一種i型鴨肝炎精制卵黃抗體制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及獸用生物制品技術領域，具體設及一種I型鴨肝炎精制卵黃抗體制備 方法。
【背景技術】
[000引鴨病毒性肝炎值uck Virus化patitis，DVH)是由小RNA病毒科腸病毒屬的鴨肝 炎病毒值uck ifepatitis Virus, DHV)引起維鴨的一種急性、高度致死性、烈性傳染病。其 特征為病鴨疫李、頭向背部后仰、呈角弓反張特異姿勢。主要病變特點為肝臟腫大，有大小 不等的出血斑、出血點。鴨肝炎病毒有血清型I型、II型和III型，Ξ個型之間沒有抗原相關 性。W往在我國流行的主要是I型鴨肝炎病毒，但近幾年來，不斷有使用I型鴨肝炎弱毒疫 苗或高免卵黃抗體進行預防或治療無效的鴨群爆發疑似鴨肝炎，懷疑為新型鴨肝炎。本病 在國內維鴨群中頻頻發生，給養殖戶帶來了極大的經濟損失。
[0003] 卵黃抗體的形成過程是：當機體受到外來抗原刺激后，法氏囊內的B細胞分化成 為漿細胞，分泌特異性抗體進入血液循環，當血液流經卵巢時，特異性抗體（主要是IgG)在 卵細胞中逐漸蓄積，形成卵黃抗體，IgG移行進入卵細胞是受體作用的結果，因而IgG可在 卵細胞中大量蓄積，濃度高于血液中的IgG。
[0004] 卵黃抗體濃度高于血清IgG,單個卵黃（約15ml)含200mg左右的卵黃抗體，而且 從卵黃中提取抗體較從動物血清中提取抗體簡便。除此之外卵黃抗體還有許多重要的理化 特性，卵黃抗體在多種環境中有較高的穩定性，在低于75Γ的條件下，卵黃抗體具有良好的 熱穩定性，90°C處理15min后，大部分卵黃抗體喪失結合活性，在PH<4時，僅有少量卵黃抗 體失去活性。在pH4~12范圍內，卵黃抗體的活性幾乎不受影響，在pH〉12時，卵黃抗體迅 速失去結合活性。實驗表明，卵黃抗體具有耐受反復凍融的特性，即使經過5次凍融，其抗 原結合活性幾乎不受影響。在室溫下可保存6個月，4°C保存可達5年W上，活性僅下降5% 左右。
[0005] 對于鴨病毒性肝炎的預防和治療，目前除了加強消毒和疫苗免疫外，抗體免疫也 在控制該病的流行中發揮著重要作用。由于卵黃抗體成本比較低且比較容易獲得，所W已 廣泛使用于一些疾病的預防和治療。但由于卵黃中含有大量的脂質，若在制備環節中去除 不徹底則容易導致使用后發生不良反應，因此卵黃抗體生產工藝中如何除脂成為影響產品 品質和安全性的關鍵環節，現有技術中常用的純化方法有聚乙二醇法、硫酸葡聚糖法、有機 溶劑法、水稀釋法、辛酸法等，目前實際應用中顯示其脂類去除率仍有待提升。此外，上述方 法所純化得到的卵黃抗體效價不高，在一定程度上制約了療效。

【發明內容】

[0006]本發明旨在針對現有技術的技術缺陷，提供一種I型鴨肝炎精制卵黃抗體制備方 法，W解決現有技術中相關方法所制備的卵黃抗體中脂類殘留量較高的技術問題。
[0007]本發明要解決的另一技術問題是現有技術的相關方法所制備的卵黃抗體效價較 低。
[0008] 為實現W上技術目的，本發明采用W下技術方案：
[000引一種I型鴨肝炎精制卵黃抗體制備方法，包括W下步驟：
[0010] 1)取I型鴨肝炎病毒高免雞蛋卵黃，攬拌均勻得到卵黃液；
[0011] 。將步驟1)所述卵黃液與水按1: (0. 5~1.W(v/v)比例混合，攬拌均勻后得到 卵黃稀釋液，于60~65°C條件下保溫25~35min;
[0012] 3)向卵黃稀釋液中加入所述卵黃液體積2. 5~3. 5倍的醋酸鹽緩沖液，攬拌后濾 布過濾收集濾液；
[0013]4)向步驟3)所述濾液中加入辛酸至終濃度3. 5~4. 5% (v/v)，攬拌后于2~8°C 放置4~8小時；
[0014] 5)取步驟4)放置后的溶液過濾至濾液澄清，收集澄清濾液；
[0015]6)取步驟5)所述澄清濾液過濾除菌，而后加入甲醒至終濃度0. 1 % (v/v)，于 35~37°C滅活12~20h。
[0016] 作為優選，步驟1)所述的高免雞蛋是利用I型鴨肝炎病毒疫苗分4次免疫母雞后 所產雞蛋，每次免疫間隔2周；進一步優選的，所述免疫是頸部皮下或肌肉注射I型鴨肝炎 病毒疫苗。
[0017] 作為優選，步驟1)所述I型鴨肝炎病毒高免雞蛋的卵黃中，I型鴨肝炎病毒抗體 效價不低于1:1024。
[0018] 作為優選，步驟1)中先對所述高免雞蛋蛋殼消毒，而后再取卵黃；進一步優選的， 所述消毒方法是先W1%的新潔爾滅溶液中浸泡消毒15min，蛋殼干燥后再噴灑75%酒精 至蛋殼表面。
[0019] 作為優選，步驟1)中所述的水是先于80°C保持30min，而后冷卻至65°CW下的注 射水。
[0020] 作為優選，步驟2)所述的醋酸鹽緩沖液抑是4. 8~5. 2,更優的是5. 0。
[0021] 作為優選，步驟3)所述的攬拌，其持續是30~120min，更優的是90min。
[0022] 作為優選，步驟3)所述的濾布是丙絕750B濾布。
[0023] 作為優選，步驟4)所說的攬拌，其持續時間是30~120min，更優的是90min。
[0024] 作為優選，步驟5)所述的過濾是先W濾布過濾，而后再W濾膜過濾至濾液澄清； 進一步優選的，所述濾布是丙絕750B濾布。
[0025] 作為優選，步驟6)中用于過濾除菌的濾膜孔徑為0.22μm。
[0026] 作為優選，步驟6)除菌后的澄清濾液中I型鴨肝炎病毒抗體效價不低于1:512。
[0027] 作為優選，步驟6)中除菌后先進行超濾濃縮，而后再加入甲醒滅活；進一步優選 的，所述超濾濃縮是利用30~50KD的PES中空纖維超濾膜實現的；進一步優選的，所述濃 縮是在2~8Γ條件下進行的。
[0028]在W上技術方案中，收集高免雞蛋卵黃后先進行初步滅活，而后W醋酸鹽緩沖液 進行初步酸化萃提，再W辛酸作為滅活劑和萃提劑進行二次滅活，在此基礎上進行過濾澄 清、過濾除菌，最后經超濾濃縮后W甲醒進行Ξ次滅活，最終得到卵黃抗體溶液。W上通過 酸化水-辛酸方法有效降低了產品中脂類的含量，降低了不良反應風險，同時超濾濃縮步 驟有助于保證產品抗體效價，提升保護率；較高的抗體效價在未來使用環節需要較高的稀 釋倍數，從而間接降低了雜質含量，進而提升安全性。
[0029] 此外，本發明通過血清學、分子生物學等試驗進行大量的臨床病料分析鑒定工作， 最終篩選得到免疫原性較好的I型鴨肝炎病毒皿-34株，選用該毒株作為抗原制備疫苗再 用于本發明卵黃抗體的制備，所得產品效價高，保護率突出。
【具體實施方式】
[0030] W下將對本發明的【具體實施方式】進行詳細描述。為了避免過多不必要的細節，在 W下實施例中對屬于公知的結構或功能將不進行詳細描述。
[0031] W下實施例中所使用的近似性語言可用于定量表述，表明在不改變基本功能的情 況下可允許數量有一定的變動。因此，用"大約"、"左右"等語言所修正的數值不限于該準 確數值本身。在一些實施例中，"大約"表示允許其修正的數值在正負百分之十（10%)的 范圍內變化，比如，"大約100"表示的可W是90到110之間的任何數值。此外，在"大約第 一數值到第二數值"的表述中，大約同時修正第一和第二數值兩個數值。在某些情況下，近 似性語言可能與測量儀器的精度有關。
[0032]除有定義外，W下實施例中所用的技術和科學術語具有與本發明所屬領域技術人 員普遍理解的相同含義。
[0033] W下實施例中所用的試驗試劑耗材，如無特殊說明，均為常規生化試劑；所述實驗 方法，如無特殊說明，均為常規方法；W下實施例中的定量試驗，均設置Ξ次重復實驗，結果 取平均值；W下實施例中的％，如無特別說明，均為質量百分含量。
[0034] 實施例1
[00巧]一、生產用毒株
[0036] 制苗免疫原用鴨肝炎病毒值uck h巧atitis virus) I型皿-34株，由瑞普（保定） 生物藥業有限公司分離、鑒定、保管和供應。
[0037] 二、疫苗（免疫原）的制備
[003引 1.制苗用病毒液的制備
[0039]皿-34株病毒液制備將生產用毒種皿-34株作100倍稀釋，尿囊腔內接種10日齡SPF雞胚，每胚0. 1ml，36~37°C解育，每日2次照胚檢查。接種后48~120小時內死亡的 雞胚，置2~8°C放置4~12小時后，收取尿囊液、羊水及胚體，胚體去掉頭和四肢。用胚液 勻漿后、凍融3次，30(K)r/min離屯、lOmin，取上清混合于無菌容器中，置2~8°C保存。
[0040] 2.濃縮
[0041] 將收獲的皿-34株病毒液在2~8°C條件下，用膜包對毒液進行濃縮，按現行《中