)域(yu)熟知的(de)(de)(de)(de)，包(bao)括例(li)如使用(yong)(yong)酶逆轉(zhuan)錄酶。一旦(dan)獲(huo)得，可(ke)以使用(yong)(yong)本領(ling)(ling)域(yu)已(yi)知的(de)(de)(de)(de)方法來表(biao)征(zheng)rna、cdna或蛋(dan)白(bai)分子的(de)(de)(de)(de)各種rna、cdna和(he)/或蛋(dan)白(bai)分子的(de)(de)(de)(de)表(biao)達(da)和(he)/或活性水平。

根據特定的(de)實施方(fang)案(an)，可(ke)以使用rna或dna檢測方(fang)法在(zai)核酸水平確定grin2b基(ji)因的(de)表達。

因此(ci)，根據本(ben)發(fa)明的一些(xie)實(shi)施方案，通(tong)過將生(sheng)物(wu)樣品(pin)、細胞或其部分(fen)或其提(ti)取物(wu)與探針(zhen)(zhen)(例如寡核(he)苷酸(suan)探針(zhen)(zhen)或引物(wu))雜交來(lai)進行grin2b途徑的rna的表達水平的檢測，所(suo)述探針(zhen)(zhen)與由(you)grin2b基(ji)因(例如，包括本(ben)領域已(yi)知的任何可選剪接形(xing)式)表達的多(duo)(duo)核(he)苷酸(suan)特異(yi)性(xing)雜交。這樣的探針(zhen)(zhen)可以是任何大小(xiao)，例如短多(duo)(duo)核(he)苷酸(suan)(例如，15-200個堿(jian)基(ji))，100-2000個堿(jian)基(ji)的中等多(duo)(duo)核(he)苷酸(suan)和多(duo)(duo)于2000個堿(jian)基(ji)的長多(duo)(duo)核(he)苷酸(suan)。

本(ben)發明使(shi)用的(de)探針(zhen)可以是任(ren)何直(zhi)接或(huo)間接標記的(de)rna分(fen)子(zi)[例(li)如(ru)，rna寡(gua)核苷酸(例(li)如(ru)，17-50個(ge)堿基(ji))，體外轉錄(lu)的(de)rna分(fen)子(zi)]，dna分(fen)子(zi)(例(li)如(ru)寡(gua)核苷酸，例(li)如(ru)15-50個(ge)堿基(ji)，cdna分(fen)子(zi)，基(ji)因組分(fen)子(zi))和/或(huo)其類(lei)似物(wu)[例(li)如(ru)肽(tai)核酸(pna)]，其對grin2b基(ji)因的(de)rna轉錄(lu)物(wu)有特(te)異性。根據特(te)定的(de)實施(shi)方案，所述(shu)探針(zhen)與可檢測部分(fen)結合。

根據(ju)(ju)本發明的教導設計的寡核苷(gan)酸可以根據(ju)(ju)本領域已知的任何(he)寡核苷(gan)酸合成(cheng)(cheng)方法生成(cheng)(cheng)，例如酶(mei)促合成(cheng)(cheng)或(huo)固相(xiang)合成(cheng)(cheng)。

根據(ju)特定的(de)(de)(de)實施方(fang)案(an)，雜交在(zai)允許(xu)形成(cheng)包(bao)含存在(zai)于細(xi)胞(bao)中的(de)(de)(de)grin2b基因的(de)(de)(de)mrna或(huo)cdna和(he)探針的(de)(de)(de)復合(he)物(wu)(wu)(wu)的(de)(de)(de)條件(jian)下進行。所述復合(he)物(wu)(wu)(wu)可(ke)以在(zai)各種溫度(du)、鹽(yan)濃度(du)和(he)ph值(zhi)下形成(cheng)，所述溫度(du)、鹽(yan)濃度(du)和(he)ph值(zhi)可(ke)根據(ju)所使用(yong)的(de)(de)(de)方(fang)法和(he)生物(wu)(wu)(wu)樣品而變化，并(bing)且本(ben)領域技術(shu)人員能夠調節適合(he)于形成(cheng)每個核苷酸/探針復合(he)物(wu)(wu)(wu)的(de)(de)(de)條件(jian)。

因此，根據本發明的(de)一(yi)個方面，提供了一(yi)種物質的(de)組合物，其包含被診斷患(huan)有戈謝病(bing)(gd)的(de)患(huan)者的(de)多(duo)核苷(gan)(gan)酸(suan)樣品，以及能夠與由grin2b基因表(biao)達的(de)多(duo)核苷(gan)(gan)酸(suan)特(te)異(yi)性雜交的(de)寡(gua)核苷(gan)(gan)酸(suan)，并且任選(xuan)地其中所(suo)述寡(gua)核苷(gan)(gan)酸(suan)被標記(ji)。

在細胞樣品中檢測rna和/或cdna分子的方法的非限制性實例包括rna印跡分析、rt-pcr[例如，半定量rt-pcr，使用例如lightcycler^tm(roche)的定量rt-pcr]，rna原位雜交(使用例如dna或rna探針用以雜交存在于細胞或組織切片中的rna分子)，原位rt-pcr(例如，如nuovogj等人，amjsurgpathol.1993，17：683-90；komminothp，等人patholrespract.1994,190：1017-25所述)和寡核苷酸微陣列(例如，通過將衍生自樣品的多核苷酸序列與附著于具有可尋址的位置的固體表面[例如，玻璃晶片)，例如affymetrix微陣列(santaclara，ca)]的寡核苷酸(suan)雜(za)交。

如上所述，根(gen)據(ju)特定的(de)實施方案，可以使(shi)用(yong)蛋白檢測(ce)方法在氨(an)基酸水平確(que)定grin2b基因的(de)表達。

因(yin)(yin)此(ci)，根據(ju)(ju)本(ben)發明的(de)(de)(de)(de)一些(xie)實施(shi)方案，通過(guo)使生物(wu)(wu)樣品(pin)、細胞或其(qi)部分或其(qi)提取物(wu)(wu)與特(te)異性結合(he)由grin2b基(ji)因(yin)(yin)(例如，包(bao)括本(ben)領域已知的(de)(de)(de)(de)其(qi)任何變(bian)體)表達的(de)(de)(de)(de)多肽的(de)(de)(de)(de)抗體接(jie)觸(chu)來進行grin2b的(de)(de)(de)(de)蛋白的(de)(de)(de)(de)表達水平(ping)的(de)(de)(de)(de)檢測。根據(ju)(ju)特(te)定的(de)(de)(de)(de)實施(shi)方案，所述接(jie)觸(chu)在(zai)允許形(xing)成包(bao)含存在(zai)于細胞中的(de)(de)(de)(de)grin2b基(ji)因(yin)(yin)涉及的(de)(de)(de)(de)多肽和抗體的(de)(de)(de)(de)復合(he)物(wu)(wu)(即免疫復合(he)物(wu)(wu))的(de)(de)(de)(de)條件下實現。

所(suo)述免(mian)疫復合(he)物(wu)可(ke)以在各種溫度(du)、鹽濃度(du)和(he)ph值下形成，所(suo)述溫度(du)、鹽濃度(du)和(he)ph值可(ke)以根據(ju)所(suo)使用的(de)方法(fa)和(he)生物(wu)樣品而變(bian)化，并(bing)且本領域技術人員能夠調節適(shi)合(he)于形成每種免(mian)疫復合(he)物(wu)的(de)條件。

因此(ci)，根據本發明的一個方面(mian)，提(ti)供了一種物(wu)質(zhi)的組合(he)(he)(he)物(wu)，其包(bao)(bao)含物(wu)質(zhi)的組合(he)(he)(he)物(wu)，其包(bao)(bao)含被診斷(duan)患(huan)有(you)戈(ge)謝病(gd)的患(huan)者的多(duo)肽樣品，以及能夠特(te)異性結合(he)(he)(he)由grin2b基因表達的多(duo)肽的抗體和任選的第(di)二(er)抗體。

檢測(ce)(ce)細(xi)胞(bao)樣品(pin)(pin)中特異(yi)性(xing)蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)分(fen)子的(de)(de)(de)水(shui)(shui)平和/或活性(xing)的(de)(de)(de)方法(fa)的(de)(de)(de)非限制性(xing)實例(li)包(bao)括(kuo)酶聯免疫吸附測(ce)(ce)定(elisa)、蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)印跡(ji)分(fen)析(xi)、免疫沉淀法(fa)(ip)、放射免疫測(ce)(ce)定(ria)、熒光(guang)活化細(xi)胞(bao)分(fen)選(facs)、免疫組織化學分(fen)析(xi)、原位活性(xing)測(ce)(ce)定(使用例(li)如(ru)施加在(zai)含有活性(xing)酶的(de)(de)(de)細(xi)胞(bao)上的(de)(de)(de)顯(xian)色底物)、體外(wai)活性(xing)測(ce)(ce)定(其中特定的(de)(de)(de)酶的(de)(de)(de)活性(xing)在(zai)提取自細(xi)胞(bao)的(de)(de)(de)蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)混合物中測(ce)(ce)量)和基于分(fen)子量的(de)(de)(de)方法(fa)。例(li)如(ru)，在(zai)需要檢測(ce)(ce)分(fen)泌(mi)(mi)蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)的(de)(de)(de)表達水(shui)(shui)平的(de)(de)(de)情(qing)況下(xia)，可以(yi)對從(cong)受試者獲(huo)得的(de)(de)(de)含有細(xi)胞(bao)分(fen)泌(mi)(mi)的(de)(de)(de)內容物的(de)(de)(de)流體樣品(pin)(pin)(例(li)如(ru)血清)進行(xing)elisa測(ce)(ce)定。

根(gen)據(ju)特定的實(shi)施(shi)方案，本發明使用的抗體可以是任何直接或(huo)間接標記的抗體。根(gen)據(ju)特定的實(shi)施(shi)方案，寡(gua)核苷酸與可檢(jian)測部分(fen)結合。

本發明的一些實施方案使用的可檢測部分可以是但不限于熒光化學品(熒光團)，磷光化學品、化學發光化學品、放射性同位素(例如^[125]碘)、酶、熒光多肽、親和(he)標記物(wu)，以及(ji)可通過正電子發射斷(duan)層(ceng)成像術(pet)或磁共振(zhen)成像(mri)檢測(ce)的(de)分子(造影劑)。

如(ru)上所(suo)述，將患者(zhe)生物(wu)樣(yang)品(pin)中的(de)grin2b基因的(de)表達(da)(da)水平(ping)(ping)與健康(kang)患者(zhe)或被(bei)診(zhen)斷患有gdi型的(de)患者(zhe)的(de)生物(wu)樣(yang)品(pin)中的(de)至少一種基因的(de)表達(da)(da)水平(ping)(ping)進行(xing)比較。

如本文所(suo)用(yong)，術語“健康患者(zhe)(zhe)”是指不(bu)患有gd的患者(zhe)(zhe)。

如上(shang)所(suo)述，相對于健康患者(zhe)或被(bei)診斷患有gdi型的(de)(de)(de)(de)患者(zhe)的(de)(de)(de)(de)生(sheng)物(wu)樣品，影響grin2b基因的(de)(de)(de)(de)表達產(chan)物(wu)的(de)(de)(de)(de)量的(de)(de)(de)(de)序列變(bian)異的(de)(de)(de)(de)存在，所(suo)述表達產(chan)物(wu)的(de)(de)(de)(de)量高于預定(ding)水平和/或所(suo)述表達產(chan)物(wu)的(de)(de)(de)(de)增加的(de)(de)(de)(de)量，指示gd的(de)(de)(de)(de)神經病性(xing)形式。

如本(ben)文(wen)所用(yong)(yong)，短語“高(gao)于預定閾(yu)值的(de)量”或“增加的(de)量”是指相對于使(shi)用(yong)(yong)相同的(de)定量方法的(de)健(jian)康受試者(zhe)的(de)類似(si)生物(wu)樣品中(zhong)發現的(de)量的(de)至少(shao)統計學顯著的(de)上調。

根(gen)據特定的實施方案，所述增加的量(liang)為相對于(yu)(yu)(yu)(yu)對照樣(yang)品增加至(zhi)(zhi)少(shao)(shao)(shao)(shao)5％，至(zhi)(zhi)少(shao)(shao)(shao)(shao)10％，至(zhi)(zhi)少(shao)(shao)(shao)(shao)20％，至(zhi)(zhi)少(shao)(shao)(shao)(shao)30％，至(zhi)(zhi)少(shao)(shao)(shao)(shao)40％，至(zhi)(zhi)少(shao)(shao)(shao)(shao)50％，至(zhi)(zhi)少(shao)(shao)(shao)(shao)60％，至(zhi)(zhi)少(shao)(shao)(shao)(shao)70％，至(zhi)(zhi)少(shao)(shao)(shao)(shao)80％，至(zhi)(zhi)少(shao)(shao)(shao)(shao)90％，至(zhi)(zhi)少(shao)(shao)(shao)(shao)95％，至(zhi)(zhi)少(shao)(shao)(shao)(shao)100％或更多，高(gao)于(yu)(yu)(yu)(yu)約(yue)(yue)(yue)2倍(bei)(bei)，高(gao)于(yu)(yu)(yu)(yu)約(yue)(yue)(yue)3倍(bei)(bei)，高(gao)于(yu)(yu)(yu)(yu)約(yue)(yue)(yue)4倍(bei)(bei)，高(gao)于(yu)(yu)(yu)(yu)約(yue)(yue)(yue)5倍(bei)(bei)，高(gao)于(yu)(yu)(yu)(yu)約(yue)(yue)(yue)6倍(bei)(bei)，高(gao)于(yu)(yu)(yu)(yu)約(yue)(yue)(yue)7倍(bei)(bei)，高(gao)于(yu)(yu)(yu)(yu)約(yue)(yue)(yue)8倍(bei)(bei)，高(gao)于(yu)(yu)(yu)(yu)約(yue)(yue)(yue)9倍(bei)(bei)，高(gao)于(yu)(yu)(yu)(yu)約(yue)(yue)(yue)20倍(bei)(bei)，高(gao)于(yu)(yu)(yu)(yu)約(yue)(yue)(yue)50倍(bei)(bei)，高(gao)于(yu)(yu)(yu)(yu)約(yue)(yue)(yue)100倍(bei)(bei)，高(gao)于(yu)(yu)(yu)(yu)約(yue)(yue)(yue)200倍(bei)(bei)，高(gao)于(yu)(yu)(yu)(yu)約(yue)(yue)(yue)350倍(bei)(bei)，高(gao)于(yu)(yu)(yu)(yu)約(yue)(yue)(yue)500倍(bei)(bei)，高(gao)于(yu)(yu)(yu)(yu)約(yue)(yue)(yue)1000倍(bei)(bei)或更多。

預期在(zai)從本(ben)申請(qing)成熟(shu)的(de)(de)(de)專利(li)期限內(nei)，將(jiang)會開發許多(duo)相(xiang)關(guan)的(de)(de)(de)nmda受體(ti)拮抗(kang)劑，并且(qie)術語(yu)“nmda受體(ti)拮抗(kang)劑”的(de)(de)(de)范圍意(yi)在(zai)包(bao)括所有這些(xie)推理(li)的(de)(de)(de)新技術。

如本文(wen)所用，術(shu)語“約”是指±10％術(shu)語“包(bao)含(han)”、“含(han)有”、“包(bao)括(kuo)(includes)”、“包(bao)括(kuo)(including)”、“具有”和它們的結合物意味著“包(bao)括(kuo)但不限(xian)于”。

術語(yu)“由...組成”是指“包括但(dan)限于”。

術語“基本(ben)上(shang)由(you)...組成(cheng)”是指組合(he)物、方法(fa)或(huo)結構(gou)可以包(bao)括另(ling)(ling)外(wai)的(de)(de)成(cheng)分、步驟和(he)/或(huo)部(bu)分，但是只有(you)當所(suo)述(shu)另(ling)(ling)外(wai)的(de)(de)成(cheng)分、步驟和(he)/或(huo)部(bu)分不(bu)會(hui)實質上(shang)改變(bian)所(suo)要(yao)求保護的(de)(de)組合(he)物、方法(fa)或(huo)結構(gou)的(de)(de)基本(ben)和(he)新(xin)特征時。

如本文所用(yong)，單數(shu)形式“一(yi)”、“一(yi)種(zhong)”和“所述(shu)”包括復數(shu)指代，除非上(shang)下(xia)文另有明確規定。例如，術(shu)語(yu)“一(yi)種(zhong)化合物(wu)”或“至少(shao)一(yi)種(zhong)化合物(wu)”可以包括多種(zhong)化合物(wu)，包括它們(men)的(de)混合物(wu)。

在本申請中，本發(fa)明的(de)(de)各(ge)種實施方案可(ke)(ke)以以范(fan)(fan)圍(wei)(wei)(wei)格(ge)式呈(cheng)現。應當(dang)理解，范(fan)(fan)圍(wei)(wei)(wei)格(ge)式的(de)(de)描(miao)述(shu)僅僅是為(wei)了方便和簡潔，并且不(bu)應被解釋為(wei)對本發(fa)明的(de)(de)范(fan)(fan)圍(wei)(wei)(wei)的(de)(de)僵化限制。因此，對范(fan)(fan)圍(wei)(wei)(wei)的(de)(de)描(miao)述(shu)應被認(ren)為(wei)已經(jing)具體公開所(suo)有可(ke)(ke)能(neng)的(de)(de)子(zi)范(fan)(fan)圍(wei)(wei)(wei)以及該范(fan)(fan)圍(wei)(wei)(wei)內的(de)(de)各(ge)個數值。例如(ru)，諸(zhu)如(ru)從1到6的(de)(de)范(fan)(fan)圍(wei)(wei)(wei)的(de)(de)描(miao)述(shu)應被認(ren)為(wei)已經(jing)具體公開子(zi)范(fan)(fan)圍(wei)(wei)(wei)諸(zhu)如(ru)1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3到6等，以及該范(fan)(fan)圍(wei)(wei)(wei)內的(de)(de)各(ge)個數字(zi)，例如(ru)1、2、3、4、5和6。不(bu)管范(fan)(fan)圍(wei)(wei)(wei)的(de)(de)寬度這(zhe)都適用。

本(ben)文(wen)無論何時顯示(shi)數(shu)(shu)值(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)范圍，都意(yi)味著包(bao)括在(zai)指(zhi)定范圍內的(de)(de)任何引(yin)用(yong)的(de)(de)數(shu)(shu)字(分(fen)數(shu)(shu)或(huo)整數(shu)(shu))。短(duan)語“范圍在(zai)第(di)一指(zhi)示(shi)數(shu)(shu)值(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)和(he)(he)第(di)二(er)指(zhi)示(shi)數(shu)(shu)值(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)之(zhi)間”和(he)(he)“范圍從(cong)第(di)一指(zhi)示(shi)數(shu)(shu)值(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)至第(di)二(er)指(zhi)示(shi)數(shu)(shu)值(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)”在(zai)本(ben)文(wen)中(zhong)可互換使用(yong)，并且意(yi)在(zai)包(bao)括所(suo)述(shu)第(di)一和(he)(he)第(di)二(er)指(zhi)示(shi)數(shu)(shu)值(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)以及它們之(zhi)間的(de)(de)所(suo)有分(fen)數(shu)(shu)和(he)(he)整數(shu)(shu)數(shu)(shu)字。

如本文(wen)所使用(yong)的，術(shu)語“方(fang)(fang)法”是指完成給定任(ren)務的方(fang)(fang)式(shi)、手段、技(ji)術(shu)和(he)(he)工序(xu)，包括但不限(xian)于(yu)已知或者(zhe)以(yi)已知方(fang)(fang)式(shi)、手段、技(ji)術(shu)和(he)(he)工序(xu)由(you)化(hua)(hua)學(xue)、藥理學(xue)、生物學(xue)、生物化(hua)(hua)學(xue)和(he)(he)醫學(xue)領域的從(cong)業者(zhe)容易開發的那些方(fang)(fang)式(shi)、手段、技(ji)術(shu)和(he)(he)工序(xu)。

當提(ti)及特定的(de)序(xu)列表時，這(zhe)樣的(de)參考應(ying)被(bei)理(li)解為也(ye)包括基(ji)(ji)本上對(dui)應(ying)于其互補序(xu)列的(de)序(xu)列，包括由(you)于例如測(ce)序(xu)錯(cuo)(cuo)誤、克隆錯(cuo)(cuo)誤或(huo)導(dao)致(zhi)堿(jian)基(ji)(ji)置換、堿(jian)基(ji)(ji)缺失或(huo)堿(jian)基(ji)(ji)添加(jia)的(de)其它(ta)改變(bian)而導(dao)致(zhi)的(de)較小(xiao)序(xu)列變(bian)異(yi)，條件是這(zhe)些變(bian)異(yi)的(de)頻率為50個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)核(he)(he)(he)苷(gan)(gan)酸(suan)(suan)中(zhong)(zhong)少(shao)(shao)于1個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)，或(huo)者100個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)核(he)(he)(he)苷(gan)(gan)酸(suan)(suan)中(zhong)(zhong)少(shao)(shao)于1個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)，或(huo)者200個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)核(he)(he)(he)苷(gan)(gan)酸(suan)(suan)中(zhong)(zhong)少(shao)(shao)于1個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)，或(huo)者500個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)核(he)(he)(he)苷(gan)(gan)酸(suan)(suan)中(zhong)(zhong)有少(shao)(shao)于1個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)，或(huo)者1000個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)核(he)(he)(he)苷(gan)(gan)酸(suan)(suan)中(zhong)(zhong)少(shao)(shao)于1個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)，或(huo)者5000個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)核(he)(he)(he)苷(gan)(gan)酸(suan)(suan)中(zhong)(zhong)少(shao)(shao)于1個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)，或(huo)者10000個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)核(he)(he)(he)苷(gan)(gan)酸(suan)(suan)中(zhong)(zhong)少(shao)(shao)于1個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)。

應(ying)(ying)當理解(jie)，為(wei)了清楚起(qi)見(jian)，在單(dan)(dan)獨實(shi)施(shi)方(fang)案(an)(an)的(de)(de)(de)(de)(de)上下(xia)(xia)文(wen)中(zhong)描(miao)述(shu)的(de)(de)(de)(de)(de)本(ben)發明的(de)(de)(de)(de)(de)某些特征也可(ke)(ke)以在單(dan)(dan)個(ge)實(shi)施(shi)方(fang)案(an)(an)中(zhong)組(zu)(zu)合提(ti)供(gong)。相反，為(wei)了簡潔起(qi)見(jian)，在單(dan)(dan)個(ge)實(shi)施(shi)方(fang)案(an)(an)的(de)(de)(de)(de)(de)上下(xia)(xia)文(wen)中(zhong)描(miao)述(shu)的(de)(de)(de)(de)(de)本(ben)發明的(de)(de)(de)(de)(de)各種特征也可(ke)(ke)以單(dan)(dan)獨提(ti)供(gong)或(huo)以任何合適的(de)(de)(de)(de)(de)子組(zu)(zu)合提(ti)供(gong)或(huo)合適的(de)(de)(de)(de)(de)在本(ben)發明的(de)(de)(de)(de)(de)任何其它描(miao)述(shu)的(de)(de)(de)(de)(de)實(shi)施(shi)方(fang)案(an)(an)中(zhong)提(ti)供(gong)。在各種實(shi)施(shi)方(fang)案(an)(an)的(de)(de)(de)(de)(de)上下(xia)(xia)文(wen)中(zhong)描(miao)述(shu)的(de)(de)(de)(de)(de)某些特征不應(ying)(ying)被認為(wei)是(shi)那些實(shi)施(shi)方(fang)案(an)(an)的(de)(de)(de)(de)(de)基本(ben)特征，除非該實(shi)施(shi)方(fang)案(an)(an)在沒有那些元素(su)的(de)(de)(de)(de)(de)情(qing)況下(xia)(xia)不起(qi)作(zuo)用。

如(ru)上所述(shu)和如(ru)下(xia)(xia)權利要求部分所要求保護(hu)的(de)本發明的(de)各種實施方(fang)案(an)和方(fang)面在以(yi)下(xia)(xia)實施例中找(zhao)到實驗支持。然而，它們絕對不被解釋為限制本發明的(de)廣泛范圍。

實施例

現在參考以下實施(shi)例，其與上述描述一(yi)(yi)起以非限制性(xing)方(fang)式說明(ming)本發明(ming)的一(yi)(yi)些實施(shi)方(fang)案。

通(tong)常，本文(wen)(wen)使用(yong)的(de)(de)(de)命名法和(he)(he)本發明中(zhong)使用(yong)的(de)(de)(de)實(shi)驗室工序包(bao)(bao)括(kuo)分子(zi)、生物化學(xue)(xue)、微(wei)生物學(xue)(xue)和(he)(he)重組dna技術。這(zhe)(zhe)些技術在文(wen)(wen)獻中(zhong)有(you)詳細解(jie)釋(shi)。參見例(li)(li)如“molecularcloning：alaboratorymanual”sambrook等(deng)人，(1989)；“currentprotocolsinmolecularbiology”第(di)(di)i-iii卷(juan)ausubel，r.m.，編(bian)(1994)；ausubel等(deng)人，“currentprotocolsinmolecularbiology”，johnwiley和(he)(he)sons，baltimore，maryland(1989)；perbal，“apracticalguidetomolecularcloning”，johnwiley&sons，newyork(1988)；watson等(deng)人，“recombinantdna”，scientificamericanbooks，newyork；birren等(deng)人(編(bian))“genomeanalysis：alaboratorymanualseries”，第(di)(di)1-4卷(juan)，coldspringharborlaboratorypress，newyork(1998)；方(fang)法如美國專利號4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和(he)(he)5,272,057中(zhong)所述；“cellbiology：alaboratoryhandbook”，第(di)(di)i-iii卷(juan)cellis，j.e.，編(bian)(1994)；“cultureofanimalcells-amanualofbasictechnique”，freshney，wiley-liss，n.y.(1994)，第(di)(di)三版；“currentprotocolsinimmunology”第(di)(di)i-iii卷(juan)coliganj.e.，編(bian)(1994)；stites等(deng)人(編(bian))，“basicandclinicalimmunology”(第(di)(di)8版)，appleton&lange，norwalk，ct(1994)；mishell和(he)(he)shiigi(編(bian))，“selectedmethodsincellularimmunology”，w.h.freemanandco.，newyork(1980)；可用(yong)的(de)(de)(de)免(mian)疫測定法在專利和(he)(he)科學(xue)(xue)文(wen)(wen)獻中(zhong)廣泛描述，參見例(li)(li)如美國專利號3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771和(he)(he)5,281,521；“oligonucleotidesynthesis”gait，m.j.，編(bian)(1984)；“nucleicacidhybridization”hames，b.d.和(he)(he)higginss.j.，編(bian)(1985)；“transcriptionandtranslation”hames，b.d.和(he)(he)higginss.j.，編(bian)(1984)；“animalcellculture”freshney，r.i.，編(bian)(1986)；“immobilizedcellsandenzymes”irlpress，(1986)；“apracticalguidetomolecularcloning”perbal，b.，(1984)和(he)(he)“methodsinenzymology”第(di)(di)1-317卷(juan)，academicpress；“pcrprotocols：aguidetomethodsandapplications”，academicpress，sandiego，ca(1990)；marshak等(deng)人，“strategiesforproteinpurificationandcharacterization-alaboratorycoursemanual”cshlpress(1996)；所有(you)這(zhe)(zhe)些通(tong)過(guo)引用(yong)并(bing)入，如在本文(wen)(wen)中(zhong)完整闡(chan)述。在本文(wen)(wen)件全文(wen)(wen)中(zhong)提(ti)供其(qi)它一(yi)般性(xing)參考文(wen)(wen)獻。其(qi)中(zhong)的(de)(de)(de)工序被認(ren)為是本領域熟知的(de)(de)(de)，并(bing)為了讀者(zhe)的(de)(de)(de)方(fang)便(bian)而提(ti)供。其(qi)中(zhong)包(bao)(bao)含(han)的(de)(de)(de)所有(you)信息通(tong)過(guo)引用(yong)并(bing)入本文(wen)(wen)。

材料和方法

小鼠-從jackson實驗室(usa)、harlanuk和harlan以色列獲得純種近交小鼠品系。具體來說，btbrt⁺itpr3^tf/jc3h/hej、dba/2j、mrl/mpj、wsb/eij、molf/ei、pwd/phj、kk/hij、bpl/1j、i/lnj、bpn/3j和lp/j獲自jackson；a/j、akr/j、nzw/lacj、129s1/svimj獲自英國的harlan實驗室；和c57bl/6jolahsd、balb/cj和fvb/nj均獲自以色列的harlan實驗室。如在vitner等人naturemedicine(2014)20：204-208；和enquist,i.b.等人proc.natl.acad.sci.usa(2007)104:17483–17488中所述地產生gba^flox/flox；巢蛋(dan)白-cre小(xiao)鼠(shu)，一種gd的(de)(de)小(xiao)鼠(shu)模型。這些小(xiao)鼠(shu)總結了人(ren)ngd的(de)(de)許多特(te)征(zheng)，盡管它們的(de)(de)gba1缺陷僅限(xian)于神經和大(da)膠(jiao)質譜系(xi)。小(xiao)鼠(shu)在(zai)特(te)定的(de)(de)無病原(yuan)體條(tiao)件下維持，并根據(ju)國際(ji)指南通過魏茨曼研究(jiu)所動物保(bao)護(hu)委員(yuan)會批準的(de)(de)方案(an)處理。

cbe注射(she)-環(huan)(huan)己烯(xi)四醇-β-環(huan)(huan)氧化物(cbe)獲自calbiochemmillipore(darmstadt，德國)。從出生后(hou)第8天(tian)(p8)開始每天(tian)向(xiang)小鼠腹膜內(nei)施用每天(tian)25mg或(huo)50mg/kg體(ti)重的劑量(liang)的cbe或(huo)pbs(對(dui)照)。

用(yong)(yong)nmda受體激動劑(ji)(ji)(ji)(ji)和(he)拮(jie)抗劑(ji)(ji)(ji)(ji)處理-所有(you)激動劑(ji)(ji)(ji)(ji)和(he)拮(jie)抗劑(ji)(ji)(ji)(ji)從(cong)p8起每(mei)(mei)(mei)天(tian)施(shi)(shi)用(yong)(yong)。每(mei)(mei)(mei)天(tian)以200mg/kg/天(tian)的(de)劑(ji)(ji)(ji)(ji)量(liang)施(shi)(shi)用(yong)(yong)d-環絲氨(an)酸(sigma)。每(mei)(mei)(mei)天(tian)以0.3mg/kg/天(tian)的(de)劑(ji)(ji)(ji)(ji)量(liang)施(shi)(shi)用(yong)(yong)mk-801(sigma)。美金剛(sigma)每(mei)(mei)(mei)天(tian)以3或30mg/kg/天(tian)的(de)劑(ji)(ji)(ji)(ji)量(liang)施(shi)(shi)用(yong)(yong)。每(mei)(mei)(mei)天(tian)以9mg/kg/天(tian)的(de)劑(ji)(ji)(ji)(ji)量(liang)施(shi)(shi)用(yong)(yong)艾芬(fen)地爾(sigma)。

免疫組(zu)織化(hua)學-處(chu)死(si)小鼠，將(jiang)全腦(nao)(nao)在(zai)4％多聚甲醛(quan)：pbs中(zhong)在(zai)4℃下固定過(guo)夜。將(jiang)組(zu)織在(zai)pbs中(zhong)洗(xi)滌并用薄(bo)片(pian)切片(pian)機(ji)切片(pian)。通過(guo)所(suo)有阻(zu)斷、抗(kang)體孵(fu)育(yu)和(he)洗(xi)滌步驟，將(jiang)40微(wei)米冠(guan)狀切片(pian)在(zai)2％bsa、0.2％tritonx-100、pbs中(zhong)自由(you)漂浮處(chu)理。將(jiang)切片(pian)在(zai)4℃下用初級抗(kang)大(da)鼠cd68(abdserotec，oxford，uk；1:1000)孵(fu)育(yu)過(guo)夜。洗(xi)滌后，將(jiang)切片(pian)用二次cy2-綴合的驢抗(kang)大(da)鼠抗(kang)體(1:200，jackson)孵(fu)育(yu)。使用落射熒光顯微(wei)鏡(jing)(zeiss)分析腦(nao)(nao)皮(pi)質(zhi)層v中(zhong)cd68-陽性細(xi)胞的存在(zai)。

rna提取和定量pcr處(chu)理(li)后，處(chu)死小鼠，并(bing)取出它們(men)的(de)(de)腦(nao)，置(zhi)于小鼠腦(nao)切(qie)片器(youngmousebrainslicermatrix)(bsmys001-1，zivicinstruments，pittsburgh，pa，usa)上(shang)，并(bing)切(qie)成1mm冠狀切(qie)片。使用(yong)刮鏟(chan)將大腦(nao)皮質分(fen)離并(bing)在(zai)液氮中快速冷凍并(bing)儲存(cun)在(zai)-80℃下(xia)。根據制造商的(de)(de)說明書，使用(yong)rneasymini試劑盒(qiagengmbh，hilden，德國)分(fen)離總rna。使用(yong)perfectasybrgreenfastmix(quantabiosciences，gaithersburg，md，usa)和abiprism7300序列檢測系統(tong)(appliedbiosystems，fostercity，ca，usa)進(jin)行定量聚合酶(mei)鏈反應(ying)(ying)(q-pcr)。引物濃度(du)為在(zai)20μl的(de)(de)反應(ying)(ying)體積中的(de)(de)13nm，且(qie)cdna相當于2ng的(de)(de)總rna。每個反應(ying)(ying)都以三(san)個生物重復和四個技術(shu)一(yi)式(shi)三(san)份進(jin)行。熱循(xun)環(huan)參(can)數如下(xia)：步驟(zou)1，95℃10分(fen)鐘(zhong)；步驟(zou)2，95℃15秒，60℃30秒和68℃30秒。重復步驟(zou)2進(jin)行40個循(xun)環(huan)，和然(ran)后進(jin)行解(jie)離步驟(zou)。使用(yong)tata盒結合蛋白(tbp)進(jin)行歸(gui)一(yi)化的(de)(de)比(bi)較(jiao)循(xun)環(huan)閾值法計算(suan)mrna水平(ping)的(de)(de)折疊變化。使用(yong)雙尾、雙獨立(li)樣本學(xue)生t檢驗計算(suan)p值。引物序列如下(xia)：

grin2b正向引物(seqidno：2)：5'-cgcccagatcctcgatttca-3'；

grin2b反向引物(wu)(seqidno：3)：5'-ctggaagaacatggaggactca-3'。

tbp正向(xiang)引(yin)物(seqidno：4)：5'-tgctgttggtgattgttggt-3'；和(he)

tbp反向(xiang)引(yin)物(seqidno：5)：5'-ctggcttgtgtgggaaagat-3'；

gba1活(huo)性(xing)測(ce)(ce)定(ding)-如前所述進行gba1活(huo)性(xing)測(ce)(ce)定(ding)(farfel-becker等人，hummolgenet.2014；23(4)：843-54)。簡言之(zhi)，將冷凍的半腦樣品(pin)在mcilvaine緩(huan)沖液(0.1m檸檬酸，ph4.2，0.2mna2hpo4，29:21，體(ti)(ti)積(ji):體(ti)(ti)積(ji))中超(chao)聲處理。將含有(you)50μg蛋白的組織勻(yun)漿物(wu)在37℃下用在25μl最(zui)終體(ti)(ti)積(ji)的mcilvaine緩(huan)沖液中的8μmc6-nbd-glccer(avantipolarlipids，alabaster，al，usa)孵育30分(fen)(fen)鐘。提取脂質并(bing)(bing)使(shi)用氯仿：甲醇：9.8mmcacl2(60:35:8，體(ti)(ti)積(ji):體(ti)(ti)積(ji):體(ti)(ti)積(ji))作(zuo)為顯影溶劑(ji)通過薄層色譜法分(fen)(fen)離較低(di)相。使(shi)用typhoon9410可變模式(shi)成像(xiang)儀(yi)，用真(zhen)實的標準鑒定(ding)c6-nbd-神經(jing)酰(xian)胺，并(bing)(bing)通過image-quanttl(gehealthcare，chalfontstgiles，uk)量化(hua)條帶。

鞘脂(zhi)分析-使用如(ru)前所(suo)述的abi4000四(si)極線性離(li)子阱質譜儀進(jin)行lc-esi-ms/ms(farfel-becker等(deng)人，hummolgenet.2014；23(4)：843-54)。鞘脂(zhi)內(nei)標獲自avantipolarlipids(alabaster，al，usa)。

全基因組關聯研究-通過高效混合模型關聯(emma)，使用如前所述的單個單核苷酸多態性(snp)關聯，對定量壽命表型進行gwa作圖(kang等人，2008)。emma校正遺傳相關性和人口結構，最大限度地減少假關聯。為了確保小鼠基因組的高度作圖分辨率，使用4000000個snp/品系進行關聯。在嚴格的bonferroni校正之后，全基因組顯著性的閾值為1.25×10^-8。雖然以前已經證明，在雜交小鼠多樣性組(hmdp)中使用emma的gwa的p<0.05全基因組等同物為p＝4.1×10^-6(kang等人，2008)，為避免假關聯，p值≤1×10^-7被(bei)認為(wei)是(shi)顯(xian)著的(de)。曼哈頓圖是(shi)使用r包(bao)生成的(de)(turnersd.qqman：用于使用q-q和曼哈頓圖可視(shi)化gwas結果的(de)r包(bao)。biorxivdoi:://dx.doi.org/10.1101/005165)。

運動(dong)檢測-通(tong)(tong)過吊線測試(shi)，一(yi)(yi)種lsd小鼠模型的(de)(de)(de)驗(yan)證測試(shi)，每周(zhou)對處(chu)理(li)的(de)(de)(de)品系中的(de)(de)(de)運動(dong)協(xie)調進行評估(alvarez等人(ren)，2008)。簡而言(yan)之(zhi)，將小鼠的(de)(de)(de)前(qian)爪(zhua)放在(zai)水平桿(3mm直(zhi)徑(jing)；35mm長(chang))的(de)(de)(de)中心處(chu)。觀察(cha)動(dong)物的(de)(de)(de)身體位置(zhi)30秒(miao)，并如前(qian)所(suo)述進行評分(alvarez等人(ren)fasebj.2008；22(10)：3617-27)：0＝在(zai)10秒(miao)內脫落；1，＝通(tong)(tong)過兩(liang)個(ge)前(qian)爪(zhua)掛在(zai)桿上(shang)；2＝試(shi)圖爬上(shang)桿；3＝通(tong)(tong)過兩(liang)個(ge)前(qian)爪(zhua)加一(yi)(yi)個(ge)或兩(liang)個(ge)后爪(zhua)掛在(zai)桿上(shang)；4＝所(suo)有四只(zhi)爪(zhua)掛著，加上(shang)尾巴卷繞(rao)在(zai)桿上(shang)；和(he)5＝主動(dong)逃生到桿的(de)(de)(de)末(mo)端。

人(ren)樣(yang)品和wb-人(ren)腦樣(yang)品通過知情(qing)同意(yi)書(shu)獲得。按照描述(vitner等人(ren)，2014)制備勻(yun)漿物(wu)。印(yin)跡用抗nr2b(1:1000，millipore，06-600)和gapdh(1:10000，chemicon，mab374)抗體孵育。

統計分析-所有(you)數據顯(xian)示為平均值±sem。使用雙(shuang)尾(wei)學生t檢(jian)驗進行兩個樣品(pin)之(zhi)間的比較(jiao)。p<0.05被(bei)認為是統計學顯(xian)著(zhu)的。

實施例1.選擇神經病性戈謝病(ngd)的小鼠模型

為(wei)了(le)(le)研究不同(tong)(tong)小(xiao)鼠(shu)(shu)品(pin)系作為(wei)2/3型(xing)gd的(de)(de)(de)(de)(de)(de)可(ke)(ke)靠模(mo)型(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)潛力，選擇了(le)(le)15種(zhong)不同(tong)(tong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)近交小(xiao)鼠(shu)(shu)品(pin)系。cbe已經被用(yong)于(yu)在小(xiao)鼠(shu)(shu)中誘(you)導(dao)gd多年(mumford等人(ren)，1975)，并(bing)且它被用(yong)于(yu)產生gd疾病的(de)(de)(de)(de)(de)(de)第(di)一(yi)動物模(mo)型(xing)。cbe是水溶性的(de)(de)(de)(de)(de)(de)，并(bing)穿過血腦(nao)屏障。所選擇的(de)(de)(de)(de)(de)(de)15種(zhong)小(xiao)鼠(shu)(shu)品(pin)系具有(you)(you)不同(tong)(tong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)系統發育起源，并(bing)且它們的(de)(de)(de)(de)(de)(de)snp分布可(ke)(ke)以自由(you)獲得(圖1a)。在出生后第(di)8天開始和在其剩下的(de)(de)(de)(de)(de)(de)生命中，每(mei)天向小(xiao)鼠(shu)(shu)腹腔注射25mg/kg/天的(de)(de)(de)(de)(de)(de)cbe(vitner等人(ren)，2014)。如下圖1b和表(biao)2中總結的(de)(de)(de)(de)(de)(de)，15種(zhong)小(xiao)鼠(shu)(shu)品(pin)系的(de)(de)(de)(de)(de)(de)存活延續超過200天。獲得的(de)(de)(de)(de)(de)(de)結果(guo)表(biao)明(ming)，每(mei)種(zhong)小(xiao)鼠(shu)(shu)品(pin)系對cbe的(de)(de)(de)(de)(de)(de)gd誘(you)導(dao)反應(ying)不同(tong)(tong)。品(pin)系可(ke)(ke)分為(wei)兩組(zu)：第(di)一(yi)組(zu)小(xiao)鼠(shu)(shu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)行為(wei)非常均一(yi)；它們發展了(le)(le)一(yi)種(zhong)非常有(you)(you)侵襲性的(de)(de)(de)(de)(de)(de)疾病，壽(shou)命短。第(di)二組(zu)品(pin)系表(biao)現出具有(you)(you)更廣(guang)泛的(de)(de)(de)(de)(de)(de)表(biao)型(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)更長的(de)(de)(de)(de)(de)(de)預期壽(shou)命。在每(mei)個(ge)品(pin)系中，壽(shou)命變化性低，表(biao)明(ming)每(mei)種(zhong)品(pin)系對cbe處理的(de)(de)(de)(de)(de)(de)反應(ying)是遺(yi)傳背景的(de)(de)(de)(de)(de)(de)結果(guo)。

為了(le)進一步表(biao)征cbe處(chu)理對不(bu)同品系(xi)的(de)(de)(de)影響，每周(zhou)使(shi)用吊(diao)線(xian)試驗，從出(chu)生后(hou)第(di)21天開始，持續2個月追蹤運動(dong)行(xing)為。掛線(xian)測試評估協(xie)調和運動(dong)功能，其(qi)中(zhong)高分(fen)(fen)意(yi)味著更好的(de)(de)(de)協(xie)調。如圖(tu)1c所示，存活短(duan)的(de)(de)(de)經(jing)cbe處(chu)理的(de)(de)(de)品系(xi)在(zai)非常早期的(de)(de)(de)時間點也(ye)顯示差(cha)的(de)(de)(de)運動(dong)行(xing)為；而(er)存活長的(de)(de)(de)品系(xi)呈現較高的(de)(de)(de)運動(dong)行(xing)為值(zhi)。呈現長壽命(ming)的(de)(de)(de)一些品系(xi)，如sv129和balb/c，在(zai)后(hou)期階段表(biao)現出(chu)較差(cha)的(de)(de)(de)運動(dong)行(xing)為，而(er)其(qi)它品系(xi)如kk/hij在(zai)所有測試時間點都具(ju)有高的(de)(de)(de)運動(dong)得(de)分(fen)(fen)。與(yu)品系(xi)無關，經(jing)pbs處(chu)理的(de)(de)(de)小鼠顯示出(chu)高掛線(xian)測試得(de)分(fen)(fen)，表(biao)明由(you)于(yu)cbe處(chu)理而(er)導致運動(dong)行(xing)為的(de)(de)(de)差(cha)異(圖(tu)1c)。值(zhi)得(de)注(zhu)意(yi)的(de)(de)(de)是，pwd/phj和wsb/eij品系(xi)由(you)于(yu)其(qi)野(ye)性行(xing)為而(er)被排除在(zai)運動(dong)行(xing)為分(fen)(fen)析中(zhong)。

為了驗證實施例1的結果，在兩個示例性品系akr/j(在第24天的平均死亡率)和btbrt^+itpr3tf/j(在第199天的100％死亡率)中分析腦的皮質層v中cd68-陽性細胞的存在。如圖2所示，通過cbe處理更容易死亡的akr/j小鼠也顯示明顯的腦病理學，表明它們可以用作2型和/或3型gd的良好模型，而btbrt^+itpr3tf/j小鼠在死亡(wang)率(lv)和腦病(bing)理學方(fang)面對cbe敏感性較低(di)。

總(zong)之，在測試的品(pin)系中，發(fa)現a/j、akr/j、c3h/hej、dba/2j、mrl/mpj、c57bl/6j、wsb/eij和molf/eij對(dui)cbe最敏感，為(wei)2/3型gd提供(gong)良(liang)好的小(xiao)鼠模型。

實施例2.不同小鼠品系的腦中的gba1活性和脂質水平與存活率差異無關

為了消除在不同小鼠品系中觀察到的表型差異是由腦中不同的cbe代謝引起的可能性，測量用cbe或pbs(對照)處理10天的小鼠的gba1酶活性。如圖3a所示，在所有測試的品系中cbe以相同程度顯著降低了大腦gba1活性。總體而言，剩下的gba1活性為對照的5-10％(圖3a)。在pbs(r²＝0.126，未顯示數據)和cbe條件(r²＝0.0581，圖3b)中，腦中的gba1活性和壽命之間無相關性。另外，根據品系進行評估時，gba1活性的抑制和壽命之間沒有發現相關性(r²＝0.0085，數據未顯示)。

在下一步中，分析了gba1抑制、glccer積累的后果。如預期，與對照相比，cbe處理的小鼠在腦中呈現更高水平的glccer。與pbs處理的小鼠相比，cbe處理的腦中glccer水平的平均升高為3.7倍(圖3c)。腦中最豐富的glccer種類c18是提高的主要glccer種類(未顯示)。重要的是，在pbs(r²＝0.1441，未顯示數據)或cbe條件下(r²＝0.0569，圖3c)，腦中glccer水平與壽命之間無相關性。每個品系的glccer水平的變化與壽命之間也沒有相關性(r²＝0.0311，數據(ju)未顯(xian)示(shi))。另外，在pbs和(he)cbe條(tiao)件下，在各種glccer亞種(c14，c16，c18:1，c18，c20，c22，c24:1，c24，c26:1和(he)c26)和(he)壽命之間沒有發現相關性(數據(ju)未示(shi)出)。

糖基鞘氨醇(glcso)是已知在gd中升高的另一種脂質，并且已被提出作為gd生物標志物(rolfs等人，plosone.2013nov20；8(11)：e79732)。與對照相比，cbe處理的腦中發現glcso水平平均升高約36倍(圖3d)。探討了glcso水平與小鼠壽命之間的潛在相關性-在pbs(r²＝0.068，未顯示數據)或cbe處理的腦(r²＝0.0013，圖3d)中沒有發現相關性。與其它脂質類似，glcso水平變化與小鼠壽命之間沒有相關性(r²＝0.0775，數據未(wei)顯示)。

另外，在處理的小鼠的腦中分析galcer和galso水平(圖3e-3f)。cbe處理的小鼠顯示這些脂質沒有升高，且脂質水平與小鼠壽命之間沒有相關性(對于galcer和galso分別為r²＝0.0975和6×10^-5)。

綜(zong)合(he)來看，gba1活(huo)性或脂質水平與小鼠壽命之間缺乏相關性表明，在測試品系中觀察到(dao)的(de)表型(xing)差(cha)異(yi)不是由于cbe的(de)差(cha)異(yi)代謝或glccer或glcsph水平的(de)差(cha)異(yi)積累，表明修飾基因(yin)的(de)參與。

實施例3.全基因組關聯研究

為了發(fa)現涉及gd進展的(de)(de)新基因(yin)(yin)(yin)(yin)，對上述15種近交系進行全基因(yin)(yin)(yin)(yin)組關(guan)聯(lian)研究(gwas)。模型(xing)(xing)(xing)生物(wu)體(ti)中的(de)(de)gwas具有(you)很(hen)大的(de)(de)潛力(li)來(lai)識別與人(ren)(ren)疾病相(xiang)(xiang)關(guan)的(de)(de)復(fu)(fu)雜(za)性(xing)狀的(de)(de)風(feng)險因(yin)(yin)(yin)(yin)素(frazeret等人(ren)(ren)，2007；peters等人(ren)(ren)，2007)。模型(xing)(xing)(xing)生物(wu)體(ti)-關(guan)聯(lian)作(zuo)圖(tu)(tu)(tu)可(ke)能比(bi)人(ren)(ren)關(guan)聯(lian)作(zuo)圖(tu)(tu)(tu)更強大，因(yin)(yin)(yin)(yin)為通過在(zai)基因(yin)(yin)(yin)(yin)相(xiang)(xiang)同的(de)(de)生物(wu)體(ti)中復(fu)(fu)制表型(xing)(xing)(xing)測量可(ke)以減(jian)少(shao)環境因(yin)(yin)(yin)(yin)素的(de)(de)影響(peters等人(ren)(ren)，2007)。此外(wai)，在(zai)模型(xing)(xing)(xing)生物(wu)體(ti)中許多(duo)正在(zai)進行的(de)(de)基因(yin)(yin)(yin)(yin)分(fen)型(xing)(xing)(xing)項目中產生的(de)(de)信息(xi)是可(ke)自(zi)由獲(huo)得(de)的(de)(de)，允許在(zai)模型(xing)(xing)(xing)生物(wu)體(ti)內對復(fu)(fu)雜(za)性(xing)狀進行計算機作(zuo)圖(tu)(tu)(tu)。例如，基因(yin)(yin)(yin)(yin)組序列分(fen)析和snp發(fa)現的(de)(de)最新進展導致大量近交系小鼠的(de)(de)密(mi)集snp作(zuo)圖(tu)(tu)(tu)的(de)(de)可(ke)用(yong)性(xing)(kirby等人(ren)(ren)，2010)。這(zhe)些(xie)小鼠snp分(fen)布是對復(fu)(fu)雜(za)性(xing)狀作(zuo)圖(tu)(tu)(tu)的(de)(de)豐(feng)富(fu)資(zi)源(yuan)，已廣(guang)泛用(yong)于gwas作(zuo)圖(tu)(tu)(tu)(liu等人(ren)(ren)2007)。

為了(le)避免(mian)由(you)于品系(xi)之(zhi)間的(de)(de)遺傳相(xiang)關(guan)性引(yin)起的(de)(de)潛在的(de)(de)假(jia)關(guan)聯(lian)，使(shi)用了(le)基于高效混合模(mo)型(xing)(xing)關(guan)聯(lian)(emma)的(de)(de)新型(xing)(xing)生物(wu)(wu)信息學(xue)工具。emma是(shi)模(mo)型(xing)(xing)生物(wu)(wu)體關(guan)聯(lian)作圖的(de)(de)統計檢驗，用于校正人口(kou)結構和(he)遺傳相(xiang)關(guan)性的(de)(de)混雜效應(kang等人，2008)。避免(mian)由(you)于人口(kou)結構引(yin)起的(de)(de)假(jia)關(guan)聯(lian)的(de)(de)另一種方法是(shi)從不同的(de)(de)系(xi)統發生起源選(xuan)擇小(xiao)鼠品系(xi)(clarke等人，2011)。

使用4000000個snp/品系來允許基因組的良好覆蓋。圖4a-b顯示了曼哈頓圖，其表明每個染色體中標記的關聯幾率的對數。gwas分析確定了編碼nmda谷氨酸受體亞基b(nmdar2b或nr2b)的基因grin2b(p值＝6.58e^-08)作為gd進展的潛在修飾基因。具體來說，在grin2b基因的非編碼序列(位于grin2bmrna的內含子區域)中，在染色體6(染色體位置136080931)上鑒定了單核苷酸變異(snpidrs29869040)，其中鳥嘌呤與cbe-敏感性和早期gd的表型相關，而腺嘌呤與相對cbe-不敏感性和gd的更緩和的表型相關(關聯p值＝1.73×10^-10)。

測試的15種小鼠品系的平均存活時(shi)間和grin2bsnp變(bian)異(yi)總結在下表(biao)2中。

表2.

基(ji)于(yu)(yu)上述(shu)預(yu)測(ce)研究，評估grin2b參與神經病性gd的(de)發病機制。內含子中發現重要的(de)關聯snp。由于(yu)(yu)非(fei)編碼snp可以調節定量(liang)性狀(zhuang)基(ji)因(yin)座(qtl)的(de)表(biao)(biao)達(da)，所以通過qpcr確(que)定grin2b的(de)mrna水(shui)平(ping)。使用的(de)樣品(pin)取自大腦皮層，因(yin)為grin2b在(zai)腦中表(biao)(biao)達(da)，且該區域(yu)顯示出病理學。在(zai)pbs或(huo)cbe處理后(hou)10天，測(ce)定2個短期(qi)存活(huo)品(pin)系(xi)(a/j和(he)c57bl6/jolahsd)和(he)2個長期(qi)存活(huo)品(pin)系(xi)(nzw和(he)fvb)的(de)轉錄水(shui)平(ping)。發現不同(tong)的(de)基(ji)因(yin)表(biao)(biao)達(da)模式(shi)-在(zai)cbe處理后(hou)，grin2b表(biao)(biao)達(da)水(shui)平(ping)僅在(zai)短期(qi)存活(huo)品(pin)系(xi)中增加，表(biao)(biao)明在(zai)應(ying)激條件下表(biao)(biao)達(da)水(shui)平(ping)的(de)調節(圖(tu)5a)。

此(ci)外，通過蛋白印跡評估了(le)對照、1型和(he)2型gd患(huan)者(zhe)中(zhong)(zhong)病原性(xing)(xing)腦(nao)區、額葉皮層(ceng)的(de)死后活組(zu)織(zhi)檢查中(zhong)(zhong)nr2b蛋白的(de)水平(ping)。類似(si)于在(zai)小鼠(shu)組(zu)織(zhi)中(zhong)(zhong)獲(huo)得的(de)qpcr結果，檢測(ce)到1型gd患(huan)者(zhe)組(zu)織(zhi)中(zhong)(zhong)的(de)nr2b水平(ping)沒有變(bian)化，而觀察到神經(jing)病性(xing)(xing)患(huan)者(zhe)中(zhong)(zhong)的(de)水平(ping)升高，表明nr2b在(zai)ngd中(zhong)(zhong)起病理作用(圖5b)。

在(zai)過去，本(ben)發明(ming)(ming)的(de)發明(ming)(ming)人(ren)之(zhi)一已經表(biao)明(ming)(ming)，glccer積累誘導功能(neng)性鈣儲存(cun)的(de)變化(hua)(korkotian等(deng)人(ren)，1999，pelled等(deng)人(ren)，2005)。此外，本(ben)發明(ming)(ming)人(ren)證明(ming)(ming)用cbe處理的(de)大鼠(shu)海馬神經元對體(ti)外高濃度(du)谷氨酸(suan)的(de)毒性作用更敏(min)感(pelled等(deng)人(ren)，2000)，表(biao)明(ming)(ming)谷氨酸(suan)受(shou)體(ti)的(de)高度(du)活化(hua)。總而言之(zhi)，這表(biao)明(ming)(ming)目前的(de)gwas分析(xi)可能(neng)已揭示(shi)了(le)可能(neng)參(can)與gd病理級聯修飾的(de)重要候(hou)選(xuan)基(ji)因；和nmda受(shou)體(ti)在(zai)長期存(cun)活品(pin)系(xi)中的(de)激動劑應減少它們的(de)壽命(ming)，并且nmda受(shou)體(ti)的(de)拮抗劑應增加短(duan)期存(cun)活品(pin)系(xi)的(de)壽命(ming)。

實施例4.nmda拮抗劑mk-801相比nmda激動劑d-環絲氨酸對ngd進展的作用

為了研究神經病性戈謝病(gd)中谷氨酸興奮性毒性的生物相關性，采用藥理學方法。首先研究了有效的nmda拮抗劑mk-801在gd發病機制中的作用。mk-801是現存的最具特異性的nmda阻斷劑之一。它以非競爭性的方式在幾個結構域處結合受體的離子通道，從而阻止ca²⁺通過(guo)通道(dao)流入。mk-801已被廣泛(fan)研究用于治療神經(jing)系統疾(ji)病的(de)動物模(mo)型(lipton，2006)。然而(er)，它拮抗(kang)突觸和突觸外nmda受體(parsons和raymond，2014)。

圖6例(li)示使(shi)用mk-801(0.3mg/kg/天(tian))阻斷nmda信號(hao)傳導如何延長cbe-處理的(25mg/kg/天(tian))c3h小鼠的存(cun)活，這表明nmda受體是抗-gd藥劑的良好治(zhi)療靶標。

相反，施用于4種長期存活小鼠品系(balb/cj、fvb/nj、129s1/svimj和btbrt⁺itpr3^tf/j)的有效(xiao)nmda激動劑d-環絲(si)氨酸減少了cbe-處理(li)的小(xiao)鼠(shu)的壽命(ming)(圖7)。

實施例5.用于治療ngd的其它nmda拮抗劑的實施例

盡管mk-801在延長gd小鼠的壽命方面有積極(ji)的作(zuo)(zuo)用(yong)(yong)(yong)，但由于其對受(shou)體的高(gao)親(qin)和(he)(he)力和(he)(he)低(di)解(jie)離動力學(xue)(off-ratekinetics)，不僅阻斷(duan)(duan)(duan)經突觸(chu)外受(shou)體的過量鈣流入的毒性(xing)作(zuo)(zuo)用(yong)(yong)(yong)，還(huan)阻斷(duan)(duan)(duan)谷(gu)氨酸信號傳導的關鍵正常功(gong)能(neng)(lipton，2004)，它(ta)不能(neng)用(yong)(yong)(yong)于治(zhi)療患者。因(yin)此，測試美金(jin)(jin)剛(一種(zhong)反競爭性(xing)的開放通道阻斷(duan)(duan)(duan)劑)，其比mk-801提供了更快的與受(shou)體的解(jie)離結合動力學(xue)，并優先(xian)阻斷(duan)(duan)(duan)突觸(chu)外nmda受(shou)體(lipton，2006，parsons和(he)(he)raymond，2014)。美金(jin)(jin)剛比mk-801較少特異性(xing)。它(ta)用(yong)(yong)(yong)作(zuo)(zuo)5-ht3受(shou)體和(he)(he)α-7nachr的非(fei)競爭性(xing)拮抗劑(rammes等(deng)人(ren)(ren)，2001；aracava等(deng)人(ren)(ren)，2005)，并且用(yong)(yong)(yong)作(zuo)(zuo)多巴胺d2受(shou)體的激動劑(seeman等(deng)人(ren)(ren)，2008)。美金(jin)(jin)剛被美國(guo)fda和(he)(he)ema批準用(yong)(yong)(yong)于治(zhi)療中度至重度阿爾茨海(hai)默病(reisberg等(deng)人(ren)(ren)，2003)和(he)(he)路易(yi)體癡呆(dai)(aarsland等(deng)人(ren)(ren)，2009)。

如(ru)圖1b和(he)上(shang)文(wen)表2所(suo)示(shi)地，使用(yong)cbe發展神經病性gd的幾種小鼠(shu)品系[a/j(aj)、c3h/hej(c3h)、dba/2j(dba)和(he)c57bl6/jolahsd(c57)]用(yong)cbe(25mg/kg天(tian))或cbe加美(mei)金剛(3mg/kg天(tian))處理。如(ru)圖8a所(suo)示(shi)，在所(suo)有測試品系中，用(yong)美(mei)金剛治療顯著延長了(le)小鼠(shu)的壽命。

即使在(zai)更高的(de)(de)(de)50mg/kg/天的(de)(de)(de)cbe處(chu)理(li)劑(ji)量的(de)(de)(de)情(qing)況(kuang)下，更高劑(ji)量的(de)(de)(de)30mg/kg/天的(de)(de)(de)美(mei)金剛治療顯著延長了aj小鼠的(de)(de)(de)存活(圖8b-c)。

用美(mei)金(jin)剛治療使得(de)神經(jing)病(bing)性gd小鼠的壽(shou)命比(bi)mk-801更大程度地增加，可能是因為美(mei)金(jin)剛優先阻斷(duan)突(tu)觸外nmda受體，而mk-801阻斷(duan)突(tu)觸和突(tu)觸外nmda受體兩者(parsons和raymond，2014)。

以類似的(de)(de)方式，如通(tong)過吊線測試(shi)評估，用美金(jin)剛治療延(yan)遲了由(you)cbe誘導的(de)(de)運動功能障礙的(de)(de)進展(圖9a)。在出生后(hou)第49天，美金(jin)剛-治療的(de)(de)小鼠(shu)呈現與cbe-處(chu)理的(de)(de)小鼠(shu)在p21時(shi)相同的(de)(de)得分，表明(ming)美金(jin)剛是治療ngd的(de)(de)最(zui)具侵襲性形式的(de)(de)潛在藥物。

重(zhong)要(yao)的(de)是，用美金(jin)剛治療并不干(gan)擾腦中的(de)gba1抑(yi)制，所述(shu)gba1在出(chu)生后第70天(p70)，小鼠疾病的(de)最后階段幾乎檢測(ce)不到(圖9b)。

由于cbe可以(yi)(yi)抑制除gba1以(yi)(yi)外的(de)其它(ta)酶，所(suo)以(yi)(yi)在ngd的(de)遺(yi)傳小(xiao)鼠(shu)模型中(zhong)(zhong)進(jin)一步評價美金剛的(de)作用，其中(zhong)(zhong)gba1缺失發生在神經(jing)元和(he)星形膠(jiao)質細胞中(zhong)(zhong)。值得注意的(de)是，如圖10a-b所(suo)示(shi)，美金剛治療(liao)顯著延(yan)長了(le)ngd小(xiao)鼠(shu)的(de)存活。

在最后階段，在cbe-處理的小鼠(shu)(shu)模型中測試(shi)了另一種nmda受(shou)體拮抗劑艾(ai)芬地爾(er)。根據其它mk801和美金剛，該藥物在cbe-處理的小鼠(shu)(shu)的壽命中也(ye)顯示增(zeng)加(jia)(圖(tu)11)。

總之，數據表明，nmda受體拮抗劑可以用作ngd的新型治療(liao)靶標。

參考文獻

(整(zheng)個申(shen)請中引用了其它參考文獻)

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