本發明(ming)涉(she)(she)及一(yi)種環(huan)肽(tai)化合物(wu)，確(que)切的說是該(gai)環(huan)肽(tai)化合物(wu)的結構及其(qi)合成方(fang)法；本發明(ming)也涉(she)(she)及該(gai)環(huan)肽(tai)化合物(wu)及其(qi)藥物(wu)組合物(wu)在預防和(he)治療結核桿菌方(fang)面的應用，屬于生物(wu)醫(yi)藥技術領(ling)域(yu)。

背景技術：

結核病(bing)(bing)(tuberculosis)是(shi)結核分枝桿(gan)(gan)菌(jun)(Mycobacterium)引(yin)起(qi)的慢性傳染性疾病(bing)(bing)，在人(ren)(ren)類(lei)社會肆虐數千年(nian)，是(shi)一種世(shi)界范圍內(nei)的流(liu)行(xing)性疾病(bing)(bing)。世(shi)界衛生(sheng)(sheng)組織統計，全球(qiu)三(san)分之一的人(ren)(ren)口(約20億(yi))感染結核桿(gan)(gan)菌(jun)，世(shi)界衛生(sheng)(sheng)組織2011年(nian)公布的第16份全球(qiu)結核病(bing)(bing)報告中提到(dao)，2010年(nian)全球(qiu)新發結核病(bing)(bing)患者880萬(wan)，死(si)亡人(ren)(ren)數為110萬(wan)人(ren)(ren)。雖然(ran)結核病(bing)(bing)新發病(bing)(bing)率和死(si)亡率呈下降趨勢，但因為結核桿(gan)(gan)菌(jun)感染人(ren)(ren)群總(zong)數巨大，所以仍然(ran)是(shi)當今世(shi)界上由單一致病(bing)(bing)菌(jun)引(yin)發的死(si)亡人(ren)(ren)數最(zui)高的疾病(bing)(bing)之一。

結(jie)核病的(de)(de)(de)化學藥物(wu)治療是人(ren)類控制結(jie)核病的(de)(de)(de)主要手段。1944年(nian)鏈(lian)霉素第一次用于(yu)治療一個(ge)垂危結(jie)核病病人(ren)并取得成功，鏈(lian)霉素的(de)(de)(de)發現(xian)標志著現(xian)代結(jie)核病化療的(de)(de)(de)開(kai)端。隨后的(de)(de)(de)20年(nian)，是抗(kang)結(jie)核藥物(wu)開(kai)發的(de)(de)(de)黃金時期，相繼(ji)成功的(de)(de)(de)研發了一線藥物(wu)異煙肼(isoniazid，INH)、利福平(Rifampin)、吡(bi)嗪酰胺(pyrazinamide，PZA)、乙(yi)胺丁醇(Ethambutol，EMB)和鏈(lian)霉素等(deng)。二線藥物(wu)對氨(an)基水楊酸(para-aminosalicylic acid，PAS)、乙(yi)硫異煙胺(ethionamide，ETH)、環絲氨(an)酸等(deng)。但由于(yu)處方不(bu) 當(dang)、藥品質量低劣或供(gong)應不(bu)力(li)、患者不(bu)堅持服藥等(deng)原因，結(jie)核桿菌產生耐(nai)藥性的(de)(de)(de)情況越來越嚴重。

結核病難以(yi)根除，主要(yao)是(shi)其耐藥(yao)性和持(chi)(chi)留性。持(chi)(chi)留性結核桿(gan)菌，是(shi)指(zhi)通過緩慢的非增殖(zhi)代謝、維持(chi)(chi)在(zai)(zai)宿(su)主細胞內長期存在(zai)(zai)的結核桿(gan)菌。宿(su)主免(mian)疫系統以(yi)及抗(kang)結核藥(yao)物能夠(gou)迅速殺死生(sheng)長狀(zhuang)(zhuang)(zhuang)態的結核桿(gan)菌，而(er)對處(chu)于非生(sheng)長狀(zhuang)(zhuang)(zhuang)態的持(chi)(chi)留結核桿(gan)菌無(wu)能為力(li)(li)。當宿(su)主免(mian)疫力(li)(li)下降時或者(zhe)停止使(shi)用抗(kang)結核藥(yao)物后(hou)，處(chu)于持(chi)(chi)留狀(zhuang)(zhuang)(zhuang)態的結核桿(gan)菌就會轉化為生(sheng)長狀(zhuang)(zhuang)(zhuang)態，大(da)量繁(fan)殖(zhi)，并獲得毒力(li)(li)，重新致病。

現(xian)階段臨床(chuang)上最有效的(de)(de)(de)(de)(de)(de)結核(he)病(bing)療(liao)法(fa)(fa)是DOTS(Directly Observed Treatment,Short Course)療(liao)法(fa)(fa)，整個(ge)療(liao)程至少需(xu)要(yao)6個(ge)月。研究(jiu)表明，在(zai)使(shi)(shi)用(yong)DOTS療(liao)法(fa)(fa)治(zhi)療(liao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)前兩周，絕大(da)多數的(de)(de)(de)(de)(de)(de)結核(he)桿菌已(yi)被殺死，剩(sheng)余(yu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)時間(jian)則是用(yong)來殺滅持(chi)(chi)(chi)(chi)留(liu)狀(zhuang)態(tai)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)結核(he)桿菌。由(you)此(ci)可以看出(chu)，因(yin)為(wei)(wei)結核(he)桿菌的(de)(de)(de)(de)(de)(de)持(chi)(chi)(chi)(chi)留(liu)性(xing)(xing)，使(shi)(shi)得結核(he)病(bing)療(liao)程變得如此(ci)漫長。冗(rong)長的(de)(de)(de)(de)(de)(de)療(liao)程不僅加重了患者的(de)(de)(de)(de)(de)(de)經濟負(fu)擔，也(ye)使(shi)(shi)得患者難于按時按量堅持(chi)(chi)(chi)(chi)服藥(yao)，導致耐(nai)藥(yao)性(xing)(xing)結核(he)桿菌的(de)(de)(de)(de)(de)(de)不斷出(chu)現(xian)，進一(yi)步加大(da)了治(zhi)愈的(de)(de)(de)(de)(de)(de)難度。隨著(zhu)人(ren)們對結核(he)分(fen)枝(zhi)桿菌持(chi)(chi)(chi)(chi)留(liu)性(xing)(xing)(persisters)認識的(de)(de)(de)(de)(de)(de)逐漸深入(ru)以及分(fen)子生物(wu)學的(de)(de)(de)(de)(de)(de)快(kuai)速發展，為(wei)(wei)研究(jiu)新(xin)(xin)靶(ba)位的(de)(de)(de)(de)(de)(de)抗持(chi)(chi)(chi)(chi)留(liu)性(xing)(xing)結核(he)分(fen)枝(zhi)桿菌藥(yao)物(wu)開辟了一(yi)條新(xin)(xin)途徑。異檸(ning)檬酸裂解(jie)酶(isocitrate lyase，ICL)是乙醛(quan)酸循(xun)環(huan)途徑中的(de)(de)(de)(de)(de)(de)關鍵限速酶之一(yi)，對結核(he)桿菌維持(chi)(chi)(chi)(chi)其持(chi)(chi)(chi)(chi)留(liu)狀(zhuang)態(tai)起決(jue)定(ding)性(xing)(xing)作(zuo)用(yong)(McKinney J D等，Persistence of Mycobacterium tuberculosis in macrophages and mice requires the glyoxylate shunt enzyme isocitrate lyase，Nature,2000, 406:735-738)。因(yin)此(ci)可選擇(ze)以異檸(ning)檬酸裂解(jie)酶作(zuo)為(wei)(wei)研究(jiu)新(xin)(xin)型抗結核(he)藥(yao)物(wu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)潛在(zai)藥(yao)物(wu)靶(ba)標。

牛(niu)雪等(deng)以異檸(ning)檬酸裂解(jie)酶(mei)(mei)蛋白為靶蛋白，利用噬菌體(ti)7肽(tai)庫篩(shai)選與異檸(ning)檬酸裂解(jie)酶(mei)(mei)特異性(xing)結(jie)(jie)合的(de)噬菌體(ti)。經(jing)過(guo)篩(shai)選、ELISA檢測(ce)和DNA序列測(ce)定(ding)，最終結(jie)(jie)果表(biao)明(ming)(ming)氨基(ji)酸序列為[NPPERSP]的(de)直(zhi)鏈肽(tai)對(dui)異檸(ning)檬酸裂解(jie)酶(mei)(mei)有(you)(you)(you)(you)明(ming)(ming)顯抑(yi)制(zhi)作用(YIN Yu-he等(deng)，Screening Peptide Inhibitors Using Phage Peptide Library with Isocitrate Lyase in Mycobacterium tuberculosis as Target，CHEM.RES.CHINESE UNIVERSITIES 2011,27(4),635—640)。在實驗(yan)過(guo)程中申請人(ren)也(ye)發現等(deng)十二條(tiao)直(zhi)鏈肽(tai)不同程度地(di)對(dui)異檸(ning)檬酸裂解(jie)酶(mei)(mei)具有(you)(you)(you)(you)抑(yi)制(zhi)作用(Xintao Liu等(deng)，Optimization of phage heptapeptide library-screening process for developing inhibitors of the isocitrate lyase homologue from Mycobacterium tuberculosis，Med Chem Res，2014，23:2543–2553)。但由于(yu)直(zhi)鏈肽(tai)藥物進入體(ti)內后可以被酶(mei)(mei)迅速代謝(xie)降解(jie)，半(ban)衰期通(tong)常很(hen)短。化(hua)學(xue)修飾是延(yan)長多肽(tai)類(lei)藥物半(ban)衰期的(de)一個有(you)(you)(you)(you)效途徑，因(yin)此，本發明(ming)(ming)中，將直(zhi)鏈肽(tai)合成環(huan)(huan)肽(tai)，并同時對(dui)直(zhi)接鏈肽(tai)和環(huan)(huan)肽(tai)的(de)抑(yi)制(zhi)異檸(ning)檬酸裂解(jie)酶(mei)(mei)活性(xing)進行檢測(ce)，結(jie)(jie)果表(biao)明(ming)(ming)環(huan)(huan)肽(tai)的(de)活性(xing)有(you)(you)(you)(you)所提高，表(biao)明(ming)(ming)其具有(you)(you)(you)(you)預防(fang)和治療結(jie)(jie)核桿菌的(de)用途。

在本(ben)發(fa)明(ming)完成之前，尚無文獻報道本(ben)發(fa)明(ming)所述的環肽化(hua)合(he)物(wu)(wu)用(yong)于預防和治(zhi)療結核桿(gan)菌(jun)的報道，也未發(fa)現該(gai)化(hua)合(he)物(wu)(wu)在制備防治(zhi)結核桿(gan)菌(jun)的藥物(wu)(wu)中的應用(yong)的報道。

技術實現要素：

本發(fa)明的目的之一(yi)在于(yu)提供一(yi)種環肽(tai)化(hua)(hua)合物，該化(hua)(hua)合物是利用(yong)固相多(duo)肽(tai)合成法,按已知異檸檬酸裂解酶抑制劑的直鏈肽(tai)氨基酸序(xu)列合成首尾相連的環肽(tai)化(hua)(hua)合物。

本發明的目的這二(er)是將該(gai)環(huan)肽化合物進行抑制結核桿(gan)菌的活性進行檢測(ce)，結果表明其(qi)具(ju)有抗結核桿(gan)菌的作用(yong)。

本(ben)發明的(de)特點為：對直(zhi)鏈(lian)肽(tai)進行化學(xue)修飾得到的(de)環(huan)肽(tai)化合物，經活(huo)性(xing)(xing)實(shi)驗(yan)證明，具(ju)有防治結(jie)核桿菌的(de)作用，該環(huan)肽(tai)化合物與直(zhi)鏈(lian)肽(tai)相比，穩定性(xing)(xing)大(da)大(da)增加，半(ban)衰期延長，活(huo)性(xing)(xing)和穩定性(xing)(xing)都得到明顯提高，具(ju)有很高的(de)藥用價值(zhi)。

本發(fa)明的目(mu)的是通過以下技術方案(an)得以實現(xian)。

一、環肽化合物的合成

一種(zhong)具有預防和治療結(jie)核桿菌的(de)環肽(tai)化合物，其結(jie)構式如(ru)下(xia)：

如上所述的(de)具有預(yu)防和治療結核桿菌的(de)環肽化(hua)合物由以下方法得到：

用(yong)DMF溶脹Rink Amide-MBHA Resin，在一(yi)定(ding)的反應體(ti)系下將Fmoc-Leu與樹(shu)脂(zhi)進(jin)行偶(ou)聯，偶(ou)聯上后(hou)脫除Fmoc保護基(ji)；按照“C”—Leu-Thr-Gln-His-Leu-Thr-Val—“N”順序，從“C”端(duan)向“N”端(duan)合(he)成，直至最后(hou)一(yi)個氨基(ji)酸；將直連肽(tai)首尾(wei)Val-Leu相連，將直鏈肽(tai)從樹(shu)脂(zhi)上裂(lie) 解下來，進(jin)行環化，用(yong)乙醚沉淀、真空干(gan)燥得(de)(de)粗(cu)品，粗(cu)品經RP-HPLC純化，得(de)(de)純品環肽(tai)化合(he)物(wu)。

其合成路線圖如下：

a.脫(tuo)除(chu)Fmoc保護基；b.肽(tai)的偶聯反(fan)應；c.肽(tai)與(yu)樹(shu)脂的分離；d.線性肽(tai)的環(huan)化(hua)。

二、環肽化合(he)物的結(jie)構確證

將(jiang)得(de)到的環肽(tai)用高效液相色(se)譜法和質譜進行(xing)結構確證(zheng)，具體(ti)如下：

1、高效液相色譜法

高效液相色譜分析條件:C₁₈色譜柱(ID4.0mm×250mm，5μm)；流動相A為(wei)水：三氟乙(yi)酸(suan)＝1：0.05,有機相B為(wei)乙(yi)腈:水：三氟乙(yi)酸(suan)90：10：0.05；進樣量為(wei)10μL,流速為(wei)1mL/min。檢測(ce)波長為(wei)225nm。

通過(guo)高效液相色(se)譜圖(tu)可知合(he)成的(de)環肽化合(he)物的(de)純(chun)度較高，為單一化合(he)物。

2、質譜法

通過質譜分析，得到譜圖(tu)如圖(tu)1所示。

通(tong)過質譜(pu)分(fen)析(xi)可知合(he)(he)成得到(dao)的(de)環肽(tai)化合(he)(he)物的(de)相對(dui)分(fen)子(zi)量為793.4，與目標(biao)環肽(tai)相對(dui)分(fen)子(zi)量一(yi)致(zhi)。

三、環肽(tai)化合物的預防和治療結(jie)核桿菌活(huo)性檢測

本發明(ming)的環肽化合(he)物具有預防和治療結核桿(gan)菌的作用，這些藥理作用，通過(guo)以下藥效學(xue)試驗例得到證實。

1、肽類化合物對結核桿菌H₃₇Ra的MIC測定

取制備好的1mg/mL的結核桿菌H37Ra菌懸液5μL，含菌數量2×10³，分別接種于每支含500μL正常狀態或限制(zhi)碳源(yuan)培(pei)養液的(de)24孔(kong)板中，然后根據需(xu)要在孔(kong)中加入1mL用(yong)DMSO配制(zhi)的(de)直鏈與環(huan)肽化(hua)合(he)物，肽濃度(du)梯度(du)稀(xi)釋為(wei)：1000、800、500和200μg/mL。以異煙肼(jing)(INH)為(wei)陽性對照(zhao)，濃度(du)梯度(du)稀(xi)釋為(wei)1.5、1.0、0.8、0.5和0.2μg/mL。以DMSO和不添(tian)加任何化(hua)合(he)物的(de)培(pei)養菌液作為(wei)陰(yin)性對照(zhao)。置37℃恒(heng)溫孵箱(xiang)內培(pei)養，2-3周觀(guan)察結果(guo)。

實(shi)驗結果如表(biao)1所示。環肽(tai)(tai)化合(he)物的MIC為200μg/mL而相應的直連(lian)肽(tai)(tai)化合(he)物的MIC為500μg/mL，說明環肽(tai)(tai)與直鏈(lian)肽(tai)(tai)相比(bi)，抑(yi)菌活性大(da)大(da)提高。

表1 各種化合物對H₃₇Ra的最小抑菌濃度

2、肽(tai)類化(hua)合物對巨(ju)噬THP-1細胞(bao)毒性測定(ding)

MTT法測定環肽(tai)對(dui)巨噬細(xi)胞THP-1的毒性(xing)

將穩定感染的巨噬細胞THP-1接種于96孔板，每孔4×10⁴個細胞。向(xiang)孔(kong)內加入RPMI1640培(pei)養(yang)(yang)液(含(han)10％胎(tai)牛血清)100μl，其中分(fen)別(bie)(bie)含(han)有(you)環肽化合物濃度(du)為(wei)(wei)0、0.5、0.8、1.0、1.2、1.5、1.8、2.0mg/mL，直(zhi)鏈肽2.0mg/mL設(she)為(wei)(wei)實驗組，同時用不(bu)含(han)藥物的(de)RPMI1640培(pei)養(yang)(yang)液為(wei)(wei)空白對(dui)照(zhao)，含(han)0.4μg/mL的(de)異煙肼(INH)為(wei)(wei)陽(yang)性對(dui)照(zhao)。分(fen)別(bie)(bie)于(yu)0d、4d及7d向(xiang)96孔(kong)細胞培(pei)養(yang)(yang)板上(shang)每(mei)(mei)孔(kong)加入10μL濃度(du)為(wei)(wei)5mg/ml的(de)MTT，繼(ji)續培(pei)養(yang)(yang)4h，培(pei)養(yang)(yang)結(jie)束，取出細胞培(pei)養(yang)(yang)板，離心棄上(shang)清，每(mei)(mei)孔(kong)加100μL DMSO，混勻后室溫放置20min，于(yu)570nm檢(jian)測吸光值(zhi)。按下(xia)述公(gong)式計(ji)算(suan)巨噬細胞存活率。

細(xi)胞(bao)給予(yu)0.5～2.0mg/mL不同(tong)劑量多(duo)肽，給藥后第(di)4d和第(di)7d采用MTT法檢測(ce)細(xi)胞(bao)存活(huo)率。同(tong)時設空(kong)白對照(zhao)組和INH(終(zhong)濃度為(wei)0.4mg/mL)對照(zhao)組。檢測(ce)結果如(ru)表2所(suo)示。

表2 570nm OD值對應細胞存活率

^*P<0.05，^**P<0.01與(yu)直(zhi)鏈肽組比較

從(cong)表(biao)2可以看出，給(gei)藥后，環(huan)肽(tai)化合物組(zu)隨(sui)著(zhu)給(gei)藥劑量的增加(jia)，細胞(bao)存活(huo)(huo)(huo)率(lv)呈劑量依賴性降(jiang)低，而且第7d細胞(bao)存活(huo)(huo)(huo)率(lv)明(ming)(ming)顯低于第4d細胞(bao)存活(huo)(huo)(huo)率(lv)。同(tong)樣(yang)濃(nong)度下，直鏈肽(tai)組(zu)細胞(bao)存活(huo)(huo)(huo)率(lv)明(ming)(ming)顯低于環(huan)肽(tai)組(zu)，INH組(zu)細胞(bao)存活(huo)(huo)(huo)率(lv)低于肽(tai)類(lei)化合物組(zu)。說明(ming)(ming)環(huan)肽(tai)對于巨噬細胞(bao)THP-1的毒(du)性遠遠小于直鏈肽(tai)。

3、肽類化合物對巨噬細胞胞內結核桿菌細菌H₃₇Ra抑制作用的測定

結核桿菌與巨噬細胞的比例為10：1(H₃₇Ra濃度1×10⁷/mL，THP-1細胞密度1×10⁶/mL)混合，在終濃度為100mmol/L的丙二(er)醇(chun)甲醚醋酸酯(zhi)(PMA)中誘導(dao)細(xi)胞(bao)分化(hua)。96孔(kong)(kong)板每(mei)孔(kong)(kong)加(jia)(jia)100μL菌懸液(ye)，感染(ran)4h后(hou)，每(mei)孔(kong)(kong)加(jia)(jia)含不(bu)同(tong)濃度目(mu)的肽(tai)100μL繼續培(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)，環肽(tai)化(hua)合物給藥濃度為0、0.5、0.8、1.0、1.2、1.5、1.8、2.0mg/mL，直鏈肽(tai)給藥濃度為2.0mg/mL。同(tong)時(shi)(shi)用RPMI-1640完全培(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)液(ye)做空(kong)白對(dui)照(zhao)，4mg/mL的異煙肼(INH)做陽性對(dui)照(zhao)。以此時(shi)(shi)作(zuo)為細(xi)菌感染(ran)零時(shi)(shi)，分別(bie)于感染(ran)后(hou)0、4及(ji)7d去除(chu)板上培(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)液(ye)，每(mei)孔(kong)(kong)加(jia)(jia)入50μL 1％Triton X-100裂(lie)(lie)(lie)解(jie)細(xi)胞(bao)。待(dai)其(qi)全部裂(lie)(lie)(lie)解(jie)后(hou)，每(mei)孔(kong)(kong)加(jia)(jia)50μL RPMI-1640細(xi)胞(bao)培(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)液(ye)終止裂(lie)(lie)(lie)解(jie)。混勻后(hou)每(mei)孔(kong)(kong)分別(bie)作(zuo)1：10和1：100稀釋，接種于正常培(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)基37℃培(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)18d后(hou)計CFU，結(jie)果如表3所示。

表3 H₃₇Ra菌落計數(Log₁₀CFU/孔)

^*P<0.05，^**P<0.01與空白組比較

從表3可以看出，以結核桿菌H₃₇Ra感染THP-1細胞，吞噬對照菌落計數表明細菌已經被細胞有效吞噬。菌落計數表明，H₃₇Ra感(gan)染THP-1細(xi)(xi)(xi)胞后(hou)細(xi)(xi)(xi)菌(jun)可在細(xi)(xi)(xi)胞內(nei)繁殖，隨著感(gan)染時(shi)(shi)間的(de)(de)延長細(xi)(xi)(xi)菌(jun)數(shu)量增加(jia)。當環肽終(zhong)濃度(du)為(wei)(wei)0.5mg/mL時(shi)(shi)，與空(kong)白(bai)對照(zhao)相(xiang)比，胞內(nei)細(xi)(xi)(xi)菌(jun)即開始下(xia)降，當環肽終(zhong)濃度(du)為(wei)(wei)1.0mg/mL時(shi)(shi)，與空(kong)白(bai)組相(xiang)比，出現(xian)顯著性(xing)差(cha)異。當環肽終(zhong)濃度(du)為(wei)(wei)1.5mg/mL時(shi)(shi)，與空(kong)白(bai)組相(xiang)比，出現(xian)極(ji)其顯著性(xing)差(cha)異，細(xi)(xi)(xi)菌(jun)的(de)(de)生(sheng)長被明顯抑制。這說(shuo)明細(xi)(xi)(xi)菌(jun)感(gan)染后(hou)，隨著給藥(yao)濃度(du)的(de)(de)增加(jia)，細(xi)(xi)(xi)菌(jun)菌(jun)落數(shu)逐漸減少。但在較低濃度(du)(低于1.2mg/mL)時(shi)(shi)，4d的(de)(de)抑制率(lv)明顯不如7d的(de)(de)抑制率(lv)。說(shuo)明較高濃度(du)(高于1.5mg/mL)抑菌(jun)效果(guo)更佳(jia)。

在表3中也(ye)可以看到隨(sui)時間(jian)增(zeng)加INH對(dui)照(zhao)組較其他(ta)加藥組菌(jun)落數多(duo)，這是(shi)因為INH作(zuo)(zuo)用(yong)期間(jian)胞(bao)內吞噬(shi)細(xi)菌(jun)處于(yu)休眠狀態，而多(duo)肽是(shi)對(dui)細(xi)胞(bao)和細(xi)菌(jun)同時作(zuo)(zuo)用(yong)。

4、環肽在(zai)血(xue)漿中的穩定性實驗

將180μL乙腈沉淀后的血(xue)漿于(yu)37℃孵(fu)育5min。分別(bie)取(qu)20μL濃度為12mg/mL的直鏈肽(tai)和(he)環肽(tai)置于(yu)正在孵(fu)育的血(xue)漿中，震蕩(dang)均勻后 迅速取(qu)出20μL混合液置于(yu)離(li)心管中，將其(qi)記(ji)為0min樣(yang)(yang)品，然后分別(bie)在5，10，15，20，25，30min各取(qu)出20μL樣(yang)(yang)品。

酶解過(guo)程(cheng)的(de)終(zhong)止：在取出的(de)樣品(pin)中(zhong)加入90μL乙腈振蕩混勻后，將樣品(pin)置于冰(bing)上5min，再用90μL(體積分數為0.5％)的(de)冰(bing)醋酸稀釋終(zhong)止酶解過(guo)程(cheng)。以13000r/min離心15min，取上清液，高(gao)效液相色譜(pu)儀(yi)進行分析，直(zhi)鏈(lian)肽(tai)(tai)和環肽(tai)(tai)的(de)半衰期分別為6min和16.5min，即(ji)環肽(tai)(tai)比直(zhi)鏈(lian)肽(tai)(tai)的(de)半衰期延長(chang)175％。說明環肽(tai)(tai)的(de)穩定性(xing)較相應的(de)直(zhi)鏈(lian)肽(tai)(tai)大大增加。

以上藥效學試驗(yan)表明(ming)環肽化合物的最低(di)抑菌(jun)濃度遠(yuan)遠(yuan)小于(yu)直(zhi)鏈(lian)肽，其細(xi)胞毒性與(yu)直(zhi)鏈(lian)肽相比遠(yuan)遠(yuan)降低(di)，環肽化合物對細(xi)胞內H37Ra菌(jun)具有明(ming)顯的抑制作用，在(zai)血漿中的穩(wen)定性實驗(yan)結果表明(ming)其穩(wen)定性大大增加(jia)。說明(ming)本發(fa)明(ming)的環肽化合物具有預防和治療結核桿菌(jun)的作用。

綜上可知，環(huan)肽(tai)(tai)與直鏈肽(tai)(tai)相比(bi)毒性(xing)更(geng)低、抑菌活(huo)性(xing)更(geng)強(qiang)，穩定性(xing)更(geng)強(qiang)，說(shuo)明本(ben)發明的環(huan)肽(tai)(tai)化合物在(zai)預防和治療結核桿菌方面具(ju)有實質的突出特點和顯著的技術進步。

附圖說明

圖1為環肽化合物質譜圖。

下(xia)面結合實(shi)施例對本發(fa)明(ming)作進一步詳(xiang)細說(shuo)明(ming)。但下(xia)述(shu)的實(shi)施例僅(jin)僅(jin)是(shi)本發(fa)明(ming)的簡易(yi)例子(zi)，并不代表或限制本發(fa)明(ming)的權(quan)利(li)保(bao)護范圍(wei)，本發(fa)明(ming)的保(bao)護范圍(wei)以權(quan)利(li)要(yao)求書為準。

具體實施方式

實施例1直(zhi)連肽的(de)合(he)成(cheng)

1、樹脂溶脹：取Rink Amide樹脂1mmol(s＝0.6mmol NH₂/g，100目，交聯度為1.0％)，放入多肽合成(cheng)反應器中，用DMF溶(rong)漲30min，排干(gan)，加20％哌(pai)啶(PIP/DMF)去保護，洗滌。

2、偶聯：將Fmoc保(bao)護的Leu、HOBT用(yong)DMF完全溶解，加入DIC混合(he)均勻，加入到(dao)反(fan)(fan)(fan)應(ying)器內進(jin)行反(fan)(fan)(fan)應(ying)。整個反(fan)(fan)(fan)應(ying)攪拌充氮，室溫下進(jin)行0.5-2h取少量樹(shu)脂，用(yong)DMF洗滌后(hou)，Kaiser檢測(ce)偶聯反(fan)(fan)(fan)應(ying)完全后(hou)，排干反(fan)(fan)(fan)應(ying)液，樹(shu)脂用(yong)DMF洗滌。

3、Fmoc保護(hu)基(ji)脫除(chu)：加入加20％哌啶(PIP/DMF)去保護(hu)，洗滌。

4、重(zhong)復上述偶聯及Fmoc保(bao)護(hu)(hu)基(ji)脫(tuo)除(chu)步(bu)驟(zou)，依次接入Fmoc-Thr、Fmoc-Gln、Fmoc-His、Fmoc-Leu、Fmoc-Thr、Fmoc-Val，其中投(tou)料比(bi)為(wei)：保(bao)護(hu)(hu)氨基(ji)酸(suan)、HOBT、DIC的投(tou)料摩(mo)爾(er)比(bi)為(wei)1:1:1，樹(shu)脂(zhi)和保(bao)護(hu)(hu)氨基(ji)酸(suan)的投(tou)料摩(mo)爾(er)比(bi)為(wei)1:3。

5、抽(chou)干(gan)(gan)反應(ying)完畢(bi)后的肽樹脂，稱重約得(de)5g。將肽樹脂置反應(ying)器中，按1g肽樹脂∶10ml裂解液(ye)的比(bi)例加入裂解液(ye)(裂解液(ye)：TFA∶EDT∶H2O∶TIS＝95∶2∶2∶1)，室溫攪拌反應(ying)2h，砂(sha)芯(xin)過(guo)濾，收集(ji)濾液(ye)，將濾液(ye)緩慢的加入到冷乙醚中，濾液(ye)與(yu)冷乙醚的體積比(bi)為1：10，靜置30min后，過(guo)濾，收集(ji)沉淀，所得(de)沉淀真空干(gan)(gan)燥后，利用HPLC純(chun)化(hua)得(de)直(zhi)連肽，并通(tong)過(guo)質譜確認(ren)為：Leu-Thr-Gln-His-Leu-Thr-Val，分(fen)子量為811.40。

實施例2肽的環化

1、用水溶解線性肽，使線性肽濃度至0.5mg/ml左右，攪拌下滴加I₂液至氧(yang)化完全，此即得環化肽粗品溶液。

2、用(yong)低壓純化(hua)系統對環肽粗(cu)品進行初(chu)步純化(hua)。根據各批次粗(cu)肽的(de)含量和體(ti)積(ji)，按(an)1g肽/50g樹脂比例上(shang)樣，梯度洗脫，收集目的(de)峰，將收集溶液過(guo)0.22μm有機相(xiang)濾膜、旋蒸濃縮、低溫放置(zhi)備用(yong)。

3、用制(zhi)備(bei)液相對低壓純化液進行精(jing)制(zhi)。條件如下：

流動相A：H₂O+0.1％TFA；流動相B：ACN+0.1％TFA

流速：50ml/min；檢(jian)測波(bo)長：214nm

梯(ti)度：0～8min：5％B～22％B

8～33min：22％B～30％B

33～35min：30％B～50％B

35～43min：50％B

4、分段(duan)收(shou)集組(zu)分，檢測合格后(hou)，減壓濃縮，低(di)溫避光(guang)放置，備用。精制液(ye)脫去TFA或轉鹽、凍(dong)干，得到所需環肽，質譜鑒(jian)定產(chan)物，分子(zi)量(liang)為793.4

5、按(an)上述合成方法(fa)，得到環肽結構式如(ru)下：