胞介素-1受體拮抗劑與白細胞介素-1受體拮抗劑-親水性非重復序列多肽融合蛋白的表達情況。
[0046]圖9，白細胞介素-1受體拮抗劑-親水性非重復序列多肽融合蛋白的純化結果。
[0047]圖10，白細胞介素-1受體拮抗劑-親水性非重復序列多肽融合蛋白的鑒定結果。
[0048]圖11，白細胞介素-1受體拮抗劑-親水性非重復序列多肽融合蛋白活性測定結果。
[0049]圖12，白細胞介素-1受體拮抗劑-親水性非重復序列多肽融合蛋白藥代動力學檢測結果。
【具體實施方式】
[0050]以下結合附圖通過具體實施例進一步說明本發明，以下實施例僅起說明的作用，不能也不應將它們視為對本發明范圍或精神的限制。本領域技術人員可以理解對于本發明的目的而言，可使用其他變化或替代形式。而本發明的目的僅由本說明書和所附權利要求書定義。
[0051]實施例1、親水性非重復序列多肽與白細胞介素-1受體拮抗劑重組融合蛋白編碼基因的獲得
[0052]人工化學合成親水性非重復序列多肽編碼基因序列，并將其克隆至pUC57質粒載體中。
[0053]首先以該質粒中的編碼基因序列為模板，采用Primer設計引物，上游引物為:5’_CRatRaattcaRRtacttctactccRR-3，,其中加下劃線處為EcoRI酶切位點；下游引物:5’ _agtctcgagtcatggtgcggtagaagat-3J,其中加下劃線處為Xhol酶切位點。引物由上海生工生物工程公司合成。
[0054]采用PCR方法克隆含有EcoRI和Xhol酶切位點的親水性非重復序列多肽編碼基因，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，實驗結果如圖1所示；PCR產物在500bp左右，與親水性非重復序列多肽編碼基因的預期大小(435bp)相符。
[0055]PCR反應1:在0.2ml的PCR管中加入以下成分并混合均勻:
[0056]2X Taq Mix25 μ 1 ;上游引物2 μ 1 ;下游引物2 μ 1 ;pUC57_融合蛋白編碼基因質粒1 μ 1 ;超純水20 μ 1 ；
[0057]PCR 反應程序為:94°C，5min ；94°C，lmin ；55°C, lmin ；72°C, lmin ；72°C, 30min。一共進行30個循環反應；
[0058]將克隆到的PCR產物連接pMD19-T simple載體，挑取陽性克隆，送至上海英駿貿易有限公司進行測序，測序結果如圖2所示，經比對與人工化學合成的核苷酸序列一致；
[0059]白細胞介素-1受體拮抗劑編碼基因的獲得:人外周血單核細胞在含有5 μ g/ml的脂多糖的RPMI1640培養基中培養18小時。采用Trizol進行RNA的提取，并采用逆轉錄試劑盒進行RNA的反轉，最終獲得cDNA ；
[0060]以反轉錄獲得的cDNA為模板，采用Primer設計引物，其中上游引物為: -cggcccatat￡cgaccctctgggag-3>,其中下劃線處為Ndel酶切位點；下游引物為:5’_at
cgaattctcgtcctcctggaagtag-3J,其中下劃線處為EcoRI酶切位點。引物由上海生工生物工程公司合成；
[0061]采用PCR方法克隆含有Ndel和EcoRI酶切位點的白細胞介素_1受體拮抗劑基因，并用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測。實驗結果如圖3所示:PCR產物的大小在500bp左右，與白細胞介素-1受體拮抗劑的目的基因大小(462bp)相符；
[0062]PCR反應I1:在0.2ml的PCR管中加入以下成分并混合均勻:
[0063]2X Taq Mix25 μ 1 ;上游引物 2 μ 1 ;下游引物 2 μ 1 ；cDNAl μ 1 ;超純水 20 μ 1 ;
[0064]PCR 反應程序為:94°C，5min ；94°C，30s ；55°C, 30s ；72°C, lmin。一共進行 30 個循環反應。最后，72°C，30min ;
[0065]將克隆到的PCR產物連接pMD19-T simple載體，挑取陽性克隆，送至上海英駿貿易有限公司進行測序，測序結果如圖4所示，經比對與人工化學合成的核苷酸序列一致。
[0066]實施例2、構建親水性非重復序列多肽與白細胞介素-1受體拮抗劑重組融合蛋白編碼基因表達載體
[0067]取PET24b表達載體及pMD19_T_白細胞介素_1受體拮抗劑編碼基因質粒，采用Ndel和EcoRI限制性核酸內切酶進行雙酶切。雙酶切的反應體系為20ul，其中質粒10ul，Ndellul，EcoRIlul，2X buffer Tango4ul,無菌水 4ul。37°C酶切 5h。酶切產物采用 1%瓊脂糖凝膠電泳分離。采用膠回收試劑盒回收目的片段，其中pET24b表達載體回收5000bp左右的片段，PMD19-白細胞介素-1受體拮抗劑回收約500p的片段；
[0068]連接反應在T4DNA連接酶催化下進行，pET24b表達載體酶切片段與白細胞介素_1受體拮抗劑基因目的片段的摩爾數比約為1:3。連接反應體系為25ul，其中T4連接酶lul，10X T4DNA連接酶緩沖液2.5ul，16°C連接過夜；
[0069]連接產物轉化感受態大腸桿菌Top 10，涂布于卡那霉素抗性LB平板上，37°C培養過夜，挑取單克隆，擴大培養后抽提質粒。將擴大培養的菌液采用PET載體通用引物測序，測序反應由上海英濰捷基貿易有限公司完成；
[0070]取構建成功的pET24b-白細胞介素-1受體拮抗劑和pMD19_親水性非重復序列多肽編碼基因質粒，采用EcoRI和Xhol限制性核酸內切酶進行雙酶切。酶切的反應體系為20ul,其中質粒 10ul, Xhol lul, EcoRI lul, 2X buffer Tango4ul,無菌水 4ul。37°C 酶切 5h。酶切產物采用1 %瓊脂糖凝膠電泳分離，實驗結果如圖5所示。采用膠回收試劑盒回收目的片段，其中pET24b-白細胞介素-1受體拮抗劑表達載體回收5800bp左右的片段，pMD19_親水性非重復序列多肽編碼基因回收約500p的片段；
[0071]連接反應在T4DNA連接酶催化下進行，pET24b_白細胞介素_1受體拮抗劑基因目的片段與親水性非重復序列多肽編碼基因片段的摩爾數比約為1:3。連接反應體系為25ul，其中T4連接酶lul，10X T4DNA連接酶緩沖液2.5ul，16°C連接過夜；
[0072]連接產物轉化感受態大腸桿菌Top 10，涂布于卡那霉素抗性LB平板上，37°C培養過夜，挑取單克隆，擴大培養后抽提質粒。將擴大培養的菌液采用PET載體通用引物測序，測序反應由上海英濰捷基貿易有限公司完成。
[0073]實施例3、構建含有組氨酸標簽的親水性非重復序列多肽與白細胞介素-1受體拮抗劑重組融合蛋白編碼基因表達載體
[0074]取PET28a表達載體及pMD19_T_白細胞介素_1受體拮抗劑編碼基因質粒，采用Ndel和EcoRI限制性核酸內切酶進行雙酶切。雙酶切的反應體系為20ul，其中質粒10ul，Ndel lul，EcoRI lul，2X buffer Tango4ul,無菌水 4ul。37°C 酶切 5h。酶切產物采用 1% 瓊脂糖凝膠電泳分離。采用膠回收試劑盒回收目的片段，其中pET28a表達載體回收5000bp左右的片段，PMD19-白細胞介素-1受體拮抗劑回收約500p的片段；
[0075]連接反應在T4DNA連接酶催化下進行，pET28a表達載體酶切片段與白細胞介素_1受體拮抗劑基因目的片段的摩爾數比約為1:3。連接反應體系為25ul，其中T4連接酶lul，10X T4DNA連接酶緩沖液2.5ul，16°C連接過夜；
[0076]連接產物轉化感受態大腸桿菌Top 10，涂布于卡那霉素抗性LB平板上，37°C培養過夜，挑取單克隆，擴大培養后抽提質粒。將擴大培養的菌液采用PET載體通用引物測序，測序反應由上海英濰捷基貿易有限公司完成；
[0077]取構建成功的pET28a-白細胞介素_1受體拮抗劑和pMD19_親水性非重復序列多肽編碼基因質粒，采用EcoRI和Xhol限制性核酸內切酶進行雙酶切。酶切的反應體系為20ul,其中質粒 10ul, Xhol lul, EcoRI lul, 2X buffer Tango4ul,無菌水 4ul。37°C 酶切 5h。酶切產物采用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，實驗結果如圖5所示。采用膠回收試劑盒回收目的片段，其中pET28a-白細胞介素-1受體拮抗劑表達載體回收5800bp左右的片段，pMD19_親水性非重復序列多肽編碼基因回收約500p的片段；
[0078]連接反應在T4DNA連接酶催化下進行，pET28a_白細胞介素_1受體拮抗劑基因目的片段與親水性非重復序列多肽編碼基因片段的摩爾數比約為1:3。連接反應體系為25ul，其中T4連接酶lul，10X T4DNA連接酶緩沖液2.5ul，16°C連接過夜；
[0079]連接產物轉化感受態大腸桿菌Top 10，涂布于卡那霉素抗性LB平板上，37°C培養過夜，挑取單克隆，