一種抗hpv16l1蛋白的單克隆抗體、其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及免疫學領域，更具體地，本發明設及一種特異性結合人乳頭瘤病毒 HPV16L1蛋白的抗體、制備方法及其在體外檢測試劑盒中的應用。
【背景技術】
[0002] 人乳頭瘤病毒（HPV)是一組無包膜的小DNA病毒，感染人皮膚及粘膜上皮組織， 可誘發產生痛狀增生乃至引發良惡性腫瘤。根據感染后誘發病變的良惡性不同分為高危 型HPV和低危型HPV。高危型HPV感染與宮頸癌及癌前病變的發生密切相關，此外還與粘 膜相關的癌及癌前病變的發生相關。HPV16屬于高危型HPV，流行病學調查及臨床統計數 據均顯示HPV16與宮頸癌及其他癌癥呈現高度相關，HPV16和HPV18型誘發的宮頸癌占所 有HPV陽性宮頸癌的70%W上，高危型HPV感染相關的惡性病變中W婦女宮頸癌的發病率 最高，全球范圍內的發病率僅次于乳腺癌，高居婦科惡性腫瘤的第二位。預防HPV感染和宮 頸癌最有效的方法就是接種HPV疫苗，目前已上市的HPV疫苗，包括Merck公司的四價疫苗 "Gardasir郝九價疫苗"Gardasil9"，W及GSK公司的雙價疫苗"Cervarix"，運Ξ種疫苗都 包括HPV16的疫苗成分。HPV疫苗可刺激機體產生保護性中和抗體，在有效的治療和預防 HPV感染和宮頸癌中具有重要意義。
[0003] 研究發現，具有中和能力的單抗基本都識別構象表位，并且大多數識別型特異性 構象表位的單克隆抗體都具有中和能力。不同中和單抗通過封閉病毒與細胞第二受體的結 合位點，可阻止病毒感染入胞的發生，對運些單抗結合表位的研究有利于解釋病毒感染入 胞的關鍵位點。目前多數認為，在動物的HPV感染中，血清IgG(主要是中和IgG)能W足夠 高的濃度穿過宮頸上皮，特別是在鱗狀、柱狀上皮結合處，從而與病毒顆粒結合并阻止感染 發生。對疫苗誘發產生的中和抗體活性的測定是檢測預防性疫苗免疫保護性的重要標準。 中和活性抗體在HPV疫苗的免疫原性檢測和含量測定中具有重要的應用前景。目前僅有 一種HPV16中和單抗一一化6.V5抗體在國外有所報道，該抗體成功的應用于HPV16疫苗生 產過程中的有效成分的質量控制。
[0004] 因此，研發更多類型，針對各種不同表位的HPV16單抗，對于更好的研究HPV病毒 W及研發HPV疫苗具有重要作用，并將抗體應用于HPV感染的診斷、預防和治療也是十分必 要。

【發明內容】

[0005] 為了解決W上技術問題，本發明的一個方面是提供一種特異性結合人乳頭瘤病毒 HPV16L1蛋白和/或VLP的抗體，包含有SEQIDNO. 1-3所示的重鏈可變區的CDRUCDR2和 CDR3區域和SEQIDNO. 4-6所示的輕鏈可變區的CDR1、CDR2和CDR3區域。
[0006] 本發明的另一個方面是提供一種特異性結合人乳頭瘤病毒HPV16L1蛋白和/或 VLP的抗體，包含有如SEQIDNO. 7所示的重鏈可變區氨基酸序列和如SEQIDNO. 8所示的 輕鏈可變區氨基酸序列。
[0007] 本發明所述抗體均為單克隆抗體。
[0008] 作為優選，在本發明的一個實施方式中，所述抗體是由保藏編號為CGMCC NO. 10955的細胞產生的單克隆抗體。所述細胞是由免疫后的宿主脾細胞和骨髓瘤細胞融合 得到的雜交瘤細胞，其被保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、（CGMCC)， 保藏編號為CGMCCNO. 10955,保藏日期為2015年7月6日。
[0009] 本發明中所述抗體為型別特異性抗體，僅能特異性的結合HPV16L1蛋白和/或 VLP，而對其他大部分的HPV型別均無反應，如HPV6、11、16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、 59、68等型別。
[0010] 在本發明中，所述抗體具有中和活性，可阻斷HPV16型假病毒感染293FT細胞，具 有中和假病毒的作用。
[0011] 作為優選，在本發明的一個實施方式中，所述抗體是單價或二價抗體。
[0012] 在本發明中，可W采用Kohler等在化化re256:495(1975)中報道的雜交瘤制備 方法來制備所述單克隆抗體。首先用免疫原（必要時候添加佐劑）免疫注射小鼠或其它合 適的宿主動物。在本發明中，所述免疫原是漢遜酵母細胞表達產生的HPV16L1蛋白和/或 該HPV16L1蛋白在體外自動組裝形成的病毒樣顆粒（VLP)。其抗原的氨基酸序列如SEQID NO. 11所示。
[0013] 免疫原或佐劑的注射方式通常為皮下多點注射或腹腔注射。佐劑可W利用弗氏佐 劑（弗氏完全性佐劑或者弗氏不完全性佐劑）或MPkTDM等。動物在接受免疫后，體內會產 生分泌特異性結合免疫原的抗體的淋己細胞。收集目的淋己細胞，并用合適的融合劑（如 陽G4000)將其與骨髓瘤細胞融合，從而獲得雜交瘤細胞（Goding，MonoclonalAntibodies: PrinciplesandPractice，pp. 59-103,AcademicPress，1996)。
[0014] 將上述制備的雜交瘤細胞接種到合適的培養基中進行生長，所述培養基中含有一 種或多種能夠抑制未融合的、母體骨髓瘤細胞生長的物質。例如，對于缺乏次黃嚷嶺鳥嚷嶺 憐酸轉移酶（HGPRT或HPRT)的母體骨髓瘤細胞，在培養基中添加次黃嚷嶺、氨基噪嶺和胸 腺喀晚（HAT培養基）等物質將可W抑制HGPRT-缺陷細胞的生長。
[0015] 優選的骨髓瘤細胞應該具有融合率高，抗體分泌能力穩定，對HAT培養基敏感 等能力。其中，骨髓瘤細胞首選鼠源骨髓瘤，如M0P-21和MC-11小鼠腫瘤衍生株燈肥 SalkInstituteCellDistributionCenter,SanDiego,Calif.USA),W及SP-2/O或 X63-A妍-653 細胞株（AmericanTypeCyltureCollection,Rockville,Md.USA)。另 夕F，還可W利用人骨髓瘤和人鼠異源骨髓瘤細胞株制備人單抗化ozbor，J.Immunol.， 133:3001(1984)；Brodeuretal. ，MonoclonalAntibodyProductionTechniquesand Applications，pp. 51-63,MarcelDekker，Inc.，NewYork，1987)。
[0016] 雜交瘤細胞生長的培養基用于檢測針對特異抗原的單抗的產生。可W使用 下列方法來測定雜交瘤細胞產生的單抗的結合特異性：免疫沉淀或體外結合試驗， 如放射免疫試驗巧IA)、酶聯免疫吸附試驗巧LISA)。例如，利用Munson等在Anal. Biochem. 107:220(1980)中描述的Scatchard分析法可測定單抗的親和力。
[0017] 在確定雜交瘤產生的抗體的特異性、親和力和反應性之后，目的細胞株可W通過 Coding,MonoclonalAntibodies：PrinciplesandPractice，pp. 59-103,AcademicPress， 1996描述的有限稀釋法進行亞克隆化。合適的培養基可W是DMEM或RPMI-1640等。另 夕F，雜交瘤細胞還可W腹水瘤的形式在動物體內生長。
[0018] 利用傳統的免疫球蛋白純化方法，如蛋白A瓊脂糖凝膠、徑基憐灰石層析、凝膠電 泳、透析或親和層析等，可W將亞克隆細胞分泌的單抗從細胞培養液、腹水或血清中分離出 來，進而得到所述單克隆抗體。
[0019] 作為優選，在本發明的一個實施方式中，所述得到的單克隆抗體為4A3。
[0020] 本發明的另一個方面是提供了一種特異性結合人乳頭瘤病毒HPV16L1蛋白和/或 VLP的抗原結合部分，包含有SEQIDNO. 1-3所示的重鏈可變區的CDRUCDR2和CDR3區域 和SEQIDNO. 4-6所示的輕鏈可變區的CDR1、CDR2和CDR3區域；
[0021] 其中，所述抗原結合部分選自F油、F油'、F(油'）2、FtdAb、互補決定區片段、單鏈 抗體，人源化抗體、嵌合抗體或雙抗體。
[0022] 所述特異性結合HPV16L1蛋白和/或VLP的抗原結合部分可使用本領域技術人員 公知的方法獲得，如利用化學試劑處理的方法，或利用蛋白酶消化的方法，如木瓜蛋白酶、 胃蛋白酶等。
[0023] 本發明的另一個方面是提供了一種保藏編號為CGMCCNO. 10958的雜交瘤細胞，其 被保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、（CGMCC)。
[0024] 本發明的另一個方面是提供了一種試劑盒，所述試劑盒包含本發明的特異性結合 人乳頭瘤病毒HPV16L1蛋白和/或VLP的抗體或其抗原結合部分。
[0025] 作為優選，在本發明的一個實施方式中，所述試劑盒中還包含與HPV16L1蛋白和/ 或VLP特異性結合的第二抗體。 陽〇%] 更優選地，所述第二抗體是由保藏編號為CGMCCNO. 10958的細胞產生的單克隆抗 體，保藏日期為2015年7月6日。
[0027] 更優選地，所述第二抗體為甜8。
[0028] 作為優選，在本發明的一個實施方式中，所述第二抗體采用與本發明所述特異性 結合人乳頭瘤病毒HPV16的抗體相同的方法制備。
[0029] 本發明還提供了上述試劑盒在檢測樣品中HPV16的L1蛋白和/或VLP的存在或 者水平中的用途。
[0030] 本發明的有益效果：
[0031] 本發明提供的特異性結合人乳頭瘤病毒HPV16L1蛋白和/或VLP的抗體或抗原結 合部分與大部分的HPV其他亞型，如HPV6、11、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68 等 型別無交叉反應，特異性高，具有中和HPV16假病毒并阻斷其感染的特性，且親和性高。可 用于樣品中檢測HPV16L1蛋白和/或VLP的存在或水平試劑盒的研發，W及針對患者的治 療和對易感人群進行被動免疫，具有良好的應用前景。
[0032] 生物保藏信息：
[0033] 保藏編號：CGMCCNO. 10955
[0034] 保藏日期：保