一種基于香豆酰肼的硫醇熒光探針的制備方法及應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及硫醇檢測技術，具體涉及一種基于香豆酰肼的硫醇熒光探針的制備方 法及應用。
【背景技術】
[0002] 巰基(-SH)在細胞中具有較高的化學活性。谷胱甘肽(L- y -谷氨酰-L-半胱氨酰-甘氨酸，glutathione)是一種同時具有谷氨酰基和疏基的生物活性三肽化合物。臨床上，谷 胱甘肽可以迅速提高機體免疫力，在抗氧化、抗輻射、清除自由基、解毒、促進鐵質吸收等方 面具有良好的效果且無副作用。它在細胞內氧化還原活動，異生物質的代謝，細胞內信號傳 導和基因調控等許多細胞功能中起到重要作用。谷胱甘肽對于放射線、放射性藥物所引起 的白細胞減少等癥狀，有強有力的保護作用。有許多疾病，如早期動脈硬化、肺病、結腸癌、 白血病、阿爾海默癥和帕金森病患者等發病時，谷胱甘肽水平發生異常。對人體血漿、組織、 細胞中谷胱甘肽含量的測定和研究，可以提供關于細胞對氧化應激的保護及反應狀態的信 息。含硫醇的物質在生物系統中的水平的評估可以有助于某些疾病的早期診斷。
[0003] 熒光分子成像技術是近年發展迅速的一種新興的分子成像技術，它利用具有特異 性的熒光分子探針標記特定的分子或細胞，從分子和細胞水平上對正常或異常的生物過程 進行空間和時間上的視覺描述，是一種非侵入式的成像方式。熒光探針具有高的熒光量子 產率、長的分析波長、良好的生物兼容性、穩定性、選擇性、靈敏度，以及動態響應范圍寬等 諸多優點，尤其是熒光法能夠實現對活體的靈敏、原位、實時成像，近年來在生物化學、細胞 生物學、環境科學、分子生物學等科學領域有廣泛的應用，成為目前廣泛采用的檢測細胞內 硫醇類物質的一種重要手段。香豆素類熒光團分子摩爾吸光系數較大，熒光量子產率較高， 因此香豆素類染料常被用作為發色基團來合成高效的熒光探針。香豆素分子易于衍生和修 飾，而且激發波長在可見區，這些特點使其成為了熒光探針設計和合成中優秀的候選熒光 團。
[0004] 目前測定硫醇化合物含量的方法有多種，如高效毛細管電泳法、電化學法、熒光分 析法和近些年發展的高效液相色譜法等。目前對于谷胱甘肽的測定還沒建立一個既十分靈 敏、特異，又十分快速、穩定、經濟的方法。硫醇化合物的各種測定方法各有其優點，有的靈 敏度高，有的快速可靠，有的可區分開各種成分；同時避免不了一些問題出現，例如有的制 備工藝較為復雜，有的對硫醇化合物中的各種成分的測定區分不開，有的實驗條件較為苛 刻等。因此，方便廉價、能夠定性定量分析生物硫醇，并且可以對生物樣品進行實時檢測的 方法非常重要。如同熒光分析法在檢測金屬離子獲得廣泛應用一樣，在眾多檢測生物硫醇 的方法中，熒光分析法具有操作簡便、直觀等優點，適于巰基物質成像分析，因而引起了人 們的廣泛關注。該方法反應速度快，硫醇化合物和熒光物質通常在室溫下即可測定，靈敏度 較高，有一定的穩定性，一些熒光加合反應有一定的專一性。因此，設計合成熒光探針以檢 測谷胱甘肽等小分子生物硫醇具有重要的意義。
[0005] 目前檢測硫醇的探針多為檢測硫醇化合物的總量，例如利用硫醇化合物中的巰基 的未核性檢測硫醇的焚光探針，利用疏基和^硫鍵的氧化還原反應檢測硫醇的焚光探針， 利用巰基與金屬離子絡合能力檢測硫醇的熒光探針，該類硫醇熒光探針設計容易，但是很 難把半胱氨酸、同型半胱氨酸和還原型谷胱甘肽進行區分。而利用醛基、氨基和巰基的共同 作用檢測硫醇化合物，則可以實現對某一種硫醇分子特異性的識別，例如半胱氨酸或同型 半胱氨酸的共輒加成環化反應、半胱氨酸或同型半胱氨酸的醛成環反應、半胱氨酸與醛基 縮合再與雙鍵加成成環反應、半胱氨酸發生分子內親核取代反應、親核取代-加成成環反應 等，但這類探針設計較為困難，因此設計合成更多可以針對生物體內不同種類硫醇分子分 析檢測的特異性熒光分子探針更加重要。
[0006] 近年來檢測巰基物質的光學探針的研究發展極為迅速，所報道的探針在生理條件 下大多有著較好的分析性能，且探針信號變化受環境因素(如pH值、溫度和極性等）的影響 較小，從而為生物樣品中巰基物質的測定和細胞成像研究提供了重要的物質基礎。

【發明內容】

[0007] 為了解決現有技術的不足，本發明提供了一種基于香豆酰肼的硫醇熒光探針的制 備方法及應用。
[0008] 本發明的技術方案是:一種基于香豆酰肼的硫醇熒光探針的制備方法，以香豆酰 肼和對叔丁基苯酚二醛為原料合成了一種席夫堿結構的香豆素類衍生物，其在與銅離子絡 合后制成了席夫堿結構的香豆素類一銅離子（n)配合物硫醇熒光探針。
[0009] 本發明的進一步改進包括：
[0010] 將0 ? 3028g的香豆酰肼（1 ? lmmol，MW= 275 ? 3031 )溶于最少量的乙醇中，加入 0.1031g的對叔丁基苯酚二醛(0.5mmol，MW= 206.2378);氮氣保護下，加熱回流12小時，點 板監測反應，冷卻后有沉淀析出，所得沉淀抽濾，并用乙醇洗滌數次，即得對叔丁基苯酚二 醛香豆酰肼，即化合物I。
[0011] 將5.1374g的對叔丁基苯酚(34.2mmol，MW= 150.2176)和9.6028g的六次甲基四胺 (68.5111111〇1爲=140.1863)溶于6〇1^的三氟乙酸溶液中，氮氣保護下回流2411，冷卻到室溫， 倒入4mol/L的HC1溶液中，攪拌30min，用100mL CH2C12萃取2次，有機相加水調pH至中性，再 用100mL CH2C12萃取2次，用200mL水洗滌;無水Na2S〇4干燥，旋蒸得到黃色油狀液體，粗產品 用硅膠色譜柱提純，得淺黃色固體即對叔丁基苯酚二醛。
[0012] 7 ? 7297g的4-二乙基氨基水楊醛（0 ? 04mol，MW= 193 ? 2423)，12 ? 8134g的丙二酸二 乙酯(0.08mo 1，MW=160.1678)和4mL哌啶在120mL無水乙醇中混和，混合液在攪拌條件下回 流6小時，冷卻到室溫，旋蒸至乙醇溶劑不再蒸出，得到少量油狀液體即為7-N，N-二甲基氨 基-2-氧-2H-3-香豆酸酯。將4.3399g的7-N，N-二甲基氨基-2-氧-2H-3-香豆酸酯（15mmol， M w=289.3264)溶于40毫升乙醇中，加入3.64mL的80%水合肼（60mmol)，室溫攪拌12分鐘 后，冰水中冷卻15分鐘。所得沉淀抽濾，粗產品用硅膠色譜柱提純，即得產物香豆酰肼。
[0013] 本發明的另一目的在于提供了一種基于香豆酰肼的硫醇熒光探針，按照上述的方 法制得。
[0014] 本發明還提供了一種基于香豆酰肼的硫醇熒光探針在谷胱甘肽檢測中的應用。
[0015] 本發明進一步提供了一種基于香豆酰肼的硫醇熒光探針在硫醇化合物檢測中的 應用。
[0016]化合物i本身具有較強熒光，而探針i-cu( n)為弱熒光化合物，隨著硫醇化合物的 加入，硫醇基團的脫金屬作用使探針I-Cu( n)釋放出化合物I，這樣就與探針I-Cu( n)產生 了很大的熒光變化，從而達到檢測硫醇化合物的目的。
[0017] 本發明以香豆酰肼和對叔丁基苯酚二醛為原料合成了一種雙席夫堿香豆素類衍 生物(化合物I)，化合物I本身具有較強的熒光，在與銅離子配位后制成了席夫堿結構的香 豆素類一銅離子（n)配合物，即為硫醇熒光探針i-cu( n)。該探針由于cu2+的順磁性及光誘 導電子轉移作用的影響，使化合物I的熒光淬滅。而巰基氨基酸及其衍生物如谷胱甘肽等化 合物中的硫原子與cu 2+具有更強的配位作用，這種競爭配位作用導致香豆素一銅離子（n) 配合物中的銅離子被巰基氨基酸及其衍生物奪走，重新生成化合物I，從而恢復化合物I的 熒光。基于此本發明建立了一種快速、簡便的檢測硫醇化合物的方法。
[0018] 探針I-Cu ( n )在CH3CN: H20(3:2，v/v)溶液中對含有巰基的氨基酸具有良好的選擇 性，其他非巰基氨基酸對探針i-cu(n)的熒光影響很小，共存時也不會干擾谷胱甘肽對探 針I-Cu(n)的增強響應，并成功用于人子宮頸鱗癌細胞SiHa細胞中進行了檢測谷胱甘肽的 細胞成像實驗。
[0019] 巰基氨基酸對銅離子(Cu2+)的高親和能力促使配合物脫銅可能是其實現熒光增強 識別的機制，從而實現了該探針對含巰基氨基酸及其衍生物如谷胱甘肽的檢測，是一種選 擇性好、抗干擾能力強的硫醇熒光探針。此外，探針具有細胞膜滲透性和低細胞毒性，還具 有良好的光化學穩定性。因此，該探針適用于檢測在活細胞中硫醇化合物的水平，