一種酶催化合成谷胱甘肽的方法
【專利摘要】本發明公開了一種酶催化合成谷胱甘肽的方法，包括以下步驟：S1、將γ?谷氨酰半胱氨酸合成酶液和谷胱甘肽合成酶液混合，得混合液A，再將混合液A與乙酸激酶液混合，得混合液B；S2、在混合液B中加入固定化載體，攪拌固定化，過濾得固定化酶；S3、將谷氨酸、L?半胱氨酸、甘氨酸、硫酸鎂、ATP、乙酰磷酸配成反應液，加入固定化酶，攪拌反應；S4、反應完成后，過濾反應液，濾液經提取精制成谷胱甘肽。本發明的方法合成效率高：反應液產品含量達到10g/L以上，底物轉化率達到90%以上；通過引入乙酸激酶構建ATP再生偶聯系統，大幅減低ATP的投料量，明顯減低生產成本；固定化酶可以重復利用，穩定性好。
【專利說明】
一種酶催化合成谷胱甘肽的方法
技術領域
[0001]本發明涉及制備谷胱甘肽的方法，特別涉及一種酶催化合成谷胱甘肽的方法。
【背景技術】
[0002]谷胱甘肽(GSH)是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸、甘氨酸縮合而成的一種含γ-2谷氨酰基和巰基的生物活性三肽類化合物，在蛋白質和DNA的合成、氨基酸的轉運、細胞的保護等重要的生物學現象中起著直接或間接作用。它主要分布于動物、植物、微生物細胞中，是生物體內最重要的非蛋白巰基化合物之一，廣泛用于治療肝臟疾病、腫瘤、氧中毒、衰老和內分泌疾病，并已成為醫學重要的具有調節人體免疫功能和輔助抗癌的藥物之一。GSH的抗氧化性又使它在食品工業中的應用備受人們關注，在食品貯藏保鮮和改善產品風味、提高產品營養價值方面的作用越來越被看好。
[0003]目前，谷胱甘肽的生產方法主要有萃取法、化學合成法、發酵法以及酶法。從谷物胚芽中提取GSH，由于GSH得率低、成本高、有機溶劑污染嚴重、純度不高，而且消耗大量糧食，現已較少使用。化學合成法成本高、反應步驟多、反應時間長、操作復雜，于活性產物不易分離，需要化學拆分，產品純度不高，且存在環境污染等問題，難以推廣。目前國內外GSH生產基本采用發酵法，原理是將編碼GSH合成酶系的基因克隆到大腸桿菌或酵母中，使用微生物發酵生產GSH。酵母發酵法，工藝較成熟，但生產周期長，產量偏低，且過多的副產物使下游工藝處理復雜。
[0004]與前幾種方法相比，酶法具有催化專一性強、反應條件溫和、轉化效率高等優點。酶法生產谷胱甘肽是利用合成谷胱甘肽所需的關鍵酶γ -谷氨酰半胱氨酸合成酶及谷胱甘肽合成酶催化，同時添加L-谷氨酸、L-半胱氨酸及甘氨酸等底物，并添加少量三磷酸腺苷來合成谷胱甘肽。
[0005]目前，微生物酶法生產谷胱甘肽所面臨的問題主要有胞壁或生物膜造成的傳質阻礙以及持續有效的ATP能量供應體系。GSH的合成伴隨著ATP的消耗(合成IM GSH需消耗2ΜATP)，由于ATP價格昂貴，直接添加ATP顯著增加了酶法合成GSH的成本，并且高濃度的ATP及其代謝產物ADP的存在還會強烈抑制GSH合成酶的活性，因此目前酶法生產GSH都采用ATP再生，主要采用酵母細胞再生的方式。但使用酵母會在反應體系中引入色素等雜質，給進一步純化增加難度，使用酶系再生ATP是近年來的研究方向。
[0006]固定化酶是一種將酶固定于載體上的技術。一般地，經過固定化的酶本身還是溶于水的，只是用物理的或化學的方法使酶與水不溶性大分子載體結合或把酶包埋在其中，使得酶的流動性降低。目前固定后的酶雖然穩定性增加，易從反應系統中分離，便于運輸和貯存，但是活性降低。
[0007]由于上述原因，迫切需要突破酶法生產GSH的瓶頸，開發相應的酶催化合成谷胱甘肽的方法。
【發明內容】
[0008]本發明的目的是提供一種酶催化合成谷胱甘肽的方法，從而克服現有技術的上述缺陷。
[0009]為達到上述目的，本發明采用以下技術方案:
一種酶催化合成谷胱甘肽的方法，包括以下步驟:
51、將γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶液和谷胱甘肽合成酶液混合，得混合液A，再將混合液A與乙酸激酶液混合，得混合液B;
52、在混合液B中加入固定化載體，攪拌固定化，過濾得固定化酶；
53、將谷氨酸、L-半胱氨酸、甘氨酸、硫酸鎂、ΑΤΡ、乙酰磷酸配成反應液，加入固定化酶，攪拌反應；
54、反應完成后，過濾反應液，濾液經提取精制成谷胱甘肽。
[0010]進一步地，所述混合液A由γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶液和谷胱甘肽合成酶液按酶蛋白量1: 0.3?I的比例混合而得。
[0011 ]進一步地，所述混合液B由混合液A與乙酸激酶液按酶蛋白量1: 0.5?2的比例混合而得。
[0012]進一步地，所述固定化載體為甲殼胺-娃膠復合物。
[0013]進一步地，所述固定化載體按照以下方法制備:稱取I重量份甲殼胺加入100?200重量份的0.5?2wt%醋酸溶液中，攪拌溶解，再加入5?20重量份粒徑為0.1-0.5mm的硅膠顆粒，攪拌8?15h，過濾后加入80?120重量份0.5?lmol/L氫氧化鈉溶液浸泡I?3h，使甲殼胺和硅膠顆粒均勻結合在一起，過濾并用純化水清洗至中性，加入80?120重量份的I?3wt%戊二醛溶液，攪拌2?5h，進行交聯反應和活化甲殼胺基團，過濾后用純化水清洗2?3次得到甲殼胺-硅膠復合物。
[00? 4]進一步地，所述固定化載體的用量是:每20?50mg蛋白加入Ig固定化載體。
[0015]進一步地，步驟S2所述攪拌固定化的條件是:溫度2?10°C，時間I?5h。
[ΟΟ??] 進一步地，所述反應液的配方是:谷氨酸20?60mmol/L、L-半胱氨酸20?60mmol/L、甘氛酸20~601111]101/1^、硫酸儀5~10_01/1^、41?5~101]11]101/1^、乙醜憐酸40~1001]11]101/1^;所述固定化酶的用量是10?50g/L。
[0017]進一步地，步驟S3所述攪拌反應的條件是:用氫氧化鈉調節反應液pH為5.0-8.0,反應溫度25?35 °C，反應時間2?6h。
[0018]本發明設計了一種固定化酶催化合成谷胱甘肽的工藝方法，其特點是把γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶、谷胱甘肽合成酶和乙酸激酶三種酶混合固定化在同一載體上，所得固定化酶與氨基酸、ATP等底物投入到反應器，一步合成谷胱甘肽。
[0019]本發明具有以下有益效果:
1、合成效率高:合成時間大幅降低至2?6h，在優選條件下反應液產品含量達到10g/L以上，底物轉化率(以L-半胱氨酸計算)達到90%以上。
[0020]2、降低成本:本發明的固定化酶含3個酶蛋白，其中γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶液和谷胱甘肽合成酶實現合成谷胱甘肽功能，乙酸激酶實現ATP再生利用功能，通過引入乙酸激酶構建ATP再生偶聯系統，大幅減低ATP的投料量，明顯減低生產成本。
[0021]3、工藝簡化:相比于發酵法和現有的酶催化合成法，本發明采用固定化酶一步催化合成谷胱甘肽，合成后反應液經過簡單的固液分離后，產品液不殘留菌體、酶蛋白、宿主菌DNA或蛋白質等，只要經過簡單的提取步驟即可獲得高質量的精制品。
[0022]4、環保節能:合成條件溫和，常溫常壓，反應時間短，節能降耗效果明顯，工藝過程產生三廢非常少，不影響車間和周邊環境。
[0023]5、固定化酶可以重復利用，而且穩定性好，連續50批次使用后，固定化酶的酶活損失不足10%。
[0024]6、固定化載體為自制甲殼胺-硅膠復合載體，價格低廉，而且具有更好的固酶效果O
【具體實施方式】
[0025]下面結合具體實施例對本發明做進一步的說明:
以下實施例所用γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶、谷胱甘肽合成酶、乙酸激酶由基因工程菌發酵表達相應的酶蛋白，然后經過鎳柱提取純化后獲得高純度的酶蛋白。
[0026]實施例1
按照以下步驟合成谷胱甘肽:
1、將γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶液和谷胱甘肽合成酶液按酶蛋白量1:1的比例混合，得混合液Α，再將混合液A與乙酸激酶液按酶蛋白量1:1的比例混合，得混合液B;
2、在混合液B中加入固定化載體，攪拌固定化，條件是:溫度5°C，時間3h，過濾得固定化酶；固定化載體的用量是:每40mg蛋白加入Ig固定化載體；固定化載體按照以下方法制備:稱取I重量份甲殼胺加入150重量份的lwt%醋酸溶液中，攪拌溶解，再加入10重量份粒徑為
0.1-0.5mm的硅膠顆粒，攪拌12h，過濾后加入100重量份0.5mol/L氫氧化鈉溶液浸泡2h，使甲殼胺和硅膠顆粒均勻結合在一起，過濾并用純化水清洗至中性，加入100重量份的2被%戊二醛溶液，攪拌4h，進行交聯反應和活化甲殼胺基團，過濾后用純化水清洗2?3次得到甲殼胺-硅膠復合物，通過交聯后甲殼胺-硅膠復合物機械強度大幅提高，活化后的復合物作為固定化載體，加入純化的酶蛋白，通過共價結合制備出穩定的固定化酶；
3、將谷氨酸2011111101/]^、1^-半胱氨酸201]111101/]^、甘氨酸201]111101/]^、硫酸鎂51]111101/1^、ATP5mmol/L、乙酰磷酸40mmol/L配成反應液，加入10g/L固定化酶，攪拌反應:用氫氧化鈉調節反應液pH為6.0左右，反應溫度30 0C左右，反應時間5h;產品谷胱甘肽的濃度5.6g/L、底物轉化率91%，可見在低底物濃度條件下合成反應的轉化率較高；
4、反應完成后，過濾反應液，濾液經提取精制成谷胱甘肽。
[0027]實施例2
按照以下步驟合成谷胱甘肽:
1、將γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶液和谷胱甘肽合成酶液按酶蛋白量1:1的比例混合，得混合液Α，再將混合液A與乙酸激酶液按酶蛋白量1:1的比例混合，得混合液B;
2、在混合液B中加入固定化載體，攪拌固定化，條件是:溫度5°C，時間3h，過濾得固定化酶；固定化載體的用量是:每40mg蛋白加入Ig固定化載體；固定化載體按照以下方法制備:稱取I重量份甲殼胺加入200重量份的0.5wt%醋酸溶液中，攪拌溶解，再加入20重量份粒徑為0.1-0.5mm的硅膠顆粒，攪拌8h，過濾后加入120重量份0.5mol/L氫氧化鈉溶液浸泡3h，使甲殼胺和硅膠顆粒均勻結合在一起，過濾并用純化水清洗至中性，加入120重量份的3被%戊二醛溶液，攪拌5h，進行交聯反應和活化甲殼胺基團，過濾后用純化水清洗2?3次得到甲殼胺-硅膠復合物；
3、將谷氨酸60mmol/L、L-半胱氨酸60mmol/L、甘氨酸60mmol/L、硫酸鎂10mmol/L、ATP10mmol/L、乙酰磷酸100mmol/L配成反應液，加入50g/L固定化酶，攪拌反應:用氫氧化鈉調節反應液pH為6.0左右，反應溫度30 °C左右，反應時間6h;產品谷胱甘肽的濃度15.0g/L、底物轉化率(以L-半胱氨酸計算，下同)81%，在大幅提高底物濃度后，雖然谷胱甘肽的濃度提高，但是合成反應的轉化率有較大幅度降低；
4、反應完成后，過濾反應液，濾液經提取精制成谷胱甘肽。
[0028]實施例3
按照以下步驟合成谷胱甘肽:
1、將γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶液和谷胱甘肽合成酶液按酶蛋白量1:1的比例混合，得混合液Α，再將混合液A與乙酸激酶液按酶蛋白量1:1的比例混合，得混合液B;
2、在混合液B中加入固定化載體，攪拌固定化，條件是:溫度5°C，時間3h，過濾得固定化酶；固定化載體的用量是:每40mg蛋白加入Ig固定化載體；固定化載體按照以下方法制備:稱取I重量份甲殼胺加入1 O重量份的2wt %醋酸溶液中，攪拌溶解，再加入5重量份粒徑為
0.1-0.5mm的硅膠顆粒，攪拌15h，過濾后加入80重量份0.8mol/L氫氧化鈉溶液浸泡Ih，使甲殼胺和硅膠顆粒均勻結合在一起，過濾并用純化水清洗至中性，加入80重量份的1?〖%戊二醛溶液，攪拌2h，進行交聯反應和活化甲殼胺基團，過濾后用純化水清洗2?3次得到甲殼胺-硅膠復合物；
3、將谷氨酸60mmol/L、L-半胱氨酸40mmol/L、甘氨酸60mmol/L、硫酸鎂10mmol/L、ATP10mmol/L、乙酰磷酸80mmol/L配成反應液，加入50g/L固定化酶，攪拌反應:用氫氧化鈉調節反應液pH為6.0左右，反應溫度30°C左右，反應時間5h;產品谷胱甘肽的濃度11.5g/L、底物轉化率94%，綜合考慮生產效率和經濟效益間的平衡，適當調整合成配方，降低其中成本較高L-半胱氨酸的投料濃度，合成反應的產率和轉化率均可達到滿意效果；
4、反應完成后，過濾反應液，濾液經提取精制成谷胱甘肽。
[0029]實施例4
按照以下步驟合成谷胱甘肽:
1、將γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶液和谷胱甘肽合成酶液按酶蛋白量1: 0.3的比例混合，得混合液A，再將混合液A與乙酸激酶液按酶蛋白量1: 0.5的比例混合，得混合液B;
2、在混合液B中加入固定化載體，攪拌固定化，條件是:溫度2°C，時間5h，過濾得固定化酶；固定化載體的用量是:每20mg蛋白加入Ig固定化載體；固定化載體按照以下方法制備:稱取I重量份甲殼胺加入180重量份的1.5wt%醋酸溶液中，攪拌溶解，再加入15重量份粒徑為0.1?0.5mm的娃膠顆粒，攪拌1h，過濾后加入90重量份0.8mol/L氫氧化鈉溶液浸泡2h，使甲殼胺和硅膠顆粒均勻結合在一起，過濾并用純化水清洗至中性，加入100重量份的2被%戊二醛溶液，攪拌3h，進行交聯反應和活化甲殼胺基團，過濾后用純化水清洗2?3次得到甲殼胺-硅膠復合物；
3、將谷氨酸4011111101/]^、1^-半胱氨酸301]111101/]^、甘氨酸501]111101/]^、硫酸鎂81]111101/1^、ATP9mmol/L、乙酰磷酸80mmol/L配成反應液，加入40g/L固定化酶，攪拌反應:用氫氧化鈉調節反應液pH為8.0左右，反應溫度35 °C左右，反應時間2h ；
4、反應完成后，過濾反應液，濾液經提取精制成谷胱甘肽。
[0030]實施例5
按照以下步驟合成谷胱甘肽:
1、將γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶液和谷胱甘肽合成酶液按酶蛋白量1:3的比例混合，得混合液A，再將混合液A與乙酸激酶液按酶蛋白量1:2的比例混合，得混合液B;
2、在混合液B中加入固定化載體，攪拌固定化，條件是:溫度10°C，時間2h，過濾得固定化酶；固定化載體的用量是:每50mg蛋白加入Ig固定化載體；固定化載體按照以下方法制備:稱取I重量份甲殼胺加入130重量份的lwt°/cif酸溶液中，攪拌溶解，再加入12重量份粒徑為0.1-0.5mm的硅膠顆粒，攪拌I Ih，過濾后加入100重量份0.7mol/L氫氧化鈉溶液浸泡2h，使甲殼胺和娃膠顆粒均勾結合在一起，過濾并用純化水清洗至中性，加入100重量份的2wt%戊二醛溶液，攪拌4h，進行交聯反應和活化甲殼胺基團，過濾后用純化水清洗2?3次得到甲殼胺-硅膠復合物；
3、將谷氨酸5011111101/]^、1^-半胱氨酸401]111101/]^、甘氨酸301]111101/]^、硫酸鎂61]111101/1^、ATP7mmol/L、乙酰磷酸50mmol/L配成反應液，加入30g/L固定化酶，攪拌反應:用氫氧化鈉調節反應液pH為5.0左右，反應溫度25 °C左右，反應時間6h ；
4、反應完成后，過濾反應液，濾液經提取精制成谷胱甘肽。
[0031 ] 實施例6
固定化酶穩定性試驗:
按照實施例1的步驟進行，區別在于:谷氨酸25mmol/L、L-半胱氨酸20mmol/L、甘氨酸25臟01凡、硫酸鎂51111]101凡、41?51]11]101/1^、乙酰磷酸401111]101凡;固定化酶的用量是158凡，反應時間4小時，連續反應50批次。結果顯示第一批的結果:反應液谷胱甘肽的濃度5.7g/L、底物轉化率93%;第50批結果:反應液谷胱甘肽的濃度5.2g/L、底物轉化率85%，可見固定化酶具有很好的穩定性，連續50批次使用后，固定化酶的酶活損失不足10%，效果顯著。
[0032]以上所述，僅為本發明的【具體實施方式】，但本發明的保護范圍并不局限于此，任何屬于本技術領域的技術人員在本發明揭露的技術范圍內，可輕易想到的變化或替換，都應涵蓋在本發明的保護范圍之內。因此，本發明的保護范圍應該以權利要求的保護范圍為準。
【主權項】
1.一種酶催化合成谷胱甘肽的方法，其特征在于，包括以下步驟: 51、將γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶液和谷胱甘肽合成酶液混合，得混合液A，再將混合液A與乙酸激酶液混合，得混合液B; 52、在混合液B中加入固定化載體，攪拌固定化，過濾得固定化酶； 53、將谷氨酸、L-半胱氨酸、甘氨酸、硫酸鎂、ΑΤΡ、乙酰磷酸配成反應液，加入固定化酶，攪拌反應； 54、反應完成后，過濾反應液，濾液經提取精制成谷胱甘肽。2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述混合液A由γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶液和谷胱甘肽合成酶液按酶蛋白量1: 0.3?I的比例混合而得。3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述混合液B由混合液A與乙酸激酶液按酶蛋白量1: 0.5?2的比例混合而得。4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述固定化載體為甲殼胺-硅膠復合物。5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述固定化載體按照以下方法制備:稱取I重量份甲殼胺加入100?200重量份的0.5?2wt%醋酸溶液中，攪拌溶解，再加入5?20重量份粒徑為0.1-0.5mm的硅膠顆粒，攪拌8?15h，過濾后加入80?120重量份0.5?lmol/L氫氧化鈉溶液浸泡I?3h，使甲殼胺和硅膠顆粒均勻結合在一起，過濾并用純化水清洗至中性，加入80?120重量份的I?3wt%戊二醛溶液，攪拌2?5h，進行交聯反應和活化甲殼胺基團，過濾后用純化水清洗2?3次得到甲殼胺-硅膠復合物。6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述固定化載體的用量是:每20?50mg蛋白加入Ig固定化載體。7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟S2所述攪拌固定化的條件是:溫度2?10°C，時間I?5h。8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述反應液的配方是:谷氨酸20?eOmmol/1^、1^-半胱1氛酸20~601111]101/1^、甘氛酸20~601111]101/1^、硫酸儀5~101]11]101/1^、41?5~101111]101/1^、乙醜磷酸40?1001111]101凡;所述固定化酶的用量是10~5(^凡。9.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟S3所述攪拌反應的條件是:用氫氧化鈉調節反應液pH為5.0-8.0，反應溫度25?35 °C，反應時間2?6h。
【文檔編號】C12P21/02GK106086126SQ201610745720
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年8月29日
【發明人】劉桂禎, 黃炯威, 周華潤, 莫世藝, 勞偉明, 梁劍鋒
【申請人】開平牽牛生化制藥有限公司