本發明涉及植物(wu)基(ji)因(yin)工程和(he)水稻(dao)分子育種領域，尤其涉及水稻(dao)基(ji)因(yin)cyp71a1和(he)5-羥色胺在調控(kong)水稻(dao)植株抗蟲性中的應用。

背景技術：

水稻(dao)是一種重要的糧食(shi)作物(wu)，尤其(qi)是對亞(ya)洲國(guo)家而(er)言，保證其(qi)穩定生產(chan)是十(shi)分(fen)重要的。褐飛虱是一種刺吸(xi)類昆(kun)蟲(chong)，通過刺吸(xi)式口器(qi)刺入葉鞘吸(xi)收水稻(dao)的營(ying)養物(wu)質，其(qi)侵害可以引起植(zhi)株(zhu)生長緩慢，導(dao)致產(chan)量(liang)下(xia)降，甚(shen)至表現出“燒苗”(hopperburn)癥狀，植(zhi)株(zhu)大(da)面積死亡。此(ci)外，稻(dao)飛虱還(huan)會傳播多種水稻(dao)病毒病。

目前，本領域對(dui)于稻飛虱的(de)防治(zhi)以化學(xue)防治(zhi)為主(zhu)，這導致用藥成本增(zeng)加、害蟲抗藥性上升、有害物質殘(can)留、環(huan)境污染等問(wen)題。

在(zai)褐(he)飛虱(shi)抗(kang)性(xing)(xing)研究(jiu)上，研究(jiu)者(zhe)已經挖掘(jue)了20多個(ge)抗(kang)性(xing)(xing)位點，但是克隆的基因(yin)并不(bu)多，目前只有bph14，bph26,bph3，bph18，bph29被克隆。不(bu)同抗(kang)性(xing)(xing)基因(yin)的抗(kang)性(xing)(xing)譜和抗(kang)蟲機制存在(zai)差(cha)異。如攜(xie)帶bph14的水稻品種表現(xian)出(chu)抗(kang)生性(xing)(xing)，縮短褐(he)飛虱(shi)取食時間(jian)、抑制其生長(chang)發育等(deng)；攜(xie)帶來源于南亞(ya)的一個(ge)品種rht的抗(kang)性(xing)(xing)基因(yin)bph3，由(you)3個(ge)凝(ning)集素受體激酶組(zu)成。

盡管較(jiao)多(duo)的(de)qtl位置被發掘，但從(cong)克隆(long)的(de)基因(yin)數量(liang)來看，還是較(jiao)少的(de)，其背后的(de)抗性機制也(ye)并不清(qing)楚。因(yin)此，抗褐飛虱水稻種質(zhi)資源(yuan)，尤其是廣譜性抗性材料的(de)發掘是十分緊迫的(de)。

水稻基因cyp71a1屬(shu)于單加氧酶p450家族基因，能夠以色胺(an)為(wei)底物(wu)，催(cui)化(hua)其芳環(huan)5'位置進(jin)行(xing)羥化(hua)反應，形(xing)成5羥色胺(an)。因此(ci)，cyp71a1又名t5h(tryptamine5hydroxylation)。

技術實現要素：

本發(fa)明提(ti)(ti)供(gong)了一種水(shui)稻基(ji)因cyp71a1和5-羥色胺在調控水(shui)稻植株抗(kang)蟲性(xing)中的(de)(de)應(ying)用(yong)，該基(ji)因的(de)(de)缺失能夠提(ti)(ti)高(gao)水(shui)稻植株的(de)(de)抗(kang)蟲性(xing)。

水(shui)稻基因cyp71a1在調控水(shui)稻植株抗蟲性中(zhong)的應用，其中(zhong)，所(suo)述水(shui)稻基因cyp71a1(loc_os12g16720)的核苷酸(suan)序列如(ru)seqidno.1所(suo)示。

具體地(di)，為了(le)提高水稻植株的抗蟲(chong)性，可以采用以下方法：

(1)通過(guo)化學(xue)物質抑制(zhi)基(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)cyp71a1表(biao)達或(huo)(huo)者(zhe)通過(guo)rnai抑制(zhi)基(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)cyp71a1的轉(zhuan)錄；(2)對基(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)cyp71a1進行基(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)突變，例如：γ射線或(huo)(huo)者(zhe)ems處理誘(you)發(fa)變異，或(huo)(huo)者(zhe)crispr基(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)編輯技術(shu)等。

本發明提(ti)供(gong)了一種提(ti)高水稻(dao)抗蟲性(xing)的(de)方(fang)法，包括：采用crispr技術(shu)將水稻(dao)基(ji)因組中(zhong)基(ji)因cyp71a1進(jin)行定點(dian)突變，獲得基(ji)因cyp71a1沉默(mo)的(de)水稻(dao)植株。

針對基(ji)因cyp71a1對蟲害(hai)的適用范圍，本發(fa)明提供(gong)了褐(he)飛(fei)虱、白(bai)背(bei)飛(fei)虱和螟蟲的驗證實驗；發(fa)現與基(ji)因cyp71a1突變后的水稻植(zhi)株(zhu)相比，褐(he)飛(fei)虱、白(bai)背(bei)飛(fei)虱和螟蟲更偏向于取食野(ye)生型水稻植(zhi)株(zhu)。

此外，本發明還通過實驗(yan)驗(yan)證了5-羥(qian)色(se)(se)胺在(zai)調控水稻(dao)植株抗蟲性中的應用，發現5-羥(qian)色(se)(se)胺的降低有利(li)于水稻(dao)植株抗蟲性的提高；所以(yi)采(cai)用抑制植株體內5-羥(qian)色(se)(se)胺含(han)量(liang)的化學(xue)物質同樣也可以(yi)降低水稻(dao)植株的抗蟲性。

與現(xian)有技術相比，本發明具有以(yi)下有益效果：

本發(fa)明(ming)通過對田間獲得的(de)突變體(ti)(ti)與野(ye)生型進行害(hai)蟲(chong)抗性(xing)(xing)實(shi)驗，發(fa)現基因cyp71a1突變的(de)水稻植(zhi)(zhi)株相比野(ye)生型具有更高(gao)地(di)抗蟲(chong)性(xing)(xing)，驗證了抑制基因cyp71a1的(de)表達在提(ti)高(gao)水稻植(zhi)(zhi)株抗蟲(chong)性(xing)(xing)中的(de)應用；與此同時(shi)，通過調節植(zhi)(zhi)株體(ti)(ti)內5-羥色胺含量(liang)的(de)變化，發(fa)現5-羥色胺含量(liang)的(de)降低可提(ti)高(gao)植(zhi)(zhi)株抗蟲(chong)性(xing)(xing)，從(cong)而驗證了抑制5-羥色胺在提(ti)高(gao)水稻植(zhi)(zhi)株抗蟲(chong)性(xing)(xing)中的(de)應用。

附圖說明

圖1為實施例(li)1中野生型(xing)水(shui)稻植(zhi)株嘉浙(zhe)b和突變體植(zhi)株嘉浙(zhe)lm對(dui)褐飛(fei)虱抗性的比較；

其中，a為將(jiang)(jiang)野生(sheng)(sheng)型(xing)水稻(dao)和(he)(he)突變(bian)體共(gong)同培養(yang)并供(gong)褐(he)飛(fei)虱(shi)自(zi)由取(qu)食后的(de)結果(guo)圖；b為褐(he)飛(fei)虱(shi)取(qu)食選擇性實驗，將(jiang)(jiang)15頭成蟲放進(jin)密閉玻(bo)璃杯罩內，不同的(de)時間(jian)點(dian)觀察野生(sheng)(sheng)型(xing)和(he)(he)突變(bian)體植株(zhu)上的(de)數目；c為b實驗中的(de)褐(he)飛(fei)虱(shi)在48小時之后，便會在水稻(dao)莖稈(gan)產卵(luan)，野生(sheng)(sheng)型(xing)和(he)(he)突變(bian)體植株(zhu)上的(de)產卵(luan)數統(tong)計(ji)結果(guo)。

圖2為(wei)實施例1中褐飛(fei)虱(shi)二齡幼蟲(chong)接于(yu)野(ye)生型(xing)水稻植株嘉浙(zhe)b和突變體植株嘉浙(zhe)lm上15天后幼蟲(chong)存(cun)活率。

圖3為(wei)實(shi)施例1中野生(sheng)型(xing)水(shui)稻植株(zhu)嘉(jia)浙(zhe)b和突(tu)變體植株(zhu)嘉(jia)浙(zhe)lm對白背飛虱抗(kang)性的比(bi)較；

其中(zhong)，a為(wei)白背(bei)飛(fei)虱(shi)的選擇性(xing)取食實驗(yan)；b為(wei)a中(zhong)白背(bei)飛(fei)虱(shi)取食48小時之后在(zai)野生型和突(tu)變體上的產卵數統計結果。

圖4為(wei)實施例1中野生型水稻植(zhi)株嘉(jia)浙b和(he)突變體植(zhi)株嘉(jia)浙lm對螟蟲抗性的比較；

其(qi)中(zhong)，a為一(yi)(yi)直以野生型或者突變(bian)體水稻植(zhi)株取食(shi)的(de)二(er)化(hua)(hua)螟(ming)(ming)在(zai)21天(tian)和28天(tian)后(hou)的(de)發育大小；b為同(tong)一(yi)(yi)時(shi)間點上，各個(ge)齡(ling)期的(de)螟(ming)(ming)蟲(chong)(chong)數(shu)目統計(ji)分析結果；c為取食(shi)野生型植(zhi)株的(de)螟(ming)(ming)蟲(chong)(chong)在(zai)不(bu)同(tong)天(tian)數(shu)下(xia)幼蟲(chong)(chong)化(hua)(hua)成(cheng)(cheng)蛹(yong)的(de)數(shu)量(liang)變(bian)化(hua)(hua)圖(tu)，其(qi)中(zhong)，大約歷時(shi)36.94天(tian)，幼蟲(chong)(chong)化(hua)(hua)成(cheng)(cheng)蛹(yong)的(de)數(shu)量(liang)達(da)到峰值；d為取食(shi)突變(bian)體植(zhi)株的(de)螟(ming)(ming)蟲(chong)(chong)在(zai)不(bu)同(tong)天(tian)數(shu)下(xia)幼蟲(chong)(chong)化(hua)(hua)成(cheng)(cheng)蛹(yong)的(de)數(shu)量(liang)變(bian)化(hua)(hua)圖(tu)，其(qi)中(zhong)，大約歷時(shi)47.46天(tian)，幼蟲(chong)(chong)化(hua)(hua)成(cheng)(cheng)蛹(yong)的(de)數(shu)量(liang)達(da)到峰。

圖5為實施例1中大田種植環(huan)境下野(ye)生型水稻植株(zhu)嘉浙b和(he)突(tu)變(bian)體植株(zhu)嘉浙lm對(dui)二化(hua)螟幼蟲抗性的(de)比較；

其中(zhong)，a為(wei)田間生(sheng)測實(shi)驗，每株水稻接種(zhong)一頭二化螟幼蟲；b為(wei)每隔十天統計死亡的水稻植株，包括枯(ku)心(xin)和白(bai)穗。

圖(tu)6為(wei)實施(shi)例(li)2中(zhong)不同水稻植(zhi)株(zhu)體(ti)內(nei)5-羥色(se)胺(an)的本底水平以及褐飛虱侵(qin)害(hai)植(zhi)株(zhu)8小(xiao)時后植(zhi)株(zhu)體(ti)內(nei)5-羥色(se)胺(an)的含量。

圖(tu)7為實施(shi)例2中不(bu)同(tong)水稻植(zhi)株種植(zhi)于不(bu)同(tong)濃度(du)梯(ti)度(du)的5-羥(qian)色胺(an)營(ying)養液(ye)中，褐飛虱選擇性取食實驗；

其中(zhong)，a為(wei)突變體植株內添加5-羥色胺回(hui)補后，取食(shi)的褐(he)(he)飛(fei)虱數(shu)量(liang)變化情(qing)(qing)況；b為(wei)往不同抗性材料中(zhong)添加5-羥色胺后，取食(shi)的褐(he)(he)飛(fei)虱數(shu)量(liang)變化情(qing)(qing)況。

圖8為實施例2中野生(sheng)型水稻植株(zhu)嘉浙(zhe)b和突變體植株(zhu)嘉浙(zhe)lm各組織部位的5-羥(qian)色(se)胺含(han)量以及回補(bu)5-羥(qian)色(se)胺后突變體植株(zhu)體內5-羥(qian)色(se)胺含(han)量變化曲(qu)線(xian)；

其中(zhong)，a為(wei)(wei)野生(sheng)(sheng)型(xing)和突(tu)變(bian)體(ti)植(zhi)株根部組(zu)織(zhi)(zhi)中(zhong)5-羥(qian)(qian)色胺的(de)含量變(bian)化情(qing)況；b為(wei)(wei)野生(sheng)(sheng)型(xing)和突(tu)變(bian)體(ti)植(zhi)株葉鞘組(zu)織(zhi)(zhi)中(zhong)5-羥(qian)(qian)色胺的(de)含量變(bian)化情(qing)況；c為(wei)(wei)野生(sheng)(sheng)型(xing)和突(tu)變(bian)體(ti)植(zhi)株葉片組(zu)織(zhi)(zhi)中(zhong)5-羥(qian)(qian)色胺的(de)含量變(bian)化情(qing)況；d為(wei)(wei)通過往樣品中(zhong)添(tian)(tian)加5-羥(qian)(qian)色胺，確認5-羥(qian)(qian)色胺的(de)特異峰；e為(wei)(wei)野生(sheng)(sheng)型(xing)材料(liao)中(zhong)，各個組(zu)織(zhi)(zhi)部位(wei)5-羥(qian)(qian)色胺含量的(de)比較；f為(wei)(wei)往突(tu)變(bian)體(ti)培養液中(zhong)添(tian)(tian)加5-羥(qian)(qian)色胺后植(zhi)株內5-羥(qian)(qian)色胺的(de)含量。

圖(tu)9為實施例2中褐飛虱侵害突變體植(zhi)株嘉浙lm后(hou)，褐飛虱體內(nei)5-羥(qian)色胺含量的變化曲線。

圖(tu)10為實施例(li)3中基因沉默植株(zhu)cyp71a1-ko與(yu)野生型植株(zhu)錫稻一號對褐飛虱抗性的比較。

圖11為實(shi)施例3中在(zai)不同種植區域種植下(xia)突變(bian)體與野生型植株的(de)田間實(shi)驗比較(jiao)。

具體實施方式

在田(tian)間水稻種(zhong)植(zhi)時(shi)，發現一個突(tu)變體(ti)(ti)(ti)(ti)，該(gai)突(tu)變體(ti)(ti)(ti)(ti)分蘗(bo)期階段的(de)(de)葉片上會形成類(lei)似病(bing)斑(褐色斑點)的(de)(de)表(biao)型(xing)，然而在室內水培種(zhong)植(zhi)時(shi)，該(gai)突(tu)變體(ti)(ti)(ti)(ti)的(de)(de)表(biao)型(xing)又與正常水稻植(zhi)株無(wu)差異(yi)。雖然造成上述(shu)現象的(de)(de)原因(yin)還不清楚，但我們通(tong)(tong)過(guo)圖位克隆發現，該(gai)突(tu)變體(ti)(ti)(ti)(ti)的(de)(de)基(ji)因(yin)cyp71a1中有一個g的(de)(de)缺失(shi)(shi)，并導致突(tu)變體(ti)(ti)(ti)(ti)喪失(shi)(shi)五羥色胺合成能力。通(tong)(tong)過(guo)實驗發現，該(gai)基(ji)因(yin)的(de)(de)缺失(shi)(shi)會影(ying)響水稻的(de)(de)抗蟲性，具體(ti)(ti)(ti)(ti)實驗內容如下(xia)。

其中，下列實驗提及的(de)害蟲(chong)有褐飛(fei)(fei)虱、白背飛(fei)(fei)虱和(he)螟蟲(chong)。褐飛(fei)(fei)虱是懷有卵的(de)雌性(xing)飛(fei)(fei)虱，其具有非常強的(de)攻擊(ji)性(xing)，由(you)浙江大學(xue)(xue)婁(lou)永根教授(shou)(shou)提供(gong)(gong)；白背飛(fei)(fei)虱由(you)由(you)浙江大學(xue)(xue)婁(lou)永根教授(shou)(shou)提供(gong)(gong)；螟蟲(chong)是由(you)浙江大學(xue)(xue)昆蟲(chong)所的(de)葉(xie)恭(gong)銀教授(shou)(shou)提供(gong)(gong)。水(shui)稻(dao)品種“嘉(jia)(jia)浙b”是一個用于三系雜交水(shui)稻(dao)的(de)保持系材料，來自(zi)嘉(jia)(jia)興(xing)農科院；水(shui)稻(dao)品種“錫稻(dao)一號(hao)”由(you)浙江大學(xue)(xue)舒(shu)慶堯教授(shou)(shou)提供(gong)(gong)。

實施例1選擇性實驗

本實施例以水稻突變體嘉浙lm(jiazhelesionmimic)和野生型嘉浙b為材料進行實驗；其中，突變體嘉浙lm是通過采用350gy⁶⁰co輻照(zhao)誘變野生(sheng)型水稻嘉浙(zhe)b獲得；經檢測(ce)，該(gai)突變體(ti)的(de)基(ji)(ji)因(yin)(yin)組中基(ji)(ji)因(yin)(yin)cyp71a1有一個(ge)g的(de)缺失。

1、褐飛虱抗性實驗

a)取食(shi)選(xuan)擇性和(he)產卵(luan)量：將(jiang)野生型(xing)水稻和(he)突變體水培于同一(yi)培養(yang)容器(qi)(qi)中，供褐(he)飛虱(shi)自(zi)由取食(shi)(結(jie)果(guo)如(ru)圖1a所(suo)示)。將(jiang)野生型(xing)水稻和(he)突變體水培于同一(yi)培養(yang)容器(qi)(qi)中，并在(zai)(zai)水稻的(de)莖稈部位(wei)用(yong)透氣玻璃罩(直徑4厘米(mi)，高(gao)度8厘米(mi))圍住(zhu)(兩種植株在(zai)(zai)同一(yi)玻璃罩內)，往(wang)透氣玻璃罩內投(tou)入15頭懷卵(luan)褐(he)飛虱(shi)雌蟲(chong)。在(zai)(zai)投(tou)入后的(de)1，2，4，8，12，24和(he)48小時(shi)，對上(shang)述兩株植株上(shang)的(de)褐(he)飛虱(shi)數(shu)量進行(xing)計(ji)(ji)數(shu)，共進行(xing)十組重(zhong)復(結(jie)果(guo)如(ru)圖1b所(suo)示)。計(ji)(ji)數(shu)結(jie)束后，收集所(suo)有(you)植株，在(zai)(zai)顯(xian)微鏡下對卵(luan)的(de)數(shu)目進行(xing)計(ji)(ji)數(shu)，同時(shi)統計(ji)(ji)卵(luan)的(de)孵(fu)化率(結(jie)果(guo)如(ru)圖1c所(suo)示)。

b)采食量：將野(ye)生型(xing)與突變體在(zai)相同培養環境下進(jin)行(xing)分開水培，并均在(zai)水稻基部用封口膜緊密(mi)包裹，封口處各(ge)投放(fang)一頭褐飛(fei)(fei)虱(shi)，24小(xiao)時(shi)之后，對投放(fang)飛(fei)(fei)虱(shi)前后封口處水稻莖稈進(jin)行(xing)稱(cheng)重，獲(huo)得質量差(cha)(即蜜(mi)露的量)，共進(jin)行(xing)20組重復(fu)。

c)幼蟲存(cun)活率：分別將15頭褐飛虱的二齡幼蟲接(jie)于野生型植(zhi)株和突變體植(zhi)株上，每天觀察存(cun)活的數目(mu)，直至(zhi)處理(li)后15天。結果如圖2所示(shi)。

由(you)圖1a可知，通過褐飛(fei)虱的(de)自由(you)取食選擇(ze)15天之后，野生型材料嘉浙b幾乎全部死亡，植(zhi)株萎縮，然而其(qi)突變(bian)體(ti)嘉浙lm還(huan)保持(chi)綠色，能夠繼續(xu)生長。

為進(jin)一步進(jin)行褐飛(fei)虱(shi)選擇性分析，將突(tu)變體和野生型放置在同(tong)一玻璃罩(zhao)子內，每隔一定時間統計植(zhi)株上(shang)(shang)的褐飛(fei)虱(shi)數量。實驗(yan)發現，褐飛(fei)虱(shi)明顯偏向于(yu)在野生型植(zhi)株上(shang)(shang)取食，例如(ru)在侵害12小時之后，野生型植(zhi)株上(shang)(shang)的褐飛(fei)虱(shi)數量是突(tu)變體植(zhi)株上(shang)(shang)的1.55倍(圖1b)。

選擇性的(de)(de)差異(yi)，勢必導(dao)致(zhi)產卵數量的(de)(de)差異(yi)。48小時之(zhi)后，我(wo)們(men)對上(shang)述實驗的(de)(de)每株水稻(dao)上(shang)的(de)(de)卵數進行統計，結(jie)果(guo)顯(xian)(xian)示，野生型嘉(jia)浙b上(shang)卵的(de)(de)數量明顯(xian)(xian)多于(yu)突(tu)變(bian)體嘉(jia)浙lm(圖(tu)1c)。

此(ci)外(wai)，對褐飛(fei)虱(shi)在水稻上的(de)取(qu)(qu)食量(liang)，也就是(shi)蜜露(lu)的(de)含量(liang)進行了調(diao)查。蜜露(lu)就是(shi)昆蟲(chong)的(de)排(pai)泄物，其排(pai)泄的(de)量(liang)越(yue)大在一定(ding)程度上也就意味著取(qu)(qu)食的(de)量(liang)也越(yue)大。

與野生型(xing)相比，突(tu)(tu)變(bian)體上的(de)蜜露含量也有30％的(de)減少。以上數據(ju)表明，褐飛虱并(bing)不喜歡(huan)在突(tu)(tu)變(bian)體上取食。并(bing)且從圖2可(ke)見，突(tu)(tu)變(bian)體嚴重影響了若蟲的(de)存(cun)活率。

2、白背(bei)飛(fei)虱(shi)抗性實驗(yan)

同樣從取(qu)食選(xuan)擇性和(he)產卵量方面進行實驗(yan)，實驗(yan)方法(fa)與(yu)褐飛虱相同，結果如(ru)圖3所示。

由(you)圖(tu)3可(ke)見，白背飛(fei)虱(shi)更傾(qing)向于(yu)在(zai)野生型上(shang)取食、產卵(如圖(tu)3)。

3、螟蟲抗性實驗

a)將野生型(xing)與(yu)突變體的莖(jing)稈(gan)飼喂10頭螟蟲(chong)若蟲(chong)，每隔7天換(huan)一次新(xin)鮮莖(jing)稈(gan)，直至螟蟲(chong)發育成熟蛹化(hua)。考察螟蟲(chong)的整個(ge)生長周期，從幼蟲(chong)，蛹化(hua)，羽化(hua)到產卵量，統計最終(zhong)蛹的數目和化(hua)蛹時(shi)間，結果如(ru)圖4所示。

取(qu)食于(yu)突變體(ti)上的(de)(de)(de)二化(hua)螟(ming)出現了發育延(yan)緩的(de)(de)(de)癥狀，體(ti)態較小(圖(tu)4a)。當野生(sheng)型上的(de)(de)(de)幼(you)蟲已經進入(ru)三齡的(de)(de)(de)時候，突變體(ti)上的(de)(de)(de)二化(hua)螟(ming)大多(duo)數(shu)還處于(yu)二齡期(qi)(圖(tu)4b)。縱觀整(zheng)個發育階段，最終大多(duo)數(shu)野生(sheng)型植(zhi)株上的(de)(de)(de)成(cheng)蟲都會化(hua)成(cheng)蛹(yong)，大約需要36.94天(tian)，而突突變體(ti)上的(de)(de)(de)二化(hua)螟(ming)需要47.46天(tian)，成(cheng)蛹(yong)數(shu)也較少(shao)(圖(tu)4c，d)。

b)對田(tian)間種植(zhi)的(de)每(mei)株野生型和(he)(he)突變體接一頭二化螟幼蟲，每(mei)十天觀察一次枯(ku)心和(he)(he)白穗的(de)數目，結果如圖5所示。

由圖(tu)5可見，接(jie)二化螟幼(you)蟲的第二十(shi)天突(tu)變體群體中的白穗和枯心數(shu)明顯少于野(ye)生型。

實施例25-羥(qian)色胺對水稻抗(kang)蟲(chong)性的影(ying)響

為了探究(jiu)突變體對(dui)褐飛虱(shi)的(de)抗性(xing)(xing)是否與5-羥色胺的(de)缺失有(you)關，進一步測(ce)定(ding)已(yi)知攜(xie)帶有(you)抗性(xing)(xing)基(ji)因的(de)水(shui)稻材(cai)料以及褐飛虱(shi)敏感(gan)材(cai)料的(de)5-羥色胺含量。

本實(shi)施例(li)中植株體內5-羥色胺含量(liang)的(de)測定方法，具體如下：

(1)樣品預(yu)處理(li)：五克葉片，莖(jing)稈或者根部組(zu)織在液(ye)氮中充分研磨至粉末(mo)，加(jia)(jia)入(ru)9ml甲醇(chun)，10℃下(xia)，180rpm搖床(chuang)混(hun)勻(yun)，充分浸提30min，13,500×g，10℃離心15min，可以抽出(chu)8ml的(de)上(shang)清液(ye)，按照1:4的(de)比例(li)，加(jia)(jia)入(ru)2ml蒸(zheng)(zheng)餾(liu)水(shui)(shui)，混(hun)勻(yun)。c18固相萃取小(xiao)柱用三倍柱床(chuang)體積的(de)甲醇(chun)活化(hua)，之后(hou)用蒸(zheng)(zheng)餾(liu)水(shui)(shui)沖洗(xi)。將已加(jia)(jia)水(shui)(shui)的(de)樣品過小(xiao)柱，流出(chu)液(ye)回(hui)收；再用10ml80％的(de)甲醇(chun)沖洗(xi)，沖洗(xi)出(chu)來(lai)的(de)溶(rong)液(ye)也回(hui)收，與之前的(de)流出(chu)液(ye)合并(bing)；最后(hou)，旋轉(zhuan)蒸(zheng)(zheng)發，加(jia)(jia)入(ru)500μl50％的(de)甲醇(chun)溶(rong)解待測。

(2)高效液相(xiang)(xiang)色譜(hplc)測(ce)定(ding)：分(fen)離(li)柱(zhu)為(wei)(wei)c18小柱(zhu)，流動相(xiang)(xiang)為(wei)(wei)10％甲醇(chun)、0.3％三(san)氟乙酸，流速控制在0.8ml/min，流動相(xiang)(xiang)分(fen)離(li)30分(fen)鐘(zhong)之后，用(yong)100％甲醇(chun)沖(chong)洗(xi)5min，再用(yong)流動相(xiang)(xiang)跑平基線10min，以保證(zheng)柱(zhu)子中的其(qi)余雜質沖(chong)洗(xi)干凈。檢測(ce)器波長設置(zhi)為(wei)(wei)280nm。

本實(shi)施例采用(yong)以(yi)下四種(zhong)褐飛(fei)(fei)虱(shi)抗性材料(liao)：mudgo(攜帶(dai)抗性基因bph1)從浙(zhe)(zhe)江大(da)學昆蟲所婁(lou)永根教授(shou)實(shi)驗(yan)室獲得；rht和(he)ir56(兩(liang)(liang)者均攜帶(dai)抗性基因bph3)從中國水稻所傅強教授(shou)實(shi)驗(yan)室獲得；b5(攜帶(dai)抗性基因bph14，bph15)從華中農(nong)業大(da)學牟同敏實(shi)驗(yan)室獲得。褐飛(fei)(fei)虱(shi)敏感材料(liao)采用(yong)以(yi)下兩(liang)(liang)種(zhong)：tn1(一個褐飛(fei)(fei)虱(shi)敏感材料(liao)，取自(zi)浙(zhe)(zhe)大(da)農(nong)學院昆蟲所婁(lou)永根課題組)和(he)嘉浙(zhe)(zhe)b。

測定(ding)上述六(liu)種水稻植(zhi)株(zhu)體內5-羥(qian)色胺的本底水平，并用褐飛虱(shi)侵害植(zhi)株(zhu)，8小時(shi)后測定(ding)植(zhi)株(zhu)體內5-羥(qian)色胺的含(han)量。

由圖6可知(zhi)，兩種褐(he)飛(fei)虱敏感材(cai)(cai)料(liao)(liao)(tn1和嘉浙(zhe)b)有(you)著(zhu)較高的本(ben)底表達量(liang)，同時能被褐(he)飛(fei)虱侵害(hai)誘導；而其(qi)余四個抗性(xing)(xing)材(cai)(cai)料(liao)(liao)(mudgo，ir56，rht，b5分別攜帶抗性(xing)(xing)基因bph1，bph3，bph3，bph14/15)的本(ben)底水平都(dou)(dou)很(hen)低，幾乎不被褐(he)飛(fei)虱侵害(hai)誘導(圖6)。可見，抗性(xing)(xing)材(cai)(cai)料(liao)(liao)都(dou)(dou)反(fan)映出更(geng)趨(qu)向于低水平的5-羥色胺。

用5-羥色胺(an)回補實驗(yan)進一步驗(yan)證(zheng)上述結果。將植株種植于(yu)不同濃(nong)度梯度(0,50,100,200,500μm)的5-羥色胺(an)營(ying)養液(ye)中，5-羥色胺(an)通過根部(bu)吸收進入植株的葉鞘組織(zhi)中。

由圖7可知(zhi)，當(dang)突(tu)變體植株營(ying)養液中5-羥(qian)色(se)胺(an)的(de)濃(nong)(nong)度上(shang)升到300μm濃(nong)(nong)度時(shi)，褐飛虱(shi)的(de)取食更加(jia)偏(pian)向于突(tu)變體，可見此(ci)(ci)濃(nong)(nong)度下能使原本5-羥(qian)色(se)胺(an)缺失的(de)突(tu)變體得到恢(hui)復(fu)，從抗性(xing)變得敏感。同(tong)樣，300μm濃(nong)(nong)度下也可以使得抗性(xing)水(shui)稻(dao)材料變得敏感。因此(ci)(ci)，低水(shui)平5-羥(qian)色(se)胺(an)更有助(zhu)于提高褐飛虱(shi)的(de)抗性(xing)，甚至是在基因組背景不同(tong)的(de)水(shui)稻(dao)中，上(shang)述結論也適(shi)用。

此(ci)外，測定野生(sheng)型(xing)和(he)突變體植株各組織部位的5-羥色胺(an)含(han)量，并通過回補實(shi)驗(yan)外源添加(jia)5-羥色胺(an)。

從圖8可知(zhi)，突(tu)(tu)變體植(zhi)株中(zhong)根部的含(han)量最高，葉鞘(qiao)最低；外(wai)源添加5-羥色(se)胺12小時(shi)后突(tu)(tu)變體中(zhong)的5羥色(se)胺含(han)量能夠恢(hui)復到野生型的本底(di)水(shui)平。

用褐飛(fei)虱(shi)侵害植(zhi)株(zhu)，測定褐飛(fei)虱(shi)體內5-羥色(se)(se)胺的(de)含(han)量(liang)，結果如圖9所示。褐飛(fei)虱(shi)取食(shi)12個小時后，取食(shi)于野生型植(zhi)株(zhu)上的(de)蟲體內5-羥色(se)(se)胺含(han)量(liang)有28.54ng/g，而突(tu)變體上的(de)褐飛(fei)虱(shi)體內5-羥色(se)(se)胺只有5.3ng/g。

實施例3

為進(jin)一(yi)步驗證實施例1所得(de)結論，我們進(jin)一(yi)步通(tong)過(guo)crispr技術(shu)，將水稻(dao)品種“錫稻(dao)一(yi)號”中(zhong)的基因cyp71a1進(jin)行定點(dian)突變，獲得(de)基因cyp71a1沉默植株，即(ji)水稻(dao)植株cyp71a1-ko。

具體步驟如下：

根(gen)據(ju)基因序列，設計(ji)靶(ba)點序列為(wei)5'-tggtcgcgttgaggaggagc-3'，與(yu)crispr載體phun4c12連接，轉入農(nong)桿(gan)菌(jun)。經農(nong)桿(gan)菌(jun)介導轉化之后，獲得t0代植株，通過測序發現突(tu)變體。導致距離起始密碼子83處插入一(yi)個“a”，從而形成(cheng)移碼，造成(cheng)突(tu)變。經繁(fan)種，獲得f1代，用于實驗。

將野生型“錫稻一號”和(he)基因沉默植株(zhu)cyp71a1-ko進行(xing)采(cai)食選擇性實驗(yan)(步驟同實施例1)。由(you)圖10可知，基因沉默之后的植株(zhu)也表現(xian)出抗(kang)性，褐飛(fei)虱并不(bu)喜歡在上(shang)面取食。因此，證實了(le)基因cyp71a1的突變(bian)有助于(yu)獲得對褐飛(fei)虱的抗(kang)性。

實施例4

田間實驗(yan)證明突(tu)(tu)變體(ti)在農業生產中(zhong)也能發揮較好的作用。將野生型和突(tu)(tu)變體(ti)種植于(yu)嘉興和三亞(ya)兩個地方，并統計植株(zhu)上的飛(fei)(fei)虱(shi)量(liang)，同樣(yang)發現突(tu)(tu)變體(ti)群體(ti)中(zhong)的飛(fei)(fei)虱(shi)數量(liang)減少(圖11)。

此外，我們進一步在田間接(jie)二化(hua)螟(ming)(ming)來檢測突(tu)變體植株是否對螟(ming)(ming)蟲有著較好的抗(kang)性(xing)。通過統計枯心和白穗(sui)的數目，同(tong)樣證實能夠(gou)提高對螟(ming)(ming)蟲的抗(kang)性(xing)。(圖5b)。

sequencelisting

<110>浙江大學

<120>水稻(dao)基因(yin)cyp71a1和(he)5-羥色胺在調控(kong)水稻(dao)植株抗(kang)蟲性中的應(ying)用(yong)

<130>

<160>2

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>2026

<212>dna

<213>水稻(dao)

<400>1

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<213>人工序列

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