本發明涉及CXCR2拮抗劑用于預防和/或治療化療誘導的周圍神經病變(CIPN)的用途。
背景技術：
：CIPN被定義為接受化療治療方案的患者所經歷的周圍神經系統損傷。CIPN是許多化療劑普遍主要的劑量限制性副作用，所述化療劑包括鉑化合物類(例如，奧沙利鉑)、紫杉烷類、長春花生物堿類、沙利度胺和更新的藥物，例如硼替佐米[Balayssac，ExpertOpin.DrugSaf.，10，407-417，2011)]。這代表了在許多不同的癌癥中顯著的治療局限性，因為終末器官神經毒性和神經病可能對患者的生活質量具有極大影響且需要停止有效治療。奧沙利鉑已知能引起嚴重的急性和慢性周圍神經病變[CassidyandMisset，Semin.Oncol.，29，11-20(2002)；Extra，Semin.Oncol.，25，13-22(1998)；Pasetto，Crit.Rev.Oncol.Hematol.，59，159-168(2006)；和QuasthoffandHartung，J.Neurol.，249，9-17(2002)]。奧沙利鉑在重復治療后在晚期引起大鼠坐骨神經中有髓纖維的退化[Kawashiri，Eur.J.Pain，15，344(2011)]，且在小鼠模型中用奧沙利鉑慢性治療誘導背根神經節(DRG)神經元收縮和有髓纖維的軸突損傷[Renn，Mol.Pain，7，29(2011)；Cavaletti，Eur.J.Cancer，37，2457(2001)]。嚙齒類中感覺終點的早期改變已在奧沙利鉑模型中發現，導致對熱(Neuropharmacology，79(2014)432-443；Pain，101(2003)65–77)和機械刺激(Neuropharmacology，79(2014)432-443；BrainResearch，784(1998)154–162)的敏感性增加，其分別使用冷的丙酮刺激和vonFrey細絲。例如，包含奧沙利鉑的治療方案(例如每2周85mg/m2)在95％的患者中產生即時性‘冷’敏感的暫時性感覺異常和肢體肌肉痙攣，其發展成無運動神經元參與的對稱性軸突感覺遠端原發性神經病[Argyriou，CancerTreatmentReviews，43，368-377(2008)]。在背根神經節(DRG)及其感覺神經元中的奧沙利鉑攝取和鉑積累是奧沙利鉑神經毒性的主要決定因素(Jong，J.Pharmacol.Exp.Ther.，338(2):537-47(2011)。此外，炎性級聯激活在CIPN的引發和進展中起作用，其中免疫細胞滲入受損的神經元環境中[Wang，Cytokine，59，3-9(2012)]。促炎性趨化因子受體CXCR2表達于感覺神經元且其配體已參與調節鈉和鉀電流的增加，其控制神經元興奮性[Wang，Mol.Pain，24，38(2008)；Yang，Mol.Pain，5，26(2009)]。在外周神經元損傷中，嚙齒類中CXCR2+促炎性分泌型免疫細胞的聚集也已知涉及一些急性和持續性疼痛狀態，其被CXCR2拮抗作用阻斷[Manjavachi，Eur.J.Pain，14，23-31(2010)；Kiguchi，J.Pharmacol.Exp.Ther.，340，577-587(2012)；Stadtmann&Zarbock，Front.Immunol.，3，263(2012)]。CXCR2配體已經顯示出調節參與傷害感受過程的TRPv1通道的功能[Dong，Neurosci.Bull.，28，155-164(2012)]并刺激鈣內流和感覺神經元中疼痛介導肽降鈣素基因相關肽(CGRP)的釋放(Qin，J.Neurosci.Res.，82，51-62(2005))。人外周神經外植體和施萬細胞培養物表達[Ozaki，NeuroReport，19，31-35(2008)]并分泌CXCR2促炎性細胞因子，例如IL-8[Rutkowski，J.Neuroimmunol.，101，47-60(1999)]，其在糖尿病和酒精性神經病以及在長度依賴性小纖維神經病中顯著升高[AboElAsar，Cytokine，59，86-93(2012)]；(Michalowska-Wender，FoliaNeuropathol.，45，78-81(2007)；Neurology，74，1806(2010)]。所述神經元CXCR2受體系統也已顯示調節髓鞘再生(re-myelination)[Veenstra&Ransohoff，J.Neuroimmunol.，246，1-9(2012)]和突觸可塑性(Xiong，J.Neurosci.Res.，71，600-607(2003)過程，其控制神經元的通信。所述CXCR2受體及其配體在結腸直腸癌中也被上調并已參與藥物抗性[Acharyya，Cell，150，165-178(2012)]、腫瘤生長、血管形成、癌細胞增殖和嗜中性粒細胞聚集到腫瘤微環境[Verbeke，Cytokine&GrowthFactorReview，22，345-358(2012)]。目前尚無用于預防和/或治療CIPN的獲批治療選擇。技術實現要素：根據第一方面，本發明提供了用于預防和/或治療CIPN的CXCR2拮抗劑。根據第二方面，本發明提供了在需要的人中預防和/或治療CIPN的方法，其包括給藥CXCR2拮抗劑。根據第三方面，本發明提供了CXCR2拮抗劑在制備用于預防和/或治療CIPN的藥物中的用途。附圖簡述圖1是顯示在大鼠中慢性壓迫性損傷(chronicconstrictioninjury,CCI)后對縮足閾值(PWT)的影響的圖。圖2是顯示小鼠中慢性壓迫性損傷后對PWT的影響的圖。圖3是顯示在大鼠中慢性壓迫性損傷后坐骨神經中對mRNA水平的影響的一系列圖。圖4是顯示在小鼠中慢性壓迫性損傷后坐骨神經中對mRNA水平的影響的一系列圖。圖5是顯示在大鼠中單次注射奧沙利鉑后對PWT的影響的圖。圖6是顯示在小鼠中單次注射奧沙利鉑后對PWT的影響的圖。圖7是顯示在大鼠中單次注射奧沙利鉑后左側坐骨神經中對mRNA水平的影響的一系列圖。圖8是顯示在小鼠中單次注射奧沙利鉑后左側坐骨神經中對mRNA水平的影響的一系列圖。圖9是顯示化療誘導的神經病變的大鼠模型中式(A)化合物的預防性治療后對PWT的影響的圖。圖10是顯示用式(A)化合物或其載體治療后大鼠坐骨神經中對奧沙利鉑減少的神經傳導速度的影響的圖。圖11是顯示用式(A)化合物或其載體治療后對大鼠體重的影響的圖。圖12是一組三個顯微照片，顯示在奧沙利鉑治療的大鼠中用式(A)化合物治療后對坐骨神經的髓鞘的厚度的影響。圖13是顯示在奧沙利鉑治療的大鼠中用式(A)化合物治療后對坐骨神經的髓鞘的厚度的影響的柱狀圖。發明詳述迄今為止還沒有公開CXCR2調節能對周圍神經病變(特別是CIPN)提供有效的預防和/或治療方案。本文所述的機理臨床研究方案的證明，預期能提供有關人的證據，即CXCR2的有效和選擇性的拮抗劑可為CIPN的有效治療方案。該機理臨床研究的證明是在患有結腸直腸癌的患者中進行，該患者即將經歷包含奧沙利鉑的化療治療方案的周期。這種使用CXCR2拮抗劑的治療將在化療周期中和化療周期前后間歇地給予。該方案保證最高的CXCR2抑制同時具有最高的全身奧沙利鉑暴露量。該研究將在每個化療周期之前、之中和之后測量多種相關的終點。主要終點是使用神經生理學跟蹤技術測量周圍神經興奮性。由含有奧沙利鉑的治療方案引起的感覺神經興奮性(SE)的急性增加可比建立的神經生理學神經傳導速度標記物更早地檢測到，所述治療方案被認為是由節點軸索電壓門控鈉通道(nodalaxonalvoltage-gatedsodiumchannel)的功能障礙引起的[Krishnan，MuscleNerve，32,51-60(2005)]，并且該急性增加已經被建議用來預測奧沙利鉑誘導的周圍神經病變的發生和嚴重性[Park，Brain，132,10,2712-23(2009)]。在奧沙利鉑的第5個周期之前SE從基線增加15％，使得在奧沙利鉑治療的第12個周期結束時檢測到80％的病例具有中度至重度神經毒性。而且，機理臨床研究方案的證明已被設計以提供以下證據，即有效且選擇性的CXCR2拮抗劑能有效預防和/或治療CIPN，其通過捕獲在奧沙利鉑周期過程中與感覺神經興奮性的變化相關的患者結果信息。此外，CXCR2拮抗劑的臨床前研究已證明，抑制CXCR2對奧沙利鉑的抗增殖作用沒有不利影響[Ning，Mol.CancerTher.，11，1353-1364(2012)]。機理研究的證明也將監測包含奧沙利鉑的治療方案對癌癥相關的終點的有效性。因此根據第一方面，本發明提供了用于預防和/或治療CIPN的CXCR2拮抗劑。如本文所述，術語CXCR2拮抗劑是指抑制CXCR2受體的激動劑-介導的響應的化合物。本文使用的術語預防是指完全阻止神經損傷和/或相應的神經功能障礙(通過神經生理跟蹤技術測量)或減緩神經損傷和/或神經功能變化的進展。應理解預防包括a)化療劑對健康神經沒有造成損傷或基本上沒有損傷的情況；b)受損的神經(例如由早期化療周期引起)不被化療劑進一步損傷或基本上不被損傷的情況；和c)與任何先前的化療周期相比，對神經的損傷(由早期化療循環的累積效應引起)減少的情況。本文使用的術語治療是指逆轉或部分逆轉CIPN，其中神經損傷和/或相應的神經功能障礙(通過神經生理跟蹤技術測量)被修復或逆轉，導致神經功能的改善，從而減少神經病的癥狀。CIPN是獨特的神經病。在大多數其它神經病(如糖尿病性神經病和酒精性神經病)中，在損害/神經損傷已發生一段時間后出現神經性癥狀。經歷化療的患者中神經病發生的可能性，特別是經歷奧沙利鉑化療的神經病的高發生率[DecisionResorcesLLC，KantarHealth，OncologyAnalyser，IntrinsiqDatabase；DeGramont，J.Clin.Oncol.，18，2938-2947(2000)]，意味著在給予化療劑之前或同時給予CXCR2拮抗劑具有防止神經病急性發生和防止慢性持久的神經性癥狀的建立的潛能。機理臨床研究的證明將通過調節神經興奮性措施及其建議的患者結果的預測性翻譯的證據而測量該預防性方面。在一個實施方案中，本發明提供用于預防CIPN的CXCR2拮抗劑。如上所述，已知許多化療劑引起CIPN，例如鉑化合物(例如，奧沙利鉑)、紫杉烷、長春花生物堿、沙利度胺和硼替佐米。在一個實施方案中，該CIPN由包括含鉑的化療劑的化療引起。在一個實施方案中，該CIPN由包括奧沙利鉑的化療引起。在一個實施方案中，該CIPN由含鉑的化療劑引起。在另一實施方案中，該CIPN由奧沙利鉑引起。CXCR2拮抗劑用于本發明的適合性可通過根據標準藥物實踐評價其功效、選擇性、吸收、代謝、藥代動力學、毒性等而測定。CXCR2拮抗劑的功效可使用容易獲得的測試方法測定，如以下實驗部分描述的測試a)、b)、c)和d)。測試a)測量人內源性激動劑IL-8與重組表達的人CXCR2受體的放射性標記的結合。測試b)測量重組表達的人CXCR2受體的功能活性，其通過報告基因構建體在受體自身下游測量。測試c)測量重組表達的人CXCR2受體的功能活性，其通過報告基因構建體在受體自身下游測量。測試d)測量全血中天然表達的人CXCR2的細胞功能活性，其通過流式細胞儀細胞分選方案在受體自身下游測量。在每個測試中，對激動劑介導的終點的抑制決定拮抗劑的效力。對于給定的拮抗劑，效力可以根據所使用的測定法而不同。然而，本領域藥理學人員能夠容易地比較不同測試的結果來確定效力。在一個實施方案中，該CXCR2拮抗劑對抗CXCR2受體的pIC50值大于或等于7.0，其在CXCR2受體結合測試中測量。在另一實施方案中，該CXCR2拮抗劑對抗CXCR2受體的pIC50值大于或等于7.8，其在受體結合測試中測量。在一個實施方案中，該CXCR2拮抗劑對抗CXCR2受體的pIC50值大于或等于7.0，其在測試a)中測量。在另一實施方案中，該CXCR2拮抗劑對抗CXCR2受體的pIC50值大于或等于7.8，其在測試a)中測量。在一個實施方案中，該CXCR2拮抗劑對抗CXCR2受體的pA2值大于或等于8.0，其在測試b)中測量。在另一實施方案中，該CXCR2拮抗劑對抗CXCR2受體的pA2值大于或等于8.2，其在測試b)中測量。在一個實施方案中，該CXCR2拮抗劑對抗CXCR2受體的pIC50值大于或等于8.0，其在測試c)中測量。在另一實施方案中，該CXCR2拮抗劑對抗CXCR2受體的pIC50值大于或等于8.8，其在測試c)中測量。在一個實施方案中，該CXCR2拮抗劑對抗CXCR2受體的pIC50值大于或等于5.0，其在測試d)中測量。在另一實施方案中，該CXCR2拮抗劑對抗CXCR2受體的pIC50值大于或等于5.4，其在測試d)中測量。CXCR2拮抗劑對CXCR2受體相對于CXCR1受體的選擇性可使用測試a)和e)測定。選擇性比例可容易通過對具體涉及的受體的相應IC50值的比例由本領域技術人員測定。在一個實施方案中，該CXCR2拮抗劑對CXCR2的選擇性是CXCR1的大于或等于29倍。在另一實施方案中，該CXCR2拮抗劑對CXCR2的選擇性是CXCR1的大于或等于50倍。在一個實施方案中，該CXCR2拮抗劑對CXCR2的選擇性是CXCR1的大于或等于100倍。口服生物利用度是指口服給藥的藥物達到體循環的比例。確定藥物口服生物利用度的因素為溶解度、膜滲透性、代謝穩定性和主動轉運體的可能參與。通常，篩選級聯法首先使用體外研究鑒定可能的傾向，然后推進至體內評估以確定口服生物利用度。溶出度，即胃-腸道(GIT)中的水性內含物對藥物的溶解作用，可從體外溶解度實驗預測，其在合適的pH進行以模擬GIT。在一個實施方案中，該CXCR2拮抗劑的最小溶解度為10μg/ml。溶解度可通過本領域的標準步驟測定，如Adv.DrugDeliv.Rev.，23，3-25(1997)中所述。膜滲透性是指化合物穿過生物膜的比率。親脂性是預測的關鍵性質且通過使用有機溶劑和緩沖液的體外LogD7.4測量值定義。在一個實施方案中，CXCR2拮抗劑的LogD7.4為-2至+4，更優選-1至+3。LogD7.4可通過本領域已知的標準步驟測定，如J.Pharm.Pharmacol.，42:144(1990)中所述。代謝穩定性涉及在吸收和消除過程中GIT或肝代謝化合物的能力。測試系統如微粒體、肝細胞等可預測代謝傾向性。在一個實施方案中，該CXCR2拮抗劑在測試系統中顯示代謝穩定性，其與低至中度的肝萃取相稱。測試系統和數據操作的實例描述于Curr.Opin.DrugDisc.Devel.，4，36-44(2001)；DrugMet.Disp.，28,1518-1523(2000)。由于上述過程的相互作用，可通過在臨床前物種中的體內實驗進一步評估藥物是否潛在可被人口服生物利用。在這些研究中通過口服和靜脈內途徑給予化合物確定絕對生物利用度。在動物中評估口服生物利用度的實例可參見DrugMet.Disp.，29，82-87(2001)；J.MedChem.，40，827-829(1997)；DrugMet.Disp.，27，221-226(1999)。合適用于本發明的CXCR2拮抗劑公開于歐洲專利公開EP1558259B1和EP2009992B1。這些公開的內容，特別是其中的權利要求的治療活性化合物的通式和實施例化合物，以其整體在此引入作為參考。在一個實施方案中，用于本發明的CXCR2拮抗劑選自：式(A)的1-(4-氯-2-羥基-3-(哌嗪-1-基磺酰基)苯基)-3-(2-氯-3-氟苯基)脲式(B)的1-(4-氯-2-羥基-3-(哌啶-3-基磺酰基)苯基)-3-(3-氟-2-甲基苯基)脲式(C)的1-(4-氯-2-羥基-3-(((R)-3-甲基四氫呋喃-3-基)磺酰基)苯基)-3-((R)-2-甲基環戊-2-烯-1-基)脲式(D)的1-(4-氯-3-((1,4-二甲基哌啶-4-基)磺酰基)-2-羥基苯基)-3-(2-氯-3-氟苯基)脲式(E)的(R)-1-(4-氯-2-羥基-3-((4-甲基四氫-2H-吡喃-4-基)磺酰基)苯基)-3-(2-氯環戊-2-烯-1-基)脲式(F)的(R)-1-(3-(叔丁基磺酰基)-4-氰基-2-羥基苯基)-3-(2-甲基環戊-2-烯-1-基)脲式(G)的1-(4-氯-2-羥基-3-((反-3-(吡咯烷-1-基)環丁基)磺酰基)苯基)-3-((R)-2-甲基環戊-2-烯-1-基)脲式(H)的1-(4-氯-3-((反-3-(二甲基氨基)環丁基)磺酰基)-2-羥基苯基)-3-((R)-2-甲基環戊-2-烯-1-基)脲式(I)的(R)-1-(4-氯-3-((1,1-二氟乙基)磺酰基)-2-羥基苯基)-3-(2-甲基環戊-2-烯-1-基)脲式(J)的1-(4-氯-2-羥基-3-(((S)-3-甲基四氫呋喃-3-基)磺酰基)苯基)-3-((R)-2-甲基環戊-2-烯-1-基)脲式(K)的1-(4-氯-2-羥基-3-(((S)-3-甲基四氫呋喃-3-基)磺酰基)苯基)-3-((R)-2-氯環戊-2-烯-1-基)脲和式(L)的1-(4-氯-2-羥基-3-(((R)-3-甲基四氫呋喃-3-基)磺酰基)苯基)-3-((R)-2-氯環戊-2-烯-1-基)脲或其藥學上可接受的鹽。式(A)的化合物可根據歐洲專利EP1558259B1實施例1所述的方法制備。式(B)的化合物可根據歐洲專利EP2009992B1實施例1所述的方法制備。式(C)、(D)、(E)、(F)、(G)、(H)、(I)、(J)、(K)和(L)的化合物可根據以下所述的方法制備。還可參見國際專利申請PCT/EP2015/061618的制備。在另一實施方案中，所述CXCR2拮抗劑為式(A)的1-(4-氯-2-羥基-3-(哌嗪-1-基磺酰基)苯基)-3-(2-氯-3-氟苯基)脲或其藥學上可接受的鹽在另一實施方案中，所述CXCR2拮抗劑為式(B)的1-(4-氯-2-羥基-3-(哌啶-3-基磺酰基)苯基)-3-(3-氟-2-甲基苯基)脲或其藥學上可接受的鹽在另一實施方案中，所述CXCR2拮抗劑為式(C)的1-(4-氯-2-羥基-3-(((R)-3-甲基四氫呋喃-3-基)磺酰基)苯基)-3-((R)-2-甲基環戊-2-烯-1-基)脲或其藥學上可接受的鹽在另一實施方案中，所述CXCR2拮抗劑為式(J)的1-(4-氯-2-羥基-3-(((S)-3-甲基四氫呋喃-3-基)磺酰基)苯基)-3-((R)-2-甲基環戊-2-烯-1-基)脲或其藥學上可接受的鹽該CXCR2拮抗劑可單獨給藥，但通常以與合適的藥物賦形劑、稀釋劑或載體的混合物給藥，該藥物賦形劑、稀釋劑或載體根據預期給藥途徑和標準藥物實踐而選擇。在通過合適的途徑給藥于患者前，該CXCR2拮抗劑通常，但不必須，配制為藥物組合物。因此，在另一方面，本發明提供了一種藥物組合物，其包含a)CXCR2拮抗劑，和b)用于預防和/或治療CIPN的一種或多種藥學上可接受的賦形劑。本發明的藥物組合物可以以散裝形式進行制備和包裝，其中將本發明化合物分配然后給藥至所述患者(例如粉末或糖漿)。或者，可將本發明藥物組合物制備和包裝成藥物劑型，其中每種物理上分散的藥物劑型含有本發明化合物。因此，在另一方面，本發明提供了包含本發明藥物組合物的藥物劑型。對于平均體重范圍為約65至80kg的人受試者，每個分散的藥物劑型通常含有5mg至100mg的本發明化合物。本領域技術人員能夠容易確定體重在該范圍之外的受試者所需的劑量水平，如兒童和老年人。本發明組合物將通常被配制成適于通過所需給藥途徑給藥至患者的藥物劑型。例如，藥物劑型包括適于以下的那些：(1)口服給藥，例如片劑、膠囊、小膠囊、丸劑、錠劑、粉末、糖漿、酏劑、混懸液、溶液、乳液、囊劑和扁囊劑；(2)胃腸外給藥，例如無菌溶液、混懸液、植入物和用于重構的粉末；(3)透皮給藥，例如透皮貼劑；(4)直腸和陰道給藥，例如栓劑、陰道栓劑和泡沫；(5)吸入和鼻內給藥，例如干粉、氣霧劑、混懸液和溶液(噴霧和滴劑)；(6)局部給藥，例如乳膏劑、軟膏劑、洗劑、溶液、糊劑、滴劑、噴霧劑、泡沫和凝膠；(7)眼部給藥，例如滴劑、軟膏劑、噴霧劑、混懸液和嵌入物；(8)口腔和舌下給藥，例如錠劑、貼劑、噴霧劑、滴劑、咀嚼片和片劑。在一個實施方案中，該劑型適用于口服給藥。在一個實施方案中，該組合物適用于口服給藥。如本文所述，術語"藥學上可接受的賦形劑"是指不與CXCR2拮抗劑明顯反應，且不導致對CXCR2拮抗劑的治療活性具有不希望的作用的物質。藥學上可接受的賦形劑將根據所選具體藥物劑型而變化。此外，可根據具體功能選擇合適的藥學上可接受的賦形劑，使它們適用于該組合物。例如，可根據其促進均一藥物劑型的產生的能力選擇一些藥學上可接受的賦形劑。可根據其促進穩定的藥物劑型的產生的能力選擇一些藥學上可接受的賦形劑。可根據一旦將化合物或本發明化合物給藥至患者便促進從一個器官或機體部分攜帶或運輸所述化合物或本發明化合物至另一器官或機體的另一部分的能力選擇一些藥學上可接受的賦形劑。可根據其提高患者順應性的能力來選擇一些藥學上可接受的賦形劑。可根據其促進CXCR2拮抗劑以適當的速率釋放以治療該病癥的能力來選擇一些藥學上可接受的賦形劑。用于適合口服給藥的組合物的藥學上可接受的賦形劑包括：稀釋劑和填料(如乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇、山梨醇、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、預膠化淀粉、纖維素、微晶纖維素、硫酸鈣、和磷酸氫鈣)；粘合劑(如淀粉、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、預膠化淀粉、明膠、阿拉伯膠、藻酸鈉、海藻酸、黃蓍膠、瓜爾膠、聚乙烯吡咯酮、纖維素和羥丙基甲基纖維素)；崩解劑(如淀粉、聚乙烯聚吡咯烷酮、羥乙酸淀粉鈉、交聯羧甲醚纖維素、海藻酸和羧甲基纖維素鈉)；潤滑劑(如硬脂酸、硬脂酸鎂、硬脂酸鈣、和十二烷基硫酸鈉)；助流劑(如滑石和膠體二氧化硅)；成粒劑；包衣劑；濕潤劑；溶劑；共溶劑；懸浮劑；乳化劑；增甜劑；調味劑；掩味劑；著色劑；抗結劑；潤濕劑；螯合劑；增塑劑；增粘劑；速率調節劑；抗氧化劑；防腐劑；穩定劑；表面活性劑；和緩沖劑。本領域技術人員將理解，一些藥學上可接受的賦形劑可起到一種以上的功能，并且根據該賦形劑在所述制劑中存在多少以及該制劑中存在什么其他成分可起到替代的功能。在一個實施方案中，適合口服給藥的劑型如片劑、膠囊、囊片和丸劑，可配制以用于立即、延遲、修飾、持續、脈沖或控制釋放本發明的化合物。本領域技術人員具有本領域的知識和技能，使它們能夠確定合適的藥學上可接受的賦形劑以適當的量用于CXCR2拮抗劑中。此外，本領域技術人員可以獲得許多資源，其描述了藥學上可接受的賦形劑并可用于選擇合適的藥學上可接受的賦形劑。實例包括Remington'sPharmaceuticalSciences(MackPublishingCompany)、TheHandbookofPharmaceuticalAdditives(GowerPublishingLimited)和TheHandbookofPharmaceuticalExcipients(theAmericanPharmaceuticalAssociationandthePharmaceuticalPress)。本發明藥物組合物可使用本領域技術人員已知的技術和方法進行制備。本領域常用的一些方法描述于Remington'sPharmaceuticalSciences(MackPublishingCompany)。以下配制例僅為示例性的且不意欲限制本發明的范圍。根據本發明，該CXCR2拮抗劑預防和/或治療通過給藥化療劑引起的CIPN。因此，該CXCR2拮抗劑可與化療劑組合給藥。在本發明一個實施方案中，該用于預防和/或治療CIPN的CXCR2拮抗劑與一種或多種主要化療劑組合，該活性劑選自以下列表：鉑化合物(例如，奧沙利鉑)、紫杉烷、長春花生物堿、沙利度胺和硼替佐米。在另一實施方案中，該主要化療劑為奧沙利鉑。通常，化療劑與額外的藥劑(例如，其他化療劑、血管生成抑制劑，止吐劑)組合給藥，其為實現患者順應性抗癌治療提供了增加的治療選擇，包括治療難治性群體。在本發明另一實施方案中，該CXCR2拮抗劑與以下一起給藥：a)主要化療劑和b)選自以下的額外的藥劑：貝伐單抗、伊立替康、卡培他濱、西妥昔單抗、帕尼單抗、瑞戈非尼和Ziv-阿柏西普。如果給予活性劑的組合，則它們可同時、分開或相繼給藥。在一個實施方案中，該CXCR2拮抗劑在給藥化療劑之前或同時給藥。應理解，本發明提供了以下其它方面的基礎。上述第一方面中的具體實施方案延伸至這些方面:在需要的人中預防和/或治療CIPN的方法，包括給藥CXCR2拮抗劑；CXCR2拮抗劑在制備用于預防和/或治療CIPN的藥物中的用途；用于預防和/或治療CIPN的藥物組合，其包含CXCR2拮抗劑和另一種上文定義的活性劑；在需要的人中預防和/或治療CIPN的方法，包括給藥包含CXCR2拮抗劑和另一種上文定義的活性劑的藥物組合；藥物組合在制備用于預防和/或治療患者CIPN的藥物中的用途，該藥物組合包含CXCR2拮抗劑和另一種上文定義的活性劑；用于預防和/或治療CIPN的試劑盒，該試劑盒包含：a)包含CXCR2拮抗劑的第一藥物組合物；b)包含另一種上文定義的活性劑的第二組合物；和c)用于該第一和第二組合物的容器；和試劑盒在制備用于預防和/或治療CIPN的藥物中的用途，該試劑盒包含：a)包含CXCR2拮抗劑的第一藥物組合物；b)包含另一種上文定義的活性劑的第二組合物；和c)用于該第一和第二組合物的容器。實驗部分a)CXCR2和CXCR1的受體結合測試[125I]IL-8(人重組體，IM249)獲自AmershamCorp.，ArlingtonHeights，IL，比活性為2000Ci/mmol。所有其它化學品為分析級。高水平的重組人CXCR1和CXCR2受體分別在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中表達，如Holmes，等人，Science，1991，253，1278所述，將其在此引入以進行本測試。中國倉鼠卵巢膜根據Haour，等人，J.Biol.Chem.，249pp2195-2205(1974)制備，將其在此引入以進行本測試，除了將均化緩沖液改變為包含1mMMgS04、0.5mMEDTA(乙二胺四乙酸)、1mMPMSF(α-甲苯-磺酰氟)、2.5mg/L亮抑酶肽和0.1mg/ml抑肽酶的40mMTris-HCLpH7.5。膜蛋白質濃度使用Bio-Rad試劑使用牛血清白蛋白作為標準而測定。所有結合測試使用閃爍親近測定法(SPA測試)進行，其使用小麥胚芽凝集素珠在96-孔微孔板(optiplate96，Packard)格式中。該CHO-CXCR2和CHO-CXCR1膜在結合緩沖液中用珠子預培養；20mMBisTris丙烷，pH8，其包含25mMNaCl、1mMMgSO4、0.1mMEDTA，在測試前在4℃保持30分鐘。化合物以終濃度的20倍在100％DMSO中稀釋(最終1nM至1000nM和5％DMSO)。該測在包含結合緩沖液、用小麥胚芽凝集素珠預處理的膜、多種濃度的化合物、5％DMSO、0.04％CHAP、0.0025％BSA和0.225nM[125I]IL-8的0.1ml反應緩沖液中進行。該96-孔板在振動平臺上培養1小時。在培養結束時將板以2000RPM旋轉5分鐘，且在TopCount計數器中計數。認為顯示pIC50值>5的化合物在測試中具有活性。式(A)的化合物對CXCR2受體的pIC50值為7.8且對CXCR1受體的pIC50值為5.5。如該測試所測量，因此式(A)的化合物對CXCR2的選擇性是CXCR1的188倍。式(B)的化合物對CXCR2受體的pIC50值為7.9且對CXCR1受體的pIC50值為6.0。如該測試所測量，因此式(B)的化合物對CXCR2的選擇性是CXCR1的78倍。b)鈣動員測試穩定表達CXCR2和Gα16的CHO-K1細胞在DMEM/F12(HAM's)1:1，w/10％FCS(熱滅活)，w/2mML-谷氨酰胺，w/0.4mg/mlG418中生長至80％融合，同時在5％CO2培養箱中維持在37℃。在進行測定之前24小時，收獲細胞并在96孔、黑色壁、透明底板(PackardView)中鋪板(每孔40,000個細胞)，并返回到CO2培養箱中。在測定當天，將化合物在100％DMSO中連續稀釋至所需測試濃度的300倍。從細胞中吸出生長培養基，并用100μL負載培養基(具有Earl's鹽w/L谷氨酰胺，0.1％BSA(來自SeriologicalsCorp.的BovunlinarCohenFractionV)的EMEM，4uMFluo-4-乙酰氧基甲基酯熒光指示劑染料(Fluo-4AM，來自MolecularProbes)和2.5mM丙磺舒)在37℃在CO2培養箱中培養1小時。抽吸負載培養基并用100μL具有Earl's鹽w/L-谷氨酰胺、0.1％明膠和2.5mM丙磺舒的EMEM更換，并且再培養10分鐘。將300x的在DMSO中的連續稀釋的化合物(3μL)轉移到含有297微升KRH(120mMNaCl，4.6mMKCl，1.03mMKH2PO4，25mMNaHCO3，1.0mMCaCl2，1.1mMMgCl2，11mM葡萄糖，20mMHEPES(pH7.4))w/2.5mM丙磺舒和0.1％明膠的96孔板(現在化合物為3x濃度)。從細胞中吸出培養基，并用KRHw/2.5mM丙磺舒、w/0.1％明膠洗滌細胞3次。將具有0.1％明膠的KRH(100μL)w/2.5mM丙磺舒加入孔中，然后將50μL在KRHw/2.5mM丙磺舒和0.1％明膠中的3x化合物加入孔中并在37℃在CO2培養箱中培養10分鐘。將板置于FLIPR(FluorometricImagingPlateReader，MolecularDevices，SunnyvaleCalif)上用于如前所述的分析[SarauetaI.，Mol.Pharmacol.，Sep.，56(3)，657-63(1999)]。針對化合物的各濃度測定由1.0nMIL-8(CXCR2的EC80濃度)誘導的最大人IL-8誘導的Ca2+遷移的百分比，并且IC50計算為抑制由1.0nMIL-8誘導的最大響應的50％的測試化合物的濃度。如該測試所測量，式(A)的化合物對CXCR2受體的pA2值為8.4。如該測試所測量，式(B)的化合物對CXCR2的pA2值為8.2。c)CXCR2Tango測試該測試測定在含有與TEV蛋白酶位點和Gal4-VP16轉錄因子相連的重組人CXCR2的穩定細胞系(Invitrogen)中，受體CXCR2的配體誘導的活化。配體與所述受體的結合導致抑制蛋白(用蛋白酶標記)募集至所述受體并觸發轉錄因子的釋放受限。所述轉錄因子進入細胞核并活化報告基因的轉錄。化合物抑制CXCR2活化的能力通過測量所述報告基因的活性而間接評估。將一小瓶冷藏保存的細胞從液氮中取出并在37℃的水浴中輕輕攪拌以迅速解凍。收集該細胞內含物并以約200,000個細胞/ml的密度再混懸于測試培養基中。將所有的測試化合物以10mM的濃度溶于DMSO中，然后連續稀釋以在384-孔測試板(Greiner781090)中產生10-點劑量響應曲線，其使用Echo(Labcyte)濃度-響應程序(50nl/孔)。向所述無細胞、未刺激和陽性對照中裝入50nl/孔純的DMSO以確保所有測試板的DMSO濃度恒定。使用具有標準盒的Multi-dropCombi(Thermo)，在含化合物的測試板中將50μl測試培養基加至無細胞對照的各孔中；將50μl無hCXCL1(CXCR2配體)的細胞混懸液加至未刺激的對照孔(每孔約10,000個細胞)；并將50μl具有80nMhCXCL1的細胞混懸液加至該測試板的剩余孔中(每孔約10,000個細胞)。將該細胞在37℃/5％CO2培養過夜。使用具有小管盒的Multi-dropCombi(Thermo)將10μl的6x底物混合物(LiveBLAzerTM-FRETB/G底物(CCF4-AM)，目錄號K1096，購自Invitrogen，Inc.)加至各孔并將該板在室溫避光培養2h。然后將該板在EnVision上使用一個激發通道(409nm)和兩個發射通道(460nm和530nm)進行讀取。通過將除去背景的藍色發射值除以除去背景的綠色發射值來計算各孔的藍/綠發射比率(460nm/530nm)。所述劑量響應曲線基于S型劑量-響應模型。所有的比率數據基于各板的陽性對照(hCXCL1)的最大發射比率和陰性對照(DMSO)的最小發射比率進行標準化。如該測試所測量，式(A)的化合物對CXCR2受體的pIC50為9.2。如該測試所測量，式(B)的化合物對CXCR2受體的pIC50為8.8。如該測試所測量，式(C)的化合物對CXCR2受體的pIC50為9.0。如該測試所測量，式(D)化合物對CXCR2受體的pIC50為8.9。如該測試所測量，式(E)化合物對CXCR2受體的pIC50為8.8。如該測試所測量，式(F)的化合物對CXCR2受體的pIC50為9.7。如該測試所測量，式(G)的化合物對CXCR2受體的pIC50為9.0。如該測試所測量，式(H)的化合物對CXCR2受體的pIC50為9.0。如該測試所測量，式(I)的化合物對CXCR2受體的pIC50為9.4。如該測試所測量，式(J)的化合物對CXCR2受體的pIC50為9.0。d)人全血測試版本i)通過靜脈穿刺在含有225微升0.25MEDTA的10ml注射器中由訓練有素的醫療人員從健康同意的成年人獲得人血液并填充7ml血液(在整個CXCL1刺激期間保持在37℃)。將測試化合物溶于100％DMSO中至10mM的濃度，并在1.2％DMSO中稀釋至測定濃度的12倍(DMSO終濃度為0.1％)。測試：將100μl全血加入含有10微升1.2％DMSO(測定濃度為0.1％)或10微升溶解在1.2％DMSO中的化合物的測試管或96孔U底透明板中(測試濃度范圍0.1μM至10μM)，然后在37℃培養10分鐘，隨后加入10μl的DPBS中的0.1％BSA(陰性對照)或10μl的120nMCXCL1(GROα，PreproTech，Inc)(溶于0.1％BSA的DPBS溶液中)(測試濃度為10nM，其為CXCL1的EC80)，并在輕輕攪拌下在37℃培養另外10分鐘，然后置于冰上，通過加入250μlCellFix或250μl3.7％v/v多聚甲醛(BDBiosciences)終止測試。一分鐘后，將50μl固定血加入含有10μl抗CD11b-FITC(BeckmanCoulter)和5μl抗人CD16-PE(DakoCytomation)的管中，輕輕混合，且將總樣品加入500μl冷DPBS中。在使用LSR流式細胞儀(Becton-Dickinson)或FACSCantoII分析之前，將細胞在4℃用10μlLDS-751(MolecularProbes)核酸染色劑染色10分鐘，允許細胞儀閾值設置排除紅細胞。使用CellQuest軟件或FACsdiva進行分析。通過順序門控測定嗜中性粒細胞群；首先在側向散射對前向散射圖中對所有粒細胞進行門控，然后對粒細胞群(CD16+嗜中性粒細胞，CD16-嗜酸性粒細胞)中的CD16+(PE熒光)細胞進行門控。評估每個樣品的嗜中性粒細胞群體的平均FITC熒光，因為其直接涉及CD11b含量，即CXCR2激活的生物標志物。測定每個樣品的平均熒光。陽性對照定義為用10nMCXCL1(無抑制劑)刺激的樣品的熒光值。陰性對照定義為載體處理的樣品(無CXCL1，無抑制劑)的熒光值。從每個樣品中減去平均陰性對照值。然后將所有樣品相對于平均陽性對照進行歸一化。如該版本的測試中所測量的，式(A)的化合物對CXCR2受體的pIC50為5.7。如該版本的測試中所測量的，式(B)的化合物對CXCR2受體的pIC50為6.4。如該版本的測試中所測量的，式(D)化合物對CXCR2受體的pIC50為5.4。版本ii)通過靜脈穿刺從知情的成人中抽取血液并倒入含有抗凝血劑肝素(10uL/mL血液)的Sterilin管中。將所有測試化合物溶于DMSO至4mM并在板中以1:3連續稀釋，得到10點劑量響應曲線。然后將該化合物在PBS[磷酸鹽緩沖液(無氯化鈣和氯化鎂)]中稀釋100倍，之后使用FX將1uL分配于96U型底的Costar板上。這么做是為了將最終的DMSO濃度降低至0.25％并在加入血液后以10uM的最終測試濃度篩選化合物。使用多通道移液管將10μL血液轉移至化合物板，輕輕敲打并在37℃培養15分鐘。15分鐘后，將刺激物GROα在0.1％BSA(牛血清白蛋白)-PBS中稀釋成100nM并將5μL分配至整個板上，使最終濃度為33nM。輕輕敲打平板并在37℃再培養15分鐘。將該板置于冰上1分鐘，然后加入10μL由BioLegend(地址：CambridgeBioscience，MunroHouse，TrafalgarWay，BarHill，Cambridge，UK)的CD11b-FITC(40ug/mL)和購自BDPharmingen(地址：TheDanbyBuilding，EdmundHalleyRoad，OxfordSciencePark，Oxford，UK)的CD16-PE組成的抗體混合物(儲備濃度100倍測試濃度，將2mL儲備體積以1:5稀釋)。將該板在冰上避光1小時。然后將該細胞使用200uL/孔的1xFACS(流式激活細胞分選(FlowActivatedCellSorting))裂解溶液(Becton和Dickinson-BD)進行固定并在冰上避光20分鐘。將該板以1600rpm離心5分鐘并用200uL冰冷的PBS再混懸。將這個步驟重復兩次并在最終步驟中將該板用50uL冰冷的-PBS再混懸，用于流式細胞檢測分析。將樣品在Becton和Dickinson(BD)-AcurriC6流式細胞儀上，使用HyperCyt采樣裝置(IntelliCyt)以2uL/秒的流速運行。監測在嗜中性粒細胞中CD11b的上調并使用側向散射和CD16表達的組合進行鑒定。如該版本的測試中所測量的，式(J)的化合物對CXCR2受體的pIC50為7.4。如該版本的測試中所測量的，式(D)化合物對CXCR2受體的pIC50為5.8。該值類似于該測試版本ii)中測量的式D的化合物獲得的pIC505.4，因此測試d)的版本i)和ii)的結果是相當的。e)GPCR抑制蛋白測試本發明的某些化合物還由DiscoveRXCorporation(42501AlbraeStreet，Fremont，CA94538，UnitedStates)在他們的GPCR抑制蛋白(Arrestin)測定中測試，以確定它們對包括CXCR2和CXCR1的一組受體的活性。根據標準方法從冷凍庫中擴增PathHunterCHO細胞系。將細胞以20μL的總體積接種到白壁384孔微量培養板中，并在測試前在37℃培養適當時間。將細胞與拮抗劑預培養，隨后在EC80濃度下進行激動劑刺激。進行樣品儲液的中間稀釋以在測試緩沖液中產生5X樣品。將5μL5x樣品加入細胞中，并在37℃或室溫培養30分鐘。載體濃度為1％。將5μL的測試緩沖液中的6XEC80激動劑加入到細胞中，并在37℃或室溫培養90或180分鐘。通過單次添加12.5或15μL(50％v/v)PathHunter檢測試劑混合物，隨后在室溫培養1小時產生測試信號。在用用于化學發光信號檢測的PerkinElmerEnvisionTM儀器產生信號后讀取微孔板。使用CBIS數據分析套件(ChemInnovation，CA)分析化合物活性。使用下式計算抑制百分比：％抑制＝100％×(1-(測試樣品的平均RLU-載體對照的平均RLU)/(EC80對照的平均RLU-載體對照的平均RLU))。如該測試所測量，式(J)的化合物對CXCR2受體的pIC50值為8.3且對CXCR1受體的pIC50值為5.4。如該測試所測量，式(J)的化合物對CXCR2的選擇性是CXCR1的730倍。如該測試所測量，式(D)化合物對CXCR2受體的pIC50值為7.0且對CXCR1受體的pIC50值為5.6。如該測試所測量，式(D)化合物對CXCR2的選擇性是CXCR1的29倍。f)奧沙利鉑和式(A)的化合物在結腸直腸癌細胞系增殖測試中的作用細胞增殖測試:細胞以不同細胞密度接種于96-孔板(Costar)：HCT116，500個細胞/孔；Caco-2，1000個細胞/孔。培養基的總體積為90μl/孔。細胞在37℃和5％CO2培養器中培養24小時。奧沙利鉑和式(A)的化合物濃度系列進一步用DPBS稀釋。奧沙利鉑在HCT116細胞系實驗中的終濃度來自500μM的3倍稀釋，15種濃度和一個對照。The終濃度sof奧沙利鉑在Caco-2細胞系實驗中的終濃度來自55.5μM的3倍稀釋，9種濃度和一個對照。式(A)的化合物的終濃度為8.5μM。5μL奧沙利鉑連同5μl載體或式(A)的化合物一起添加至培養基且再在37℃和5％CO2培養器中培養72小時。細胞增殖速率通過添加100μlCellTiter-GloTM(Promega)根據制造商的說明進行測量。培養10分鐘后，將細胞裂解物轉移至OptiPlate-384孔，通過BioTekSynergyTM4Hybrid微板讀取器使用Gen5軟件記錄發光。所有數據點一式五份生成。進行三個獨立的實驗。數據分析：pIC50值通過軟件GraphPadPrism5使用S形濃度-響應(可變斜率)計算。所有數據表示為來自三個獨立實驗確定的平均值的平均值±標準誤差。通過從三個獨立實驗確定的單因素ANOVA方差分析(GraphPadPrism5)分析單獨的式(A)化合物(8.5μM)對Caco-2和HCT116細胞系的基底增殖的影響。在這些分析中包括從奧沙利鉑濃度響應曲線和載體對照的整體產生的所有數據，以允許相關統計學評價奧沙利鉑的確定的生物效應的背景下單獨的式(A)化合物的作用。結果：奧沙利鉑顯示在Caco-2和HCT116細胞系中對細胞增殖的濃度-依賴性抑制，其中pIC50值分別為5.923±0.047和6.049±0.016。在濃度為8.5μM的式(A)的化合物的存在下，這些奧沙利鉑抑制細胞增殖的效力不受影響，其中pIC50值分別為5.95±0.07和6.05±0.02。在Caco-2和HCT116細胞系中；單獨的式(A)化合物存在基底增殖的非顯著性降低，分別為2.7±2.1％和8.9±0.7％。此外，這些影響小于在各個奧沙利鉑濃度響應曲線中觀察到的生物相關統計學差異。因此，式(A)的化合物(8.5μM)單獨對兩種細胞系的基底細胞增殖沒有影響。g)慢性壓迫性損傷嚙齒類中的臨床前基因表達神經性疼痛的慢性壓迫性損傷(CCI)模型涉及具有四個結扎的坐骨神經的單側松散連接。這導致出現痛覺過敏，異常性疼痛和自發性疼痛(異位放電)，部分由外周中炎性細胞的募集和脊髓中小膠質細胞和星形膠質細胞的活化引起。認為該模型模擬在臨床中觀察到的神經性疼痛的一些癥狀和病因(Bennett和Xie，Pain198833(1)：87-107(1988)；Field等，Pain83(2)：303-11(1999)。在CCI模型中已經觀察到嚙齒動物中感覺終點的早期改變，導致對熱(Neuropharmacology，79(2014)432-443；Pain，101(2003)65-77)和機械刺激(Neuropharmacology，79(2014)432-443；BrainResearch，784(1998)154-162)的敏感性增加，分別使用冷丙酮刺激和vonFrey細絲。雄性SpragueDawley大鼠(Harlan，UK.200-250克)在四個一組的標準籠養和實驗室條件下飼養，自由獲取食物(5CR4，Purina)和水(放置在測試箱中時除外)，以12/12光/暗循環。從到達日提供環境豐富化，并在星期一(城堡)，星期三(房子)和星期五(管)改變以防止自殘。將雄性C57BL6小鼠(Harlan，UK，6-7周齡)放在標準的籠中，實驗室條件和5個一組的環境富集中，自由獲得食物(5CR4，Purina)和水(放置在測試箱中時除外)，以12/12光/暗循環。行為部分：基線測試：所有動物在手術前進行機械性異常性疼痛的行為測試，以確定基線縮足閾值。對于大鼠研究，將對用von-Frey纖毛刺激的最后兩個(共三個)的基線縮足閾值(PWT)的平均值作為基線。對于小鼠研究，在兩個分開的天(第-1天和第0天)收集基線數據。手術過程：在與氧氣混合的異氟烷麻醉(3:1，1L/min)下，將左后腿在大腿中部水平剃毛，并使用手術刀穿過皮膚進行切口。通過使用一對鋒利的剪刀進行初始切開來解剖股二頭肌層，然后使用一對鈍剪刀將其擴大。暴露常見的坐骨神經，并且在坐骨神經周圍綁扎3根(用于小鼠)或4根(用于大鼠)疏松綁扎的聚丙烯縫線(對于小鼠)或鉻腸線(SMI)(對于大鼠)，每個之間具有1mm的間距。然后將神經返回到肌肉層下面，使用可吸收縫線(Vicryl)閉合傷口。假手術動物進行相同的程序，只是神經未結扎。在手術后3天開始行為測試，在第3天和第7天采取機械響應閾值。在CCI手術治療后的第1天、第3天和第7天收集來自DRG和坐骨神經的組織。在第1天和第3天使用單獨的手術制備的動物組進行組織收集，并在第3天進行行為評估。通過放置在適當大小的標記管中并放置在液氮中將所有組織速凍。靜態機械(觸覺)異常性疼痛：大鼠：將動物置于具有0.5cm2網格的升高的網底平臺上，并將倒置的有機玻璃容器置于各動物之上。在初始15-20分鐘適應/習慣期后進行測試。使用校準的(力；g)von-Frey單絲(觸摸測試感覺評估器；ScientificMarketingAssociates)實現縮足閾值的測量，其應用后爪的足底表面約8秒，用足夠的力以引起細絲的稍微彎曲。縮足閾值通過增加和減少刺激強度來確定，并使用Dixon的上下方法估計[Dixon，Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.，20，441-62(1980)；Chaplan等人，J.Neurosci.Methods，Jul，53(1)，55-63(1994)]。僅認為對刺激的立即快速縮回反應(或退縮)代表陽性反應。小鼠：通過使用應用于后爪的足底表面的校準(力；g)von-Frey單絲(Touch-TestSensoryEvaluator；ScientificMarketingAssociates)，通過測量縮足閾值來評估靜態機械性異常性疼痛。在試驗前將動物置于凸起的金屬網上的單獨的Perspex盒中30-40分鐘。以1秒開1秒關的方案依次施加一系列漸變的vonFrey纖毛(0.07，0.16，0.4，0.6和1g)，重復10次。將每根纖毛垂直地施加到爪的腹側表面的中心，直到它略微彎曲。施加到動物后爪以在10個軌跡中誘導5個響應的力將被記錄為PWT。僅認為對刺激的立即快速縮回反應(或退縮)代表陽性反應。在連續兩天(第-1天和第0天)評估和在手術后第3天和第7天重新評估PWT，以監測機械性異常性疼痛的發展。統計分析：行為數據通過GraphpadPrism使用常規雙因素ANOVA方差分析進行分析，“治療”作為受試者之間的效應，且“天”作為受試者內的效應。使用Bonferroni方法進行事后分析。p值<0.05被認為是統計學顯著的。mRNA表達：QuantStudioOpenArray用于評估CCI對觸覺行為終點后NPY(神經肽Y)、CXCR2及其同族配體CXCL1的表達水平的影響。解剖出大鼠和小鼠的坐骨神經并在液氮中快速冷凍。將組織在-80℃冷凍儲存或在干冰上儲存，直到處理用于CXCR2和CXCL1的RNA分析。ActB、GAPDH、HPRT1和MAPK6用作內部測試對照和標準品，并且NPY用作CCI的對照。使用Q-PCR測量以下基因。測試用于制備預擴增池。大鼠的具體測試基因符號Taqman測試IDActBRn00667869_m1CXCL1Rn00578225_m1CXCR2Rn00567841_m1GAPDHRn01775763_g1HPRT1Rn01527840_m1MAPK6Rn00581152_m1NPYRn01410145_m1小鼠的具體測試基因符號Taqman測試IDActBMm01205647_g1CXCL1Mm04207460_m1CXCR2Mm00438258_m1GAPDHMm99999915_g1HPRT1Mm01545399_m1MAPK6Mm00727050_s1NPYMm03048253_m1總RNA分離：對于每個組織樣品，通過根據制造商的說明在RocheMagnaLyser上的GreenBead管(Roche)中的MagNAPureLC裂解緩沖液(Roche)中將組織勻漿來制備一個RNA樣品，并使用RocheMagnaPureRNA分離系統(Roche)根據制造商手冊中的說明進行總RNA分離。將樣品以50μL等分試樣洗脫，并在80℃儲存直至需要。RNA定量和完整性評估：根據制造商的手冊，在LifeTechnologiesQubit上定量每個總RNA樣品。使用AgilentPico試劑盒(AgilentTechnologies)根據制造商的手冊在Agilent2100生物分析儀上評估總RNA樣品的代表性樣品的完整性。如果RIN(RNA完整性數)為6或更大，則認為RNA是可接受的質量。第一鏈cDNA合成：使用SuperscriptVilo試劑盒(LifeTechnologies)從50ng的每種總RNA合成第一鏈cDNA。每個RNA用無RNase的水補足至11μL，并向每個RNA樣品中加入14μL主混合物。主混合物基于下表制成:組分體積5xViloRT緩沖液5μL10xVilo酶混合物2.5μL無核酸酶的水6.5μL最終體積RT主混合物14μL將樣品在DNA熱循環儀中在25℃培養10分鐘，在42℃培養60分鐘，然后在85℃培養5分鐘。合成后，將cDNA儲存在-20℃直至準備使用。預擴增：Taqman測試(LifeTechnologies)的預擴增池通過將10μL每種x20測試混合在一起而制備(共16種測試：4種感興趣的基因(大鼠)，4種管家基因(Housekeepers)(大鼠)，4種感興趣的基因(小鼠)和4種管家基因(小鼠))并稀釋至x0.2(通過加入840μLTE緩沖液(LifeTechnologies))各25μLcDNA通過以下培養而擴增:試劑體積2xPreAmpMM25μL0.2X匯聚的測試混合物12.5μL使用以下循環條件:階段重復溫度時間酶活化(保持)1195℃10minsPCR(周期)21495℃30sec60℃4mins酶滅活99℃10mins將預擴增產物儲存在-20℃直到準備使用，然后用0.1XTE(pH8.0)稀釋1:10，然后在TaqManOpenArray上運行。實時定量PCR：根據LifeTechnologies指南設置并運行QuantStudio開放陣列。將2X實時PCR主混合物(LifeTechnologies；cat：4462164)混合，并組合以下組分：組分1個樣品的體積2x開放陣列主混合物2.5μL水1.3μL將1.2μL每種預擴增的cDNA與3.8μL開放陣列主混合物混合，并置于Accufill384孔板中，通過AccufillTM系統分配到開放陣列上。OpenArray樣品跟蹤器軟件用于跟蹤樣品。開放陣列在QuantStudio上運行，并在QuantStudio上進行分析和質量控制，并將生成的文件導出到ArrayStudio進行數據分析。通過QuantStudio開放陣列評估小鼠和大鼠坐骨神經中的CXCR2、CXCL1和NPY的表達：ArrayStudio中的分析：使用OpenArray條形碼注釋QuantStudio.txt文件，刪除具有空目標名稱值的所有行，并且將其適當排序為ArrayStudio的格式。單獨的開放陣列.txt文件已上傳到ArrayStudio中。檢查“無逆轉錄”、“無模板對照”和“水空白”數據，并從最終分析中除去。對四種管家基因進行主成分分析(PCA)。在第一次PCA運行后去除異常值數據。在通過管家基因調整協方差的影響后，使用該模型估計每個基因和治療的平均log2(豐度)。選擇并運行全線性分析模型和分析因子。這產生了歸一化數據的匯總表、去除了異常值的匯總表、每個基因的系數和指示基因是否通過歸一化改進的P值。通過3因素主成分分析來分析這些數據，以檢查生物復制樣品聚集在一起。在每個模型和物種內通過單因素ANOVA方差分析來分析數據，以在每個時間點產生不同處理之間的倍數差值。計算平均差異不包含0的貝葉斯后驗概率。取大于0.95的概率表示平均差異顯著不同于0。對于CCI模型，比較類似組織的同側和對側樣品。結果：當觀察組織表達時，在涉及CCI的大鼠和小鼠實驗之間的組間基線縮足閾值(PWT)沒有差異。CCI誘導顯著的機械性異常性疼痛表型，如通過大鼠(圖1)和小鼠(圖2)中PWT的顯著減少所反映的。在大鼠中，與基線值和在這些時間點的假手術組相比，CCI組的PWT在手術后的第3天和第7天顯著降低(圖1)。(數值是平均值±SEM。**P<0.01，表示在相同時間點與假手術組相比的顯著性，雙因素ANOVA方差分析。基線：n＝20/組；第3天：n＝15/組；第7天：n＝10/組)。類似地，小鼠在慢性壓迫性損傷后發展機械性異常性疼痛。術后第3天和第7天，CCI組的PWT顯著降低(圖2)。(數值是平均值±SEM。***P<0.001，表示在相同時間點與假手術組相比的顯著性，雙因素ANOVA方差分析。第-1天：假手術組n＝20，CCI組n＝21；第0天：假手術組n＝20，CCI組n＝10；第3天：假手術組n＝15，CCI組n＝16；第7天：假手術組n＝10，CCI組n＝11)。從圖3(大鼠)和圖4(小鼠)可以看出，CXCR2和CXCL1在大鼠和小鼠中的表達譜在CCI誘導第1天后的坐骨神經中的CCI(同側；ipsi)的位點處顯著升高，如通過與假處理的動物相比的倍數變化的統計學顯著增加所證明。當與假手術治療的動物比較時，在CCI誘導后第3天，在坐骨神經中CCI(同側；ipsi)的位點處的神經感覺肽(神經肽Y(NPY))的表達譜僅在大鼠中顯著升高。從圖3可以看出，與假手術組動物或對側組織相比，CCI手術后的早期階段，同側坐骨神經中CXCR2及其配體CXCL1mRNA顯著增加，在第7天減退。在第7天，與假手術動物和對側組織相比，神經肽-Y(NPY)mRNA在統計學上不同。值顯示為平均值。#表示在同一時間點CCI和假手術大鼠之間的顯著性差異，*表示在相同時間點的對側和同側坐骨神經之間的顯著性差異，在每個時間點n＝5/組，通過貝葉斯后驗概率>0.95評估。ipsi＝同側；contra＝對側。從圖4(小鼠)可以看出，與假手術動物或對側組織相比，CCI手術后的早期階段，同側坐骨神經中CXCR2及其配體CXCL1mRNA顯著增加，在第7天減退。在進行測量的任何時間點，與假手術動物或對側組織相比，神經肽-Y(NPY)mRNA沒有統計學差異。值顯示為平均值。#表示在同一時間點CCI和假手術小鼠之間的顯著性差異，*表示在相同時間點對側和同側坐骨神經之間的顯著性差異，在每個時間點n＝5，通過貝葉斯后驗概率>0.95評估。ipsi＝同側；contra＝對側。總結：在兩種嚙齒動物物種中的CCI程序引起穩健的機械性異常性疼痛。在這兩種物種中，增強的CXCR2和CXCL1mRNA表達在機械性異常性疼痛的暫時評估的早期明顯。在大鼠中感覺神經肽Y表達也有變化。大鼠中的這種特性與在CCI模型中CXCR2系統和感覺神經肽的已知靈敏度一致，并且允許該方法用于在奧沙利鉑模型中檢測這些蛋白質。h)在奧沙利鉑-誘導的急性感覺損傷嚙齒動物中的臨床前基因表達將成年雄性Sprague-Dawley大鼠(230-300g)在恒定溫度和濕度的受控環境(溫度：21±1℃，光:暗周期為12:12小時)中以3～5只一組圈養在有機玻璃籠中，隨意獲得食物和水。將成年雄性C57BL6小鼠(21-30g)在恒定溫度和濕度的受控環境(溫度：21±1℃，光:暗周期為12:12小時)中以3～5只一組圈養在有機玻璃籠中，隨意獲得食物和水。允許動物從運輸中恢復至少一周，然后開始實驗。基線測試：所有動物在注射前進行機械性異常性疼痛的行為測試，以確定基線縮足閾值。在最后兩天(第-1天和第0天)獲取用von-Frey纖毛刺激的基線PWT。神經病變誘導：制備2mg/ml的奧沙利鉑在5％葡萄糖中的溶液。對于大鼠，在第0天通過腹膜內途徑以12mg/kg以6ml/kg的體積施用單劑量的奧沙利鉑。載體對照組接受腹膜內6ml/kg的5％葡萄糖溶液。對于小鼠，在第0天通過腹膜內途徑以15mg/kg以7.5ml/kg的體積施用單劑量的奧沙利鉑。載體對照組接受腹膜內7.5ml/kg的5％葡萄糖溶液。行為部分：通過在施用單劑量的載體或奧沙利鉑后測量PWT來確定機械性異常性疼痛的出現。在連續兩天(第-1天和第0天)測定PWT，然后在第1天、第3天和/或第7天重新評估。大鼠：在試驗前將動物置于凸起的金屬網上的單獨有機玻璃盒中至少40分鐘。從最小力(約1g)的細絲開始，將每根細絲垂直地施加到爪的腹側表面的中心，直到輕微彎曲6秒。如果動物在刺激時縮回或抬起爪子，則使用具有稍微低于測試的力的纖毛。如果沒有觀察到反應，則測試具有稍微更高的力的纖毛。將誘導可靠反應所需的最小量的力(5次試驗中3次為陽性)記錄為PWT的值。小鼠：在測試前將動物置于凸起的金屬網上的單獨的有機玻璃盒中30-40分鐘。以1秒開1秒關的方案依次施加一系列漸變的vonFrey纖毛(0.07、0.16、0.4、0.6和1g)，重復10次。將每根纖毛垂直地施加到爪的腹側表面的中心，直到它略微彎曲。施加于動物后爪以在10次試驗中誘導5次反應的力記錄為PWT。組織取樣：在實驗結束時，用包含異氟烷+氧氣的混合氣體麻醉動物，并通過斷頭術殺死動物。手術切除來自每側的坐骨神經的節段，在分析天平上稱重并記錄。將來自每側的坐骨神經分別置于2mlCorning小瓶中。組織在液氮中快速冷凍，然后在-80度儲存。統計分析：通過GraphpadPrism使用常規雙因素ANOVA方差分析來分析行為數據，“治療”作為受試者之間的效應，“天”作為受試者內的效應。使用Bonferroni方法進行事后分析。p值<0.05被認為是統計學顯著的。基因表達部分：切除嚙齒動物的坐骨神經并在液氮中快速冷凍。將組織在-80℃冷凍儲存或在干冰上儲存，直到處理用于CXCR2和CXCL1的RNA分析。ActB、GAPDH、HPRT1和MAPK6用作內部測試對照和標準品，并且NPY用作奧沙利鉑誘導的損傷的對照。使用Q-PCR測量以下基因。測試用于制備預擴增池。大鼠的具體測試基因符號Taqman測試IDActBRn00667869_m1CXCL1Rn00578225_m1CXCR2Rn00567841_m1GAPDHRn01775763_g1HPRT1Rn01527840_m1MAPK6Rn00581152_m1NPYRn01410145_m1小鼠的具體測試基因符號Taqman測試IDActBMm01205647_g1CXCL1Mm04207460_m1CXCR2Mm00438258_m1GAPDHMm99999915_g1HPRT1Mm01545399_m1MAPK6Mm00727050_s1NPYMm03048253_m1總RNA分離：對于每個組織樣品，根據制造商的說明，通過在RocheMagnaLyser上的GreenBead管(Roche)中的MagNAPureLC裂解緩沖液(Roche)中將組織勻漿制備一個RNA樣品，并使用RocheMagnaPureRNA分離系統(Roche)根據制造商的說明進行總RNA分離。將樣品以50μL等分試樣洗脫，并在-80℃儲存直至需要。RNA定量和完整性評估：根據制造商的說明，在LifeTechnologiesQubit上定量每個總RNA樣品。使用AgilentPico試劑盒(AgilentTechnologies)，根據制造商的說明，在Agilent2100Bioanalyser上評估總RNA樣品的代表性樣品的完整性。如果RIN為6或更多，則認為RNA是可接受的質量。第一鏈cDNA合成：使用SuperscriptVilo試劑盒(LifeTechnologies)從50ng的每種總RNA合成第一鏈cDNA。每個RNA用無RNase的水補足至11μL，并向每個RNA樣品中加入14μL主混合物。主混合物基于下表制成:組分體積5xViloRT緩沖液5μL10xVilo酶混合物2.5μL無核酸酶的水6.5μL最終容積RTmastermix14μL將樣品在DNA熱循環儀中在25℃培養10分鐘，在42℃培養60分鐘，然后在85℃培養5分鐘。合成后，將cDNA儲存在-20℃直至準備使用。預擴增：Taqman測試(LifeTechnologies)的預擴增池通過將10μL每種x20測試混合在一起而制備[共16種測試：4種感興趣的基因(大鼠)，4種管家基因(大鼠)]并稀釋至x0.2(通過加入840μLTE緩沖液(LifeTechnologies)]。各25μLcDNA等分試樣通過以下培養而擴增:試劑體積2xPreAmpMM25μL0.2X匯聚的測試混合物12.5μL使用以下循環條件:階段重復溫度時間酶活化(保持)1195℃10minsPCR(周期)21495℃30sec60℃4mins酶滅活99℃10mins將預擴增產物儲存在-20℃直到準備使用，且用0.1XTE(pH8.0)稀釋1:10，然后在TaqManOpenArray上運行。實時定量PCR：根據LifeTechnologies指南設置并運行QuantStudio開放陣列。將2X實時PCR主混合物(LifeTechnologies；cat：4462164)混合，并組合以下組分：組分1個樣品的體積2x開放陣列主混合物2.5μL水1.3μL將1.2μL每種預擴增的cDNA與3.8μL開放陣列主混合物混合，并置于Accufill384孔板中，通過AccufillTM系統分配到開放陣列上。OpenArray樣品跟蹤器軟件用于跟蹤樣品。開放陣列在QuantStudio上運行，并在QuantStudio上進行分析和質量控制，并將生成的文件導出到ArrayStudio進行數據分析。通過QuantStudio開放陣列評估大鼠坐骨神經中的CXCR2、CXCL1、NPY和CGRP的表達。ArrayStudio中的分析：使用OpenArray條形碼注釋QuantStudio.txt文件，刪除具有空目標名稱值的所有行，并且將其適當排序為ArrayStudio的格式。單獨的開放陣列.txt文件已上傳到ArrayStudio中。檢查“無逆轉錄”、“無模板對照”和“水空白”數據，并從最終分析中除去。對四種管家基因進行主成分分析(PCA)。在第一次PCA運行后去除異常值數據。在通過管家基因調整協方差的影響后，使用該模型估計每個基因和治療的平均log2(豐度)。選擇并運行全線性分析模型和分析因子。這產生了歸一化數據的匯總表、去除了異常值的匯總表、每個基因的系數和指示基因是否通過歸一化改進的P值。通過3因素主成分分析來分析這些數據，以檢查生物復制樣品聚集在一起。在每個模型和物種內通過單因素ANOVA方差分析來分析數據，以在每個時間點產生不同處理之間的倍數差值。計算平均差異不包含0的貝葉斯后驗概率。計算平均差異不包含0的貝葉斯后驗概率。如果概率大于0.95，則意味著平均差異顯著不同于0。分別比較每個組織。結果：在涉及奧沙利鉑的大鼠和小鼠實驗之間，各組之間的基線PWT沒有差異。從圖5(大鼠)和圖6(小鼠)可以看出，奧沙利鉑治療在兩種嚙齒動物物種中引起顯著的機械性異常性疼痛，如從第1天維持至第7天的PWT的顯著降低所表示的。從圖5可以看出，大鼠在單劑量的奧沙利鉑后產生機械性異常性疼痛。在第1、3和7天，奧沙利鉑組的PWT統計學下降。值為平均值±SEM。*P<0.05，***P<0.001，表示與載體組相比在相同時間點的顯著性，2因素ANOVA方差分析。第-2天、第-1天、第0天：n＝20/組；第1天：n＝5/組；第3天：n＝15/組；第7天：n＝10/組。從圖6中可以看出，小鼠在單次劑量的奧沙利鉑后產生機械性異常性疼痛。在第1、3和7天，奧沙利鉑組的PWT統計學下降。值為平均值±SEM。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，表示與載體組相比在相同時間點的顯著性，雙因素ANOVA方差分析。第-2天，第-1天，第0天：n＝20/組；第1天：n＝5/組；第3天：n＝15/組；第7天：n＝10/組。從圖7(大鼠)和圖8(小鼠)可以看出，在奧沙利鉑治療后第1天，在大鼠左坐骨神經中，奧沙利鉑治療后CXCR2和NPYmRNA的表達譜顯著升高，但在小鼠中不明顯。在兩種物種中在奧沙利鉑治療后，左側坐骨神經中的奧沙利鉑治療后CXCL1mRNA的表達譜沒有統計學差異。從圖7可以看出，在左側坐骨神經中，CXCR2及其配體CXCL1mRNA在注射奧沙利鉑后的早期(第1天)高度增加，如同NPYmRNA。值顯示為平均值。#表示在同一時間點奧沙利鉑和載體組之間的顯著性差異，在每個時間點n＝10，通過貝葉斯后驗概率>0.95評估。從圖8可以看出，在左側坐骨神經中，在奧沙利鉑注射后7天內，CXCR2或其配體CXCL1mRNA和NPYmRNA都不顯著增加。值顯示為平均值。#表示在同一時間點奧沙利鉑和載體組之間的顯著性差異，在每個時間點n＝10，通過貝葉斯后驗概率>0.95評估。總結：在單次奧沙利鉑給藥后，大鼠和小鼠都出現出穩健的機械性異常性疼痛。然而，CXCR2和NPYmRNA表達(在左坐骨神經中增加)的早期統計學顯著變化僅在大鼠中明顯。因此，選擇大鼠作為主要物種，其能夠探索藥理學抑制CXCR2受體對奧沙利鉑誘導的機械性異常性疼痛的作用。i)臨床前CXCR2拮抗劑對奧沙利鉑誘導的急性感覺損傷大鼠的作用動物：將60只成年雄性Sprague-Dawley大鼠(CharlesRiver，UK。230-300g)用于本研究。將動物在恒定溫度和濕度(溫度：21±1℃，光:暗周期為12:12小時)的受控環境中以3至5只每組飼養在有機玻璃籠中，隨意獲得食物和水。在開始實驗前，允許它們從運輸中恢復至少一周。通過濕磨法制備式(A)化合物的0.5mg/ml、2mg/ml和5mg/ml混懸液(分別針對5mg/kg，20mg/kg和50mg/kg給藥)，然后在1％甲基纖維素(MC)中超聲處理。每周制備制劑，并在避光保存于4℃。給藥體積為10ml/kg。在整個給藥期間連續攪拌化合物。在水中制備1％(1g/100ml水)的甲基纖維素(Sigma)，并置于攪拌器上直至完全溶解。載體處理的動物以每日兩次(b.i.d.)給藥1％MC，10ml/kgp.o。通過在5％葡萄糖(Baxter)中超聲處理制備作為2mg/ml溶液(針對12mg/kg)的奧沙利鉑(Tocrisbioscience)。制劑在給藥當天新鮮制備。給藥體積為6ml/kg。研究方案：研究方案示于表1中。在第0天注射一次奧沙利鉑，從第-1天至第6天每日兩次給予三個劑量的式(A)化合物。在第-2天、第-1天、第0天、第3天和第7天測試PWT。表1研究以下5組：誘導化療誘發的神經病：以6ml/kg的體積以12mg/kg腹膜內(i.p.)注射單劑量的奧沙利鉑。在使用前將奧沙利鉑溶于5％葡萄糖中至2mg/ml。使用施加到后爪上的一系列漸變的vonFrey纖毛以引發縮足反應(PWT，參見下文)來監測神經性疼痛的出現(其特征在于顯著的機械性異常性疼痛)，。載體對照組接受腹膜內6ml/kg的5％葡萄糖溶液。以相同的測試順序注射動物。在試驗前將動物置于凸起的金屬網上的單獨有機玻璃盒中至少40分鐘。從最小力(約1g)的細絲開始，將每根細絲垂直地施加到爪的腹側表面的中心，直到輕微彎曲，保持6秒。如果動物在刺激時縮回或抬起爪子，則使用具有稍稍低于測試的力的纖毛。如果沒有觀察到反應，則測試具有稍微更高的力的纖毛。將誘導可靠反應所需的最小量的力(5次試驗中3次為陽性)記錄為PWT的值。在連續三天(第-2天，第-1天和第0天)評估PWT，并在施用單劑量的載體或奧沙利鉑之后在第3天和第7天重新評估，以監測機械性異常性疼痛的出現。第-2天和第-1天是在給予奧沙利鉑之前的基線，第0天是在奧沙利鉑注射當天的讀數。統計分析：通過雙因素重復量數ANOVA方差分析來分析行為數據，“治療”作為受試者之間的效應，“天”作為受試者內的效應。事后分析使用計劃的成對比較進行[InVivoStat；Clark等人，J.Psychopharmacology，26(8)1136-1142(2012)]。結果：注射奧沙利鉑導致機械性異常性疼痛的出現，其使用PWT的von-Frey評估測量。在奧沙利鉑之前用式(A)化合物(在第-1天開始)的預防性治療導致預防奧沙利鉑誘導的機械性異常性疼痛的出現。這在奧沙利鉑治療后第3天的所有劑量水平和在奧沙利鉑治療后第7天的20和50mg/kgbid的情況下是明顯的。如圖9所示，奧沙利鉑的推注導致明顯的機械性異常性疼痛的出現。在第3天和第7天，與Veh/Veh組相比，PWT顯著降低。預防性的式(A)化合物給藥抑制了通過奧沙利鉑治療建立的機械性異常性疼痛，PWT與Oxa/Veh組相比顯著增加。數值為平均值±SEM。*P<0.05，**P<0.01和***P<0.001指示與Oxa/Veh組相比的顯著性，++p<0.01和+++p<0.001指示與Veh/Veh組相比的顯著性，2因素ANOVA方差分析。Oxa＝奧沙利鉑；Veh＝載體；5、20和50mpk＝式(A)化合物的劑量水平，以mg/kgbidpo。總結：單次推注奧沙利鉑導致大鼠機械性異常性疼痛的出現。用式(A)化合物的預防性治療減輕了機械性異常性疼痛的出現。在第3天，與奧沙利鉑和載體組相比，式(A)化合物的所有三個劑量水平(5、20和50mg/kgp.o.b.i.d)都降低了機械異常性疼痛。到第7天，僅在以20和50mg/kgp.o.b.i.d接受式(A)化合物的動物中仍然存在機械性異常性疼痛的穩健降低。j)臨床前CXCR2拮抗劑對重復給藥奧沙利鉑誘導的感覺損傷大鼠的作用已經確認化療治療引起人和嚙齒類動物中神經的傳導潛能的顯著降低[Renn等人，Pain，26；7:29，(2011)]。因此，為了補充研究奧沙利鉑誘導的行為超敏性，進行坐骨神經的電生理研究以進一步探測CXCR2機理參與人類經歷的化療誘導的周圍神經病變的神經生理學性質。將雄性Sprague-Dawley大鼠(109-167g，周齡)在恒定溫度和濕度(溫度：25±3℃，光:暗周期為12:12小時)的控制環境中以3只一組圈養在籠中，隨意獲得食物(25g/大鼠/天的LabDiet5053)和水。化合物制備：將式(A)化合物制備為在1％甲基纖維素(MC)(w/v)中的2mg/mL懸浮液。在水中制備1％(w/v)(1g/100mL水)的MC(Sigma目錄號423238)，并置于攪拌器上直至完全溶解。該制劑每6-8天制備一次，每次400-700mL，并在4℃避光儲存。所用的給藥體積為10mL/kg，得到20mg/kgp.o.劑量。載體處理的動物以10mL/kgp.o每日兩次(b.i.d.)給藥1％MCw/v。將奧沙利鉑(Selleckchem)加入5％葡萄糖(SigmaAldrich)溶液中，超聲處理30分鐘直至溶解。在每次注射前制備新鮮溶液。對照載體動物用5％w/v葡萄糖以5ml/kg處理。在milli-Q水中制備5％(w/v)(5g/100mL水)的葡萄糖(SigmaAldrichCat#G7021)，并置于攪拌器上直至完全溶解。使用無菌0.2μm過濾器(ThermoscientificCat#595-4520)過濾，并在室溫儲存。用SpragueDawley大鼠的治療方案：對雄性SpragueDawley大鼠每天用式(A)化合物(20mg/kgp.o.b.i.d.)或其載體(1％甲基纖維素10ml/kgp.o.b.i.d.)給藥4周(28天)，開始于第0天。每天早晨進行一次給藥，隨后約8小時后在晚上進行第二次給藥。在第一天用式(A)化合物預處理后二十四小時，在短暫的3％異氟烷(Abbott)麻醉下給動物施用奧沙利鉑(4mg/kgi.p.)或其載體(葡萄糖溶液5％w/v：1ml/kgi.p.)。在早晨用式(A)化合物或載體預處理90分鐘后，用奧沙利鉑或其載體的這種治療每周重復兩次持續4周(在第1、3、8、10、15、17、22、24天)。因此，將大鼠隨機分配到以下組：體重跟蹤：在第1、3、9、11、16、18、23和25天，每周兩次測量大鼠的體重，持續4周。第5周的體重值表示當進行傳導速度研究時從第29、30和31天的每個組的組合數據。進行這些研究的科學家不知道動物接受的治療，直到所有數據分析完成。使用GraphpadPrism軟件分析數據。它們以平均值±SEM表示。通過雙因素ANOVA方差分析，隨后通過Dunnett檢驗測定參數差異的統計顯著性。p值<0.05被認為是統計學顯著的。坐骨神經傳導速度的測量：在用式(A)的化合物或其載體治療4周后，在第29天至第31天之間在右坐骨神經中測量神經傳導速度。在這些天的每一天，平衡治療組，進行這些研究的科學家不知道動物接受的治療，直到所有數據分析完成。在測量傳導速度之后，收集大鼠的左坐骨神經用于組織學研究(參見下面的方法)。用水合氯醛(350mg/kg，3.5mL/kg，腹膜內)麻醉大鼠。當達到麻醉的手術深度時，小心暴露坐骨切口上方的肌肉和右后肢踝部。仔細鑒定右坐骨神經，并通過放置在第二和第三手指之間的電極記錄動作電位，如Jamieson等人，Br.J.Cancer,88(12):1942-7(2003)所述，以及在坐骨切口和踝處經由鉑絲電極電刺激神經(5V，0.5s，單波脈沖)，來測量傳導速度。測量坐骨切口和踝之間的長度。使用具有CED1902mkIV可編程放大器/濾波器和DS2A-MK.II單獨刺激器-恒定電壓(CambridgeElectronicDesignLimited)的CEDMicro1401-3科學數字數據記錄器記錄動作電位，數據通過CEDSignal(Windows軟件版本6)(CambridgeElectronicDesignLimited)分析。神經傳導速度被計算為坐骨切口和踝之間的長度除以各刺激位點處的時間潛伏期之間的差異[潛伏期(坐骨切口)–潛伏期(踝)]。使用GraphpadPrism軟件分析數據。它們以平均值±SEM表示。通過單因素ANOVA，隨后通過Tukey檢驗測定參數差異的統計學顯著性。p值<0.05被認為是統計學顯著的。坐骨神經的組織學評估：在傳導速度的測量之后，收集大鼠的左坐骨神經用于組織學研究。進行這些研究的科學家不知道動物接受的治療，直到所有數據分析完成。定位并小心地切除左坐骨神經(遠端)的1cm部分。將神經在4％多聚甲醛(SigmaAldrich目錄號：P6148)中固定過夜，然后用0.2％甘氨酸(SigmaAldrich目錄號：15527)固定過夜。用磷酸鹽緩沖鹽水[磷酸二氫鈉(SigmaAldrich目錄號：04270)]；磷酸氫二鈉(SigmaAldrich目錄號：30427)；氯化鈉(BDH目錄號：7647-14-5)]洗滌后，將坐骨神經在2％四氧化鋨中后固定2小時。在從30％至70％乙醇脫水后，將神經樣品包埋在石蠟中，將神經切成2μm厚度的切片(使用Leica切片機)，安裝在載玻片(SuperiorMaerienfeld)上，并在58℃風干。然后將切片浸入100％二甲苯(BDH；CAS號1330-20-7)中，隨后用100％至70％乙醇(Merck；CAS號：64-17-5)，然后用100％Milli-Q水再水合。然后將神經在1％甲苯胺藍中染色，并在用水和75％乙醇洗滌后，用蓋玻片固定載玻片。選擇第一清晰和完整的神經部分用于分析。使用自動立式復合顯微鏡(LeicaDM6000B)捕獲圖像。使用INCellAnalyzer6000(GEHealthcare)自動測量坐骨神經(包括髓鞘)的神經纖維的內部的橫截面積和整體面積，如DiCesareMannelli等人，J.Pain，14(12)：1585-600(2013)中所述。然后計算坐骨神經的神經纖維的內部面積與整體面積的比率作為神經的髓鞘的厚度的指示。使用GraphpadPrism軟件分析數據。它們以平均值±SEM表示。通過單因素ANOVA方差分析，隨后通過Tukey檢驗測定參數差異的統計學顯著性。p值<0.05被認為是統計學顯著的。結果：使用慢性大鼠CIPN模型，檢查體重、坐骨神經髓鞘的傳導速度和厚度。在第29天、第30天和第31天測量神經傳導速度。在第29、30或31天之間的每個治療組中未觀察到傳導速度的差異。相比載體-處理的對照(40.28±1.30m/s)，奧沙利鉑治療的大鼠顯示出在坐骨切口和腳踝之間顯著更低的傳導速度(35.99±0.59m/s)(p<0.05)。式(A)化合物治療顯著地防止大鼠中奧沙利鉑誘導的傳導速度降低(40.83±1.45m/s)(p<0.05)(圖10)。在載體/奧沙利鉑處理的和式(A)的化合物/奧沙利鉑處理的組之間沒有觀察到體重的顯著性差異(圖11)。使用組織學染色研究式(A)化合物對坐骨神經髓鞘厚度的影響。來自所有組的神經纖維的代表性橫截面顯示在圖12中。對神經的髓鞘的厚度進行定量。從圖13，與載體對照(0.13±0.01)相比，經奧沙利鉑處理的大鼠顯示出髓鞘的顯著變薄(由更高的神經纖維的內部面積/整體面積的比例指示(0.23±0.02))(p<0.001)。與載體/奧沙利鉑處理相比，向經奧沙利鉑處理的大鼠口服施用式(A)化合物顯示出坐骨神經的髓鞘厚度增加，如通過較低的神經纖維的內部面積/整體面積比例指示(0.17±0.01)(p<0.05)。因此，用式(A)化合物的預防性治療抑制了由奧沙利鉑治療誘導的坐骨神經傳導速度受損。圖10：值是平均值±SEM。*P<0.05表示載體/奧沙利鉑與載體/載體組相比的顯著性，#p<0.05表示式(A)的化合物/奧沙利鉑與載體/奧沙利鉑組相比的顯著性，單因素ANOVA方差分析。載體/載體，n＝13；載體/奧沙利鉑，n＝12；式(A)的化合物/奧沙利鉑，n＝12。在圖11中顯示，式(A)的化合物不影響奧沙利鉑誘導的體重變化。在2周時間點，在載體/載體和載體/奧沙利鉑治療組之間觀察到體重的顯著性差異。每周兩次測量體重，持續4周。第5周的體重值表示當進行傳導速度研究時從第29、30和31天的每個組的組合數據。在研究的任何時間點，載體/奧沙利鉑和式(A)化合物/奧沙利鉑治療組之間沒有發現顯著性差異。數值為平均值±SEM。***p<0.001指示與載體/奧沙利鉑相比載體/載體的顯著性，###p<0.001指示與化合物D/奧沙利鉑處理的大鼠相比載體/載體的顯著性；雙因素ANOVA方差分析，然后是Dunnett檢驗，n＝13(載體/載體)，n＝12(載體/奧沙利鉑)，n＝12(化合物D/奧沙利鉑)。圖12和13顯示式(A)的化合物防止奧沙利鉑使坐骨神經的髓鞘厚度減小。圖12示出了使用光學顯微鏡在40x放大率下拍攝的來自每組的圖像。圖13圖示了神經纖維的髓鞘的厚度。評價內神經纖維的橫截面積與坐骨神經整個神經纖維(包括髓鞘)的總橫截面積的比率。奧沙利鉑減少大鼠坐骨神經的髓鞘的厚度，通過用式(A)的化合物處理逆轉該效應。數值為平均值±SEM。***p<0.001指示與載體/載體組相比的載體/奧沙利鉑的顯著性，#p<0.05指示與載體/奧沙利鉑處理的大鼠相比的化合物D/奧沙利鉑的顯著性；單因素ANOVA方差分析隨后是Tukey檢驗，n＝12(載體/載體)，n＝12(載體/奧沙利鉑)，n＝12(式(A)的化合物/奧沙利鉑)。總結：奧沙利鉑誘導大鼠的周圍神經病變，通過神經傳導速度和神經髓鞘的厚度的降低評估。用式(A)化合物的預處理防止了奧沙利鉑治療的大鼠中坐骨神經傳導速度的降低，但不影響奧沙利鉑治療誘導的體重減少。式(A)的化合物還改善由奧沙利鉑誘導的坐骨神經的髓鞘的變化。這些研究的結果表明，式(A)化合物防止在大鼠中奧沙利鉑誘導的行為特征的變化(該行為特征為對機械刺激的超敏反應)、坐骨神經的髓鞘狀態和神經傳導速度的減慢。這些是患者中化療誘導的周圍神經病變的特征。k)機理臨床研究的證明打算進行機理臨床研究的證明以進一步證明式(A)化合物在治療人類患者的CIPN中的作用。可能的研究設計如下：臨床研究設計將是：雙盲、安慰劑對照的平行組，機理研究證據在患有結腸直腸癌的患者中，計劃由含奧沙利鉑的化療治療開始。該項目的概況可能包括受試者每兩周出席抗癌化療的臨床中心。在每次奧沙利鉑給藥之前，將根據臨床中心程序進行常規實驗室檢查。指示受試者在奧沙利鉑iv輸注前兩天開始服用式(A)化合物。在前六次奧沙利鉑輸注期間，將指導合格的受試者每天一次在早晨服用一劑的式(A)化合物(x片劑xmg或安慰劑)，持續7天。設計式(A)化合物的給藥方案以在奧沙利鉑的全身峰值期間實現CXCR2拮抗劑最大效應。在該第一研究中，間歇給藥將通過延長與奧沙利鉑的共同給藥來最大化治療功效并最小化任何副作用的可能性。在第六周期結束后，受試者將停止用式(A)化合物或安慰劑的治療，并將繼續臨床上合適的化療方案。在前7個化療周期期間，在臨床中心時，評估將包括安全性、耐受性和藥代動力學。在基線和在第1、3、5、6和7周期的奧沙利鉑輸注后24-48小時之間進行關于神經興奮性概況的臨床評估和主要電生理學測量。對臨床中心的所有隨訪將包括使用NCI-CTCv4和總神經病評分和亞組[TNSc；CavalettiG.F.B.，J.Peripher.Nerv.Syst.，Sep.，12(3)，210-5(2007)；CornblathDR，Neurology，53(8)，1660(1999)]的臨床評估。將根據護理標準監測腫瘤學措施。主要措施包括：·測量的感覺興奮性(超興奮性％)的變化，其作為化療周期1的給藥前和在最后的式(A)的化合物/安慰劑給藥后的化療周期前的差異。式(A)化合物的安全性：監測不良事件、臨床體征、安全實驗室和生命體征。·式(A)的化合物的PK。式(D)化合物：1-(4-氯-3-((1,4-二甲基哌啶-4-基)磺酰基)-2-羥基苯基)-3-(2-氯-3-氟苯基)脲三氟乙酸鹽向6-氨基-3-氯-2-[(1,4-二甲基-4-哌啶基)磺酰基]苯酚二鹽酸鹽(中間體D1)(0.30g)在1,4-二噁烷(10mL)和水(1mL)中的溶液中添加NaHCO3(0.193g)。將混合物在室溫攪拌10分鐘。然后添加2-氯-1-氟-3-異氰酸酯基苯(0.131g)。攪拌再持續10分鐘。然后，該反應混合物用水(50mL)稀釋，用EA(2×50mL)萃取。該溶液然后用鹽水洗滌，用無水Na2SO4干燥且通過MDAP純化以得到標題產物(130mg)。中間體D1：6-氨基-3-氯-2-((1,4-二甲基哌啶-4-基)磺酰基)苯酚二鹽酸鹽步驟1：在-78℃向4-((2-(叔丁基)-6-氯苯并[d]噁唑-7-基)磺酰基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(0.35g)(中間體D2)在四氫呋喃(THF)(25mL)中的溶液中添加正丁基鋰(0.383mL，2.0M在環己烷中)。將混合物在-78℃攪拌1h。然后添加MeI(0.048mL)。攪拌在-78℃持續4h。然后，該反應用NH4Cl水溶液淬滅，用EA萃取(2×50mL)。該溶液然后用鹽水洗滌，用無水Na2SO4干燥，且濃縮以得到4-((2-(叔丁基)-6-氯苯并[d]噁唑-7-基)磺酰基)-4-甲基哌啶-1-甲酸叔丁酯(0.4g)。步驟2：向4-((2-(叔丁基)-6-氯苯并[d]噁唑-7-基)磺酰基)-4-甲基哌啶-1-甲酸叔丁酯(0.35g)在二氯甲烷(DCM)(20mL)中的溶液中添加TFA(0.572mL)。將混合物在室溫攪拌過夜。所得溶液真空濃縮以得到2-(叔丁基)-6-氯-7-((4-甲基哌啶-4-基)磺酰基)苯并[d]噁唑三氟乙酸鹽(0.35g)。步驟3：向2-(叔丁基)-6-氯-7-((4-甲基哌啶-4-基)磺酰基)苯并[d]噁唑三氟乙酸鹽(0.35g)在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(10mL)中的溶液中添加AcOH(0.054mL)和甲醛(0.788mL)。然后將反應混合物冷卻至0℃且攪拌10分鐘。然后分批添加三乙酰氧基硼氫化鈉(0.6g)。反應完成后，將混合物用飽和NaHCO3(20mL)水溶液淬滅且用EA萃取(2×50mL)。該溶液然后用鹽水洗滌，用無水Na2SO4干燥，且濃縮以得到2-(叔丁基)-6-氯-7-((1,4-二甲基哌啶-4-基)磺酰基)苯并[d]噁唑(0.3g)。步驟4：向2-(叔丁基)-6-氯-7-((1,4-二甲基哌啶-4-基)磺酰基)苯并[d]噁唑(0.3g)在1,4-二噁烷(10mL)和水(10mL)中的溶液中添加HCl(0.640mL，37％在水中)。將混合物在120℃加熱3小時。然后，所得溶液真空濃縮以得到標題產物(0.3g)，將其用于下一步而不用進一步純化。中間體D2：4-((2-(叔丁基)-6-氯苯并[d]噁唑-7-基)磺酰基)哌啶-1-甲酸叔丁酯步驟1：向4-羥基哌啶-1-甲酸叔丁酯(10.0g)在DCM(100mL)中的溶液中添加TEA(13.9mL)，然后在冰浴中添加MsCl(4.7mL)。將混合物在室溫攪拌4小時。添加水(100mL)。分離有機層，用硫酸鈉干燥，過濾且濃縮以得到4-((甲基磺酰基)氧基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(13.9g)，其為白色固體。MS(ES+)m/z302(MNa+)。步驟2：向2-(叔丁基)-6-氯苯并[d]噁唑-7硫醇鈉(12.0g)和4-((甲基磺酰基)氧基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(13.9g)在DMF(100mL)中的溶液中添加碳酸鉀(6.3g)。將混合物在80℃攪拌2小時。添加EA(200mL)。有機相用鹽水洗滌(4×200mL)。合并的有機層用硫酸鈉干燥，過濾且濃縮以得到4-((2-(叔丁基)-6-氯苯并[d]噁唑-7-基)硫基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(19.3g)，其為黃色油狀物。MS(ES+)m/z369(M-t-Bu+H+H+)。步驟3：在0℃向4-((2-(叔丁基)-6-氯苯并[d]噁唑-7-基)硫基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(19.3g)在DCM(50mL)中的溶液中添加mCPBA(20.4g)。在室溫攪拌過夜后，將混合物用NaHCO3水溶液和Na2S2O3水溶液淬滅，然后用EA萃取(2×150mL)。將合并的有機層洗滌，干燥且濃縮。粗物質通過在甲醇/H2O中重結晶純化以得到4-((2-(叔丁基)-6-氯苯并[d]噁唑-7-基)磺酰基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(14.0g)。MS(ES+)m/z479(MNa+)。式(E)化合物：(R)-1-(4-氯-2-羥基-3-((4-甲基四氫-2H-吡喃-4-基)磺酰基)苯基)-3-(2-氯環戊-2-烯-1-基)脲向6-氨基-3-氯-2-((4-甲基四氫-2H-吡喃-4-基)磺酰基)苯酚鹽酸鹽(50mg)(中間體E1)在吡啶(5mL)中的溶液中添加新鮮的(R)-1-氯-5-異氰酸酯基環戊-1-烯(中間體E2，0.03M在甲苯中，5mL)且所得混合物在室溫攪拌過夜。將混合物用乙醇(5mL)淬滅且在減壓下濃縮。殘余物用MDAP純化(堿性條件)以得到標題化合物(34mg)；1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm10.36(br.s.，1H)，8.39(d，J＝8.8Hz，1H)，8.20(s，1H)，7.35(d，J＝8.8Hz，1H)，7.13(d，J＝9.0Hz，1H)，5.96-6.02(m，1H)，4.69-4.80(m，1H)，3.84(dd，J＝11.7，4.4Hz，2H)，3.49(t，J＝11.2Hz，2H)，2.22-2.46(m，3H)，2.04(td，J＝12.5，5.1Hz，2H)，1.61-1.74(m，1H)，1.58-1.61(m，1H)，1.54-1.58(m，1H)，1.50(s，3H)；MS(ES+)m/z449(MH+)。中間體E1：6-氨基-3-氯-2-((4-甲基四氫-2H-吡喃-4-基)磺酰基)苯酚鹽酸鹽步驟1：向四氫-2H-吡喃-4-醇(10.0g)在DCM(200mL)中的溶液中添加TEA(12.9g)和甲烷磺酰氯(11.3g)。將混合物在0℃攪拌1小時，然后用H2O洗滌。有機層用Na2SO4干燥且濃縮以得到四氫-2H-吡喃-4-基甲磺酸酯(15.5g)。步驟2：向2-(叔丁基)-6-氯苯并[d]噁唑-7-硫醇(18.0g)和Cs2CO3(12.1g)在乙腈(5mL)中的溶液中添加四氫-2H-吡喃-4-基甲磺酸酯(14.8g)。將混合物在90℃攪拌16小時。冷卻至室溫后，將混合物濃縮。殘余物在EA(100mL)和H2O(100mL)之間分配。將有機層干燥且濃縮以得到2-(叔丁基)-6-氯-7-((四氫-2H-吡喃-4-基)硫基)苯并[d]噁唑(24.0g)。MS(ES+)m/z326(MH+)。步驟3：向2-(叔丁基)-6-氯-7-((四氫-2H-吡喃-4-基)硫基)苯并[d]噁唑(24.0g)在DCM(1000mL)中的溶液中添加mCPBA(31.8g)。將混合物在15℃攪拌2小時，然后用Na2SO3水溶液淬滅。將pH調節至～7。將有機層干燥且濃縮以得到2-(叔丁基)-6-氯-7-((四氫-2H-吡喃-4-基)磺酰基)苯并[d]噁唑(18.0g)。步驟4：在-78℃在氮氣氛向2-(叔丁基)-6-氯-7-((四氫-2H-吡喃-4-基)磺酰基)苯并[d]噁唑(5.0g)在THF(50mL)中的溶液中添加BuLi(2.5M在己烷中，6.2mL)。將混合物在-78℃攪拌45分鐘。添加MeI(2.2g)。將反應混合物在-78℃攪拌1小時，然后用NH4Cl水溶液淬滅。將有機層干燥且濃縮。殘余物通過柱色譜法純化以得到2-(叔丁基)-6-氯-7-((4-甲基四氫-2H-吡喃-4-基)磺酰基)苯并[d]噁唑(4.8g)。MS(ES+)m/z372(MH+)。步驟5：向2-(叔丁基)-6-氯-7-((4-甲基四氫-2H-吡喃-4-基)磺酰基)苯并[d]噁唑(1.0g)在1,4-二噁烷(10mL)中的溶液中添加HCl水溶液(37％，10mL)。在110℃回流4小時后，將混合物濃縮以得到標題化合物(1.0g)，其為灰色固體。MS(ES+)m/z306(MH+)。中間體E2：(R)-1-氯-5-異氰酸酯基環戊-1-烯步驟1：向環戊-2-烯酮(1.2g)在甲醇(10mL)中的溶液中添加過氧化氫溶液(30％，0.5g)。所得混合物在室溫攪拌過夜。添加冷卻水(30mL)且所得混合物用飽和NaHCO3溶液中和。水層用DCM萃取(2×100mL)。合并的有機層用Na2SO4干燥，過濾且真空濃縮以得到6-氧雜雙環[3.1.0]己-2-酮(1.3g)，其為黃色油狀物。步驟2：向6-氧雜雙環[3.1.0]己-2-酮(25g)在甲醇(10mL)和水(3mL)中的溶液中添加氯化鈰(III)七水合物(95g)。所得混合物在70℃攪拌1小時。添加冷卻水(30mL)且所得混合物用飽和NaHCO3溶液中和。水層用DCM萃取(2×100mL)。合并的有機層用Na2SO4干燥，過濾且真空濃縮以得到2-氯環戊-2-烯酮(29g)，其為黃色油狀物。步驟3：向2-氯環戊-2-烯酮(600mg)在甲醇(20mL)中的溶液中添加氯化鈰(III)七水合物(1918mg)和NaBH4(195mg)。所得混合物在室溫攪拌1小時。添加冷水(30mL)且所得混合物用飽和NaHCO3溶液中和。水層用DCM萃取(2×100mL)。合并的有機層用Na2SO4干燥，過濾且真空濃縮以得到2-氯環戊-2-烯醇(400mg)，其為黃色油狀物。步驟4：在0℃向2-氯環戊-2-烯醇(20.0g)和異二氫吲哚-1,3-二酮(37.2g)在THF(200mL)中的溶液中添加Ph3P(66.4g)和DIAD(49.2mL)。將混合物在室溫攪拌過夜。將溶劑真空去除且殘余物通過柱色譜法純化(用PE:EA＝10:1洗脫)以得到2-(2-氯環戊-2-烯-1-基)異二氫吲哚-1,3-二酮(18.0g)，其為黃色固體。MS(ES+)m/z248(MH+)。步驟5：2-(2-氯環戊-2-烯-1-基)異二氫吲哚-1,3-二酮(14g)通過SFC純化以得到(R)-2-(2-氯環戊-2-烯-1-基)異二氫吲哚-1,3-二酮(5.0g)，其為白色固體，和(S)-2-(2-氯環戊-2-烯-1-基)異二氫吲哚-1,3-二酮(5.5g)，其為黃色油狀物。(R)-2-(2-氯環戊-2-烯-1-基)異二氫吲哚-1,3-二酮：手性HPLC(柱：AD-H(250*4.6mm，5um)；流動相：MeOH/CO2＝15％；流速：3.0ml/min；溫度：40℃)：tR＝2.54分鐘，ee％＝100％；1H-NMR(400MHz，CDCl3)δppm7.74-7.98(m，4H)，6.04(d，J＝2.2Hz，1H)，5.32(dd，J＝9.3，1.9Hz，1H)，2.77(ddd，J＝9.4，8.0，3.0Hz，1H)，2.41-2.62(m，2H)，2.22-2.39(m，1H)；(S)-2-(2-氯環戊-2-烯-1-基)異二氫吲哚-1,3-二酮：手性HPLC(柱：AD-H(250*4.6mm，5um)；流動相：MeOH/CO2＝15％；流速：3.0ml/min；溫度：40℃)：tR＝3.04分鐘，ee％＝100％；1H-NMR(400MHz，CDCl3)δppm7.32-8.36(m，4H)，6.03(d，J＝2.2Hz，1H)，5.31(dd，J＝9.3，1.8Hz，1H)，2.77(ddd，J＝9.4，8.0，3.0Hz，1H)，2.40-2.64(m，2H)，2.32(ddd，J＝14.2，8.7，3.8Hz，1H)。步驟6：向(R)-2-(2-氯環戊-2-烯-1-基)異二氫吲哚-1,3-二酮(3.5g)在乙醇(100mL)中的溶液中添加肼.H2O(0.7mL)。回流3小時后，將反應混合物冷卻至室溫。將沉淀過濾且用EtOH(10mL)沖洗。將濾液濃縮以去除一半溶劑。向溶液添加醚中的HCl(1M，20mL)且濃縮以得到(R)-2-氯環戊-2-烯胺的鹽酸鹽(2.0g)。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm8.53(s，3H)，6.22(s，1H)，4.19(d，J＝5.8Hz，1H)，2.49-2.54(m，1H)，2.26-2.45(m，2H)，1.90-2.04(m，1H)。步驟7：向(R)-2-氯環戊-2-烯胺鹽酸鹽(600mg)在甲苯(15mL)中的溶液中添加碳酸二(三氯甲基)酯(694mg)。將混合物在120℃攪拌4小時。混合物然后冷卻至室溫以得到(R)-1-氯-5-異氰酸酯基環戊-1-烯的甲苯溶液。該溶液應每次新鮮合成。式(F)的化合物：(R)-1-(3-(叔丁基磺酰基)-4-氰基-2-羥基苯基)-3-(2-甲基環戊-2-烯-1-基)脲向4-氨基-2-(叔丁基磺酰基)-3-羥基芐腈(中間體F1，450mg)在吡啶(20mL)中的溶液中添加新鮮的在甲苯(20mL)中的(R)-5-異氰酸酯基-1-甲基環戊-1-烯(中間體F2，327mg)。將反應混合物在室溫攪拌過夜。將混合物用水(5mL)淬滅且濃縮。殘余物用MDAP純化(酸性條件)以得到(R)-1-(3-(叔丁基磺酰基)-4-氰基-2-羥基苯基)-3-(2-甲基環戊-2-烯-1-基)脲(120mg)。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm10.13(br.s.，1H)，8.51-8.64(m，2H)，7.60(d，J＝8.6Hz，1H)，7.34(d，J＝8.3Hz，1H)，5.52(s，1H)，4.54(d，J＝6.8Hz，1H)，2.11-2.37(m，3H)，1.66(s，3H)，1.46-1.60(m，1H)，1.30-1.46(m，9H)；MS(ES+)m/z378(MH+)。中間體F1：4-氨基-2-(叔丁基磺酰基)-3-羥基芐腈步驟1：該反應以五批次進行(各600mg)微波合成，然后組合純化：將2-(叔丁基)-7-(叔丁基磺酰基)-6-氯苯并[d]噁唑(中間體F3，0.6g)和氰化銅(I)(1.6g)在NMP(4mL)中的混合物在180℃在微波中攪拌90分鐘。冷卻后，合并5個批次，且用EA(100mL)和水(100mL)稀釋。過濾后，分離有機層，洗滌，干燥，過濾且濃縮。殘余物通過柱色譜法純化(用PE:EA＝1:0至7:3洗脫)以得到2-(叔丁基)-7-(叔丁基磺酰基)苯并[d]噁唑-6-甲腈(1.0g)。MS(ES+)m/z321(MH+)。步驟2：向2-(叔丁基)-7-(叔丁基磺酰基)苯并[d]噁唑-6-甲腈(1.0g)在乙醇(25mL)和水(25mL)中的溶液中添加氫氧化鈉(0.3g)。所得混合物在60℃攪拌1小時，然后在減壓下濃縮。殘余物用水(50mL)稀釋，用檸檬酸水溶液酸化至pH＝6，且用EA萃取(2×50mL)。將合并的有機層洗滌，干燥，過濾且濃縮以得到N-(3-(叔丁基磺酰基)-4-氰基-2-羥基苯基)特戊酰胺(1.1g)。MS(ES+)m/z361(MH+)。步驟3：向N-(3-(叔丁基磺酰基)-4-氰基-2-羥基苯基)特戊酰胺(1.2g)在THF(30mL)中的溶液中添加DMAP(0.04g)和Boc2O(1.6mL)。將混合物在60℃攪拌2小時。向混合物添加肼.H2O(1.6mL)。所得混合物在室溫攪拌過夜，用水(50mL)稀釋，且用EA萃取(2×100mL)。將合并的有機層洗滌，干燥，過濾且濃縮。殘余物通過柱色譜法純化(用PE:EA＝1:0至7:3洗脫)以得到(3-(叔丁基磺酰基)-4-氰基-2-羥基苯基)氨基甲酸叔丁酯(1.2g)。MS(ES+)m/z355(MH+)。步驟4：向(3-(叔丁基磺酰基)-4-氰基-2-羥基苯基)氨基甲酸叔丁酯(1.2g)在DCM(25mL)中的溶液中添加TFA(2.6mL)。所得混合物在室溫攪拌過夜。去除DCM。殘余物用NaHCO3水溶液(pH＝8)堿化，且用EA萃取(2×50mL)。將合并的有機層洗滌，干燥，過濾且濃縮以得到標題化合物(0.8g)。MS(ES+)m/z255(MH+)。中間體F2：(R)-5-異氰酸酯基-1-甲基環戊-1-烯步驟1：將2-甲基環戊烷-1,3-二酮(27.0g)、2-甲基丙-1-醇(62.5g)和TsOH(4.6g)在苯(500mL)中的溶液加熱至回流過夜。將溶劑真空去除且殘余物真空蒸餾以得到3-異丁氧基-2-甲基環戊-2-烯酮(34.5g)，其為黃色油狀物。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δppm3.92(d，J＝6.6Hz，2H)，2.53-2.70(m，2H)，2.32-2.52(m，2H)，2.04(dp，J＝13.3，6.7Hz，1H)，1.64(t，J＝1.5Hz，3H)，1.01(d，J＝6.7Hz，6H)；MS(ES+)m/z169(MH+)。步驟2：在0℃向3-異丁氧基-2-甲基環戊-2-烯酮(34.5g)在DCM(300mL)中的溶液中滴加DIBAL-H(1M在己烷中，250mL)。將反應混合物在該溫度攪拌90分鐘。該反應用水淬滅，然后在DCM(200mL)和HCl溶液(1M，100mL)之間分配。水層用DCM萃取(2×200mL)。合并的有機層用飽和碳酸氫鈉溶液(100mL)、鹽水(200mL)洗滌，用Na2SO4干燥，過濾且真空濃縮以得到2-甲基環戊-2-烯醇和2-甲基環戊-2-烯酮(27.0g)的混合物，其為黃色油狀物。步驟3：將2-甲基環戊-2-烯醇(27.0g)和氧化錳(IV)(5.0g)在乙醚(200mL)中的混合物在室溫攪拌過夜。將混合物過濾且濾液真空濃縮。殘余物真空蒸餾以得到2-甲基環戊-2-烯酮(16.5g)，其為無色油狀物。步驟4：向(R)-1-甲基-3,3-二苯基六氫吡咯并[1,2-c][1,3,2]氧雜氮雜硼雜環戊烯(oxazaborole)(1M在甲苯中，31.8mL)在無水THF(20mL)中的溶液中小心添加2-甲基環戊-2-烯酮(15.3g)和BH3(1M在THF中，111mL)。將混合物攪拌1小時。添加甲醇(150ml)且所得混合物用鹽水稀釋。水層用DCM萃取(2×200mL)。合并的有機層用Na2SO4干燥，過濾且真空濃縮以得到(S)-2-甲基環戊-2-烯醇(ee％未知，16.0g)，其為黃色油狀物。步驟5：在N2下向(S)-2-甲基環戊-2-烯醇(16.0g)和異二氫吲哚-1,3-二酮(36.0g)在THF(240mL)中的溶液中添加三苯基膦(77.0g)。將混合物冷卻至0℃。將二異丙基偶氮二甲酸酯(63.4mL)滴加至混合物。攪拌30分鐘后，將混合物在0℃攪拌過夜。去除溶劑且殘余物通過柱色譜法純化(用PE:EA＝10:1洗脫)以得到粗產物，其通過SFC純化以得到(R)-2-(2-甲基環戊-2-烯-1-基)異二氫吲哚-1,3-二酮(10.6g，>98％ee)，其為白色固體。手性HPLC(柱：AD-H，4.6*250mm，5μm，MeOH/CO2＝10％，柱溫度：40℃，CO2流速：2.7mL/min)：tR＝2.17分鐘，ee％：>98％；1H-NMR(400MHz，CDCl3)δppm7.83(dd，J＝5.4，3.1Hz，2H)，7.76-7.61(m，2H)，5.68(s，1H)，5.21(d，J＝7.4Hz，1H)，2.69(dd，J＝5.7，3.5Hz，1H)，2.42-2.30(m，2H)，2.22-2.12(m，1H)，1.61(s，3H)；MS(ES+)m/z228(MH+)。步驟6：向(R)-2-(2-甲基環戊-2-烯-1-基)異二氫吲哚-1,3-二酮(10.7g)在乙醇(150mL)中的溶液中添加肼.H2O(3.0mL)。回流3小時后，將反應混合物冷卻至室溫。將沉淀過濾且濾餅用EtOH(10mL)沖洗。向該濾液添加二噁烷中的HCl(4M，5mL)且將混合物濃縮。所得殘余物溶于水，然后冷凍干燥以得到(R)-2-甲基環戊-2-烯胺的鹽酸鹽(6.3g)，其為棕色固體，將其用于下一步而不用純化。步驟7：向(R)-2-甲基環戊-2-烯胺鹽酸鹽(420mg)在甲苯(30mL)中的溶液中添加三光氣(560mg)。所得混合物在110℃攪拌6小時。該混合物然后冷卻至室溫以得到(R)-5-異氰酸酯基-1-甲基環戊-1-烯的甲苯溶液。該溶液應每次新鮮合成。步驟8：在0℃向(R)-2-甲基環戊-2-烯胺鹽酸鹽(23mg)在DCM(3mL)和飽和NaHCO3水溶液(3mL)中的溶液中添加碳酸二(三氯甲基)酯(18mg)。在0℃至25℃將混合物攪拌2小時。分離所得兩層，且水層用DCM萃取(60mL)。合并的有機層用鹽水(15mL)洗滌，用Na2SO4干燥，過濾且在減壓下濃縮以得到(R)-5-異氰酸酯基-1-甲基環戊-1-烯(20mg)，其為白色固體，其直接用于下一步而不用進一步純化。MS(ES+)m/z141(MH+)(M：含氫氧化銨的脲衍生物)。中間體F3：2-(叔丁基)-7-(叔丁基磺酰基)-6-氯苯并[d]噁唑步驟1：向2-(叔丁基)-6-氯苯并[d]噁唑-7-硫醇(3.0g)在DMF(30mL)中的溶液中添加2-碘丙烷(2.1g)。將混合物在100℃攪拌2小時。冷卻后，去除溶劑。殘余物通過柱色譜法純化以得到2-(叔丁基)-6-氯-7-(異丙基硫基)苯并[d]噁唑(3.5g)。步驟2：在15℃向2-(叔丁基)-6-氯-7-(異丙基硫基)苯并[d]噁唑(3.5g)在DCM(40mL)中的溶液中添加mCPBA(5.3g)。將混合物在15℃攪拌48小時，然后用飽和Na2SO3溶液淬滅。有機層用Na2SO4干燥，過濾且濃縮。殘余物通過柱色譜法純化以得到2-(叔丁基)-6-氯-7-(異丙基磺酰基)苯并[d]噁唑(3.6g)。MS(ES+)m/z316(MH+)。步驟3：向2-(叔丁基)-6-氯-7-(異丙基磺酰基)苯并[d]噁唑(3.0g)在THF(10mL)中的溶液中添加LiHMDS(1M在THF中，31.7mL)。將混合物在-78℃攪拌10分鐘，然后添加碘甲烷(6.74g)。將混合物在-78℃攪拌10分鐘，然后用NH4Cl水溶液和HCl水溶液(10％)淬滅。將混合物用EA萃取。有機層用鹽水洗滌，用Na2SO4干燥且濃縮。粗產物通過柱色譜法純化以得到2-(叔丁基)-7-(叔丁基磺酰基)-6-氯苯并[d]噁唑(F3，2.8g)。MS(ES+)m/z330(MH+)。式(G)的化合物：1-(4-氯-2-羥基-3-((反-3-(吡咯烷-1-基)環丁基)磺酰基)苯基)-3-((R)-2-甲基環戊-2-烯-1-基)脲三氟乙酸鹽向6-氨基-3-氯-2-((反-3-(吡咯烷-1-基)環丁基)磺酰基)苯酚(中間體G1，80mg)在吡啶(5mL)中的溶液中滴加(R)-5-異氰酸酯基-1-甲基環戊-1-烯(中間體F2，74mg)在甲苯(5mL)中的溶液。將混合物在室溫攪拌過夜。將混合物濃縮且所得殘余物重溶于DMF(8mL)且通過MDAP純化以得到1-(4-氯-2-羥基-3-((反-3-(吡咯烷-1-基)環丁基)磺酰基)苯基)-3-((R)-2-甲基環戊-2-烯-1-基)脲的三氟乙酸鹽(21mg)，其為白色固體。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm10.44(br.s.，2H)，8.28(br.s.，1H)，8.18(d，J＝8.8Hz，1H)，7.13(d，J＝8.8Hz，1H)，7.10(d，J＝8.6Hz，1H)，5.52(s，1H)，4.49-4.62(m，2H)，4.02(quin，J＝7.5Hz，1H)，2.82-3.23(m，2H)，2.64-2.80(m，5H)，2.11-2.36(m，3H)，1.80-2.08(m，4H)，1.67(s，3H)，1.45-1.64(m，1H)；MS(ES+)m/z454(MH+)。中間體G1：6-氨基-3-氯-2-(((1r,3r)-3-(吡咯烷-1-基)環丁基)磺酰基)苯酚步驟1：在0℃在氮氣氛向順-3-((2-(叔丁基)-6-氯苯并[d]噁唑-7-基)磺酰基)環丁醇(中間體G2，3.0g)在DCM(30mL)中的溶液中添加TEA(2.6g)和甲烷磺酰氯(1.2g)。所得混合物在該溫度攪拌30分鐘。將混合物用NaHCO3水溶液淬滅，用DCM萃取(2×30mL)。洗滌合并的有機相，干燥且濃縮以得到甲磺酸順-3-((2-(叔丁基)-6-氯苯并[d]噁唑-7-基)磺酰基)環丁基酯(2.6g)。MS(ES+)m/z422(MH+)。步驟2：向甲磺酸順-3-((2-(叔丁基)-6-氯苯并[d]噁唑-7-基)磺酰基)環丁基酯(2.4g)在DMF(30mL)中的溶液中添加碳酸鉀(1.6g)和吡咯烷(0.5g)。將混合物在80℃攪拌過夜。添加水(20mL)。粗產物用EA萃取(3×80mL)。合并的有機相用鹽水洗滌，過濾且濃縮以得到粗產物，其通過柱色譜法純化(用PE:EA＝2:1洗脫)為2-(叔丁基)-6-氯-7-((反-3-(吡咯烷-1-基)環丁基)磺酰基)苯并[d]噁唑(2.0g)。MS(ES+)m/z397(MH+)。步驟3：將2-(叔丁基)-6-氯-7-((反-3-(吡咯烷-1-基)環丁基)磺酰基)苯并[d]噁唑(2.0g)溶于二噁烷的HCl中(50mL)和水(50mL)中。在120℃將反應混合物攪拌過夜。去除溶劑以得到粗產物(1.5g)，將其與相同反應的另一批次合并，該反應使用2-(叔丁基)-6-氯-7-((反-3-(吡咯烷-1-基)環丁基)磺酰基)苯并[d]噁唑(1.3g)作為起始原料。混合物通過制備型HPLC純化以得到標題化合物(614mg)。MS(ES+)m/z331(MH+)。中間體G2：順-3-((2-(叔丁基)-6-氯苯并[d]噁唑-7-基)磺酰基)環丁醇步驟1：向2-(叔丁基)-6-氯苯并[d]噁唑-7-硫醇(25.0g)在DMF(250mL)中的溶液中添加4-溴丁-1-烯(16.8g)，然后添加K2CO3(21.4g)。所得混合物在60℃攪拌4小時。冷卻后，將其倒入水(1L)中，且用EA萃取(2×200mL)。合并的有機層用水和鹽水洗滌。用Na2SO4干燥后，將有機層濃縮以得到7-(丁-3-烯-1-基硫基)-2-(叔丁基)-6-氯苯并[d]噁唑(27.6g)。MS(ES+)m/z296(MH+)。步驟2：向冰-水冷卻的7-(丁-3-烯-1-基硫基)-2-(叔丁基)-6-氯苯并[d]噁唑(27.6g)在DCM(400mL)中的溶液中分批添加mCPBA(84.0g)。在室溫攪拌過夜后，添加NaHCO3水溶液和Na2S2O3水溶液。將混合物用DCM萃取(2×500mL)。合并的有機層用水和鹽水洗滌，用Na2SO4干燥，過濾且濃縮。粗產物通過柱色譜法純化(用PE:EA＝1:0至7:3洗脫)以得到2-(叔丁基)-6-氯-7-((2-(氧雜環丙烷-2-基)乙基)磺酰基)苯并[d]噁唑(26.0g)。步驟3：在-70℃向2-(叔丁基)-6-氯-7-((2-(氧雜環丙烷-2-基)乙基)磺酰基)苯并[d]噁唑(10.0g)在THF(200mL)中的溶液中添加甲基溴化鎂(3M在醚中，38.8mL)。將混合物緩慢加熱且在室溫攪拌過夜。將反應混合物倒入NH4Cl水溶液，且用EA萃取(2×200mL)。合并的有機層用鹽水洗滌，用Na2SO4干燥且過濾。去除溶劑后，粗產物通過柱色譜法純化(用PE:EA＝4:1至3:2洗脫)以得到順-3-((2-(叔丁基)-6-氯苯并[d]噁唑-7-基)磺酰基)環丁醇(7.2g)。式(H)的化合物：1-(4-氯-3-((反-3-(二甲基氨基)環丁基)磺酰基)-2-羥基苯基)-3-((R)-2-甲基環戊-2-烯-1-基)脲三氟乙酸鹽向6-氨基-3-氯-2-((反-3-(二甲基氨基)環丁基)磺酰基)苯酚(中間體H1，100mg)在吡啶(5mL)中的溶液中添加新鮮的在甲苯(5mL)中的(R)-5-異氰酸酯基-1-甲基環戊-1-烯(中間體F2，40mg)。將反應混合物在室溫攪拌過夜，然后用水(5mL)淬滅。去除溶劑。殘余物通過MDAP純化(酸性條件)以得到1-(4-氯-3-((反-3-(二甲基氨基)環丁基)磺酰基)-2-羥基苯基)-3-((R)-2-甲基環戊-2-烯-1-基)脲的三氟乙酸鹽(40mg)。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm10.46(br.s.，1H)，8.32(s，1H)，8.16(d，J＝8.8Hz，1H)，7.06-7.17(m，2H)，5.52(s，1H)，4.50-4.58(m，1H)，4.40-4.50(m，1H)，3.98(quin，J＝7.9Hz，1H)，2.62-2.82(m，10H)，2.11-2.36(m，3H)，1.67(s，3H)，1.49-1.59(m，1H)；MS(ES+)m/z428(MH+)。中間體H1：6-氨基-3-氯-2-((反-3-(二甲基氨基)環丁基)磺酰基)苯酚步驟1：在室溫將碳酸鉀(262mg)添加至甲磺酸順-3-((2-(叔丁基)-6-氯苯并[d]噁唑-7-基)磺酰基)環丁基酯(中間體H2；200mg)和二甲基胺鹽酸鹽(77mg)在DMF(3mL)中的溶液中。將反應混合物在100℃攪拌12小時，然后與相同反應的另一批次合并，該反應使用甲磺酸順-3-((2-(叔丁基)-6-氯苯并[d]噁唑-7-基)磺酰基)環丁基酯(200mg)作為起始原料。合并的混合物用EA(50mL)稀釋。有機相用水(2×20mL)和鹽水(20mL)洗滌，用Na2SO4干燥且濃縮以得到反-3-((2-(叔丁基)-6-氯苯并[d]噁唑-7-基)磺酰基)-N,N-二甲基環丁胺(250mg)，其為棕色油狀物。MS(ES+)m/z371(MH+)。步驟2：在室溫將HCl水溶液(35％，5mL)添加至反-3-((2-(叔丁基)-6-氯苯并[d]噁唑-7-基)磺酰基)-N,N-二甲基環丁胺(550mg)在1,4-二噁烷(10mL)和水(10mL)中的溶液中。將反應混合物在120℃攪拌3小時，然后與相同反應的另一批次合并，該反應使用反-3-((2-(叔丁基)-6-氯苯并[d]噁唑-7-基)磺酰基)-N,N-二甲基環丁胺(400mg)作為起始原料。將合并的混合物濃縮。殘余物溶于MeOH。添加NaHCO3水溶液直到pH＝8。將混合物濃縮。所得殘余物通過柱色譜法純化(用洗脫DCM:MeOH＝50:1)以得到標題化合物(220mg)，其為黑色油狀物。MS(ES+)m/z305(MH+)。中間體H2：甲磺酸順-3-((2-(叔丁基)-6-氯苯并[d]噁唑-7-基)磺酰基)環丁基酯在0℃向順-3-((2-(叔丁基)-6-氯苯并[d]噁唑-7-基)磺酰基)環丁醇(中間體G2，1.0g)和N,N-二乙基丙-2-胺(0.9mL)在DCM(20mL)中的溶液中添加甲磺酰氯(0.3mL)。將混合物在0℃攪拌4小時。然后將反應混合物倒入水中且用DCM萃取(2×50mL)。洗滌合并的有機相，干燥且濃縮以得到甲磺酸順-3-((2-(叔丁基)-6-氯苯并[d]噁唑-7-基)磺酰基)環丁基酯(1.3g)，其為無色固體。MS(ES+)m/z422(MH+)。式(I)的化合物：(R)-1-(4-氯-3-((1,1-二氟乙基)磺酰基)-2-羥基苯基)-3-(2-甲基環戊-2-烯-1-基)脲向6-氨基-3-氯-2-((1,1-二氟乙基)磺酰基)苯酚(中間體I1，84mg)在吡啶(5mL)中的溶液中添加(R)-5-異氰酸酯基-1-甲基環戊-1-烯(中間體F2，0.15M在甲苯中，4mL)。將反應混合物在室溫攪拌過夜。將混合物濃縮且殘余物溶于DMF(8mL)且通過MDAP純化以得到(R)-1-(4-氯-3-((1,1-二氟乙基)磺酰基)-2-羥基苯基)-3-(2-甲基環戊-2-烯-1-基)脲(15mg)，其為白色固體。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm10.53(br.s.，1H)，8.28(s，1H)，8.26(d，J＝9.0Hz，1H)，7.17(d，J＝8.8Hz，1H)，7.07(d，J＝8.3Hz，1H)，5.52(br.s.，1H)，4.44-4.62(m，1H)，2.23-2.36(m，2H)，2.16-2.23(m，1H)，2.09(t，J＝19.2Hz，3H)，1.67(s，3H)，1.47-1.59(m，1H)；MS(ES+)m/z395(MH+)。中間體I1：6-氨基-3-氯-2-((1,1-二氟乙基)磺酰基)苯酚步驟1：向在-78℃攪拌的2-(叔丁基)-6-氯苯并[d]噁唑-7-硫醇(6.0g)和氫氧化鉀(13.9g)在乙腈(80mL)和水(80mL)中的溶液中一次性添加(溴代二氟甲基)膦酸二乙基酯(11.9g)。將混合物溫熱至室溫且攪拌30分鐘。添加EA(200mL)。分離有機相。水相用EA萃取(2×100mL)。合并有機層，用硫酸鈉干燥，過濾且濃縮以得到2-(叔丁基)-6-氯-7-((二氟甲基)硫基)苯并[d]噁唑(7.2g)，其為無色油狀物。MS(ES+)m/z292(MH+)。步驟2：在0℃向2-(叔丁基)-6-氯-7-((二氟甲基)硫基)苯并[d]噁唑(7.2g)在DCM(200mL)中的溶液中添加mCPBA(19.5g)且攪拌2小時。由于起始原料沒有消耗完全，添加另外的mCPBA(19.5g)。將混合物在室溫攪拌過夜。然后添加Na2SO3水溶液。分離有機相，用飽和碳酸鈉溶液和鹽水洗滌。所得溶液用硫酸鈉干燥，過濾且濃縮。殘余物通過柱色譜法純化(用PE:EA＝1:0-2:3洗脫)以得到2-(叔丁基)-6-氯-7-((二氟甲基)磺酰基)苯并[d]噁唑(3.2g)，其為白色固體。MS(ES+)m/z324(MH+)。步驟3：向2-(叔丁基)-6-氯-7-((二氟甲基)磺酰基)苯并[d]噁唑(2.2g)和碘甲烷(4.2mL)在THF(30mL)和HMPA(27mL)中的溶液中添加LDA(2M在THF中，13.5mL)。將混合物在-50℃攪拌30分鐘。混合物然后用飽和NH4Cl溶液和10％HCl溶液中和。添加EA(50mL)。有機層用鹽水洗滌，用硫酸鈉干燥且真空濃縮。粗產物與相同反應的另一批次合并，該反應使用2-(叔丁基)-6-氯-7-((二氟甲基)磺酰基)苯并[d]噁唑(1.0g)作為起始原料。粗產物通過柱色譜法純化(用PE:EA＝1:0-3:2洗脫)以得到2-(叔丁基)-6-氯-7-((1,1-二氟乙基)磺酰基)苯并[d]噁唑(1.0g)，其為白色固體。MS(ES+)m/z338(MH+)。步驟4：向2-(叔丁基)-6-氯-7-((1,1-二氟乙基)磺酰基)苯并[d]噁唑(1.0g)在1,4-二噁烷(20mL)中的溶液中添加濃HCl溶液(20mL)。混合物在110℃回流4小時，然后濃縮。所得殘余物溶于EA(20mL)。溶液的pH用TEA調節至8。將混合物濃縮。殘余物通過柱色譜法純化(用PE:EA＝1:0至1:4洗脫)以得到標題化合物(1.0g)，其為淺棕色固體。MS(ES+)m/z272(MH+)。式(J)的化合物：1-(4-氯-2-羥基-3-(((S)-3-甲基四氫呋喃-3-基)磺酰基)苯基)-3-((R)-2-甲基環戊-2-烯-1-基)脲和式(C)的化合物：1-(4-氯-2-羥基-3-(((R)-3-甲基四氫呋喃-3-基)磺酰基)苯基)-3-((R)-2-甲基環戊-2-烯-1-基)脲向6-氨基-3-氯-2-((3-甲基四氫呋喃-3-基)磺酰基)苯酚(中間體JC1，3000mg)在吡啶(20mL)中的溶液中添加(R)-5-異氰酸酯基-1-甲基環戊-1-烯(中間體F2，2279mg)。所得混合物在40℃攪拌12小時。添加冷卻水(30mL)且水層用DCM萃取(2×100mL)。合并的有機層用Na2SO4干燥，過濾且濃縮以得到1-(4-氯-2-羥基-3-((3-甲基四氫呋喃-3-基)磺酰基)苯基)-3-((R)-2-甲基環戊-2-烯-1-基)脲(4.1g)，其為黑色固體。一部分該化合物(3.0g)通過SFC和MDAP在酸性條件純化以得到純的兩種對映異構體：1-(4-氯-2-羥基-3-(((S)-3-甲基四氫呋喃-3-基)磺酰基)苯基)-3-((R)-2-甲基環戊-2-烯-1-基)脲(式(J)的化合物，666mg)和1-(4-氯-2-羥基-3-(((R)-3-甲基四氫呋喃-3-基)磺酰基)苯基)-3-((R)-2-甲基環戊-2-烯-1-基)脲(式(C)的化合物，626mg)。式(J)的化合物：HPLC(ChiralpakIC柱(4.6*250mm，5uM)，1:1ACN/IPA(包含0.5％DEA)，CO2流速：2.55mL/min；共溶劑流速：0.45mL/min；反壓：120巴)；tr＝16.9min；>93％ee；1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm10.53(s，1H)，8.36(d，J＝8.8Hz，1H)，8.17(s，1H)，7.14(d，J＝8.8Hz，1H)，7.05(d，J＝8.3Hz，1H)，5.51(s，1H)，4.49-4.63(m，1H)，4.33(d，J＝10.3Hz，1H)，3.76-3.89(m，2H)，3.61(d，J＝10.0Hz，1H)，2.68(dt，J＝13.3，7.9Hz，1H)，2.10-2.35(m，3H)，1.91-2.02(m，1H)，1.67(s，3H)，1.44-1.58(m，4H)；MS(ES+)m/z415(MH+)；式(C)的化合物：HPLC(ChiralpakIC柱(4.6*250mm，5uM)，1:1ACN/IPA(包含0.5％DEA)，CO2流速：2.55mL/min；共溶劑流速：0.45mL/min；反壓：120巴)；tr＝14.3min；>99％ee；1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm10.52(s，1H)，8.36(d，J＝9.0Hz，1H)，8.17(s，1H)，7.14(d，J＝8.8Hz，1H)，7.05(d，J＝8.3Hz，1H)，5.51(s，1H)，4.49-4.61(m，1H)，4.33(d，J＝10.0Hz，1H)，3.75-3.91(m，2H)，3.61(d，J＝10.0Hz，1H)，2.68(dt，J＝13.3，7.9Hz，1H)，2.09-2.37(m，3H)，1.90-2.02(m，1H)，1.67(s，3H)，1.42-1.59(m，4H)；MS(ES+)m/z415(MH+)；中間體JC1：6-氨基-3-氯-2-((3-甲基四氫呋喃-3-基)磺酰基)苯酚步驟1：向四氫呋喃-3-醇(5.0g)在DCM(100mL)中的冰-水冷卻的溶液中添加TEA(11.9mL)和MsCl(4.9mL)。所得反應混合物在0℃攪拌3小時，然后用NaHCO3水溶液淬滅。將混合物用EA萃取(2×100mL)。將合并的有機相洗滌，干燥，過濾且濃縮以得到甲磺酸四氫呋喃-3-基酯(6.2g)。步驟2：向2-(叔丁基)-6-氯苯并[d]噁唑-7硫醇鈉(11.8g)在DMF(100mL)中的溶液中添加甲磺酸四氫呋喃-3-基酯(6.2g)和K2CO3(7.7g)。所得反應混合物在80℃攪拌過夜。冷卻后，將其倒入水(500mL)中且用EA萃取(2×150mL)。將合并的有機相洗滌，干燥且濃縮以得到2-(叔丁基)-6-氯-7-((四氫呋喃-3-基)硫基)苯并[d]噁唑(11.4g)。步驟3：向2-(叔丁基)-6-氯-7-((四氫呋喃-3-基)硫基)苯并[d]噁唑(7.4g)在DCM(200mL)中的冰-水冷卻的溶液中添加mCPBA(11.7g)。所得混合物在室溫攪拌2天，然后用NaHCO3水溶液和Na2S2O3水溶液淬滅。將混合物用EA萃取(2×200mL)。將合并的有機相洗滌，干燥且濃縮。殘余物通過柱色譜法純化(用PE中的0-40％EA洗脫)以得到2-(叔丁基)-6-氯-7-((四氫呋喃-3-基)磺酰基)苯并[d]噁唑(4.3g)。MS(ES+)m/z344(MH+)。步驟4：向2-(叔丁基)-6-氯-7-((四氫呋喃-3-基)磺酰基)苯并[d]噁唑(4.3g)和MeI(2.0mL)在THF(100mL)中的干冰-乙醇冷卻的溶液中添加LiHMDS(1M在THF中，31.3mL)。所得混合物緩慢加熱且在室溫攪拌30分鐘。添加NH4Cl水溶液。將混合物用EA萃取(2×150mL)。將合并的有機相洗滌，干燥且濃縮以得到2-(叔丁基)-6-氯-7-((3-甲基四氫呋喃-3-基)磺酰基)苯并[d]噁唑(4.4g)。MS(ES+)m/z358(MH+)。步驟5：向2-(叔丁基)-6-氯-7-((3-甲基四氫呋喃-3-基)磺酰基)苯并[d]噁唑(4.4g)在1,4-二噁烷(150mL)中的溶液中添加HCl水溶液(37％，30.3mL)。將混合物在120℃回流過夜，然后濃縮。殘余物溶于水(100mL)。溶液的pH用NaHCO3水溶液調節至8，且用EA萃取。將有機相洗滌且濃縮。所得殘余物通過柱色譜法純化(用PE中的0-80％EA的梯度洗脫)以得到標題化合物(2.4g)。MS(ES+)m/z292(MH+)。式(K)的化合物：1-(4-氯-2-羥基-3-(((S)-3-甲基四氫呋喃-3-基)磺酰基)苯基)-3-((R)-2-氯環戊-2-烯-1-基)脲和式(L)的化合物：1-(4-氯-2-羥基-3-(((R)-3-甲基四氫呋喃-3-基)磺酰基)苯基)-3-((R)-2-氯環戊-2-烯-1-基)脲向6-氨基-3-氯-2-((3-甲基四氫呋喃-3-基)磺酰基)苯酚(中間體JC1，600mg)在吡啶(20mL)中的溶液中添加在甲苯(20mL)中的新鮮的(R)-1-氯-5-異氰酸酯基環戊-1-烯(中間體E2，443mg)。將混合物在室溫攪拌過夜。所得溶液用水(5mL)淬滅且濃縮。殘余物用MDAP純化(酸性條件)以得到1-(4-氯-2-羥基-3-((3-甲基四氫呋喃-3-基)磺酰基)苯基)-3-((R)-2-氯環戊-2-烯-1-基)脲(205mg)。將一部分該化合物(160mg)通過手性分離純化(AD-H(4.6*250mm,5um)，共溶劑MeOH，1％DEA)，然后通過MDAP(酸性條件)純化以得到1-(4-氯-2-羥基-3-(((S)-3-甲基四氫呋喃-3-基)磺酰基)苯基)-3-((R)-2-氯環戊-2-烯-1-基)脲和1-(4-氯-2-羥基-3-(((R)-3-甲基四氫呋喃-3-基)磺酰基)苯基)-3-((R)-2-氯環戊-2-烯-1-基)脲(分別為式(K)的化合物和式(L)的化合物，37mg和31mg)，其為紫羅蘭色固體。異構體1：HPLC(AD-H柱(4.6*250mm，5uM)，IPA(包含0.1％DEA)，CO2流速：2.25mL/min；共溶劑流速：0.75mL/min；反壓：149巴)；tr＝4.7min；>99％ee；1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm10.49(s，1H)，8.37(d，J＝8.9Hz，1H)，8.25(s，1H)，7.38(d，J＝8.8Hz，1H)，7.16(d，J＝8.9Hz，1H)，5.99(d，J＝1.7Hz，1H)，4.73(s，1H)，4.34(d，J＝10.1Hz，1H)，3.72-3.97(m，2H)，3.61(d，J＝10.1Hz，1H)，2.67(m，1H)，2.18-2.47(m，3H)，1.84-2.04(m，1H)，1.57-1.78(m，1H)，1.49(s，3H)；MS(ES+)m/z435(MH+)。異構體2：HPLC(AD-H柱(4.6*250mm，5uM)，IPA(包含0.1％DEA)，CO2流速：2.25mL/min；共溶劑流速：0.75mL/min；反壓：149巴)；tr＝5.5min；>93％ee；1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm10.49(s，1H)，8.37(d，J＝8.9Hz，1H)，8.24(s，1H)，7.37(d，J＝8.7Hz，1H)，7.16(d，J＝8.9Hz，1H)，5.99(s，1H)，4.73(s，1H)，4.34(d，J＝10.1Hz，1H)，3.71-3.96(m，2H)，3.61(d，J＝10.1Hz，1H)，2.62-2.78(m，1H)，2.19-2.44(m，3H)，1.84-2.06(m，1H)，1.56-1.78(m，1H)，1.49(s，3H)；MS(ES+)m/z435(MH+)。當前第1頁1 2 3