本(ben)申(shen)請(qing)要求(qiu)于(yu)2014年(nian)5月9日提交的美國臨時(shi)專(zhuan)(zhuan)利(li)申(shen)請(qing)No.61/991,423和于(yu)2014年(nian)5月12日提交的美國臨時(shi)專(zhuan)(zhuan)利(li)申(shen)請(qing)No.61/992,152的優先權，所述(shu)臨時(shi)專(zhuan)(zhuan)利(li)申(shen)請(qing)的全部內容以引用的方(fang)式納入本(ben)文(wen)。

基金信息

本發(fa)明是在由國(guo)立衛生研(yan)究院所授予(yu)的基金No.CA034196、HLO77642和DK057199的政府(fu)支(zhi)持下完成的。政府(fu)對本發(fa)明享有某些權利。

技術領域

本(ben)文總(zong)體(ti)上記(ji)載了用(yong)于鑒定改變iRhom多(duo)肽活性的(de)化合物的(de)方法及(ji)其用(yong)途。根據(ju)具體(ti)的(de)方面，本(ben)文公開了用(yong)于鑒定調節iRhom多(duo)肽的(de)蛋白水(shui)解活性(例如，增大、刺激、降低、抑制或消除(chu)iRhom多(duo)肽的(de)蛋白水(shui)解活性)的(de)化合物的(de)方法，以及(ji)其用(yong)途。

背景技術：

菱(ling)(ling)形(xing)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)酶(mei)(mei)(rhomboid protease)是幾乎存在(zai)于所有物種中的(de)酶(mei)(mei)家族。菱(ling)(ling)形(xing)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)酶(mei)(mei)是膜(mo)(mo)內(nei)絲氨酸蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)酶(mei)(mei)，菱(ling)(ling)形(xing)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)酶(mei)(mei)的(de)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)水(shui)解裂解作用對細(xi)(xi)胞調控是重(zhong)要的(de)。膜(mo)(mo)內(nei)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)酶(mei)(mei)的(de)活(huo)性位點(dian)埋在(zai)細(xi)(xi)胞膜(mo)(mo)的(de)脂雙層中，并(bing)且它們在(zai)其他(ta)跨(kua)膜(mo)(mo)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)的(de)跨(kua)膜(mo)(mo)結構域(yu)內(nei)裂解這些跨(kua)膜(mo)(mo)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)。

無活(huo)(huo)性(xing)的(de)菱形蛋(dan)白(bai)(bai)酶(mei)(iRhom)是高度(du)保守的(de)膜內(nei)蛋(dan)白(bai)(bai)。在本發(fa)(fa)明的(de)發(fa)(fa)現(xian)之前，人們認為iRhom由于在推定的(de)活(huo)(huo)性(xing)位點缺少絲氨酸殘基而無蛋(dan)白(bai)(bai)水(shui)解活(huo)(huo)性(xing)。

技術實現要素：

一(yi)方(fang)(fang)面，本發(fa)明(ming)基于(yu)以(yi)下發(fa)現：iRhom是短壽命蛋(dan)(dan)白，但是顯性(xing)(xing)(xing)突變增加它們的(de)蛋(dan)(dan)白穩定(ding)性(xing)(xing)(xing)并刺(ci)激不依賴(lai)于(yu)金屬蛋(dan)(dan)白酶活性(xing)(xing)(xing)的(de)特定(ding)的(de)EGF家族配體雙調(diao)蛋(dan)(dan)白的(de)分泌(mi)。另一(yi)方(fang)(fang)面，本發(fa)明(ming)基于(yu)以(yi)下發(fa)現：哺乳動物iRhom在調(diao)節EGFR信號(hao)傳(chuan)導(dao)(dao)事件(jian)中(zhong)發(fa)揮作(zuo)用，所述EGFR信號(hao)傳(chuan)導(dao)(dao)事件(jian)促(cu)進傷(shang)口加速愈合并引發(fa)腫瘤(liu)發(fa)生。另一(yi)方(fang)(fang)面，本發(fa)明(ming)至少部分基于(yu)以(yi)下發(fa)現：iRhom能夠(gou)與(yu)金屬蛋(dan)(dan)白酶并行調(diao)節EGFR信號(hao)傳(chuan)導(dao)(dao)，并且在受損的(de)傷(shang)口愈合和(he)癌癥(zheng)中(zhong)可用作(zuo)治療(liao)靶(ba)標。

一方面，本發明(ming)提供了(le)鑒定(ding)化合物(wu)的(de)方法，所述化合物(wu)激活(huo)(huo)iRhom多(duo)(duo)肽(tai)對(dui)底物(wu)的(de)蛋(dan)白水解活(huo)(huo)性，所述方法包(bao)括：a)使表達(da)iRhom多(duo)(duo)肽(tai)的(de)細胞與測(ce)試化合物(wu)接觸；以(yi)及b)測(ce)定(ding)iRhom多(duo)(duo)肽(tai)穩(wen)(wen)定(ding)性相對(dui)于合適(shi)對(dui)照的(de)增(zeng)加，其中iRhom多(duo)(duo)肽(tai)穩(wen)(wen)定(ding)性的(de)增(zeng)加表明(ming)所述化合物(wu)激活(huo)(huo)了(le)iRhom多(duo)(duo)肽(tai)對(dui)底物(wu)的(de)蛋(dan)白水解活(huo)(huo)性。

另一方面，本(ben)發(fa)明(ming)提供了鑒定(ding)(ding)(ding)化合物的(de)方法(fa)，所(suo)(suo)述化合物能夠(gou)在受試(shi)者中(zhong)加(jia)(jia)(jia)速(su)傷(shang)口愈(yu)合或組織修復，所(suo)(suo)述方法(fa)包括：使(shi)表達iRhom多肽和EGFR配體(ti)的(de)細胞(bao)與(yu)測試(shi)化合物接觸；b)測定(ding)(ding)(ding)iRhom多肽穩定(ding)(ding)(ding)性相對(dui)于合適對(dui)照的(de)增(zeng)加(jia)(jia)(jia)；以及c)測定(ding)(ding)(ding)細胞(bao)分泌(mi)的(de)EGFR配體(ti)相對(dui)于合適對(dui)照的(de)增(zeng)加(jia)(jia)(jia)，其中(zhong)iRhom多肽穩定(ding)(ding)(ding)性的(de)增(zeng)加(jia)(jia)(jia)和細胞(bao)分泌(mi)的(de)EGFR配體(ti)的(de)增(zeng)加(jia)(jia)(jia)表明(ming)所(suo)(suo)述化合物能夠(gou)加(jia)(jia)(jia)速(su)傷(shang)口愈(yu)合。

另一方(fang)(fang)面，本發明提供(gong)了(le)鑒定(ding)化合(he)物(wu)的(de)(de)方(fang)(fang)法(fa)，所述化合(he)物(wu)抑制(zhi)iRhom多肽的(de)(de)胞(bao)質(zhi)結(jie)構域(yu)，所述方(fang)(fang)法(fa)包括：a)使表達iRhom多肽的(de)(de)細胞(bao)與測試化合(he)物(wu)接觸(chu)；b)測定(ding)iRhom多肽穩定(ding)性(xing)相對(dui)于合(he)適(shi)對(dui)照的(de)(de)增(zeng)加，其中(zhong)iRhom多肽穩定(ding)性(xing)的(de)(de)增(zeng)加表明所述化合(he)物(wu)抑制(zhi)iRhom多肽的(de)(de)胞(bao)質(zhi)結(jie)構域(yu)。

在一個(ge)實施(shi)方案(an)中，所(suo)(suo)述方法還(huan)提(ti)供了通過分析暴露于所(suo)(suo)述化合(he)物后iRhom多肽的半衰(shuai)期來測定(ding)iRhom多肽穩定(ding)性的增加(jia)。

在一些(xie)實(shi)施方案(an)中，所述底物(wu)是(shi)EGFR配體或EGF樣底物(wu)。

在(zai)另(ling)一(yi)個實(shi)施方案中，通(tong)過(guo)檢測(ce)(ce)EGFR配(pei)體分泌的增(zeng)加來測(ce)(ce)定(ding)iRhom多(duo)(duo)肽穩(wen)定(ding)性的增(zeng)加。在(zai)另(ling)一(yi)個實(shi)施方案中，通(tong)過(guo)檢測(ce)(ce)可溶性EGFR配(pei)體水平的增(zeng)加來測(ce)(ce)定(ding)iRhom多(duo)(duo)肽穩(wen)定(ding)性的增(zeng)加。在(zai)一(yi)些實(shi)施方案中，所述EGFR配(pei)體選自AREG、HB-EGF、TGFα和EPGN。

在另一個(ge)實施(shi)方案中，通過檢測EGFR信號傳(chuan)導活(huo)性的增(zeng)(zeng)加來測定(ding)iRhom多肽穩定(ding)性的增(zeng)(zeng)加。

在另一(yi)個實施方案(an)中，本(ben)發(fa)明的化(hua)合物抑制iRhom多肽和蛋(dan)白酶體之間的相互作用。

在另一個實施(shi)方案(an)中，所述化合物使iRhom多肽的(de)胞(bao)(bao)質結構域失活(huo)。在一些(xie)實施(shi)方案(an)中，所述胞(bao)(bao)質結構域的(de)失活(huo)是(shi)短暫的(de)。

在(zai)一個實(shi)施(shi)(shi)方(fang)(fang)案中(zhong)，本(ben)發明的化合物使iRhom多肽的胞質結構域裂(lie)解(jie)和/或缺失，以使所述多肽具有(you)蛋白水解(jie)活性(xing)(xing)或改變(bian)的生物活性(xing)(xing)。在(zai)一些(xie)實(shi)施(shi)(shi)方(fang)(fang)案中(zhong)，小鼠iRhom2在(zai)第1至(zhi)(zhi)(zhi)268位(wei)氨基(ji)酸(suan)殘基(ji)之間(jian)被裂(lie)解(jie)，或人(ren)iRhom2在(zai)第1至(zhi)(zhi)(zhi)298位(wei)氨基(ji)酸(suan)殘基(ji)之間(jian)被裂(lie)解(jie)。在(zai)其他實(shi)施(shi)(shi)方(fang)(fang)案中(zhong)，小鼠iRhom1在(zai)第1至(zhi)(zhi)(zhi)272位(wei)氨基(ji)酸(suan)殘基(ji)之間(jian)被裂(lie)解(jie)，或人(ren)iRhom1在(zai)第1至(zhi)(zhi)(zhi)316位(wei)氨基(ji)酸(suan)殘基(ji)之間(jian)被裂(lie)解(jie)。在(zai)另一個實(shi)施(shi)(shi)方(fang)(fang)案中(zhong)，所述化合物激活iRhom多肽的肽酶域。

在(zai)一個(ge)實(shi)施方案(an)中，所(suo)述iRhom多(duo)肽(tai)是iRhom1或iRhom2。在(zai)另(ling)一個(ge)實(shi)施方案(an)中，所(suo)述iRhom多(duo)肽(tai)是人或小鼠iRhom多(duo)肽(tai)。

在(zai)一(yi)個實(shi)施方(fang)案(an)中(zhong)，本發明的化合(he)物(wu)(wu)(wu)選自小分子、肽(tai)(tai)或多肽(tai)(tai)誘(you)餌(decoy)。在(zai)另(ling)一(yi)個實(shi)施方(fang)案(an)中(zhong)，所(suo)述化合(he)物(wu)(wu)(wu)連接(jie)至細胞穿透(tou)肽(tai)(tai)。在(zai)另(ling)一(yi)個實(shi)施方(fang)案(an)中(zhong)，所(suo)述化合(he)物(wu)(wu)(wu)是(shi)細胞可透(tou)過性的。在(zai)另(ling)一(yi)個實(shi)施方(fang)案(an)中(zhong)，所(suo)述化合(he)物(wu)(wu)(wu)是(shi)泛(fan)素(su)蛋白酶抑制劑。

在一(yi)個(ge)實(shi)施方案(an)中(zhong)，本發明(ming)的(de)化合物加速角化細(xi)(xi)胞的(de)遷移(yi)。在另一(yi)個(ge)實(shi)施方案(an)中(zhong)，所述化合物加速成纖(xian)維細(xi)(xi)胞的(de)增殖。

一方面，本(ben)發明提供了鑒定化合(he)(he)物(wu)(wu)的(de)(de)方法，所述(shu)化合(he)(he)物(wu)(wu)抑制iRhom多(duo)肽(tai)(tai)對底(di)物(wu)(wu)的(de)(de)蛋(dan)白水(shui)解(jie)活(huo)性，所述(shu)方法包括：a)使表(biao)達iRhom多(duo)肽(tai)(tai)的(de)(de)細胞與測(ce)試化合(he)(he)物(wu)(wu)接觸；以及b)測(ce)定iRhom多(duo)肽(tai)(tai)的(de)(de)生理靶(ba)標(biao)的(de)(de)分泌(mi)相對于合(he)(he)適對照的(de)(de)減少(shao)，或(huo)EGFR活(huo)性相對于合(he)(he)適對照的(de)(de)降低，其中iRhom多(duo)肽(tai)(tai)的(de)(de)生理靶(ba)標(biao)分泌(mi)的(de)(de)減少(shao)或(huo)EGFR活(huo)性的(de)(de)降低表(biao)明所述(shu)化合(he)(he)物(wu)(wu)抑制iRhom多(duo)肽(tai)(tai)對底(di)物(wu)(wu)的(de)(de)蛋(dan)白水(shui)解(jie)活(huo)性。

另(ling)一(yi)方面，本發明(ming)提(ti)供了鑒定化(hua)合(he)物(wu)的(de)(de)(de)方法(fa)，所述化(hua)合(he)物(wu)能夠在受(shou)試者中降(jiang)低腫瘤生(sheng)(sheng)長和(he)/或(huo)進(jin)(jin)展或(huo)治(zhi)療癌(ai)癥(zheng)，所述方法(fa)包括：a)使表達iRhom多肽的(de)(de)(de)細胞與測試化(hua)合(he)物(wu)接觸；以及b)測定iRhom多肽的(de)(de)(de)生(sheng)(sheng)理靶標的(de)(de)(de)分泌相對于合(he)適對照(zhao)的(de)(de)(de)減少(shao)，或(huo)EGFR活性相對于合(he)適對照(zhao)的(de)(de)(de)降(jiang)低，其中iRhom多肽的(de)(de)(de)生(sheng)(sheng)理靶標分泌的(de)(de)(de)減少(shao)或(huo)EGFR活性的(de)(de)(de)降(jiang)低表明(ming)所述化(hua)合(he)物(wu)能夠在受(shou)試者中降(jiang)低腫瘤生(sheng)(sheng)長和(he)/或(huo)進(jin)(jin)展或(huo)治(zhi)療癌(ai)癥(zheng)。

另(ling)一方面，本發明提供了鑒定化(hua)合物(wu)的(de)(de)方法，所述(shu)化(hua)合物(wu)能(neng)夠在受試者中(zhong)促進毛發生長，所述(shu)方法包括：a)使表(biao)達iRhom多肽(tai)的(de)(de)細胞與測試化(hua)合物(wu)接觸；以及b)測定iRhom多肽(tai)的(de)(de)生理靶標的(de)(de)分泌相對(dui)于(yu)合適對(dui)照的(de)(de)減(jian)少，或EGFR活性相對(dui)于(yu)合適對(dui)照的(de)(de)降(jiang)低，其中(zhong)iRhom多肽(tai)的(de)(de)生理靶標分泌的(de)(de)減(jian)少或EGFR活性的(de)(de)降(jiang)低表(biao)明所述(shu)化(hua)合物(wu)能(neng)夠在受試者中(zhong)促進毛發生長。

在(zai)一(yi)個(ge)實施(shi)(shi)方案(an)(an)中(zhong)，所述腫瘤是(shi)(shi)實體瘤。在(zai)一(yi)些實施(shi)(shi)方案(an)(an)中(zhong)，所述癌(ai)(ai)(ai)(ai)(ai)癥是(shi)(shi)上皮癌(ai)(ai)(ai)(ai)(ai)。在(zai)其(qi)他實施(shi)(shi)方案(an)(an)中(zhong)，所述癌(ai)(ai)(ai)(ai)(ai)癥是(shi)(shi)食管(guan)癌(ai)(ai)(ai)(ai)(ai)、肺癌(ai)(ai)(ai)(ai)(ai)、腦癌(ai)(ai)(ai)(ai)(ai)、結腸癌(ai)(ai)(ai)(ai)(ai)、腎癌(ai)(ai)(ai)(ai)(ai)、前列腺(xian)癌(ai)(ai)(ai)(ai)(ai)、皮膚癌(ai)(ai)(ai)(ai)(ai)、肝(gan)癌(ai)(ai)(ai)(ai)(ai)、胰腺(xian)癌(ai)(ai)(ai)(ai)(ai)、胃癌(ai)(ai)(ai)(ai)(ai)、子(zi)宮癌(ai)(ai)(ai)(ai)(ai)、卵巢(chao)癌(ai)(ai)(ai)(ai)(ai)、乳腺(xian)癌(ai)(ai)(ai)(ai)(ai)、淋巴腺(xian)癌(ai)(ai)(ai)(ai)(ai)或膀(bang)胱癌(ai)(ai)(ai)(ai)(ai)。

在一個實(shi)施方案中(zhong)，所(suo)述底物是EGFR配體(ti)或EGF樣底物。

在(zai)另一個實(shi)(shi)施方案(an)中，通過(guo)檢測iRhom多肽的(de)(de)生理(li)靶標分泌的(de)(de)減少來(lai)測定(ding)對iRhom多肽的(de)(de)蛋白水(shui)(shui)解(jie)活(huo)性的(de)(de)抑制。在(zai)一些實(shi)(shi)施方案(an)中，所述iRhom多肽的(de)(de)生理(li)靶標是(shi)EGFR配體。在(zai)一個實(shi)(shi)施方案(an)中，通過(guo)檢測可(ke)溶性EGFR配體水(shui)(shui)平的(de)(de)下降來(lai)測定(ding)對iRhom多肽的(de)(de)蛋白水(shui)(shui)解(jie)活(huo)性的(de)(de)抑制。在(zai)其他(ta)實(shi)(shi)施方案(an)中，所述EGFR配體選自AREG、HB-EGF、TGFα和EPGN。

在一個實(shi)施方案中，通過檢測(ce)EGFR活性(xing)的(de)降(jiang)低來(lai)測(ce)定(ding)對(dui)iRhom多肽的(de)蛋(dan)白水解活性(xing)的(de)抑制。

在另(ling)一個實(shi)施方案中，所述化合物抑制iRhom多肽(tai)的肽(tai)酶域。

在另一(yi)個(ge)實施(shi)方案(an)中，所(suo)述化(hua)合(he)物(wu)通過使(shi)iRhom多(duo)肽肽酶域的蛋白(bai)水解(jie)位(wei)(wei)(wei)點(dian)中的一(yi)個(ge)或多(duo)個(ge)氨(an)(an)(an)基(ji)(ji)酸(suan)(suan)殘(can)(can)(can)基(ji)(ji)失(shi)活來影響(xiang)iRhom多(duo)肽的活性。在一(yi)個(ge)實施(shi)方案(an)中，所(suo)述iRhom多(duo)肽是(shi)小鼠iRhom2，并且所(suo)述化(hua)合(he)物(wu)使(shi)小鼠iRhom2的蛋白(bai)水解(jie)位(wei)(wei)(wei)點(dian)中的一(yi)個(ge)或多(duo)個(ge)氨(an)(an)(an)基(ji)(ji)酸(suan)(suan)殘(can)(can)(can)基(ji)(ji)失(shi)活，所(suo)述氨(an)(an)(an)基(ji)(ji)酸(suan)(suan)殘(can)(can)(can)基(ji)(ji)選(xuan)自TM螺旋(xuan)(xuan)2上(shang)的第635位(wei)(wei)(wei)組(zu)氨(an)(an)(an)酸(suan)(suan)、TM螺旋(xuan)(xuan)4上(shang)的第695位(wei)(wei)(wei)谷(gu)氨(an)(an)(an)酰(xian)胺、TM螺旋(xuan)(xuan)4上(shang)的第701位(wei)(wei)(wei)半(ban)胱(guang)氨(an)(an)(an)酸(suan)(suan)和(he)(he)TM螺旋(xuan)(xuan)6上(shang)的第744位(wei)(wei)(wei)組(zu)氨(an)(an)(an)酸(suan)(suan)。在其他(ta)實施(shi)方案(an)中，所(suo)述iRhom多(duo)肽是(shi)人(ren)(ren)iRhom2，并且所(suo)述化(hua)合(he)物(wu)使(shi)人(ren)(ren)iRhom2的蛋白(bai)水解(jie)位(wei)(wei)(wei)點(dian)中的一(yi)個(ge)或多(duo)個(ge)氨(an)(an)(an)基(ji)(ji)酸(suan)(suan)殘(can)(can)(can)基(ji)(ji)失(shi)活，所(suo)述氨(an)(an)(an)基(ji)(ji)酸(suan)(suan)殘(can)(can)(can)基(ji)(ji)選(xuan)自TM螺旋(xuan)(xuan)2上(shang)的第664位(wei)(wei)(wei)組(zu)氨(an)(an)(an)酸(suan)(suan)、TM螺旋(xuan)(xuan)4上(shang)的第724位(wei)(wei)(wei)谷(gu)氨(an)(an)(an)酰(xian)胺、TM螺旋(xuan)(xuan)4上(shang)的第730位(wei)(wei)(wei)半(ban)胱(guang)氨(an)(an)(an)酸(suan)(suan)和(he)(he)TM螺旋(xuan)(xuan)6上(shang)的第773位(wei)(wei)(wei)組(zu)氨(an)(an)(an)酸(suan)(suan)。

在一個實施(shi)方(fang)案中，iRhom家(jia)族(zu)成員(yuan)是iRhom1或(huo)iRhom2。在其他實施(shi)方(fang)案中，iRhom家(jia)族(zu)成員(yuan)是人或(huo)小鼠iRhom家(jia)族(zu)成員(yuan)。

在(zai)一(yi)個實施(shi)(shi)方(fang)(fang)案(an)(an)中，本發明的(de)化(hua)合(he)(he)物(wu)(wu)選自(zi)(zi)小分(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)、多肽(tai)誘餌(er)、miRNA分(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)、siRNA分(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)、shRNA分(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)、dsRNA分(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)、反義(yi)分(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)、特異性針對(dui)Rhbdf2的(de)核(he)酶；或編碼miRNA、siRNA、shRNA、dsRNA的(de)多聚核(he)苷酸；或其(qi)各自(zi)(zi)的(de)生物(wu)(wu)等價物(wu)(wu)。在(zai)其(qi)他實施(shi)(shi)方(fang)(fang)案(an)(an)中，所述化(hua)合(he)(he)物(wu)(wu)連接至(zhi)細胞(bao)穿透肽(tai)。在(zai)一(yi)些實施(shi)(shi)方(fang)(fang)案(an)(an)中，所述化(hua)合(he)(he)物(wu)(wu)是細胞(bao)可透過性的(de)。

一方面(mian)，本發明(ming)提供了分(fen)離的多(duo)肽，其包(bao)含變體iRhom多(duo)肽。

另一方面，本發(fa)明提供了(le)分(fen)離的多肽(tai)，其包含缺失細胞溶質N-末端結(jie)構域的人iRhom2。

另一(yi)方面，本發明(ming)提(ti)供(gong)了分離的多肽，其包含缺失細(xi)胞溶質(zhi)N-末端(duan)結構域(yu)的小鼠iRhom2。

另(ling)一(yi)方面(mian)，本(ben)發明(ming)提供了分(fen)離的(de)(de)小(xiao)鼠(shu)iRhom2多(duo)肽，其(qi)在(zai)小(xiao)鼠(shu)iRhom2的(de)(de)蛋白水解位點中的(de)(de)一(yi)個或多(duo)個氨基(ji)酸殘基(ji)處包含(han)突(tu)變，所述氨基(ji)酸殘基(ji)選自(zi)TM螺旋(xuan)2上(shang)的(de)(de)第635位組氨酸、TM螺旋(xuan)4上(shang)的(de)(de)第695位谷氨酰胺、TM螺旋(xuan)4上(shang)的(de)(de)第701位半胱(guang)氨酸和TM螺旋(xuan)6上(shang)的(de)(de)第744位組氨酸。

另一方面，本發明提供了(le)分(fen)離的(de)(de)人iRhom2多(duo)肽，其在人iRhom2的(de)(de)蛋白(bai)水解位(wei)點中的(de)(de)一個(ge)或(huo)多(duo)個(ge)氨(an)基(ji)(ji)酸(suan)殘基(ji)(ji)處包含(han)突變，所述氨(an)基(ji)(ji)酸(suan)殘基(ji)(ji)選自TM螺(luo)旋2上的(de)(de)第(di)664位(wei)組氨(an)酸(suan)、TM螺(luo)旋4上的(de)(de)第(di)724位(wei)谷氨(an)酰胺、TM螺(luo)旋4上的(de)(de)第(di)730位(wei)半胱(guang)氨(an)酸(suan)和TM螺(luo)旋6上的(de)(de)第(di)773位(wei)組氨(an)酸(suan)。

在(zai)一(yi)個(ge)實(shi)施方(fang)案(an)(an)中，本(ben)發(fa)明(ming)提供了(le)編(bian)碼上(shang)述多肽中任一(yi)種的(de)分(fen)(fen)離的(de)核(he)酸(suan)分(fen)(fen)子。在(zai)另(ling)一(yi)個(ge)實(shi)施方(fang)案(an)(an)中，本(ben)發(fa)明(ming)提供了(le)包含上(shang)述核(he)酸(suan)分(fen)(fen)子的(de)載(zai)體。在(zai)另(ling)一(yi)個(ge)實(shi)施方(fang)案(an)(an)中，本(ben)發(fa)明(ming)提供了(le)表達(da)上(shang)述載(zai)體的(de)宿主細胞。

附圖說明

圖1A是示出了(le)使用本文所述的增殖測定(ding)對MEF進(jin)行定(ding)量的圖；以X軸所示的數(shu)目接(jie)種(zhong)細(xi)胞并孵育細(xi)胞24h，熒光程度與總(zong)細(xi)胞DNA的量成比例；數(shu)據以平均值±s.d.表示；

圖1B是(shi)示出(chu)了使用(yong)本文所述(shu)的(de)劃痕(scratch-wound)試驗對cub/cub mcub/mcub和+/+mcub/mcub MEF的(de)遷移進行定(ding)量的(de)圖；在(zai)時間點0時測量劃痕傷口的(de)寬度(100％開口)，以初始寬度的(de)百(bai)分數(shu)計算在(zai)各時間點傷口閉合(he)的(de)增加；數(shu)據(ju)以平均值±s.d.表示；

圖1C是示出了對(dui)cub/cub mcub/mcub或+/+mcub/mcub MEF的(de)EGFR信(xin)號(hao)傳導的(de)多個(ge)標記物的(de)免疫(yi)印跡分析(xi)的(de)圖像，其(qi)中(zhong)一(yi)式兩份地測(ce)定(ding)(run)細胞裂解物，使(shi)用肌動蛋白充當內參(can)照(loading control)；

圖1D示(shi)出(chu)了在受傷后第0、7、14、21和28天，6-40周齡雌性cub/cub mcub/mcub和+/+mcub/mcub小(xiao)鼠(每組n＝3)中再生耳組織的(de)代表性圖像。

圖(tu)1E是示出了對圖(tu)1D中(zhong)所示的耳孔(kong)閉(bi)合的定量的圖(tu)；數據以平均值±s.d.表示；

圖1F示出了在(zai)受傷后第0、7和14天，cub/cub mcub/mcub和+/+mcub/mcub小鼠(shu)的耳橫(heng)截(jie)面的圖像，用蘇木(mu)精(jing)/曙紅進行染色(se)(原始放(fang)大率(lv)，×10)；注意cub/cub mcub/mcub小鼠(shu)的耳中未分化且(qie)增厚的表皮(E)(10-12個(ge)有核層)以及廣泛程度(du)的增殖(M)；虛(xu)線表示切開的部(bu)位；

圖2A是(shi)示出了cub突變為小鼠(shu)Rhbdf2基因中12681bp缺(que)失的(de)(de)圖，其中所述缺(que)失開始于外(wai)顯(xian)子(zi)1和2的(de)(de)中間并且(qie)包含外(wai)顯(xian)子(zi)2-6，在外(wai)顯(xian)子(zi)6之后(hou)隨即結束；

圖2B示出了使用(yong)外顯(xian)子2、5、12和19的引物對+/+mcub/mcub、+/cub mcub/mcub和cub/cub mcub/mcub小鼠的MEF進行(xing)逆轉錄酶PCR的結(jie)果(guo)圖；ntc代(dai)表無(wu)模(mo)板對照；

圖2C示出了(le)使(shi)(shi)用(yong)(yong)針對所示外顯子邊界的TaqMan基因表達測定，對從皮膚(fu)組織提取的cDNA進(jin)行qPCR的結果圖，使(shi)(shi)用(yong)(yong)肌動蛋白充當內參照(endogenous control)；將數據標準化為+/+mcub/mcub肌動蛋白水平，使(shi)(shi)用(yong)(yong)4種生物復制品，一式三份地(di)測定樣(yang)品；數據以平均值±s.d.表示；

圖2D示出了使用常規TaqMan基因(yin)表(biao)達(da)測定檢測具有外(wai)顯(xian)子(zi)1-外(wai)顯(xian)子(zi)7邊界(jie)的(de)轉(zhuan)錄物的(de)qPCR結果圖；使用3種生物復制品，一式三(san)份地測定樣(yang)品(各柱代(dai)表(biao)單(dan)獨的(de)小鼠)；數據以平均值±s.d.表(biao)示；

圖2E是(shi)瞬時(shi)表達Flag標(biao)記的HuWt(人全長RHBDF2cDNA)和HuCub(人類(lei)版本的cub cDNA)的HEK293細(xi)胞的抗Flag免(mian)疫印跡的圖像，使(shi)用(yong)肌動蛋(dan)白作為(wei)內參照(zhao)；

圖(tu)2F示出了(le)使(shi)用Flag特異性抗體染(ran)色(se)的表(biao)達Flag標記的HuWt和HuCub的B6原代MEF的代表(biao)性圖(tu)像，DAPI用于(yu)對(dui)細胞(bao)核(he)進行復染(ran)色(se)；箭頭代表(biao)全長蛋白和突(tu)變蛋白的細胞(bao)質(zhi)表(biao)達；

圖3A是(shi)示出了(le)KOMP Rhbdf2敲除小鼠中野生型產物(wu)的PCR結果的圖像，預(yu)期產物(wu)長度為2181bp；L代表從New England Biolabs獲得的1kb DNA梯狀標記物(wu)(ladder)，ntc代表無模板對(dui)照；

圖3B示出了對Rhbdf2表達的報告基因的分析的圖像；全胚胎(whole-mount)X-gal染色的E18.5Rhbdf2^-/-胚胎示出了表皮中β-gal的強表達(箭簇)(原始放大率，×2.5)，X-gal染色的兩周齡雌性Rhbdf2^-/-皮膚示出了(le)毛(mao)囊內鞘(qiao)層(ceng)和外鞘(qiao)層(ceng)中的β-gal陽性(箭(jian)頭)(原始放大(da)率，×5)；毛(mao)干中未觀察到染色；比例尺(chi)，1mm；

圖3C是示出了具有Rhbdf2無效突變的小鼠缺少再生表型的圖，如與Rhbdf2^cub/cub小鼠相比，6至8周齡雌性Rhbdf2^-/-小鼠(shu)的耳中顯著延(yan)緩的傷口閉合所顯示(shi)的；

圖3D示出了證明了具有Rhbdf2無效突變的小鼠具有正常的皮膚和毛發形態的圖像；在所示的創傷后時間點獲取的來自Rhbdf2^cub/cub和Rhbdf2^-/-小鼠的成年皮膚的H&E染色切片，其中成年Rhbdf2^cub/cub皮膚顯示出薄的皮下脂肪層(F)、異常的毛囊(H)、厚的表皮(E)、增大的皮脂腺(SG)、致密的交織排列的膠原纖維束(C)，以及毛囊和毛球的不完全分化(HF)；成年Rhbdf2^-/-皮(pi)膚顯示出正常表皮(pi)和毛囊；比(bi)例尺，100μm；原始放(fang)大(da)率，×10和×40；

圖3E是示出了Rhbdf2^-/-小鼠發育出正常的毛皮(箭簇)，而復合突變的Rhbdf2^-/cub小鼠表現出稀疏(shu)的毛皮(箭頭)的圖(tu)像(xiang)；

圖(tu)4A是(shi)示出(chu)了Mcub是(shi)T至(zhi)G點(dian)突(tu)變(bian)的(de)圖(tu)，所(suo)述點(dian)突(tu)變(bian)破壞了Areg基因中的(de)正(zheng)常(chang)供體剪(jian)接位點(dian)(外顯子1)，導致使用(yong)可(ke)變(bian)的(de)下游剪(jian)接位點(dian)；

圖4B是示出了在28天中6-8周齡雌性Rhbdf2^+/+Areg^+/+、Rhbdf2^cub/cub Areg^+/+和Rhbdf2^cub/cub Areg^Mcub/Mcub小鼠中耳孔的愈合(每組n＝3只小鼠)的圖；數據以平均值±s.d.表示；

圖4C示出了蘇木精/曙紅染色的切片圖，其示出了Rhbdf2^cub/cub Areg^Mcub/Mcub小(xiao)鼠(shu)耳孔切開后的愈合(he)，其中虛(xu)線表示(shi)切開部位；原始(shi)放大率，×10；E代(dai)表表皮，M代(dai)表增殖；與圖1F進行比較；

圖4D是示出了同齡的Rhbdf2^+/+Areg^+/+、Rhbdf2^cub/cub Areg^+/+和Rhbdf2^cub/cubAreg^Mcub/Mcub雌性小鼠中血清AREG水平的圖，其中在Rhbdf2^cub/cub Areg^Mcub/Mcub小鼠(shu)的血清中未檢測到AREG(n.d.)；數據以三次獨立實驗的平均值±s.d.表示；***p<0.001；

圖 4E是對從Rhbdf2^+/+Areg^+/+、Rhbdf2^cub/cub Areg^+/+和Rhbdf2^cub/cub Areg^Mcub/Mcub小鼠中分離的培養的小鼠表皮角化細胞(MEK)的上清液中AREG水平的ELISA定量的圖，其中在Rhbdf2^cub/cub Areg^Mcub/Mcub小鼠的(de)MEK中未檢測到AREG(n.d.)；數(shu)據以(yi)三(san)次獨立實驗的(de)平均值±s.d.表(biao)示；***p<0.001；

圖4F是示出了從EGFR配體的qPCR獲得的結果：使用TaqMan基因表達測定，從Rhbdf2^cub/cub Areg^+/+和Rhbdf2^+/+Areg^+/+的皮膚組織提取cDNA，使用肌動蛋白充當內參照；將數據標準化為Rhbdf2^+/+Areg^+/+肌(ji)動蛋白(bai)水平，數(shu)據以三次(ci)獨立實驗的平均值±s.d.表(biao)示(shi)；*p<;0.05；

圖5A是示出了全長人RHBDF2(Hu Wt)基因和模擬小鼠Rhbdf2^cub基(ji)因的(de)人(ren)構建體(HuCub)的(de)示(shi)意圖；

圖(tu)5B是(shi)示出了在293T細(xi)胞(bao)(bao)中(zhong)共(gong)表(biao)達(da)Hu Wt或(huo)HuCub與AREG基(ji)因(yin)后，對(dui)經裂解的AREG的ELISA定量(liang)的圖(tu)；轉染后24h，用DMSO或(huo)10μM馬立馬司他(ta)(MM)孵育細(xi)胞(bao)(bao)24h，并在條件(jian)培養(yang)基(ji)中(zhong)分析AREG水平，重(zhong)復進行轉染并將條件(jian)培養(yang)基(ji)稀(xi)釋5倍。

圖5C是示出了對所示基因型的8-12周齡雌性小鼠進行LPS注射后3h，通過ELISA對血清TNFα水平進行定量的圖，其中在沒有進行LPS注射的Rhbdf2^+/+小鼠的血清中未檢測到TNFα(n.d.)；*p<0.05；

圖5D是示(shi)出了共表(biao)達(da)人RHBDL2(HuRHBDL2)基因與AREG或(huo)HB-EGF或(huo)EGF基因后(hou)，對經裂解的AREG/HB-EGF/EGF的ELISA定(ding)量的圖；轉染后(hou)24h，用10μM馬(ma)立(li)馬(ma)司他(MM)孵育(yu)細胞24h，并(bing)在條件(jian)(jian)培(pei)養基中分(fen)析AREG/HB-EGF/EGF水平(ping)，其中不稀釋HB-EGF和(he)EGF條件(jian)(jian)培(pei)養基，而將AREG培(pei)養基稀釋5倍；數據(ju)以三(san)次獨立(li)實驗的平(ping)均值(zhi)±s.d.表(biao)示(shi)；***p<0.001；

圖(tu)(tu)5E是示出了在293T細胞中(zhong)共表達(da)Hu Wt或HuCub與HB-EGF基(ji)因后，對經裂解的(de)HB-EGF的(de)ELISA定量的(de)圖(tu)(tu)；轉染后24h，用10μM馬立馬司他(MM)孵育細胞24h，并在條件培養基(ji)中(zhong)分析HB-EGF水平；***p<0.001；

圖5F是示出了在293T細胞(bao)中共(gong)表(biao)達Hu Wt或HuCub與EGF基因后，對經裂解的EGF的ELISA定量的圖；轉染后24h，用(yong)DMSO或10μM馬(ma)立馬(ma)司他(ta)(MM)孵育(yu)細胞(bao)24h，并在條件(jian)培(pei)養基中分析(xi)EGF水平(ping)；**p<0.01；

圖5G是示出(chu)了(le)在293T細胞中共(gong)表達HuCub或無肽酶域(yu)的(de)HuCub(HuCubΔPD)與AREG基因后，對經裂解的(de)AREG的(de)ELISA定(ding)量(liang)的(de)圖；轉染后24h，用(yong)10μM馬立(li)馬司他(MM)孵育細胞24h，并在條件培養基中分析AREG水(shui)平；***p<0.001；

圖5H是示出了(le)在293T細(xi)胞(bao)中共表達HuCub或具有單個(ge)丙(bing)氨酸突變的(de)(de)HuCub與AREG基因(yin)后(hou)，對(dui)經裂解的(de)(de)AREG的(de)(de)ELISA定量的(de)(de)圖；轉染后(hou)24h，用10μM馬立馬司他(MM)孵育細(xi)胞(bao)24h，并(bing)在條(tiao)件培養基中分析(xi)AREG水平；***p<0.001；

圖5I是(shi)示(shi)出(chu)了在293T細胞(bao)中共表達(da)HuCub或具有單個丙氨酸突變(bian)的(de)(de)HuCub與EGF基因后(hou)，對(dui)經裂解的(de)(de)EGF的(de)(de)ELISA定量的(de)(de)圖；轉染(ran)后(hou)24h，用10μM馬立(li)馬司他(MM)孵育細胞(bao)24h，并在條(tiao)件(jian)培養基中分析EGF水平；**p<0.001；

圖5J是示出了Rhbdf2^cub的膜拓撲結構的圖，其中所示氨基酸對于Rhbdf2^cub調控EGFR配體產生是(shi)關鍵(jian)的；

圖6A是示出(chu)了在10μM馬立馬司(si)他(MM)的(de)存在下，通過ELISA對來(lai)自用AREG與人RHBDF2p.I186T突變體、HuWt或(huo)HuCub轉染的(de)HEK293細胞的(de)條件培養基的(de)經裂(lie)解的(de)AREG進行定量的(de)圖；**p<0.01；

圖6B是示出了HEK293細胞(bao)(bao)的(de)蛋(dan)白(bai)質(zhi)印(yin)跡(ji)(ji)的(de)圖像，所述HEK293細胞(bao)(bao)用AREG與(yu)HuCub、HuWt或(huo)p.I186T共轉染，用DMSO或(huo)MM孵育(yu)，并且對(dui)HA-AREG進行(xing)免疫(yi)印(yin)跡(ji)(ji)，表(biao)(biao)明即使在(zai)(zai)10μM MM的(de)存在(zai)(zai)下，與(yu)AREG/Hu Wt或(huo)單獨的(de)AREG的(de)表(biao)(biao)達相比，AREG與(yu)HuCub或(huo)p.I186T的(de)共表(biao)(biao)達顯著降低了AREG前(qian)體的(de)胞(bao)(bao)內水平，；

圖6C是示出了(le)表達各RHBDF2P.I186T點突(tu)變體并用AREG基(ji)因或空載體共轉染的細胞中(zhong)(zhong)的AREG水(shui)平(ping)的圖；各殘(can)基(ji)被突(tu)變為(wei)丙氨(an)酸；用10μM MM孵育細胞24h并在(zai)條件培養基(ji)中(zhong)(zhong)測定AREG水(shui)平(ping)；

圖6D是X-gal染色的2周齡雌性Rhbdf2^-/-的腸的圖像，其顯示了報告(gao)基因β-gal在中部(bu)和上部(bu)絨毛區(qu)的表(biao)達(da)；原始放(fang)大率，×2.5；

圖6E是示出了Apc^Min/+Rhbdf2^+/+小鼠(n＝28)和Apc^Min/+Rhbdf2^+/cub(n＝23)小鼠的Kaplan-Meier存活曲線的圖，其中Apc^Min/+Rhbdf2^+/+小鼠的中值存活期為172天，與之相比，Apc^Min/+Rhbdf2^+/cub小鼠的中值存活期為135天(tian)；

圖(tu)6F示(shi)出了三月齡時所示(shi)基因型(xing)小(xiao)鼠的腸組(zu)織的蘇(su)木精-曙紅(hong)染色的切片(pian)的圖(tu)像；原始放大率，×2.5；

圖6G是示出了三月齡時所示基因型小鼠的息肉大小/每只小鼠的圖；對于Apc^Min/+Rhbdf2^+/+小鼠和Apc^Min/+Rhbdf2^+/cub小鼠，平均腫瘤大小分別為1.8mm²和3.7mm²；

圖6H是示出了三月齡時所示基因型小鼠的息肉數目/每只小鼠的圖；對于Apcs^Min/+Rhbdf2^+/+小鼠和ApcMin^/+Rhbdf2^+/cub小(xiao)鼠(shu)，平均息肉(rou)數目分別為12和21；

圖7A是人(ren)iRhom2-AREG復合體(ti)的免(mian)疫(yi)共(gong)沉(chen)淀圖，其(qi)中用Flag標(biao)記(ji)的HuWt或Flag標(biao)記(ji)的HuCub或Flag標(biao)記(ji)的p.I186T共(gong)轉染來自COS7細胞(bao)的裂解(jie)物，對(dui)HA標(biao)記(ji)的AREG用抗Flag磁珠進行免(mian)疫(yi)沉(chen)淀并用抗Flag抗體(ti)和抗HA抗體(ti)進行探測；

圖7B示出了用(yong)所(suo)(suo)示的(de)Flag標記(ji)的(de)基因轉染并使用(yong)Flag特(te)異性PE標記(ji)的(de)抗體進(jin)行(xing)免(mian)疫標記(ji)的(de)293T或(huo)COS7(圖14)細(xi)胞的(de)流(liu)式(shi)細(xi)胞術結果，其中在轉染后48h對(dui)所(suo)(suo)述細(xi)胞進(jin)行(xing)免(mian)疫標記(ji)；

圖7C是示出了(le)對圖7B中獲得的(de)數據(ju)的(de)定(ding)量的(de)圖；

圖7D示出(chu)了在所示時間用(yong)150μg/ml蛋(dan)白合成抑制劑(ji)環(huan)己酰胺對(dui)瞬時轉(zhuan)染的(de)(de)COS7細胞進行追(zhui)蹤，并使用(yong)Flag特異性PE標記的(de)(de)抗體來評估(gu)蛋(dan)白表達的(de)(de)測試結果(guo)；數(shu)據代表總共三(san)次(ci)實驗(yan)中的(de)(de)一(yi)次(ci)；

圖7E是示(shi)出(chu)了對圖7D中(zhong)獲(huo)得(de)的數據的定(ding)量的圖；

圖7F是示出了用(yong)(yong)10μM細胞(bao)(bao)可透過性(xing)的(de)蛋(dan)白酶抑制劑MG-132預(yu)孵育瞬時轉染的(de)COS7細胞(bao)(bao)4h，然后在(zai)(zai)所(suo)示時間在(zai)(zai)MG-132存在(zai)(zai)下(xia)用(yong)(yong)150μg/ml環己酰胺追蹤(zong)的(de)測試結果的(de)圖；如(ru)圖7D所(suo)述測定(ding)蛋(dan)白表(biao)達；***p<0.001；

圖8示(shi)出了(le)(le)(le)野生型iRhom2是短壽命蛋白，其N末端缺(que)失或N-末端結(jie)構域中(zhong)的(de)突(tu)變(bian)(包括那些(xie)引起上皮癌的(de)突(tu)變(bian))增(zeng)加了(le)(le)(le)其蛋白穩定(ding)性，進而(er)增(zeng)加了(le)(le)(le)選擇性EGF家族配體(包括AREG)的(de)分泌(mi)；抑(yi)制ADAM17對AREG分泌(mi)沒有影響(xiang)，而(er)iRhom2的(de)肽酶(mei)域中(zhong)氨基酸(suan)H366、Q426、C432和H475的(de)缺(que)失終止了(le)(le)(le)AREG分泌(mi)；相反，AREG分泌(mi)增(zeng)加導致(zhi)EGFR信號傳導的(de)過(guo)度激活，從(cong)而(er)增(zeng)加了(le)(le)(le)細胞增(zeng)殖和遷(qian)移；

圖9A是示(shi)出了cub/cub mcub/mcub(箭簇(cu))和cub/cub Mcub/mcub(箭頭)小鼠的圖像；

圖(tu)9B是(shi)示(shi)出了+/cub mcub/mcub小(xiao)鼠的傷口愈合似乎介于(yu)cub/cub mcub/mcub小(xiao)鼠和(he)+/+小(xiao)鼠之間的圖(tu)；在(zai)(zai)創傷(2mm通(tong)孔(kong))后0、7、14和(he)21天，在(zai)(zai)6至(zhi)40周齡雌性(xing)+/+mcub/mcub、+/cub mcub/mcub和(he)cub/cub mcub/mcub小(xiao)鼠(每組n＝3)中對耳孔(kong)閉合率(lv)進(jin)行定量；數據以(yi)平均(jun)值(zhi)±s.d.表示(shi)；

圖(tu)10A示出(chu)了B6原代(dai)MEF中Flag標記的全(quan)長(HuWt)和(he)cub(HuCub)Rhbdf2克(ke)隆的體外(wai)表達，然(ran)后用Flag特(te)異性抗體和(he)細胞(bao)核(he)的DAPI復染色進行蛋(dan)白表達的免疫化(hua)學評估，表明全(quan)長和(he)突變(bian)蛋(dan)白都(dou)與ER標記物(wu)鈣聯蛋(dan)白共定(ding)位；

圖10B示出(chu)了(le)B6原(yuan)代(dai)MEF中Flag標記(ji)的(de)全(quan)長(chang)(HuWt)和cub(HuCub)Rhbdf2克隆的(de)體(ti)(ti)外(wai)表(biao)達，然后用Flag特異性抗體(ti)(ti)和細胞核的(de)DAPI復染色(se)進行蛋白表(biao)達的(de)免疫化(hua)學評估，表(biao)明全(quan)長(chang)和突變(bian)蛋白都不與高爾基體(ti)(ti)標記(ji)物巨蛋白(giantin)共定位；

圖11是示出了(le)(le)(le)T至G點(dian)(dian)突變破壞(huai)了(le)(le)(le)原(yuan)始剪接(jie)位點(dian)(dian)(外顯子1)而導致可(ke)變剪接(jie)位點(dian)(dian)的(de)圖，所述(shu)可(ke)變剪接(jie)位點(dian)(dian)在Areg轉錄物上添(tian)加了(le)(le)(le)22個額外的(de)核(he)苷酸(suan)并(bing)在蛋白質上添(tian)加了(le)(le)(le)16個錯誤的(de)氨基酸(suan)，引入了(le)(le)(le)提前終(zhong)止密碼子；

圖12A是對cub/cub Mcub/Mcub或cub/cub mcub/mcub MEF的所示標記物的免疫印跡分析(xi)圖，其中一式兩份地測定細胞裂解物，使(shi)用(yong)肌(ji)動蛋白充當內參照；

圖12B是示出了對在scramble shRNA或小鼠Areg shRNA慢病毒感染的Rhbdf2^+/+或Rhbdf2^cub/cub MEF中Areg表(biao)達的定(ding)量RT-PCR測定(ding)的圖；

圖12C是示出了用scramble shRNA或小鼠Areg shRNA感染之后，使用本文所述的增殖測定對Rhbdf2^+/+MEF進行定(ding)量的圖，其中以X軸(zhou)所示的數目接(jie)種(zhong)細胞(bao)并(bing)孵育細胞(bao)24h，熒(ying)光(guang)程度與(yu)總細胞(bao)DNA的量成(cheng)比例；

圖12D是示出了用scramble shRNA或小鼠Areg shRNA感染之后，使用本文所述的增殖測定對Rhbdf2^cub/cub MEF進行定量的圖，其中以X軸所示的數目接種細(xi)(xi)胞并孵育細(xi)(xi)胞24h，熒光程(cheng)度(du)與總(zong)細(xi)(xi)胞DNA的量成比例；

圖(tu)13A是示出了對來自在10μM馬立馬司他(MM)存在下(xia)用小鼠(shu)Rhbdf1或N-末(mo)端(duan)截短的(de)小鼠(shu)Rhbdf1(ΔN-iRhom1)或ΔN-iRhom1突(tu)變體以及AREG基(ji)因(yin)轉染的(de)HEK 293T細(xi)胞的(de)條件培(pei)養(yang)基(ji)的(de)分泌的(de)AREG進行ELISA定量的(de)圖(tu)；***p<0.001；

圖(tu)13B是示(shi)出了對來自在10μM馬立馬司(si)他(MM)存在下用小鼠(shu)Rhbdf1或N-末(mo)端(duan)截短的(de)小鼠(shu)Rhbdf1(ΔN-iRhom1)以及(ji)EGF基(ji)因(yin)轉染的(de)HEK 293T細(xi)胞的(de)條件培養基(ji)的(de)經裂解的(de)EGF進行(xing)ELISA定量的(de)圖(tu)；***p<0.001；

圖13C是對(dui)人iRhom2和RHBDL2，以及人和小(xiao)鼠(shu)iRhom的肽酶域序列(lie)的氨基酸(suan)進行比對(dui)的圖像；

圖13D是示(shi)出(chu)了在(zai)293T細(xi)(xi)胞中共表達(da)HuCub或具有單個丙氨酸(suan)突變(bian)的(de)HuCub與AREG基(ji)因后(hou)，對分泌的(de)AREG進行ELISA定(ding)量(liang)的(de)圖；轉染后(hou)24h時，用(yong)10μM馬(ma)立馬(ma)司他(MM)孵育(yu)細(xi)(xi)胞24h并(bing)在(zai)條件培養基(ji)中分析AREG水平(ping)；數(shu)據代表三次獨立實驗的(de)平(ping)均值±s.d.；

圖13E是示出(chu)了對(dui)iRHOM1和iRHOM2、活(huo)性(xing)菱(ling)形RHBDL2、秀(xiu)麗線蟲(C.elegans)無活(huo)性(xing)菱(ling)形ROM3和ROM4，以及果蠅屬(Drosophila)iRhom的肽(tai)酶域的氨(an)基酸的序列比對(dui)的圖，其中(zhong)星號代表(biao)對(dui)iRHOM2調控(kong)EGFR配體而言(yan)至關重要的保守氨(an)基酸；以及

圖14示(shi)出(chu)了用(yong)所示(shi)的Flag標(biao)記的基因(yin)轉染并(bing)使用(yong)Flag特異(yi)性PE標(biao)記的抗(kang)體(ti)進行免疫標(biao)記的COS7細(xi)(xi)胞(bao)的流式細(xi)(xi)胞(bao)術結果的圖像，其中在轉染后(hou)48h對(dui)所述細(xi)(xi)胞(bao)進行免疫標(biao)記。

具體實施方式

本文使用的科(ke)技術(shu)語旨在具有本領域普通技術(shu)人(ren)員通常所理(li)解的含義。發現這些術(shu)語在多篇(pian)標準(zhun)參(can)(can)考文獻的上下文中被定義和使用，所述參(can)(can)考文獻示(shi)例性地包括(kuo)J.Sambrook和D.W.Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press；第(di)(di)3版(ban),2001；F.M.Ausubel Ed.,Short Protocols in Molecular Biology,Current Protocols；第(di)(di)5版(ban),2002；B.Alberts等(deng)(deng)人(ren),Molecular Biology of the Cell,第(di)(di)4版(ban),Garland,2002；D.L.Nelson and M.M.Cox,Lehninger Principles of Biochemistry,第(di)(di)4版(ban),W.H.Freeman&Company,2004；Engelke,D.R.,RNA Interference(RNAi):Nuts and Bolts of RNAi Technology,DNA Press LLC,Eagleville,PA,2003；Herdewij n,P.(Ed.),Oligonucleotide Synthesis:Methods and Applications,Methods in Molecular Biology,Humana Press,2004；A.Nagy,M.Gertsenstein,K.Vintersten,R.Behringer,Manipulating the Mouse Embryo:A Laboratory Manual,第(di)(di)3版(ban),Cold Spring Harbor Laboratory Press；2002年12月15日(ri),ISBN-10:0879695919；Kursad Turksen(Ed.),Embryonic stem cells:methods and protocols in Methods Mol Biol.2002；185,Humana Press；Current Protocols in Stem Cell Biology,ISBN:9780470151808；Chu,E.和Devita,V.T.,Eds.,Physicians’Cancer Chemotherapy Drug Manual,Jones&Bartlett Publishers,2005；J.M.Kirkwood等(deng)(deng)人(ren)，Eds.,Current Cancer Therapeutics,第(di)(di)4版(ban),Current Medicine Group,2001；Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott Williams&Wilkins,第(di)(di)21版(ban),2005；L.V.Allen,Jr.等(deng)(deng)人(ren),Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,第(di)(di)8版(ban),Philadelphia,PA:Lippincott,Williams&Wilkins,2004；以及(ji)L.Brunton等(deng)(deng)人(ren),Goodman&Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics,McGraw-Hill Professional,第(di)(di)12版(ban),2011。

除非另外明(ming)確說(shuo)(shuo)明(ming)或上(shang)下文中另外清楚(chu)說(shuo)(shuo)明(ming)，單數術語“一(yi)”、“一(yi)個”和“所述(shu)”不(bu)意為限制(zhi)性的，且(qie)包括復數指代(dai)物(wu)。

無活(huo)性菱(ling)形(xing)蛋(dan)(dan)白酶(mei)(iRhom)是高度(du)保(bao)守(shou)的膜內蛋(dan)(dan)白，其之(zhi)前被認為不具(ju)有蛋(dan)(dan)白水解活(huo)性。iRhom的特征在于(yu)長(chang)的細胞溶質的N-末(mo)端結(jie)構域，保(bao)守(shou)的富含半胱(guang)氨酸(suan)的無活(huo)性菱(ling)形(xing)蛋(dan)(dan)白酶(mei)同源結(jie)構域(IRHD)，在肽(tai)酶(mei)域內缺少活(huo)性位點絲(si)氨酸(suan)殘基(ji)的休眠(mian)的(dormant)蛋(dan)(dan)白水解位點。

在(zai)許多物(wu)種(zhong)中(zhong)，iRhom參與多種(zhong)功能，包括在(zai)黑腹果蠅(ying)(Drosophila melanogaster)中(zhong)調(diao)節表皮(pi)生長因子受體(EGFR)信號(hao)傳導、人鱗狀上皮(pi)癌細胞的(de)(de)存活、在(zai)哺乳動物(wu)細胞系(xi)中(zhong)從內(nei)質(zhi)網膜清(qing)除錯誤折疊的(de)(de)蛋白(bai)、誘導原代小鼠(shu)角化細胞的(de)(de)遷移、在(zai)小鼠(shu)中(zhong)分泌可(ke)溶性(xing)TNFα、以(yi)及在(zai)小鼠(shu)胚胎成纖維細胞中(zhong)調(diao)節受激的(de)(de)ADAM17介(jie)導的(de)(de)金屬蛋白(bai)酶脫落(shedding)的(de)(de)底(di)物(wu)選(xuan)擇性(xing)。EGF樣配體可(ke)作(zuo)為iRhom家族成員的(de)(de)底(di)物(wu)發揮(hui)作(zuo)用。

Rhbdf2基(ji)因編(bian)碼(ma)無(wu)活性的(de)(de)菱形(xing)蛋白酶iRhom2——包含長細胞溶質的(de)(de)N-末端和(he)之(zhi)前功能未知的(de)(de)休(xiu)眠的(de)(de)肽酶域的(de)(de)酶家族之(zhi)一。本發(fa)明提供了iRhom2可通(tong)過EGFR信號(hao)傳導(dao)的(de)(de)組成型激活在(zai)上(shang)皮再生(sheng)和(he)癌生(sheng)長中發(fa)揮作(zuo)用。

本發(fa)明(ming)的方面(mian)至(zhi)少部分基于以下發(fa)現：Rhbdf2突(tu)變通過增加(jia)雙調蛋(dan)白(bai)的分泌來提高iRhom2蛋(dan)白(bai)穩定性(xing)并驅(qu)使EGFR過度激活。

本(ben)(ben)發(fa)明(ming)的(de)(de)(de)方(fang)面至(zhi)少部(bu)分(fen)基于以(yi)下發(fa)現：iRhom2是(shi)短壽命(ming)蛋白，其穩定(ding)性(xing)可通過(guo)在N-末端(duan)(duan)結構域的(de)(de)(de)選(xuan)擇(ze)性(xing)突變來提高(gao)。進而，這些(xie)穩定(ding)的(de)(de)(de)變體增加EGF家(jia)族配(pei)體(包括雙調蛋白)的(de)(de)(de)分(fen)泌(mi)，此過(guo)程不依賴于金(jin)屬蛋白酶ADAM17活性(xing)。在體內，N-末端(duan)(duan)iRhom2突變誘導(dao)傷(shang)(shang)口加速愈合以(yi)及(ji)腫瘤生(sheng)成加速，但是(shi)不驅使自發(fa)性(xing)腫瘤發(fa)展。因此，本(ben)(ben)發(fa)明(ming)還至(zhi)少部(bu)分(fen)基于iRhom2在調控創傷(shang)(shang)愈合和腫瘤生(sheng)長中涉及(ji)的(de)(de)(de)EGFR信號傳(chuan)導(dao)事件的(de)(de)(de)生(sheng)理作用(yong)，以(yi)及(ji)iRhom2關鍵(jian)結構域的(de)(de)(de)功能。

表皮生(sheng)長因子受體(EGFR)信(xin)號(hao)轉導在(zai)哺乳動物細胞的(de)生(sheng)長、增殖和分(fen)化中發揮重要作用。典型(xing)的(de)EGFR配體(包(bao)括EGF、AREG和HB-EGF)作為在(zai)細胞表面表達的(de)前(qian)體蛋白而存在(zai)，為了(le)結合EGFR，所述EGFR配體必須被(bei)排放(shed)至胞外區室。在(zai)不(bu)同的(de)發育階段，不(bu)同類別的(de)蛋白酶使與膜相連的(de)EGFR前(qian)配體裂(lie)解以調節多(duo)種生(sheng)物活性。

一方面，本發(fa)(fa)明(ming)(ming)至少部(bu)(bu)分(fen)基(ji)(ji)于(yu)以(yi)(yi)下(xia)(xia)發(fa)(fa)現：小(xiao)鼠中(zhong)Rhbdf2基(ji)(ji)因中(zhong)的(de)(de)(de)(de)自發(fa)(fa)性(xing)缺失是(shi)卷曲(qu)裸露(lu)(cub)突變(bian)的(de)(de)(de)(de)原(yuan)因，在所述突變(bian)中(zhong)iRhom2的(de)(de)(de)(de)細胞溶質的(de)(de)(de)(de)N-末(mo)端(duan)結(jie)構域(yu)的(de)(de)(de)(de)缺失導(dao)(dao)(dao)致(zhi)隨(sui)后對毛囊發(fa)(fa)育、創傷(shang)愈(yu)合和腫瘤(liu)發(fa)(fa)生的(de)(de)(de)(de)影響(xiang)。此外，cub的(de)(de)(de)(de)修飾因子(zi)(Mcub)治愈(yu)或(huo)矯正了(le)(le)變(bian)禿和/或(huo)促進毛發(fa)(fa)生長(實施(shi)例1)。另一方面，本發(fa)(fa)明(ming)(ming)至少部(bu)(bu)分(fen)基(ji)(ji)于(yu)以(yi)(yi)下(xia)(xia)發(fa)(fa)現：iRhom2是(shi)短(duan)壽命蛋(dan)白(bai)，但(dan)是(shi)N-末(mo)端(duan)的(de)(de)(de)(de)功(gong)(gong)能獲得性(xing)突變(bian)(胼胝癥(tylosis))或(huo)N-末(mo)端(duan)缺失(cub突變(bian))提高了(le)(le)突變(bian)蛋(dan)白(bai)穩(wen)定性(xing)，導(dao)(dao)(dao)致(zhi)不依賴于(yu)金屬蛋(dan)白(bai)酶(mei)(mei)的(de)(de)(de)(de)EGFR配體雙調蛋(dan)白(bai)(AREG)的(de)(de)(de)(de)分(fen)泌(mi)。Cub表型(xing)的(de)(de)(de)(de)遺傳修飾因子(zi)(Mcub)用于(yu)證(zheng)明(ming)(ming)AREG是(shi)iRhom2的(de)(de)(de)(de)生理靶標。另一方面，本發(fa)(fa)明(ming)(ming)至少部(bu)(bu)分(fen)基(ji)(ji)于(yu)對AREG分(fen)泌(mi)所必需的(de)(de)(de)(de)iRhom2肽(tai)酶(mei)(mei)域(yu)中(zhong)的(de)(de)(de)(de)關鍵氨基(ji)(ji)酸的(de)(de)(de)(de)鑒定，表明(ming)(ming)該假酶(mei)(mei)的(de)(de)(de)(de)肽(tai)酶(mei)(mei)域(yu)盡管在推定的(de)(de)(de)(de)活性(xing)位點缺少絲氨酸殘基(ji)(ji)，仍(reng)可(ke)能是(shi)功(gong)(gong)能性(xing)的(de)(de)(de)(de)。本發(fa)(fa)明(ming)(ming)因此提供了(le)(le)iRhom關鍵結(jie)構域(yu)的(de)(de)(de)(de)功(gong)(gong)能并建(jian)立了(le)(le)框架(jia)，用于(yu)理解(jie)iRhom、EGFR信號(hao)傳導(dao)(dao)(dao)、以(yi)(yi)及創傷(shang)愈(yu)合和腫瘤(liu)發(fa)(fa)生中(zhong)涉及的(de)(de)(de)(de)生物過程之間的(de)(de)(de)(de)關系。

iRhom家族成員

iRhom1和iRhom2

菱(ling)形蛋(dan)白(bai)(bai)酶(mei)是存在(zai)于幾(ji)乎所(suo)有物種(zhong)中的(de)(de)酶(mei)家族。菱(ling)形蛋(dan)白(bai)(bai)酶(mei)是膜(mo)內絲(si)氨酸蛋(dan)白(bai)(bai)酶(mei)，菱(ling)形蛋(dan)白(bai)(bai)酶(mei)的(de)(de)蛋(dan)白(bai)(bai)質水解(jie)裂解(jie)作用對(dui)細胞調(diao)控(kong)而言非(fei)常重要。膜(mo)內蛋(dan)白(bai)(bai)酶(mei)的(de)(de)活性位點埋在(zai)細胞膜(mo)的(de)(de)脂雙層中，并且它們在(zai)其他跨膜(mo)蛋(dan)白(bai)(bai)的(de)(de)跨膜(mo)結構域內裂解(jie)這些蛋(dan)白(bai)(bai)。

iRhom或(huo)(huo)“無(wu)(wu)活(huo)(huo)性的(de)(de)菱形(xing)蛋白(bai)酶”是(shi)菱形(xing)蛋白(bai)酶的(de)(de)一個(ge)亞家族，在本(ben)發(fa)明(ming)之前，其被認(ren)為(wei)缺(que)乏蛋白(bai)水解(jie)(jie)活(huo)(huo)性。iRhom是(shi)高度(du)保守(shou)的(de)(de)膜內(nei)蛋白(bai)，其特征在于，長(chang)的(de)(de)細(xi)胞溶(rong)質的(de)(de)N-末端結構域，保守(shou)的(de)(de)富(fu)含半胱氨酸(suan)的(de)(de)無(wu)(wu)活(huo)(huo)性菱形(xing)蛋白(bai)酶同源結構域(IRHD)，在肽酶域內(nei)缺(que)少活(huo)(huo)性位(wei)點(dian)絲氨酸(suan)殘(can)基的(de)(de)休眠的(de)(de)蛋白(bai)水解(jie)(jie)位(wei)點(dian)。適用于本(ben)發(fa)明(ming)的(de)(de)iRhom家族成員(yuan)包括iRhom1(RHBDF1)和iRhom2(RHBDF2)。用于本(ben)發(fa)明(ming)的(de)(de)iRhom1和/或(huo)(huo)iRhom2可(ke)以是(shi)真核的(de)(de)、原核的(de)(de)或(huo)(huo)哺乳動物的(de)(de)。此外，用于本(ben)發(fa)明(ming)的(de)(de)iRhom1和/或(huo)(huo)iRhom2可(ke)來自人、靈長(chang)類動物、嚙(nie)齒類動物(例如，小鼠、大鼠、豚鼠)、牛、馬、驢、兔、山(shan)羊、綿羊、狗、雞(ji)、豬、果蠅(ying)、秀(xiu)麗線蟲或(huo)(huo)大腸桿菌(E.coli)。

在(zai)本文(wen)中(zhong)舉例說(shuo)明的野生型iRhom為小鼠(shu)iRhom2(SEQ ID No:1)、小鼠(shu)iRhom1(SEQ ID No:3)、人(ren)iRhom2(SEQ ID No:5)和人(ren)iRhom1(SEQ ID No:7)。在(zai)本文(wen)中(zhong)舉例說(shuo)明的分離的iRhom突變序(xu)列為SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8。

本領域技術人員(yuan)將易于(yu)認識到(dao)編(bian)碼(ma)本文所(suo)示的iRhom多肽的核(he)(he)(he)酸序(xu)列(lie)為SEQ ID NO:1-8。應理解，由于(yu)遺傳(chuan)密碼(ma)的簡并(bing)性，多于(yu)一個的核(he)(he)(he)酸序(xu)列(lie)編(bian)碼(ma)具體(ti)(ti)的iRhom多肽或(huo)變體(ti)(ti)，并(bing)且所(suo)述核(he)(he)(he)酸序(xu)列(lie)可被(bei)表達以產生所(suo)需的iRhom。

通常，iRhom1和(he)iRhom2變體與本申(shen)請(qing)中所示(shi)的(de)野(ye)生型iRhom1和(he)iRhom2的(de)序列的(de)序列同(tong)一性為至(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)少(shao)(shao)50％，例如(ru)至(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)少(shao)(shao)60％、至(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)少(shao)(shao)70％、至(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)少(shao)(shao)80％、至(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)少(shao)(shao)85％、至(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)少(shao)(shao)86％、至(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)少(shao)(shao)87％、至(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)少(shao)(shao)88％、至(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)少(shao)(shao)89％、至(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)少(shao)(shao)90％、至(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)少(shao)(shao)91％、至(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)少(shao)(shao)92％、至(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)少(shao)(shao)93％、至(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)少(shao)(shao)94％，至(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)少(shao)(shao)95％、至(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)少(shao)(shao)96％、至(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)少(shao)(shao)97％、至(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)少(shao)(shao)98％、或至(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)少(shao)(shao)99％。

一方面，與相(xiang)(xiang)應的野生型(xing)iRhom1或(huo)iRhom2相(xiang)(xiang)比，本發明的iRhom變(bian)體中改變(bian)(例(li)(li)如(ru)(ru)，置換、插入或(huo)缺失)的數目為1-20，例(li)(li)如(ru)(ru)1-10和1-5，例(li)(li)如(ru)(ru)1、2、3、4、5、6、7、8、9或(huo)10個改變(bian)。

作用機制

在(zai)許多(duo)物(wu)種中(zhong)(zhong)，iRhom參與多(duo)種功(gong)能(neng)，包括在(zai)黑(hei)腹(fu)果蠅中(zhong)(zhong)調(diao)節表皮生(sheng)長因子受體(ti)(EGFR)信號(hao)傳導(dao)、人鱗狀上皮癌細胞的(de)(de)存活、在(zai)哺乳動物(wu)細胞系中(zhong)(zhong)從內質網膜清除錯誤(wu)折疊的(de)(de)蛋(dan)白、誘(you)導(dao)原代小(xiao)鼠(shu)角(jiao)化細胞的(de)(de)遷(qian)移、在(zai)小(xiao)鼠(shu)中(zhong)(zhong)分泌可溶性TNFα、以及在(zai)小(xiao)鼠(shu)胚胎成纖維細胞中(zhong)(zhong)調(diao)節受激(ji)的(de)(de)ADAM17介導(dao)的(de)(de)金屬(shu)蛋(dan)白酶脫落的(de)(de)底物(wu)選(xuan)擇性。

在(zai)(zai)一個(ge)實施(shi)方(fang)案中(zhong)(zhong)(zhong)，本發(fa)明(ming)證(zheng)(zheng)明(ming)了(le)小鼠中(zhong)(zhong)(zhong)Rhbdf2基因(yin)內的(de)(de)(de)(de)自發(fa)性(xing)(xing)缺(que)失(shi)是(shi)(shi)卷曲(qu)裸(luo)露(cub)突(tu)(tu)變的(de)(de)(de)(de)原因(yin)，在(zai)(zai)所述(shu)突(tu)(tu)變中(zhong)(zhong)(zhong)iRhom2的(de)(de)(de)(de)細胞(bao)溶質的(de)(de)(de)(de)N-末端(duan)(duan)結(jie)構域(yu)的(de)(de)(de)(de)缺(que)失(shi)導致隨后對(dui)毛囊(nang)發(fa)育(yu)、創傷愈合和(he)腫瘤(liu)發(fa)生(sheng)的(de)(de)(de)(de)影響。在(zai)(zai)另(ling)一個(ge)實施(shi)方(fang)案中(zhong)(zhong)(zhong)，本發(fa)明(ming)證(zheng)(zheng)明(ming)了(le)iRhom2是(shi)(shi)短壽命蛋白，但(dan)是(shi)(shi)N-末端(duan)(duan)的(de)(de)(de)(de)功能獲得性(xing)(xing)突(tu)(tu)變或N-末端(duan)(duan)缺(que)失(shi)提高(gao)了(le)突(tu)(tu)變蛋白穩定性(xing)(xing)，導致不(bu)依賴于金屬蛋白酶(mei)(mei)的(de)(de)(de)(de)EGFR配(pei)體雙調蛋白(AREG)的(de)(de)(de)(de)分泌(mi)(mi)。使用(yong)cub表型(xing)的(de)(de)(de)(de)遺傳修飾因(yin)子(zi)(Mcub)，本發(fa)明(ming)證(zheng)(zheng)明(ming)了(le)AREG是(shi)(shi)iRhom2的(de)(de)(de)(de)生(sheng)理靶標。在(zai)(zai)另(ling)一個(ge)實施(shi)方(fang)案中(zhong)(zhong)(zhong)，鑒定了(le)AREG分泌(mi)(mi)所必(bi)需的(de)(de)(de)(de)iRhom2的(de)(de)(de)(de)肽酶(mei)(mei)域(yu)中(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)關鍵(jian)氨基酸(H、C、Q、H)，表明(ming)該假酶(mei)(mei)的(de)(de)(de)(de)肽酶(mei)(mei)域(yu)盡管在(zai)(zai)推定的(de)(de)(de)(de)活性(xing)(xing)位(wei)點中(zhong)(zhong)(zhong)缺(que)少絲氨酸殘基，但(dan)仍可(ke)能是(shi)(shi)功能性(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)。

iRhom家族(zu)成員的突變形式(shi)

本(ben)發明還涉及(ji)iRhom家族(zu)成員的(de)突變(bian)形式。在(zai)一(yi)(yi)個(ge)實施(shi)方案中(zhong)，iRhom1或(huo)iRhom2的(de)細(xi)(xi)胞溶質(zhi)的(de)N-末端被缺失。所述細(xi)(xi)胞溶質(zhi)的(de)N-末端的(de)缺失激活(huo)了iRhom多肽(tai)的(de)肽(tai)酶域中(zhong)的(de)休眠的(de)蛋白(bai)水解(jie)位(wei)(wei)點。在(zai)一(yi)(yi)個(ge)實施(shi)方案中(zhong)，iRhom1或(huo)iRhom2的(de)細(xi)(xi)胞溶質(zhi)末端被裂解(jie)，以(yi)使跨膜結構域具(ju)有(you)蛋白(bai)水解(jie)活(huo)性(xing)(xing)。在(zai)一(yi)(yi)個(ge)實施(shi)方案中(zhong)，小(xiao)鼠iRhom1在(zai)第1至272位(wei)(wei)殘(can)基(ji)之間(jian)(jian)(jian)被裂解(jie)，和(he)/或(huo)人(ren)iRhom1在(zai)第1至316位(wei)(wei)殘(can)基(ji)之間(jian)(jian)(jian)被裂解(jie)，以(yi)使跨膜結構域具(ju)有(you)蛋白(bai)水解(jie)活(huo)性(xing)(xing)。在(zai)另(ling)一(yi)(yi)個(ge)實施(shi)方案中(zhong)，小(xiao)鼠iRhom2在(zai)第1至268位(wei)(wei)殘(can)基(ji)之間(jian)(jian)(jian)被裂解(jie)，和(he)/或(huo)人(ren)iRhom2在(zai)第1至298位(wei)(wei)殘(can)基(ji)之間(jian)(jian)(jian)被裂解(jie)，以(yi)使跨膜結構域具(ju)有(you)蛋白(bai)水解(jie)活(huo)性(xing)(xing)。

所(suo)(suo)述iRhom多(duo)肽也可在(zai)跨(kua)(kua)(kua)膜(mo)(mo)結(jie)構域(yu)的(de)蛋(dan)白水(shui)(shui)解(jie)位(wei)(wei)點中(zhong)包含突變(bian)。在(zai)一(yi)個(ge)(ge)實(shi)施(shi)方案中(zhong)，小鼠iRhom2多(duo)肽在(zai)跨(kua)(kua)(kua)膜(mo)(mo)結(jie)構域(yu)的(de)蛋(dan)白水(shui)(shui)解(jie)位(wei)(wei)點(肽酶域(yu))中(zhong)包含一(yi)個(ge)(ge)或多(duo)個(ge)(ge)關鍵氨(an)(an)基酸的(de)突變(bian)，所(suo)(suo)述突變(bian)選(xuan)自TM螺(luo)(luo)(luo)旋2上的(de)第(di)(di)(di)635位(wei)(wei)組(zu)(zu)氨(an)(an)酸、TM螺(luo)(luo)(luo)旋4上的(de)第(di)(di)(di)695位(wei)(wei)谷(gu)氨(an)(an)酰(xian)胺(an)、跨(kua)(kua)(kua)膜(mo)(mo)螺(luo)(luo)(luo)旋4上的(de)第(di)(di)(di)701位(wei)(wei)半(ban)胱氨(an)(an)酸和第(di)(di)(di)744位(wei)(wei)組(zu)(zu)氨(an)(an)酸，以使跨(kua)(kua)(kua)膜(mo)(mo)結(jie)構域(yu)具有蛋(dan)白水(shui)(shui)解(jie)活性(xing)。在(zai)另一(yi)個(ge)(ge)實(shi)施(shi)方案中(zhong)，人iRhom2多(duo)肽在(zai)跨(kua)(kua)(kua)膜(mo)(mo)結(jie)構域(yu)的(de)蛋(dan)白水(shui)(shui)解(jie)位(wei)(wei)點中(zhong)包含一(yi)個(ge)(ge)或多(duo)個(ge)(ge)突變(bian)，所(suo)(suo)述突變(bian)選(xuan)自TM螺(luo)(luo)(luo)旋2上的(de)第(di)(di)(di)664位(wei)(wei)組(zu)(zu)氨(an)(an)酸、TM螺(luo)(luo)(luo)旋4上的(de)第(di)(di)(di)724位(wei)(wei)谷(gu)氨(an)(an)酰(xian)胺(an)、跨(kua)(kua)(kua)膜(mo)(mo)螺(luo)(luo)(luo)旋4上的(de)第(di)(di)(di)730位(wei)(wei)半(ban)胱氨(an)(an)酸和TM螺(luo)(luo)(luo)旋6上的(de)第(di)(di)(di)773位(wei)(wei)組(zu)(zu)氨(an)(an)酸，從(cong)而(er)使跨(kua)(kua)(kua)膜(mo)(mo)結(jie)構域(yu)具有蛋(dan)白水(shui)(shui)解(jie)活性(xing)。

篩選測定

本(ben)發明提供了鑒定改變(bian)(bian)iRhom多(duo)(duo)肽(例如，iRhom1或iRhom2)活性的化合物的方法(fa)。所(suo)述(shu)iRhom多(duo)(duo)肽可(ke)(ke)以是突(tu)變(bian)(bian)的iRhom多(duo)(duo)肽。例如，所(suo)述(shu)iRhom多(duo)(duo)肽可(ke)(ke)在(zai)其(qi)N-末(mo)(mo)端(duan)(duan)胞質結(jie)構域包(bao)(bao)含缺失(shi)。所(suo)述(shu)iRhom多(duo)(duo)肽可(ke)(ke)在(zai)跨膜(mo)肽酶(mei)域中包(bao)(bao)含突(tu)變(bian)(bian)。此外，所(suo)述(shu)iRhom多(duo)(duo)肽可(ke)(ke)在(zai)其(qi)N-末(mo)(mo)端(duan)(duan)胞質結(jie)構域中包(bao)(bao)含缺失(shi)，以及在(zai)跨膜(mo)肽酶(mei)域中包(bao)(bao)含突(tu)變(bian)(bian)。

一方(fang)面(mian)，本發明的(de)方(fang)法(fa)通常包(bao)括鑒定(ding)(ding)化合物(wu)，所(suo)述(shu)化合物(wu)激活(huo)iRhom多(duo)肽(tai)(tai)對(dui)(dui)底(di)物(wu)的(de)蛋白水(shui)解活(huo)性(xing)(xing)。在一個實(shi)施方(fang)案中(zhong)，所(suo)述(shu)方(fang)法(fa)包(bao)括使表達iRhom多(duo)肽(tai)(tai)的(de)細胞與測(ce)試化合物(wu)接觸并測(ce)定(ding)(ding)iRhom多(duo)肽(tai)(tai)穩定(ding)(ding)性(xing)(xing)相(xiang)對(dui)(dui)于合適對(dui)(dui)照(zhao)的(de)增加(jia)(jia)，其中(zhong)iRhom多(duo)肽(tai)(tai)穩定(ding)(ding)性(xing)(xing)的(de)增加(jia)(jia)表明所(suo)述(shu)化合物(wu)激活(huo)了iRhom多(duo)肽(tai)(tai)對(dui)(dui)底(di)物(wu)的(de)蛋白水(shui)解活(huo)性(xing)(xing)。在一個實(shi)施方(fang)案中(zhong)，所(suo)述(shu)底(di)物(wu)可以是EGFR配體或EGF樣底(di)物(wu)。

另一(yi)方(fang)面，本發明(ming)的(de)(de)方(fang)法(fa)通(tong)常包括鑒定化合物(wu)(wu)(wu)的(de)(de)方(fang)法(fa)，所(suo)(suo)述(shu)化合物(wu)(wu)(wu)抑制(zhi)iRhom多(duo)(duo)肽(tai)對(dui)(dui)底(di)(di)(di)物(wu)(wu)(wu)的(de)(de)蛋白(bai)(bai)水解活(huo)性(xing)。在(zai)一(yi)個實(shi)(shi)施方(fang)案中(zhong)，所(suo)(suo)述(shu)方(fang)法(fa)包括使表達iRhom多(duo)(duo)肽(tai)的(de)(de)細(xi)胞與測試(shi)化合物(wu)(wu)(wu)接觸并測定iRhom多(duo)(duo)肽(tai)的(de)(de)生理(li)靶標的(de)(de)分(fen)泌(mi)相對(dui)(dui)于(yu)合適對(dui)(dui)照(zhao)的(de)(de)減少或EGFR活(huo)性(xing)相對(dui)(dui)于(yu)合適對(dui)(dui)照(zhao)的(de)(de)降低，其中(zhong)iRhom多(duo)(duo)肽(tai)的(de)(de)生理(li)靶標分(fen)泌(mi)的(de)(de)減少或EGFR活(huo)性(xing)的(de)(de)降低表明(ming)所(suo)(suo)述(shu)化合物(wu)(wu)(wu)抑制(zhi)iRhom多(duo)(duo)肽(tai)對(dui)(dui)底(di)(di)(di)物(wu)(wu)(wu)的(de)(de)蛋白(bai)(bai)水解活(huo)性(xing)。在(zai)一(yi)個實(shi)(shi)施方(fang)案中(zhong)，所(suo)(suo)述(shu)底(di)(di)(di)物(wu)(wu)(wu)可以是EGFR配(pei)體(ti)或EGF樣底(di)(di)(di)物(wu)(wu)(wu)。

人(ren)們認為(wei)，表(biao)皮生長(chang)因(yin)子(zi)受體(EGFR)信(xin)號轉(zhuan)導在哺(bu)乳(ru)動物細胞的(de)(de)生長(chang)、增殖和分化中發(fa)揮重要作用(yong)。本(ben)(ben)(ben)發(fa)明(ming)提供了(le)(le)iRhom是(shi)短壽(shou)命蛋白，但是(shi)顯性(xing)突變提高(gao)其蛋白穩定(ding)性(xing)并刺(ci)激不依賴于金屬蛋白酶(mei)活性(xing)的(de)(de)特(te)定(ding)的(de)(de)EGF家族配體雙調(diao)蛋白的(de)(de)分泌。本(ben)(ben)(ben)發(fa)明(ming)證明(ming)了(le)(le)哺(bu)乳(ru)動物iRhom在調(diao)節(jie)促進創傷(shang)加速愈合并引發(fa)腫瘤形成的(de)(de)EGFR信(xin)號傳(chuan)導事件(jian)中的(de)(de)重要性(xing)。本(ben)(ben)(ben)發(fa)明(ming)還提供了(le)(le)iRhom可與金屬蛋白酶(mei)并行(xing)調(diao)節(jie)EGFR信(xin)號傳(chuan)導。因(yin)此，本(ben)(ben)(ben)發(fa)明(ming)提供了(le)(le)使用(yong)iRhom作為(wei)受損的(de)(de)傷(shang)口(kou)愈合和癌癥中的(de)(de)新型治療靶(ba)標(biao)的(de)(de)新策略。

本發明的(de)多方面涉及篩選(xuan)和測定(ding)(ding)方法及手(shou)段，以及由此(ci)鑒(jian)定(ding)(ding)的(de)物質，例如(ru)，用于激活或抑制(zhi)iRhom多肽(tai)對底(di)物的(de)蛋(dan)白水解活性的(de)化合(he)物的(de)測定(ding)(ding)。所述底(di)物可以是(shi)EGFR配體或EGF樣底(di)物。

其他測(ce)定用于與iRhom多肽相互(hu)作用或結(jie)合并且調節(即提高、刺激、降低、抑(yi)制或消除)iRhom多肽的蛋白水解(jie)活性的化合物或物質。

對(dui)(dui)照是本領域(yu)熟知的(de)，本領域(yu)技術人員易于識別出合(he)適(shi)對(dui)(dui)照并(bing)且能夠僅借助常規(gui)實驗確定用于本發明方法的(de)合(he)適(shi)對(dui)(dui)照。

根據鑒定(ding)調節根據本發明方(fang)(fang)面(mian)的(de)(de)(de)iRhom多(duo)(duo)(duo)肽(tai)(tai)活性(xing)的(de)(de)(de)化(hua)合(he)物的(de)(de)(de)方(fang)(fang)法——其(qi)包括使表達iRhom多(duo)(duo)(duo)肽(tai)(tai)的(de)(de)(de)細(xi)胞與(yu)測(ce)試化(hua)合(he)物接觸(chu)并測(ce)定(ding)所述(shu)測(ce)試化(hua)合(he)物對iRhom多(duo)(duo)(duo)肽(tai)(tai)的(de)(de)(de)活性(xing)的(de)(de)(de)影響——的(de)(de)(de)方(fang)(fang)面(mian)，當(dang)在相同(tong)或相似的(de)(de)(de)條件下，表達iRhom多(duo)(duo)(duo)肽(tai)(tai)的(de)(de)(de)細(xi)胞不與(yu)所述(shu)測(ce)試化(hua)合(he)物接觸(chu)時，用合(he)適對照測(ce)定(ding)iRhom多(duo)(duo)(duo)肽(tai)(tai)的(de)(de)(de)活性(xing)。

合適(shi)對照可(ke)(ke)以是(shi)變量的(de)(de)(de)參照水(shui)平，例如iRhom多(duo)肽(tai)(tai)的(de)(de)(de)活性(xing)(xing)、iRhom多(duo)肽(tai)(tai)的(de)(de)(de)穩定(ding)(ding)性(xing)(xing)水(shui)平、iRhom多(duo)肽(tai)(tai)的(de)(de)(de)生理靶標的(de)(de)(de)分泌水(shui)平、相對于合適(shi)對照的(de)(de)(de)EGFR活性(xing)(xing)水(shui)平和/或(huo)可(ke)(ke)溶性(xing)(xing)EGFR配體的(de)(de)(de)水(shui)平，其被事先測定(ding)(ding)并存儲在印刷品中(zhong)或(huo)電(dian)子介質中(zhong)，用于調用(recall)并與根據(ju)鑒(jian)定(ding)(ding)調節本發明的(de)(de)(de)iRhom多(duo)肽(tai)(tai)活性(xing)(xing)的(de)(de)(de)化合物的(de)(de)(de)方(fang)法(fa)的(de)(de)(de)方(fang)面而測定(ding)(ding)的(de)(de)(de)測試化合物對iRhom多(duo)肽(tai)(tai)活性(xing)(xing)的(de)(de)(de)影響進(jin)行比較。

鑒定(ding)iRhom多(duo)(duo)肽(tai)(tai)的(de)(de)調節劑的(de)(de)測(ce)(ce)定(ding)方法(fa)可包括(kuo)使本文(wen)所述的(de)(de)iRhom多(duo)(duo)肽(tai)(tai)與(yu)(yu)測(ce)(ce)試(shi)化(hua)(hua)合(he)(he)(he)物(wu)接觸，確定(ding)所述測(ce)(ce)試(shi)化(hua)(hua)合(he)(he)(he)物(wu)與(yu)(yu)iRhom多(duo)(duo)肽(tai)(tai)的(de)(de)結合(he)(he)(he)，并在存(cun)在和(he)不存(cun)在結合(he)(he)(he)iRhom多(duo)(duo)肽(tai)(tai)的(de)(de)測(ce)(ce)試(shi)化(hua)(hua)合(he)(he)(he)物(wu)的(de)(de)情況下測(ce)(ce)定(ding)iRhom多(duo)(duo)肽(tai)(tai)的(de)(de)蛋(dan)白水解(jie)(jie)活性。可通(tong)過下文(wen)所述的(de)(de)測(ce)(ce)定(ding)底物(wu)的(de)(de)裂解(jie)(jie)來測(ce)(ce)定(ding)蛋(dan)白水解(jie)(jie)活性。所述iRhom多(duo)(duo)肽(tai)(tai)可以(yi)是分離的(de)(de)或(huo)包含于脂質體或(huo)細胞中。

篩選(xuan)和/或(huo)獲得調節(jie)iRhom多(duo)(duo)(duo)肽活(huo)(huo)性(xing)的(de)(de)物(wu)質/化(hua)合(he)(he)(he)物(wu)的(de)(de)方法可(ke)(ke)包(bao)括在(zai)合(he)(he)(he)適(shi)的(de)(de)反(fan)應培養(yang)基中(zhong)(zhong)使一種或(huo)多(duo)(duo)(duo)種測試(shi)物(wu)質或(huo)化(hua)合(he)(he)(he)物(wu)與(yu)iRhom多(duo)(duo)(duo)肽接觸，測定(ding)經處(chu)(chu)理的(de)(de)多(duo)(duo)(duo)肽的(de)(de)活(huo)(huo)性(xing)，并(bing)將所述活(huo)(huo)性(xing)與(yu)在(zai)未用(yong)所述一種或(huo)多(duo)(duo)(duo)種測試(shi)物(wu)質處(chu)(chu)理的(de)(de)相當的(de)(de)反(fan)應培養(yang)基中(zhong)(zhong)所述多(duo)(duo)(duo)肽的(de)(de)活(huo)(huo)性(xing)進行比較。所述iRhom多(duo)(duo)(duo)肽可(ke)(ke)以以分離的(de)(de)形式存在(zai)于反(fan)應培養(yang)基中(zhong)(zhong)或(huo)可(ke)(ke)包(bao)含于脂質體或(huo)細胞中(zhong)(zhong)。

經處(chu)理和未經處(chu)理的iRhom多肽之間的活性差(cha)異指(zhi)示相關的一種或(huo)多種測試物質(zhi)的調節作用(yong)，例如，抑制或(huo)增強(qiang)作用(yong)。

可通(tong)過測(ce)定經蛋白水解而裂解的(de)底物(wu)的(de)產生(sheng)來測(ce)定iRhom多(duo)肽的(de)活(huo)性。例如，所(suo)述(shu)iRhom多(duo)肽可作用于與膜(mo)結合(he)的(de)底物(wu)以產生(sheng)被檢測(ce)的(de)可溶性產物(wu)。

根據本發明(ming)的(de)另一(yi)方(fang)面(mian)，提供(gong)了(le)鑒定和(he)/或獲得iRhom多肽的(de)調節劑的(de)測(ce)(ce)定方(fang)法，所述方(fang)法包括(kuo)：(a)在(zai)存(cun)在(zai)多肽底物(wu)的(de)情況下使iRhom多肽與測(ce)(ce)試化合物(wu)接觸；和(he)(b)測(ce)(ce)定所述多肽底物(wu)的(de)蛋白水解(jie)裂解(jie)。

可在(zai)存在(zai)和不存在(zai)測試化(hua)合(he)物的(de)(de)(de)情況(kuang)下測定對底物的(de)(de)(de)裂(lie)解(jie)。存在(zai)測試化(hua)合(he)物的(de)(de)(de)情況(kuang)相對于不存在(zai)測試化(hua)合(he)物的(de)(de)(de)情況(kuang)下裂(lie)解(jie)的(de)(de)(de)差(cha)異指示所述測試化(hua)合(he)物是iRhom蛋白酶活性的(de)(de)(de)調節劑。

任何被iRhom多肽(tai)經蛋(dan)白水(shui)解而裂解的多肽(tai)底(di)物均(jun)可(ke)用于本(ben)文所述(shu)(shu)的測定方法。使用標準(zhun)技術可(ke)容易地鑒定所述(shu)(shu)底(di)物。所述(shu)(shu)多肽(tai)底(di)物可(ke)以為EGFR配(pei)體，例如AREG或HB-EGF。

合適(shi)(shi)的底物可包括可檢測的標記，例(li)如綠色(se)熒光(guang)蛋白(GFP)、熒光(guang)素酶(mei)或(huo)堿性磷酸(suan)酶(mei)。這允許(xu)便利地檢測可溶性裂解產物，并且(qie)特別適(shi)(shi)用于自動化測定。

適用(yong)于本(ben)測定的EGFR配體在本(ben)領域(yu)被很好(hao)的表征，并且(qie)可具(ju)有包(bao)含一個(ge)或多(duo)個(ge)表皮(pi)生長因子(EGF)結(jie)(jie)(jie)構(gou)(gou)域(yu)和單一跨膜結(jie)(jie)(jie)構(gou)(gou)域(yu)的結(jie)(jie)(jie)構(gou)(gou)。

優選地(di)，合適的(de)EGFR配(pei)體與脊椎動物EGFR配(pei)體具有大(da)于(yu)(yu)50％的(de)同源(yuan)性(xing)(xing)(xing)，大(da)于(yu)(yu)60％的(de)同源(yuan)性(xing)(xing)(xing)，大(da)于(yu)(yu)70％的(de)同源(yuan)性(xing)(xing)(xing)，大(da)于(yu)(yu)80％的(de)同源(yuan)性(xing)(xing)(xing)，大(da)于(yu)(yu)90％的(de)同源(yuan)性(xing)(xing)(xing)或(huo)大(da)于(yu)(yu)95％的(de)同源(yuan)性(xing)(xing)(xing)。

在本(ben)文所述的(de)方法(fa)中，嵌合配體(ti)可具有改(gai)進的(de)特性，例如它(ta)可更有效地被iRhom多肽(tai)裂解，具有改(gai)進的(de)分泌特性或更易于(yu)被檢測。

本發明的(de)(de)另一方(fang)面提供了嵌合的(de)(de)EGFR配(pei)體(ti)(ti)，其包含(han)來自(zi)兩種(zhong)或更多種(zhong)EGFR配(pei)體(ti)(ti)的(de)(de)序列(lie)，例如(ru)嵌合配(pei)體(ti)(ti)可(ke)(ke)包含(han)第一EGFR配(pei)體(ti)(ti)的(de)(de)跨膜結(jie)構(gou)域(yu)以及(ji)第二EGFR配(pei)體(ti)(ti)的(de)(de)胞內(nei)和胞外結(jie)構(gou)域(yu)。嵌合底(di)物還(huan)可(ke)(ke)包含(han)可(ke)(ke)檢測的(de)(de)標簽，例如(ru)熒光素酶、GFP或堿(jian)性磷(lin)酸(suan)酶。

本發明(ming)的獲得或鑒定(ding)iRhom活性調節劑的測(ce)定(ding)方法(fa)或其他方法(fa)可(ke)以(yi)是基于(yu)(yu)細(xi)胞(bao)的體(ti)內(nei)測(ce)定(ding)或不基于(yu)(yu)細(xi)胞(bao)的體(ti)外(wai)測(ce)定(ding)。

可在巴馬(ma)司他(Batimastat)存在下(xia)進行所述(shu)方法以抑(yi)制非(fei)菱形蛋白酶(mei)或非(fei)iRhom依賴的底物脫落，從而減少(shao)背景。

在體外(wai)測定中，所述iRhom多肽可以是分離的或包含(han)于脂(zhi)(zhi)質體中。可使用本領(ling)域(yu)熟知的方法進(jin)行基于脂(zhi)(zhi)質體的試驗(yan)。

用于體外測定的適合的細(xi)胞類型(xing)包括哺乳動物(wu)細(xi)胞，例如小鼠胚胎成纖維細(xi)胞、角化細(xi)胞、HEK293、CHO、HeLa和COS細(xi)胞。

對于本發明的(de)(de)(de)(de)體外或(huo)體內測(ce)定(ding)，不(bu)必使用(yong)完整的(de)(de)(de)(de)全長蛋白。可(ke)(ke)以本領域技術(shu)人(ren)員已知的(de)(de)(de)(de)任(ren)(ren)何合(he)(he)適(shi)的(de)(de)(de)(de)方法(fa)產(chan)生并使用(yong)保留全長蛋白活性的(de)(de)(de)(de)如本文所(suo)(suo)述(shu)的(de)(de)(de)(de)多肽(tai)片段。產(chan)生片段的(de)(de)(de)(de)合(he)(he)適(shi)的(de)(de)(de)(de)方法(fa)包括但(dan)不(bu)限(xian)于，來自編(bian)碼(ma)DNA的(de)(de)(de)(de)片段的(de)(de)(de)(de)重(zhong)組表達(da)(da)。可(ke)(ke)通過取編(bian)碼(ma)DNA、鑒定(ding)待表達(da)(da)的(de)(de)(de)(de)部(bu)(bu)分任(ren)(ren)一側的(de)(de)(de)(de)合(he)(he)適(shi)的(de)(de)(de)(de)限(xian)制(zhi)性酶識別(bie)位點、以及從DNA切下所(suo)(suo)述(shu)部(bu)(bu)分來產(chan)生所(suo)(suo)述(shu)片段。然后可(ke)(ke)在(zai)標(biao)準的(de)(de)(de)(de)市售可(ke)(ke)得的(de)(de)(de)(de)表達(da)(da)系統中將所(suo)(suo)述(shu)部(bu)(bu)分與合(he)(he)適(shi)的(de)(de)(de)(de)啟動子可(ke)(ke)操(cao)作地連接。另一種重(zhong)組方法(fa)是使用(yong)合(he)(he)適(shi)的(de)(de)(de)(de)PCR引物來擴增(zeng)DNA的(de)(de)(de)(de)相關(guan)部(bu)(bu)分。也可(ke)(ke)采用(yong)本領域熟知的(de)(de)(de)(de)肽(tai)合(he)(he)成法(fa)來產(chan)生小片段(例(li)如，最多達(da)(da)約(yue)20或(huo)30個(ge)氨基酸)。

本發(fa)明的(de)(de)測定的(de)(de)準確形(xing)式可(ke)(ke)由本領域(yu)技(ji)術(shu)人員使用(yong)常規技(ji)術(shu)和(he)知(zhi)識而改(gai)變。例如，可(ke)(ke)通過用(yong)可(ke)(ke)檢(jian)測的(de)(de)標(biao)(biao)(biao)記(ji)來(lai)標(biao)(biao)(biao)記(ji)一(yi)種多肽(tai)(tai)并使其與已固定在固體(ti)載體(ti)上的(de)(de)另一(yi)種多肽(tai)(tai)接觸，在體(ti)外研究所述多肽(tai)(tai)之間的(de)(de)相(xiang)互作(zuo)用(yong)。合適的(de)(de)可(ke)(ke)檢(jian)測的(de)(de)標(biao)(biao)(biao)記(ji)包括35S-甲硫(liu)氨酸(suan)，其可(ke)(ke)被摻入到通過重組產(chan)生的(de)(de)肽(tai)(tai)和(he)多肽(tai)(tai)中。通過重組產(chan)生的(de)(de)肽(tai)(tai)和(he)多肽(tai)(tai)也可(ke)(ke)被表達為融合蛋白，其包含(han)可(ke)(ke)用(yong)抗體(ti)進行標(biao)(biao)(biao)記(ji)的(de)(de)表位。

可(ke)(ke)產(chan)生融合(he)蛋白(bai)，其在(zai)所述(shu)重組蛋白(bai)的(de)(de)N-末端或(huo)C-末端納(na)入(ru)6個組氨酸(suan)(suan)殘(can)基。所述(shu)組氨酸(suan)(suan)標簽可(ke)(ke)用于使(shi)用市售(shou)可(ke)(ke)得(de)的(de)(de)包含金屬離子(鎳或(huo)鈷)的(de)(de)柱來(lai)進(jin)行的(de)(de)蛋白(bai)純化(hua)。這些(xie)標簽也可(ke)(ke)用于檢(jian)測(ce)蛋白(bai)，所述(shu)檢(jian)測(ce)使(shi)用市售(shou)可(ke)(ke)得(de)的(de)(de)針對所述(shu)6個組氨酸(suan)(suan)殘(can)基的(de)(de)單克隆抗體來(lai)進(jin)行。

本發明(ming)的(de)測定(ding)可采(cai)用體外測定(ding)的(de)形式。可在細(xi)胞(bao)(bao)系(xi)(例如酵母菌株、昆蟲細(xi)胞(bao)(bao)系(xi)或(huo)哺乳動物(wu)細(xi)胞(bao)(bao)系(xi))中進行體外測定(ding)，在所述細(xi)胞(bao)(bao)系(xi)中從(cong)被(bei)引入到細(xi)胞(bao)(bao)中的(de)一個或(huo)多個載體表達相(xiang)關的(de)多肽或(huo)肽。

在(zai)(zai)所(suo)(suo)述(shu)實施方(fang)(fang)案的測定方(fang)(fang)法或其(qi)他方(fang)(fang)法中(zhong)，在(zai)(zai)存(cun)在(zai)(zai)底物(wu)(wu)(例如EGFR配體)的情況下(xia)使iRhom多(duo)肽(tai)與測試化(hua)合(he)物(wu)(wu)接觸。在(zai)(zai)所(suo)(suo)述(shu)方(fang)(fang)法中(zhong)，所(suo)(suo)述(shu)iRhom多(duo)肽(tai)和(he)底物(wu)(wu)可(ke)存(cun)在(zai)(zai)于細(xi)胞中(zhong)。例如，這可(ke)通過從已通過轉化(hua)被引入到(dao)細(xi)胞中(zhong)的一個(ge)或多(duo)個(ge)表達(da)載體表達(da)所(suo)(suo)述(shu)多(duo)肽(tai)而實現。

用于鑒定和(he)/或(huo)獲得(de)iRhom蛋(dan)白水解(jie)活(huo)性的(de)(de)調(diao)節劑的(de)(de)測定方(fang)法因(yin)此可包(bao)括(kuo)：(a)在存在EGFR配體(ti)多(duo)肽的(de)(de)情況下使(shi)iRhom多(duo)肽與(yu)測試化合物接觸；和(he)(b)測定EGFR配體(ti)的(de)(de)裂(lie)解(jie)。

可在(zai)存(cun)(cun)活(huo)和不存(cun)(cun)在(zai)測(ce)試(shi)化(hua)合物(wu)(wu)(wu)的(de)情況(kuang)(kuang)下測(ce)定(ding)裂解。存(cun)(cun)在(zai)測(ce)試(shi)化(hua)合物(wu)(wu)(wu)的(de)情況(kuang)(kuang)相對(dui)于不存(cun)(cun)在(zai)測(ce)試(shi)化(hua)合物(wu)(wu)(wu)的(de)情況(kuang)(kuang)下裂解的(de)差(cha)異(yi)指(zhi)示所述化(hua)合物(wu)(wu)(wu)是(shi)iRhom活(huo)性的(de)調節劑(即(ji)增強(qiang)劑或抑制劑)。

可(ke)(ke)將編碼(ma)(ma)上文(wen)所述(shu)的(de)(de)(de)iRhom多(duo)(duo)肽(tai)(tai)和/或(huo)多(duo)(duo)肽(tai)(tai)底物的(de)(de)(de)核酸(suan)(suan)提(ti)供為可(ke)(ke)復(fu)制載(zai)體(ti)(ti)(特別是可(ke)(ke)在合適條件下從其表達(da)編碼(ma)(ma)多(duo)(duo)肽(tai)(tai)的(de)(de)(de)任何表達(da)載(zai)體(ti)(ti))和宿主細(xi)胞(bao)(其包(bao)含(han)任何所述(shu)載(zai)體(ti)(ti)或(huo)核酸(suan)(suan))的(de)(de)(de)一部(bu)分。在本上下文(wen)中(zhong)表達(da)載(zai)體(ti)(ti)是包(bao)括編碼(ma)(ma)目的(de)(de)(de)多(duo)(duo)肽(tai)(tai)和合適調(diao)控(kong)序(xu)列的(de)(de)(de)核酸(suan)(suan)的(de)(de)(de)核酸(suan)(suan)分子(zi)，用于在體(ti)(ti)外表達(da)系統(例(li)如網(wang)織紅(hong)細(xi)胞(bao)裂解物)或(huo)體(ti)(ti)內(例(li)如，在真核細(xi)胞(bao)如HEK、COS或(huo)CHO細(xi)胞(bao)中(zhong)或(huo)原核細(xi)胞(bao)如大腸(chang)桿(gan)菌中(zhong))表達(da)所述(shu)多(duo)(duo)肽(tai)(tai)。這將在下文(wen)中(zhong)進一步討論。

組合(he)文庫技術提(ti)供了(le)測(ce)(ce)試(shi)潛在的(de)大量不(bu)同(tong)(tong)物(wu)質調(diao)節(jie)多(duo)肽活(huo)性的(de)能(neng)力的(de)有效(xiao)方法。在活(huo)性調(diao)節(jie)的(de)篩選之前或同(tong)(tong)時，可篩選測(ce)(ce)試(shi)物(wu)質與多(duo)肽相(xiang)互作用的(de)能(neng)力，例如(ru)在酵母雙雜交系統(其需要多(duo)肽和(he)測(ce)(ce)試(shi)物(wu)質都(dou)能(neng)夠在酵母中由編碼核酸表達)中進行篩選。這可用作測(ce)(ce)試(shi)物(wu)質調(diao)節(jie)多(duo)肽活(huo)性的(de)真實能(neng)力之前的(de)粗(cu)篩。

通常根據所使用的(de)(de)(de)化(hua)合物的(de)(de)(de)類型(xing)通過反復試(shi)驗(trial and error)來確定(ding)(ding)(ding)可(ke)添(tian)加到本發明測定(ding)(ding)(ding)中的(de)(de)(de)測試(shi)物質或(huo)化(hua)合物的(de)(de)(de)量(liang)。通常，可(ke)使用約(yue)0.01至(zhi)100nM濃(nong)度(du)的(de)(de)(de)推(tui)定(ding)(ding)(ding)抑(yi)制(zhi)劑或(huo)激活劑化(hua)合物，例(li)如0.1至(zhi)10nM。當(dang)采用基(ji)于細胞(bao)的(de)(de)(de)測定(ding)(ding)(ding)時(shi)，所述(shu)試(shi)驗物質或(huo)化(hua)合物需要(yao)是膜可(ke)透過性的(de)(de)(de)，以接近(jin)iRhom多肽。

測(ce)試化合(he)物可以(yi)是用(yong)于藥物篩選程序(xu)的天(tian)然或(huo)(huo)(huo)合(he)成化合(he)物。也可使(shi)用(yong)包含若(ruo)干被表征或(huo)(huo)(huo)未被表征的組分的植物提取物。另一(yi)類推定的抑制劑或(huo)(huo)(huo)激活劑化合(he)物可獲得(de)自iRhom多肽和/或(huo)(huo)(huo)結合(he)其的配體。可測(ce)試5至40個(ge)氨基酸(例如(ru)6至10個(ge)氨基酸)的膜可透過(guo)性(xing)(xing)的的肽片(pian)段破壞所述(shu)相互作用(yong)或(huo)(huo)(huo)活性(xing)(xing)的能(neng)力。

在(zai)(zai)一(yi)個實施方(fang)(fang)案(an)中(zhong)(zhong)，調節(例(li)如提高或降低)iRhom多肽(tai)(tai)的蛋白(bai)水解活性(xing)的化(hua)合(he)(he)(he)(he)物可(ke)以為小(xiao)分子化(hua)合(he)(he)(he)(he)物。在(zai)(zai)另一(yi)個實施方(fang)(fang)案(an)中(zhong)(zhong)，所述(shu)化(hua)合(he)(he)(he)(he)物細(xi)胞可(ke)透(tou)過性(xing)的。例(li)如，所述(shu)化(hua)合(he)(he)(he)(he)物可(ke)以為泛素(su)蛋白(bai)酶抑制劑。在(zai)(zai)另一(yi)個實施方(fang)(fang)案(an)中(zhong)(zhong)，所述(shu)化(hua)合(he)(he)(he)(he)物連接至(zhi)細(xi)胞穿(chuan)透(tou)肽(tai)(tai)。所述(shu)細(xi)胞穿(chuan)透(tou)肽(tai)(tai)可(ke)包含富含賴氨酸或精氨酸的序列(lie)。例(li)如，所述(shu)細(xi)胞穿(chuan)透(tou)肽(tai)(tai)可(ke)以是tat。

其他測試化合(he)物(wu)可基于多肽(tai)或肽(tai)片段的(de)三維結構的(de)建模并且(qie)使用合(he)理的(de)藥物(wu)設(she)計(ji)以提(ti)供具有特定分子(zi)形狀(zhuang)、大小(xiao)和電荷特征的(de)潛在的(de)抑制(zhi)劑(ji)化合(he)物(wu)。

在鑒定調節或影響(xiang)多肽(tai)活性的(de)物(wu)(wu)(wu)(wu)質(zhi)(zhi)之(zhi)后，可(ke)(ke)進一步研究(jiu)所(suo)述物(wu)(wu)(wu)(wu)質(zhi)(zhi)。此外(wai)，可(ke)(ke)制(zhi)備所(suo)述物(wu)(wu)(wu)(wu)質(zhi)(zhi)和(he)/或將其用于制(zhi)備(即制(zhi)備或配制(zhi))組(zu)合物(wu)(wu)(wu)(wu)(例(li)如藥劑、藥物(wu)(wu)(wu)(wu)組(zu)合物(wu)(wu)(wu)(wu)或藥物(wu)(wu)(wu)(wu))。可(ke)(ke)將它們給予個體。

本發明的(de)(de)另一(yi)方(fang)(fang)面(mian)提供了本文所述的(de)(de)iRhom多肽(tai)在獲得(de)或(huo)鑒定(ding)iRhom蛋白水(shui)解活性的(de)(de)調節劑(ji)(例(li)如抑制劑(ji))的(de)(de)方(fang)(fang)法中的(de)(de)用途。也提供了iRhom多肽(tai)用于多肽(tai)底物的(de)(de)跨膜結構域的(de)(de)蛋白水(shui)解裂解的(de)(de)方(fang)(fang)法和用途。

iRhom活性(xing)調(diao)節劑(特別是抑制劑)可用于治療(liao)癌(ai)癥，例如食(shi)管癌(ai)、肺癌(ai)、腦癌(ai)、結腸癌(ai)、腎癌(ai)、前列腺癌(ai)、皮膚癌(ai)、肝(gan)癌(ai)、胰腺癌(ai)、胃癌(ai)、子宮(gong)癌(ai)、卵巢癌(ai)、淋巴腺癌(ai)或膀胱癌(ai)。

iRhom活性(xing)調節劑(特(te)別是激活劑)可(ke)用于加速組織(例如，皮(pi)膚、肝(gan)臟、心臟、肌肉或腎(shen))中受損(sun)的傷口(kou)愈合(he)。

iRhom活性(xing)調節劑也可用于(yu)治療炎癥(zheng)(zheng)病癥(zheng)(zheng)或(huo)疾病，例如類風濕性(xing)關節炎和自身(shen)免疫性(xing)疾病。

因(yin)此，本發(fa)明在多個方面(mian)不僅(jin)擴展至(zhi)根(gen)據本文公(gong)開的(de)內容被鑒定為iRhom活性調節劑(ji)的(de)物(wu)(wu)質(zhi)(zhi)，還擴展至(zhi)包(bao)含所(suo)述(shu)(shu)物(wu)(wu)質(zhi)(zhi)的(de)藥(yao)物(wu)(wu)組(zu)(zu)合(he)(he)物(wu)(wu)、藥(yao)劑(ji)、藥(yao)物(wu)(wu)或(huo)其(qi)(qi)他組(zu)(zu)合(he)(he)物(wu)(wu)；包(bao)括將所(suo)述(shu)(shu)組(zu)(zu)合(he)(he)物(wu)(wu)給予患者(例如(ru)用于治(zhi)療(其(qi)(qi)可包(bao)括預防(fang)性治(zhi)療)病原體感(gan)染(ran)或(huo)與(yu)異(yi)常ErbB或(huo)EGF受(shou)體活性相(xiang)關的(de)病癥(例如(ru)癌癥、冠(guan)狀(zhuang)(zhuang)動脈粥(zhou)樣硬化(hua)、銀屑病、傷(shang)口(kou)愈合(he)(he)、毛發(fa)生長)、治(zhi)愈和/或(huo)矯正變禿)的(de)方法；所(suo)述(shu)(shu)物(wu)(wu)質(zhi)(zhi)用于制備組(zu)(zu)合(he)(he)物(wu)(wu)的(de)用途，所(suo)述(shu)(shu)組(zu)(zu)合(he)(he)物(wu)(wu)用于給予，例如(ru)用于治(zhi)療病原體感(gan)染(ran)或(huo)與(yu)異(yi)常ErbB或(huo)EGF受(shou)體活性相(xiang)關的(de)病癥(例如(ru)癌癥、冠(guan)狀(zhuang)(zhuang)動脈粥(zhou)樣硬化(hua)、銀屑病、傷(shang)口(kou)愈合(he)(he)、毛發(fa)生長)、治(zhi)愈和/或(huo)矯正變禿；以(yi)及制備藥(yao)物(wu)(wu)組(zu)(zu)合(he)(he)物(wu)(wu)的(de)方法，包(bao)括將所(suo)述(shu)(shu)物(wu)(wu)質(zhi)(zhi)與(yu)可藥(yao)用賦形(xing)劑(ji)、媒介物(wu)(wu)或(huo)載體以(yi)及任選的(de)其(qi)(qi)他成分混合(he)(he)。

被使用本文(wen)所述的測定鑒定為多(duo)肽(tai)(tai)(tai)或(huo)(huo)啟動子(zi)功能的調節劑的物(wu)(wu)(wu)質本質上可以(yi)為肽(tai)(tai)(tai)或(huo)(huo)非肽(tai)(tai)(tai)。對(dui)于(yu)許多(duo)體內(nei)藥(yao)物(wu)(wu)(wu)用途(tu)而(er)言(yan)，通常優選非肽(tai)(tai)(tai)“小(xiao)分(fen)子(zi)”。因(yin)此，可針對(dui)藥(yao)物(wu)(wu)(wu)用途(tu)設計所述物(wu)(wu)(wu)質(特別是如果是肽(tai)(tai)(tai))的類似物(wu)(wu)(wu)或(huo)(huo)模擬物(wu)(wu)(wu)。

已知的(de)藥(yao)物(wu)(wu)活(huo)(huo)性化(hua)合(he)(he)(he)物(wu)(wu)的(de)類(lei)(lei)似(si)(si)物(wu)(wu)的(de)設(she)計(ji)(ji)是基于“先導(lead)”化(hua)合(he)(he)(he)物(wu)(wu)開(kai)發藥(yao)物(wu)(wu)的(de)已知方法。當活(huo)(huo)性化(hua)合(he)(he)(he)物(wu)(wu)難以合(he)(he)(he)成(cheng)或合(he)(he)(he)成(cheng)費用高時(shi)(shi)，或活(huo)(huo)性化(hua)合(he)(he)(he)物(wu)(wu)不(bu)適合(he)(he)(he)特定(ding)的(de)給(gei)藥(yao)方法時(shi)(shi)，可能需要設(she)計(ji)(ji)其(qi)類(lei)(lei)似(si)(si)物(wu)(wu)。

類似物設計(ji)、合(he)成和測試(shi)可(ke)用于避免(mian)針對靶標(biao)特性(xing)隨機篩(shai)選大(da)量分子。

iRhom家(jia)族多(duo)肽(tai)的(de)必要催化(hua)殘基對應于(yu)小鼠iRhom2多(duo)肽(tai)的(de)TM螺(luo)(luo)(luo)旋(xuan)2上(shang)(shang)的(de)第(di)635位(wei)(wei)組氨(an)(an)酸(suan)、TM螺(luo)(luo)(luo)旋(xuan)4上(shang)(shang)的(de)第(di)695位(wei)(wei)谷氨(an)(an)酰胺(an)、TM螺(luo)(luo)(luo)旋(xuan)4上(shang)(shang)的(de)第(di)701位(wei)(wei)半胱氨(an)(an)酸(suan)和TM螺(luo)(luo)(luo)旋(xuan)6上(shang)(shang)的(de)第(di)744位(wei)(wei)組氨(an)(an)酸(suan)。iRhom家(jia)族多(duo)肽(tai)的(de)必要催化(hua)殘基也(ye)對應于(yu)人(ren)iRhom2多(duo)肽(tai)的(de)TM螺(luo)(luo)(luo)旋(xuan)2上(shang)(shang)的(de)第(di)664位(wei)(wei)組氨(an)(an)酸(suan)、TM螺(luo)(luo)(luo)旋(xuan)4上(shang)(shang)的(de)第(di)724位(wei)(wei)谷氨(an)(an)酰胺(an)、TM螺(luo)(luo)(luo)旋(xuan)4上(shang)(shang)的(de)第(di)730位(wei)(wei)半胱氨(an)(an)酸(suan)和TM螺(luo)(luo)(luo)旋(xuan)6上(shang)(shang)的(de)第(di)773位(wei)(wei)組氨(an)(an)酸(suan)。

本(ben)發明(ming)的(de)能(neng)夠調節(jie)多肽活(huo)性的(de)化合(he)物、多肽、肽或物質可在試(shi)劑盒中提供(gong)，例如(ru)密封于適合(he)的(de)容(rong)器中，所述容(rong)器保護(hu)其內容(rong)物免受外部環境影響(xiang)。這類試(shi)劑盒可包括(kuo)使(shi)用說(shuo)明(ming)書(shu)。

無論待給予(yu)(yu)個體(ti)的(de)是(shi)本發明的(de)多肽(tai)、抗體(ti)、肽(tai)、核酸分子、小分子或(huo)其他(ta)藥學上有用(yong)的(de)化合物，優選以“預防有效量(liang)”或(huo)“治(zhi)療(liao)有效量(liang)”(視情況(kuang)而定(ding)，盡管預防可(ke)被認為(wei)是(shi)治(zhi)療(liao))給予(yu)(yu)，這足以對個體(ti)顯示(shi)出(chu)益(yi)處(chu)。實際給予(yu)(yu)的(de)量(liang)、以及(ji)給予(yu)(yu)的(de)速率和(he)(he)時間過(guo)程取決于被治(zhi)療(liao)的(de)病(bing)癥的(de)性質(zhi)和(he)(he)嚴重(zhong)性。治(zhi)療(liao)處(chu)方(例如對劑量(liang)等的(de)決定(ding))在全科醫師和(he)(he)其他(ta)醫生的(de)責任范(fan)圍(wei)內(nei)。

根據待治療的病(bing)癥，可單獨給予組合物(wu)(wu)或結合其他治療同時或依次(ci)給予組合物(wu)(wu)。

本發明的化合物

改變iRhom多肽的蛋(dan)白水解活性的化合物

本發明的化(hua)合(he)物或測試化(hua)合(he)物可改變iRhom多肽的蛋白水解(jie)活性(xing)。在(zai)一個實施方案中(zhong)，所(suo)述(shu)化(hua)合(he)物包(bao)括iRhom多肽的蛋白水解(jie)活性(xing)的激(ji)活劑或抑(yi)制劑。

在一個(ge)(ge)實(shi)(shi)(shi)施(shi)方(fang)(fang)案中，所(suo)(suo)述(shu)化(hua)合(he)物(wu)是(shi)結(jie)(jie)合(he)iRhom多(duo)(duo)肽(tai)的小分子。在另一個(ge)(ge)實(shi)(shi)(shi)施(shi)方(fang)(fang)案中，所(suo)(suo)述(shu)化(hua)合(he)物(wu)是(shi)抑制iRhom多(duo)(duo)肽(tai)活性的小分子。在另一個(ge)(ge)實(shi)(shi)(shi)施(shi)方(fang)(fang)案中，所(suo)(suo)述(shu)化(hua)合(he)物(wu)是(shi)激活iRhom多(duo)(duo)肽(tai)活性的小分子。這(zhe)些(xie)小分子可包括，例(li)如，肽(tai)、類(lei)肽(tai)物(wu)(peptidomimetics)、有機化(hua)合(he)物(wu)等。在一個(ge)(ge)實(shi)(shi)(shi)施(shi)方(fang)(fang)案中，所(suo)(suo)述(shu)小分子化(hua)合(he)物(wu)能夠轉(zhuan)運通過質(zhi)膜(mo)并與(yu)(yu)iRhom多(duo)(duo)肽(tai)相互作(zuo)用(yong)(yong)。在一些(xie)實(shi)(shi)(shi)施(shi)方(fang)(fang)案中，所(suo)(suo)述(shu)小分子化(hua)合(he)物(wu)與(yu)(yu)iRhom多(duo)(duo)肽(tai)的細胞質(zhi)尾相互作(zuo)用(yong)(yong)。在其他實(shi)(shi)(shi)施(shi)方(fang)(fang)案中，所(suo)(suo)述(shu)小分子化(hua)合(he)物(wu)與(yu)(yu)iRhom多(duo)(duo)肽(tai)的蛋白水解結(jie)(jie)構域相互作(zuo)用(yong)(yong)。

在(zai)一些實施方案(an)中，所述化合物是泛素酶抑制劑。

在另(ling)一(yi)個實(shi)(shi)施(shi)方案(an)中，改變iRhom多肽的(de)蛋白水解(jie)活(huo)性(xing)的(de)化(hua)合(he)物(wu)可包(bao)括，例如，針對iRhom DNA或(huo)mRNA的(de)miRNA、siRNA、shRNA、dsRNA或(huo)反義(yi)RNA，或(huo)編碼所述miRNA、siRNA、shRNA、dsRNA或(huo)反義(yi)RNA的(de)多聚核(he)苷(gan)酸(suan)，包(bao)含所述多聚核(he)苷(gan)酸(suan)的(de)載體(ti)。在另(ling)一(yi)個實(shi)(shi)施(shi)方案(an)中，改變iRhom多肽的(de)蛋白水解(jie)活(huo)性(xing)的(de)化(hua)合(he)物(wu)包(bao)括，例如，抗(kang)體(ti)、抗(kang)體(ti)片段、肽或(huo)多肽誘餌。通(tong)過篩選可從(cong)組合(he)化(hua)學(xue)(xue)抑制劑文(wen)庫鑒定(ding)其他(ta)化(hua)合(he)物(wu)，然后(hou)通(tong)過化(hua)學(xue)(xue)改變進一(yi)步優化(hua)這些化(hua)合(he)物(wu)。

在(zai)另(ling)一個(ge)實施方案中，所(suo)述(shu)化合物(wu)還(huan)包括(kuo)細胞穿(chuan)透(tou)肽。一方面，所(suo)述(shu)細胞穿(chuan)透(tou)肽包括(kuo)HIV-TAT肽。

藥物組合物

可使用(yong)藥(yao)(yao)(yao)物(wu)組(zu)合物(wu)給(gei)予改變iRhom多肽的(de)(de)(de)(de)蛋白(bai)水解(jie)活(huo)性(xing)的(de)(de)(de)(de)本發(fa)明的(de)(de)(de)(de)化合物(wu)。合適(shi)的(de)(de)(de)(de)藥(yao)(yao)(yao)物(wu)組(zu)合物(wu)包(bao)括(kuo)(kuo)(kuo)本文所述化合物(wu)(或(huo)(huo)(huo)其可藥(yao)(yao)(yao)用(yong)的(de)(de)(de)(de)鹽或(huo)(huo)(huo)酯(zhi))的(de)(de)(de)(de)任一(yi)種，以及任選(xuan)地包(bao)括(kuo)(kuo)(kuo)可藥(yao)(yao)(yao)用(yong)載體。在某些(xie)實施(shi)方(fang)案中，這些(xie)組(zu)合物(wu)任選(xuan)地還包(bao)括(kuo)(kuo)(kuo)一(yi)種或(huo)(huo)(huo)多種額外的(de)(de)(de)(de)治(zhi)療劑。

可接受的“藥物載體(ti)”是(shi)本領(ling)域技術人員熟知的，并且可包括但不(bu)限(xian)于(yu)任(ren)一種標準藥物載體(ti)，例如磷酸(suan)鹽緩沖液、水和(he)乳劑(ji)(ji)(例如油/水乳劑(ji)(ji))和(he)各種類(lei)型的濕潤劑(ji)(ji)。

本(ben)(ben)文使用(yong)的(de)術語“可(ke)藥用(yong)的(de)鹽(yan)”是指在(zai)合(he)(he)理的(de)醫學判斷的(de)范圍內，適用(yong)于與(yu)人(ren)和低(di)等動(dong)物的(de)組(zu)織接觸而不導致明(ming)顯(xian)的(de)毒(du)性、刺(ci)激性、過(guo)敏反(fan)應(ying)等，并且(qie)與(yu)合(he)(he)理的(de)受益/風險(xian)比率相稱的(de)那些鹽(yan)類。胺、羧酸和其(qi)他類型化(hua)合(he)(he)物的(de)可(ke)藥用(yong)的(de)鹽(yan)是本(ben)(ben)領域熟知的(de)。例如(ru)(ru)，S.M.Berge等人(ren)在(zai)J.Pharmaceutical Sciences,66:1-19(1977)(以引用(yong)的(de)方式納入(ru)本(ben)(ben)文)中詳細記載(zai)了可(ke)藥用(yong)的(de)鹽(yan)。可(ke)在(zai)本(ben)(ben)發(fa)明(ming)化(hua)合(he)(he)物的(de)最(zui)終分離和純化(hua)過(guo)程中原位(wei)制備鹽(yan)，或(huo)通過(guo)游離堿(jian)或(huo)游離酸官能團與(yu)合(he)(he)適試劑反(fan)應(ying)而單獨地制備鹽(yan)，如(ru)(ru)下文所概(gai)述的(de)。

例(li)如(ru)(ru)(ru)，游離堿(jian)官(guan)能團(tuan)可(ke)與(yu)合(he)適的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)反應。此外，當本發明的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)化(hua)合(he)物攜帶(dai)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)性基(ji)(ji)團(tuan)時，其(qi)適合(he)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)可(ke)藥用(yong)(yong)(yong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)可(ke)包(bao)(bao)括(kuo)金(jin)屬鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)，例(li)如(ru)(ru)(ru)堿(jian)金(jin)屬鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)類，例(li)如(ru)(ru)(ru)鈉(na)鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)或(huo)(huo)鉀鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)；以及(ji)堿(jian)土金(jin)屬鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)，例(li)如(ru)(ru)(ru)鈣鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)和鎂鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)。可(ke)藥用(yong)(yong)(yong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)無(wu)(wu)毒(du)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)加(jia)成(cheng)鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)實例(li)為氨(an)基(ji)(ji)與(yu)無(wu)(wu)機(ji)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(例(li)如(ru)(ru)(ru)鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)、氫(qing)(qing)溴酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)、磷(lin)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)、硫(liu)(liu)(liu)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)和高氯酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan))或(huo)(huo)有機(ji)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(例(li)如(ru)(ru)(ru)乙(yi)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)、草(cao)(cao)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)、馬(ma)來(lai)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)、酒(jiu)石酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)、檸檬(meng)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)、琥珀酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)或(huo)(huo)丙(bing)(bing)(bing)二(er)(er)(er)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan))形(xing)成(cheng)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)、或(huo)(huo)通過使(shi)用(yong)(yong)(yong)本領域中使(shi)用(yong)(yong)(yong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)其(qi)他(ta)方法如(ru)(ru)(ru)離子(zi)交換而形(xing)成(cheng)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)氨(an)基(ji)(ji)鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)。其(qi)他(ta)可(ke)藥用(yong)(yong)(yong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)包(bao)(bao)括(kuo)己二(er)(er)(er)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)、海藻酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)、抗(kang)壞血(xue)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)、天(tian)冬氨(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)、苯(ben)(ben)磺酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)、苯(ben)(ben)甲酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)、硫(liu)(liu)(liu)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)氫(qing)(qing)鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)、硼酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)、丁酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)、樟腦(nao)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)、樟腦(nao)磺酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)、檸檬(meng)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)、環戊烷丙(bing)(bing)(bing)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)、二(er)(er)(er)葡萄(tao)糖(tang)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)、十(shi)二(er)(er)(er)烷基(ji)(ji)硫(liu)(liu)(liu)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)、乙(yi)磺酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)、甲酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)、延胡索酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)、葡庚糖(tang)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)、甘油磷(lin)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)、葡糖(tang)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)、半硫(liu)(liu)(liu)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)、庚酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)、己酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)、氫(qing)(qing)碘化(hua)物、2-羥基(ji)(ji)-乙(yi)磺酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)、乳糖(tang)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)、乳酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)、月桂(gui)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)、月桂(gui)基(ji)(ji)硫(liu)(liu)(liu)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)、蘋果酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)、馬(ma)來(lai)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)、丙(bing)(bing)(bing)二(er)(er)(er)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)、甲磺酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)、2-萘磺酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)、煙酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)、硝酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)、油酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)、草(cao)(cao)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)、棕櫚酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)、雙羥萘酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(pamoate)、果膠酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(pectinate)、過硫(liu)(liu)(liu)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)、3-苯(ben)(ben)丙(bing)(bing)(bing)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)、磷(lin)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)、苦味酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)、新戊酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)、丙(bing)(bing)(bing)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)、硬脂酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)、丁二(er)(er)(er)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)、硫(liu)(liu)(liu)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)、酒(jiu)石酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)、硫(liu)(liu)(liu)氰酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)、對甲苯(ben)(ben)磺酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)、十(shi)一酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)、戊酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)等。代表性的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)堿(jian)金(jin)屬或(huo)(huo)堿(jian)土金(jin)屬鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)包(bao)(bao)括(kuo)鈉(na)鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)、鋰(li)鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)、鉀鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)、鈣鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)、鎂鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)等。其(qi)他(ta)可(ke)藥用(yong)(yong)(yong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)包(bao)(bao)括(kuo)，如(ru)(ru)(ru)果適合(he)，使(shi)用(yong)(yong)(yong)抗(kang)衡離子(zi)(例(li)如(ru)(ru)(ru)鹵(lu)化(hua)物、氫(qing)(qing)氧(yang)化(hua)物、羧酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)、硫(liu)(liu)(liu)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)、磷(lin)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)、硝酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)、低烷基(ji)(ji)磺酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)和芳基(ji)(ji)磺酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan))形(xing)成(cheng)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)無(wu)(wu)毒(du)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)銨、季銨和胺陽離子(zi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)鹽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)。

本文使用(yong)(yong)(yong)的(de)術(shu)語“可藥(yao)用(yong)(yong)(yong)的(de)酯(zhi)(zhi)(zhi)”是指在體內水(shui)解(jie)(jie)的(de)酯(zhi)(zhi)(zhi)且包(bao)括(kuo)易于在人體中分(fen)解(jie)(jie)以離開(kai)母體化合(he)物或其鹽(yan)的(de)那(nei)些(xie)(xie)酯(zhi)(zhi)(zhi)。合(he)適(shi)的(de)酯(zhi)(zhi)(zhi)基團包(bao)括(kuo)，例如，來自可藥(yao)用(yong)(yong)(yong)的(de)脂肪族(zu)羧酸(suan)(suan)(suan)(suan)(特別是烷(wan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)、烯酸(suan)(suan)(suan)(suan)、環烷(wan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)和(he)烷(wan)二(er)酸(suan)(suan)(suan)(suan))的(de)那(nei)些(xie)(xie)，其中各(ge)烷(wan)基或烯基有(you)利地(di)具(ju)有(you)不多于6個碳原子。具(ju)體的(de)酯(zhi)(zhi)(zhi)的(de)實例包(bao)括(kuo)甲酸(suan)(suan)(suan)(suan)酯(zhi)(zhi)(zhi)、乙酸(suan)(suan)(suan)(suan)酯(zhi)(zhi)(zhi)、丙(bing)酸(suan)(suan)(suan)(suan)酯(zhi)(zhi)(zhi)、丁(ding)酸(suan)(suan)(suan)(suan)酯(zhi)(zhi)(zhi)、丙(bing)烯酸(suan)(suan)(suan)(suan)酯(zhi)(zhi)(zhi)和(he)乙基丁(ding)二(er)酸(suan)(suan)(suan)(suan)酯(zhi)(zhi)(zhi)。

如(ru)上所述(shu)(shu)(shu)(shu)，所述(shu)(shu)(shu)(shu)藥物(wu)(wu)(wu)組(zu)合(he)物(wu)(wu)(wu)可(ke)(ke)額外地包(bao)括可(ke)(ke)藥用的(de)(de)(de)載(zai)(zai)(zai)體(ti)。所述(shu)(shu)(shu)(shu)載(zai)(zai)(zai)體(ti)包(bao)括任(ren)(ren)(ren)何或(huo)所有溶劑(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)、稀(xi)釋劑(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)或(huo)其(qi)他(ta)液體(ti)載(zai)(zai)(zai)體(ti)、分(fen)散或(huo)懸(xuan)浮助劑(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)、表面活性劑(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)、等滲劑(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)、增稠(chou)劑(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)或(huo)乳化(hua)劑(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)、防腐劑(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)、固體(ti)粘(zhan)合(he)劑(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)、潤滑劑(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)等，其(qi)適合(he)于所需的(de)(de)(de)特定劑(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)型(xing)。Remington’s Pharmaceutical Sciences,第16版,E.W.Martin(Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1980)公開了用于配(pei)制(zhi)藥物(wu)(wu)(wu)組(zu)合(he)物(wu)(wu)(wu)的(de)(de)(de)各種載(zai)(zai)(zai)體(ti)以(yi)(yi)及(ji)(ji)已(yi)知的(de)(de)(de)制(zhi)備(bei)它們(men)的(de)(de)(de)技術。除了與(yu)所述(shu)(shu)(shu)(shu)化(hua)合(he)物(wu)(wu)(wu)不(bu)(bu)相容(例(li)(li)如(ru)通過產生任(ren)(ren)(ren)何不(bu)(bu)想(xiang)要的(de)(de)(de)生物(wu)(wu)(wu)效(xiao)應或(huo)以(yi)(yi)有害方式(shi)與(yu)所述(shu)(shu)(shu)(shu)藥物(wu)(wu)(wu)組(zu)合(he)物(wu)(wu)(wu)的(de)(de)(de)任(ren)(ren)(ren)何其(qi)他(ta)組(zu)分(fen)相互作(zuo)用)的(de)(de)(de)任(ren)(ren)(ren)何常(chang)規(gui)(gui)載(zai)(zai)(zai)體(ti)介質(zhi)外，預期常(chang)規(gui)(gui)載(zai)(zai)(zai)體(ti)介質(zhi)的(de)(de)(de)使用落(luo)在(zai)本發明的(de)(de)(de)范圍內(nei)。可(ke)(ke)作(zuo)為(wei)可(ke)(ke)藥用載(zai)(zai)(zai)體(ti)的(de)(de)(de)物(wu)(wu)(wu)質(zhi)的(de)(de)(de)一些(xie)實例(li)(li)包(bao)括但(dan)不(bu)(bu)限(xian)于糖(tang)，例(li)(li)如(ru)乳糖(tang)、葡萄(tao)糖(tang)和(he)(he)蔗糖(tang)；淀(dian)粉(fen)，例(li)(li)如(ru)玉(yu)米(mi)(mi)淀(dian)粉(fen)和(he)(he)馬鈴(ling)薯淀(dian)粉(fen)；纖(xian)維(wei)(wei)素及(ji)(ji)其(qi)衍生物(wu)(wu)(wu)，例(li)(li)如(ru)羧甲基纖(xian)維(wei)(wei)素鈉、乙(yi)(yi)基纖(xian)維(wei)(wei)素和(he)(he)乙(yi)(yi)酸(suan)(suan)纖(xian)維(wei)(wei)素；黃芪膠粉(fen)；麥芽；明膠；滑石；賦形劑(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)例(li)(li)如(ru)可(ke)(ke)可(ke)(ke)脂和(he)(he)栓劑(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)蠟；油類(lei)，例(li)(li)如(ru)花生油、棉花籽油、紅花油、芝麻油、橄欖(lan)油、玉(yu)米(mi)(mi)油和(he)(he)大豆油；二醇(chun)類(lei)，例(li)(li)如(ru)丙二醇(chun)；酯(zhi)類(lei)，例(li)(li)如(ru)油酸(suan)(suan)乙(yi)(yi)酯(zhi)和(he)(he)月桂酸(suan)(suan)乙(yi)(yi)酯(zhi)；瓊(qiong)脂；緩沖劑(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)，例(li)(li)如(ru)氫氧化(hua)鎂和(he)(he)氫氧化(hua)鋁(lv)；海藻(zao)酸(suan)(suan)；無熱(re)原的(de)(de)(de)水；等滲鹽(yan)水；林格氏溶液；乙(yi)(yi)醇(chun)和(he)(he)磷酸(suan)(suan)鹽(yan)緩沖液，以(yi)(yi)及(ji)(ji)其(qi)他(ta)無毒的(de)(de)(de)相容的(de)(de)(de)潤滑劑(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)如(ru)十(shi)二烷基硫酸(suan)(suan)鈉和(he)(he)硬脂酸(suan)(suan)鎂，以(yi)(yi)及(ji)(ji)著色劑(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)、釋放劑(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)、涂(tu)層劑(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)、甜味(wei)劑(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)、調味(wei)劑(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)和(he)(he)芳(fang)香劑(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)，防腐劑(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)和(he)(he)抗氧化(hua)劑(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)也(ye)可(ke)(ke)存在(zai)于所述(shu)(shu)(shu)(shu)組(zu)合(he)物(wu)(wu)(wu)中，這依據調制(zhi)人員的(de)(de)(de)判斷。

可將用(yong)于本發明的(de)(de)(de)(de)組(zu)(zu)合(he)(he)(he)(he)物配(pei)制(zhi)成具有任(ren)意濃(nong)度的(de)(de)(de)(de)所需化(hua)(hua)合(he)(he)(he)(he)物。在(zai)一(yi)些實施方(fang)案(an)中，配(pei)制(zhi)所述(shu)組(zu)(zu)合(he)(he)(he)(he)物以(yi)使(shi)其包含(han)至少治(zhi)療有效量(liang)(liang)(liang)的(de)(de)(de)(de)改變iRhom多(duo)肽的(de)(de)(de)(de)蛋白水解活性的(de)(de)(de)(de)化(hua)(hua)合(he)(he)(he)(he)物。治(zhi)療有效量(liang)(liang)(liang)是在(zai)給藥條(tiao)件下足以(yi)實現所需治(zhi)療效果的(de)(de)(de)(de)量(liang)(liang)(liang)，例如足以(yi)治(zhi)療癌癥、加速傷口愈合(he)(he)(he)(he)或(huo)(huo)治(zhi)療炎(yan)性病癥的(de)(de)(de)(de)量(liang)(liang)(liang)。在(zai)一(yi)些實施方(fang)案(an)中，配(pei)制(zhi)所述(shu)組(zu)(zu)合(he)(he)(he)(he)物以(yi)使(shi)其包含(han)不(bu)會導致一(yi)種或(huo)(huo)多(duo)種不(bu)想(xiang)要的(de)(de)(de)(de)副作用(yong)的(de)(de)(de)(de)量(liang)(liang)(liang)。在(zai)某些實施方(fang)案(an)中，配(pei)制(zhi)所述(shu)組(zu)(zu)合(he)(he)(he)(he)物以(yi)使(shi)所述(shu)化(hua)(hua)合(he)(he)(he)(he)物以(yi)約(yue)1mg/mL至約(yue)20mg/mL、約(yue)1mg/mL至約(yue)15mg/mL、約(yue)1mg/mL至約(yue)10mg/mL、約(yue)2mg/mL至約(yue)9mg/mL、約(yue)3mg/mL至約(yue)8mg/mL、約(yue)4mg/mL至約(yue)7mg/mL、約(yue)4mg/mL至約(yue)6mg/mL的(de)(de)(de)(de)濃(nong)度存在(zai)。在(zai)某些實施方(fang)案(an)中，配(pei)制(zhi)所述(shu)組(zu)(zu)合(he)(he)(he)(he)物以(yi)使(shi)所述(shu)化(hua)(hua)合(he)(he)(he)(he)物以(yi)約(yue)5mg/mL的(de)(de)(de)(de)濃(nong)度存在(zai)。

試劑盒

本發明(ming)還提供了(le)組合物(wu)和試(shi)劑(ji)(ji)(ji)盒(he)，用于(yu)預測改變iRhom多肽活(huo)性的(de)(de)(de)(de)化(hua)合物(wu)在受試(shi)者中加(jia)速傷口愈合、治(zhi)(zhi)療癌(ai)癥或(huo)治(zhi)(zhi)療炎性疾(ji)病的(de)(de)(de)(de)能力，或(huo)用于(yu)確定(ding)受試(shi)者中的(de)(de)(de)(de)癌(ai)癥是(shi)否(fou)對(dui)所述(shu)化(hua)合物(wu)的(de)(de)(de)(de)治(zhi)(zhi)療敏感(gan)。這些試(shi)劑(ji)(ji)(ji)盒(he)包括以下的(de)(de)(de)(de)一種或(huo)多種：獲得和/或(huo)制備樣(yang)品(例如(ru)，皮膚活(huo)檢、腫瘤活(huo)檢或(huo)血液樣(yang)品)的(de)(de)(de)(de)試(shi)劑(ji)(ji)(ji)；確定(ding)樣(yang)品是(shi)否(fou)表現(xian)(xian)出(chu)iRhom蛋白(bai)水解(jie)活(huo)性的(de)(de)(de)(de)試(shi)劑(ji)(ji)(ji)；確定(ding)樣(yang)品是(shi)否(fou)表現(xian)(xian)出(chu)基因(yin)(例如(ru)，Rhbdf1或(huo)Rhbdf2基因(yin))突變的(de)(de)(de)(de)探針和試(shi)劑(ji)(ji)(ji)；確定(ding)樣(yang)品是(shi)否(fou)表現(xian)(xian)出(chu)野(ye)生型(xing)基因(yin)(例如(ru)，Rhbdf1或(huo)Rhbdf2基因(yin))序列的(de)(de)(de)(de)探針和試(shi)劑(ji)(ji)(ji)；確定(ding)樣(yang)品中iRhom多肽的(de)(de)(de)(de)半(ban)衰(shuai)期(qi)的(de)(de)(de)(de)試(shi)劑(ji)(ji)(ji)；確定(ding)樣(yang)品分(fen)泌EGFR配體的(de)(de)(de)(de)試(shi)劑(ji)(ji)(ji)；以及使用說明(ming)書。

本發明的(de)(de)試劑盒可任選地(di)包(bao)括其他可用于實(shi)施本發明方法(fa)的(de)(de)組分(fen)。例(li)(li)如，所述(shu)試劑盒可包(bao)括適(shi)于使(shi)互補核酸(suan)退火或適(shi)于使(shi)抗體(ti)與其特異性結合的(de)(de)蛋白相(xiang)結合的(de)(de)液體(ti)(例(li)(li)如，SSC緩(huan)沖(chong)液)、一(yi)個或多個樣(yang)品(pin)(pin)室、描述(shu)本發明方法(fa)的(de)(de)實(shi)施的(de)(de)指(zhi)導材料、正常細(xi)(xi)胞的(de)(de)樣(yang)品(pin)(pin)、癌(ai)細(xi)(xi)胞的(de)(de)樣(yang)品(pin)(pin)、創傷細(xi)(xi)胞的(de)(de)樣(yang)品(pin)(pin)、炎(yan)癥細(xi)(xi)胞的(de)(de)樣(yang)品(pin)(pin)等。

適應癥

傷口愈合

傷口(kou)愈(yu)(yu)合(he)是一個(ge)過程(cheng)(cheng)，皮(pi)膚或另一器官組織在(zai)受傷后借(jie)助此過程(cheng)(cheng)自我修(xiu)復(fu)。在(zai)一個(ge)實(shi)施方案中，本發明可用于鑒定在(zai)受試者中激活iRhom多肽的蛋白水解位點，從而加速傷口(kou)愈(yu)(yu)合(he)的化(hua)合(he)物。

本(ben)發(fa)明的(de)方法可用于鑒定(ding)在(zai)受試者中加速傷(shang)口(kou)(kou)(kou)愈合的(de)化合物(wu)。在(zai)一個實(shi)施(shi)(shi)方案中，所述化合物(wu)加速傷(shang)口(kou)(kou)(kou)愈合，以實(shi)現傷(shang)口(kou)(kou)(kou)閉合。在(zai)一個實(shi)施(shi)(shi)方案中，所述傷(shang)口(kou)(kou)(kou)可以是開(kai)放的(de)皮膚傷(shang)口(kou)(kou)(kou)，例(li)如(ru)燒(shao)傷(shang)、化學(例(li)如(ru)堿)燒(shao)傷(shang)引起的(de)傷(shang)口(kou)(kou)(kou)、物(wu)理創傷(shang)的(de)傷(shang)口(kou)(kou)(kou)、神(shen)經性潰(kui)瘍(yang)、壓瘡、靜脈(mo)淤(yu)滯(zhi)性潰(kui)瘍(yang)和糖尿病性潰(kui)瘍(yang)。

在(zai)另一個實(shi)施方案(an)中，本發明提(ti)供了激活iRhom多肽(tai)的(de)蛋白水解位點以在(zai)受試者中加速、促進(jin)或增強傷口愈(yu)合的(de)化合物(wu)(wu)或藥(yao)物(wu)(wu)組合物(wu)(wu)。

在一(yi)些(xie)實施方(fang)案(an)(an)中(zhong)(zhong)，本(ben)發明提供了上(shang)文所述(shu)或本(ben)文他處所述(shu)的(de)(de)化合物的(de)(de)任一(yi)種(zhong)激活iRhom多(duo)肽的(de)(de)蛋白水解位點以在傷口(kou)(kou)周(zhou)圍或傷口(kou)(kou)附近加(jia)速傷口(kou)(kou)愈(yu)合或調(diao)節(jie)一(yi)種(zhong)或多(duo)種(zhong)細(xi)胞特性的(de)(de)用(yong)途。在一(yi)些(xie)實施方(fang)案(an)(an)中(zhong)(zhong)，本(ben)發明提供了上(shang)文所述(shu)的(de)(de)組合物在傷口(kou)(kou)周(zhou)圍或傷口(kou)(kou)附近增強傷口(kou)(kou)愈(yu)合或調(diao)節(jie)一(yi)種(zhong)或多(duo)種(zhong)細(xi)胞特性的(de)(de)用(yong)途。

癌癥

本發明(ming)的化合物可用(yong)于在(zai)受試者中(zhong)治療(liao)癌(ai)癥。本發明(ming)的化合物也(ye)可用(yong)于在(zai)受試者中(zhong)降低腫瘤生長和/或進展。

在(zai)一個實施方案(an)中(zhong)(zhong)(zhong)，本(ben)發(fa)明可用于(yu)鑒定能夠在(zai)受試者中(zhong)(zhong)(zhong)降(jiang)低腫瘤生(sheng)(sheng)長和(he)/或(huo)進展或(huo)治療癌(ai)癥(zheng)的(de)(de)化(hua)合(he)(he)物。在(zai)一個實施方案(an)中(zhong)(zhong)(zhong)，所述化(hua)合(he)(he)物抑制(zhi)iRhom多(duo)肽(tai)的(de)(de)蛋(dan)(dan)白水解(jie)位(wei)點，從(cong)而(er)(er)減少iRhom多(duo)肽(tai)的(de)(de)生(sheng)(sheng)理(li)靶(ba)標的(de)(de)分(fen)泌(mi)和(he)/或(huo)降(jiang)低EGFR活(huo)性(xing)，從(cong)而(er)(er)降(jiang)低腫瘤生(sheng)(sheng)長和(he)/或(huo)進展。在(zai)另一個實施方案(an)中(zhong)(zhong)(zhong)，所述化(hua)合(he)(he)物抑制(zhi)iRhom多(duo)肽(tai)的(de)(de)蛋(dan)(dan)白水解(jie)位(wei)點，從(cong)而(er)(er)減少iRhom多(duo)肽(tai)的(de)(de)生(sheng)(sheng)理(li)靶(ba)標的(de)(de)分(fen)泌(mi)和(he)/或(huo)降(jiang)低EGFR活(huo)性(xing)，從(cong)而(er)(er)可用于(yu)治療癌(ai)癥(zheng)。

在一些實施方案中，編碼iRhom2的(de)基因RHBDF2的(de)錯義突(tu)變(bian)(p.I186T；p.P189L；p.D188N)可導致(zhi)胼胝(zhi)癥及人食管(guan)癌，其特(te)征在于(yu)掌跖和口(kou)的(de)過度角化(hua)。

本發明的化合物也可用于治療各種癌(ai)(ai)(ai)(ai)癥(zheng)。在(zai)一個實施(shi)方(fang)案中，所述癌(ai)(ai)(ai)(ai)癥(zheng)為上皮癌(ai)(ai)(ai)(ai)。在(zai)另(ling)一個實施(shi)方(fang)案中，所述癌(ai)(ai)(ai)(ai)癥(zheng)為食管癌(ai)(ai)(ai)(ai)、肺(fei)癌(ai)(ai)(ai)(ai)、腦癌(ai)(ai)(ai)(ai)、結腸癌(ai)(ai)(ai)(ai)、腎癌(ai)(ai)(ai)(ai)、前列腺癌(ai)(ai)(ai)(ai)、皮膚癌(ai)(ai)(ai)(ai)、肝(gan)癌(ai)(ai)(ai)(ai)、胰腺癌(ai)(ai)(ai)(ai)、胃癌(ai)(ai)(ai)(ai)、子宮(gong)癌(ai)(ai)(ai)(ai)、卵巢癌(ai)(ai)(ai)(ai)、乳腺癌(ai)(ai)(ai)(ai)、淋巴(ba)腺癌(ai)(ai)(ai)(ai)或膀(bang)胱癌(ai)(ai)(ai)(ai)。

本(ben)發明(ming)的(de)化合(he)物(wu)也(ye)可用于治療各種(zhong)腫(zhong)(zhong)瘤。在一個實施方案(an)中，所述(shu)腫(zhong)(zhong)瘤是(shi)實體瘤。

炎癥

本發明(ming)的(de)化合(he)物可用于在受試(shi)者中(zhong)減輕炎(yan)癥(zheng)。本發明(ming)的(de)化合(he)物可用于治療(liao)炎(yan)性(xing)(xing)(xing)疾病(bing)(bing)(bing)和(he)(he)/或病(bing)(bing)(bing)癥(zheng)。炎(yan)性(xing)(xing)(xing)疾病(bing)(bing)(bing)和(he)(he)/或病(bing)(bing)(bing)癥(zheng)包(bao)括(kuo)，例如(ru)，系統性(xing)(xing)(xing)紅斑狼瘡(SLE)、狼瘡腎(shen)炎(yan)、冷球蛋(dan)白(bai)血癥(zheng)、脈(mo)管炎(yan)、類(lei)風(feng)濕性(xing)(xing)(xing)關(guan)節(jie)炎(yan)、干燥綜(zong)合(he)征(Sjoegren’s syndrome)、葡萄膜炎(yan)、脊椎關(guan)節(jie)炎(yan)、流產(chan)、先兆子癇、尋常痤瘡、哮喘(chuan)、自身免(mian)疫性(xing)(xing)(xing)疾病(bing)(bing)(bing)、乳糜瀉(xie)、慢性(xing)(xing)(xing)前(qian)列腺炎(yan)、腎(shen)小(xiao)球性(xing)(xing)(xing)腎(shen)炎(yan)、超敏(min)反(fan)應(ying)、炎(yan)性(xing)(xing)(xing)腸(chang)疾病(bing)(bing)(bing)(包(bao)括(kuo)潰瘍性(xing)(xing)(xing)結腸(chang)炎(yan)和(he)(he)節(jie)段性(xing)(xing)(xing)腸(chang)炎(yan)(Crohn’s disease))、盆腔炎(yan)性(xing)(xing)(xing)疾病(bing)(bing)(bing)、再灌注(zhu)損傷、類(lei)風(feng)濕性(xing)(xing)(xing)關(guan)節(jie)炎(yan)、結節(jie)病(bing)(bing)(bing)、移植排斥、脈(mo)管炎(yan)、間質性(xing)(xing)(xing)膀(bang)胱炎(yan)、動脈(mo)粥(zhou)樣硬(ying)化、過(guo)敏(min)反(fan)應(ying)、肌(ji)病(bing)(bing)(bing)、白(bai)細胞缺陷、銀屑病(bing)(bing)(bing)、多發性(xing)(xing)(xing)硬(ying)化癥(zheng)和(he)(he)癌(ai)癥(zheng)。

在(zai)一個實(shi)施方案(an)(an)中(zhong)(zhong)(zhong)，本發明(ming)(ming)可(ke)用(yong)(yong)于(yu)(yu)鑒定能(neng)夠在(zai)受(shou)試者中(zhong)(zhong)(zhong)減(jian)(jian)(jian)(jian)輕(qing)炎(yan)(yan)癥或(huo)治(zhi)療炎(yan)(yan)性(xing)疾病的(de)(de)(de)(de)化(hua)(hua)合(he)物(wu)。在(zai)一個實(shi)施方案(an)(an)中(zhong)(zhong)(zhong)，所述化(hua)(hua)合(he)物(wu)降低(di)(di)iRhom多(duo)肽(tai)的(de)(de)(de)(de)蛋(dan)白水(shui)解(jie)結構(gou)域的(de)(de)(de)(de)活性(xing)，以(yi)(yi)使(shi)iRhom多(duo)肽(tai)的(de)(de)(de)(de)生(sheng)理靶標的(de)(de)(de)(de)分(fen)泌(mi)(mi)(mi)減(jian)(jian)(jian)(jian)少(shao)(shao)和/或(huo)TNFα分(fen)泌(mi)(mi)(mi)減(jian)(jian)(jian)(jian)少(shao)(shao)，從(cong)而使(shi)炎(yan)(yan)癥減(jian)(jian)(jian)(jian)輕(qing)。在(zai)另一個實(shi)施方案(an)(an)中(zhong)(zhong)(zhong)，所述化(hua)(hua)合(he)物(wu)降低(di)(di)iRhom多(duo)肽(tai)的(de)(de)(de)(de)蛋(dan)白水(shui)解(jie)結構(gou)域的(de)(de)(de)(de)活性(xing)，以(yi)(yi)使(shi)iRhom多(duo)肽(tai)的(de)(de)(de)(de)生(sheng)理靶標的(de)(de)(de)(de)分(fen)泌(mi)(mi)(mi)減(jian)(jian)(jian)(jian)少(shao)(shao)和/或(huo)TNFα分(fen)泌(mi)(mi)(mi)減(jian)(jian)(jian)(jian)少(shao)(shao)，所述化(hua)(hua)合(he)物(wu)因此可(ke)用(yong)(yong)于(yu)(yu)于(yu)(yu)治(zhi)療炎(yan)(yan)性(xing)病癥或(huo)疾病。在(zai)另一個實(shi)施方案(an)(an)中(zhong)(zhong)(zhong)，本發明(ming)(ming)的(de)(de)(de)(de)化(hua)(hua)合(he)物(wu)通過靶向細胞溶質結構(gou)域或(huo)跨膜(mo)肽(tai)酶(mei)域而減(jian)(jian)(jian)(jian)少(shao)(shao)TNFα分(fen)泌(mi)(mi)(mi)，從(cong)而可(ke)用(yong)(yong)于(yu)(yu)在(zai)受(shou)試者中(zhong)(zhong)(zhong)減(jian)(jian)(jian)(jian)輕(qing)炎(yan)(yan)癥。

可利用各種測試測定化合物治(zhi)療炎(yan)性病癥的功效。

毛發生長

本發明的(de)(de)化合物(wu)可用于在受試者中治療禿(tu)頂(ding)和(he)/或(huo)促(cu)進毛發生長(chang)。毛發脫落(luo)或(huo)禿(tu)頂(ding)(例如，脫發癥(alopecia))是毛發從頭部(bu)或(huo)身體脫落(luo)。禿(tu)頂(ding)可以(yi)指一(yi)(yi)般的(de)(de)毛發脫落(luo)、男性(xing)模式的(de)(de)禿(tu)頂(ding)或(huo)女性(xing)毛發脫落(luo)。一(yi)(yi)些類型(xing)的(de)(de)禿(tu)頂(ding)可由斑禿(tu)(alopecia areata)——一(yi)(yi)種(zhong)自身免(mian)疫性(xing)疾(ji)病——引(yin)起。斑禿(tu)的(de)(de)極端形(xing)式為全禿(tu)(alopecia totalis)，其(qi)包括全部(bu)頭發的(de)(de)脫落(luo)，以(yi)及普禿(tu)(alopecia universalis)，其(qi)包括頭部(bu)和(he)身體的(de)(de)全部(bu)毛發脫落(luo)。

在一個(ge)實(shi)施(shi)方(fang)案中，本發(fa)明(ming)(ming)基于(yu)以(yi)下發(fa)現：cub突變(bian)導致變(bian)禿(tu)(tu)。在另一個(ge)實(shi)施(shi)方(fang)案中，本發(fa)明(ming)(ming)基于(yu)以(yi)下發(fa)現：cub(Mcub)的修(xiu)飾因子(zi)促(cu)進毛發(fa)生長、治愈變(bian)禿(tu)(tu)、矯正變(bian)禿(tu)(tu)或減(jian)輕(qing)變(bian)禿(tu)(tu)(實(shi)施(shi)例1)。

在一個實施方案中，本發明(ming)可用于鑒定能(neng)夠在受試(shi)者(zhe)中促進毛(mao)發生(sheng)(sheng)長的(de)(de)(de)(de)化(hua)(hua)合物(wu)，其包(bao)括：使(shi)表達iRhom多(duo)肽的(de)(de)(de)(de)細胞與測試(shi)化(hua)(hua)合物(wu)接觸；并測定iRhom多(duo)肽的(de)(de)(de)(de)生(sheng)(sheng)理靶(ba)標的(de)(de)(de)(de)分泌(mi)(mi)相對(dui)于合適(shi)對(dui)照(zhao)的(de)(de)(de)(de)減少，或(huo)EGFR活性相對(dui)于合適(shi)對(dui)照(zhao)的(de)(de)(de)(de)降低(di)，其中iRhom多(duo)肽的(de)(de)(de)(de)生(sheng)(sheng)理靶(ba)標分泌(mi)(mi)的(de)(de)(de)(de)減少或(huo)EGFR活性的(de)(de)(de)(de)降低(di)指示所述化(hua)(hua)合物(wu)能(neng)夠在受試(shi)者(zhe)中促進毛(mao)發生(sheng)(sheng)長。

在(zai)另一個(ge)實(shi)施方案中，本發明可(ke)用(yong)于鑒定能夠在(zai)受試者中治愈和(he)/或(huo)矯(jiao)正禿(tu)頂的(de)化合(he)(he)物，其包括：使(shi)表達iRhom多肽(tai)的(de)細胞(bao)與測試化合(he)(he)物接觸(chu)；并測定iRhom多肽(tai)的(de)生理(li)靶標的(de)分泌相(xiang)對于合(he)(he)適對照的(de)減少，或(huo)EGFR活性(xing)相(xiang)對于合(he)(he)適對照的(de)降低，其中iRhom多肽(tai)的(de)生理(li)靶標分泌的(de)減少或(huo)EGFR活性(xing)的(de)降低指示所述化合(he)(he)物能夠在(zai)受試者中治愈和(he)/或(huo)矯(jiao)正禿(tu)頂。

通(tong)過以下實施例(li)進(jin)一步對本(ben)發明進(jin)行舉(ju)例(li)說明，所(suo)述實施例(li)不應解釋(shi)為限(xian)制性的(de)(de)(de)。本(ben)申請(qing)通(tong)篇引用的(de)(de)(de)所(suo)有文獻、專利和(he)公開的(de)(de)(de)專利申請(qing)的(de)(de)(de)全(quan)部內容由此以引用的(de)(de)(de)方式納入本(ben)文。

實施例

實施例1：cub突變導致EGFR信號傳(chuan)導通路的過度激活

被命名為(wei)卷曲-裸露(cub)的(de)(de)隱性小鼠突(tu)變的(de)(de)特征為(wei)無毛(mao)(mao)表型。顯性Mcub等位基因的(de)(de)單拷貝與cub/cub基因型的(de)(de)組合產生豐滿(man)、卷曲的(de)(de)毛(mao)(mao)皮而非cub/cub mcub/mcub小鼠的(de)(de)無毛(mao)(mao)毛(mao)(mao)皮。我們研究了cub/cub mcub/mcub基因型是否可能與改變的(de)(de)EGFR信(xin)號傳導方面(例如，細(xi)胞(bao)增(zeng)殖和細(xi)胞(bao)遷移)有(you)關。

我們對從cub/cub mcub/mcub小鼠(shu)和(he)對照(+/+mcub/mcub)小鼠(shu)分(fen)離的小鼠(shu)胚胎成纖(xian)維細(xi)胞(bao)(MEF)進行增殖、細(xi)胞(bao)遷(qian)移(yi)(劃痕-傷(shang)口(kou)愈合)和(he)免疫印跡測(ce)定。圖1A-1F示出了cub突(tu)變加速EGFR相(xiang)關的細(xi)胞(bao)增殖和(he)遷(qian)移(yi)以(yi)及皮膚愈合。

cub/cub mcub/mcub MEF相對于對照MEF具(ju)有顯著(zhu)更高的(de)(de)增(zeng)殖率和(he)遷移率(圖(tu)(tu)1A和(he)1B)。這(zhe)些改變與EGFR通路(lu)的(de)(de)典型信號(hao)轉導蛋白(包(bao)括Akt、S6、mTOR和(he)p38)的(de)(de)磷酸化的(de)(de)顯著(zhu)增(zeng)加有關(圖(tu)(tu)1C)。此外(wai)，我們(men)觀察到cub/cub mcub/mcub MEF中細(xi)胞表(biao)面EGFR水平的(de)(de)顯著(zhu)下降(圖(tu)(tu)1C)，表(biao)明(ming)EGFR信號(hao)傳導的(de)(de)內(nei)化和(he)組(zu)成型激(ji)活。

為了(le)測(ce)試EGFR信號(hao)傳導(dao)的(de)(de)(de)增加(jia)是否對(dui)應于(yu)上(shang)皮(pi)增殖(zhi)的(de)(de)(de)變化，我們進行了(le)傷口-愈(yu)合測(ce)定(ding)，在(zai)測(ce)定(ding)中(zhong)(zhong)我們在(zai)6-40周齡cub小鼠(shu)的(de)(de)(de)耳(er)中(zhong)(zhong)穿出(chu)2mm通孔并在(zai)隨(sui)后的(de)(de)(de)多天(tian)監(jian)測(ce)閉合率(lv)(圖1D-1E)。在(zai)14天(tian)中(zhong)(zhong)，與(yu)對(dui)照+/+mcub/mcub同窩幼仔(zi)相(xiang)(xiang)比，cub/cub mcub/mcub小鼠(shu)顯示(shi)出(chu)加(jia)速閉合。相(xiang)(xiang)對(dui)于(yu)對(dui)照小鼠(shu)，+/cub mcub/mcub小鼠(shu)(其(qi)具有(you)正常皮(pi)毛)還(huan)在(zai)受(shou)傷后14天(tian)顯示(shi)出(chu)更快的(de)(de)(de)愈(yu)合，參見(jian)圖9A和9B，表明單一突變的(de)(de)(de)cub等位基因能夠引(yin)起EGFR信號(hao)傳導(dao)的(de)(de)(de)增加(jia)，盡管增加(jia)的(de)(de)(de)水(shui)平不足以(yi)阻斷毛囊誘導(dao)。這(zhe)些(xie)數(shu)據(ju)表明，cub/cub mcub/mcub基因型(xing)產生了(le)活(huo)性過高的(de)(de)(de)EGFR表型(xing)。

實施例2：cub是編碼iRhom2的Rhbdf2基因的突變

接下來，我們檢驗了作為cub突變的候選物的iRhom2基因Rhbdf2。cub/cub小鼠的DNA測序鑒定出Rhbdf2基因中12,681堿基對(bp)缺失，這導致外顯子2-6的缺失(圖2A)。為了測試所述缺失是否產生異常的Rhbdf2轉錄物，我們使用被設計以擴增外顯子2、5、12和19的引物對來自野生型和cub/cub mcub/mcub MEF的RNA進行逆轉錄酶PCR(RT-PCR)。cub轉錄物含有外顯子12和19，但是缺少外顯子2和5(圖2B)。另外，對來自cub/cub mcub/mcub和+/+mcub/mcub皮膚的RNA進行的定量RT-PCR(qPCR)擴增出cub轉錄物，其中外顯子2-6被缺失但是其余外顯子被表達，表明在cub小鼠中cub基因的其余部分被轉錄(圖2C)。為了測試cub轉錄物是否導致外顯子1至7的剪接，我們使用專門被設計以僅擴增包含剪接至外顯子7的外顯子1的轉錄物的探針進行qPCR。使用該探針，我們在cub/cub mcub/mcub小鼠中檢測到PCR產物，但是未在+/+mcub/mcub小鼠中檢測到(圖2D)。這些發現確認了cub是Rhbdf2基因的突變，并將在下文中被稱為Rhbdf2^cub。

考慮到Rhbdf2^cub轉錄物中外顯子3中的正常翻譯起始位點是缺失的，我們接下來測試這些突變轉錄物是否會產生突變的iRhom2蛋白。對Rhbdf2^cub DNA的序列分析表明下一個框內翻譯起始位點(ATG)在外顯子8中，其將產生約63.5kDa的蛋白。由于我們缺少iRhom2的抗體，我們通過將全長野生型人RHBDF2cDNA(Hu Wt)以及模擬突變Rhbdf2^cub轉錄物的版本(HuCub)同時克隆到C-末端Flag標記的表達載體中，測試了Rhbdf2^cub轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)物(wu)(wu)是否能夠在體(ti)外產(chan)(chan)生蛋(dan)白(bai)產(chan)(chan)物(wu)(wu)。首先(xian)，使用免(mian)疫(yi)印跡法，我(wo)們確定(ding)Hu Wt克隆產(chan)(chan)生約100kDa的(de)蛋(dan)白(bai)產(chan)(chan)物(wu)(wu)，而HuCub突(tu)變體(ti)構建體(ti)產(chan)(chan)生約67kDa的(de)產(chan)(chan)物(wu)(wu)，這(zhe)與(yu)預期(qi)的(de)標記蛋(dan)白(bai)的(de)分(fen)子量一致(圖(tu)(tu)2E)。此外，Hu Wt克隆中沒(mei)有(you)任何縮(suo)短的(de)蛋(dan)白(bai)產(chan)(chan)物(wu)(wu)的(de)證據。第二(er)，我(wo)們使用免(mian)疫(yi)染(ran)色法檢驗了用Hu Wt或HuCub克隆轉(zhuan)(zhuan)染(ran)B6MEF之后兩(liang)種蛋(dan)白(bai)形式的(de)定(ding)位模(mo)式(圖(tu)(tu)2F以(yi)及圖(tu)(tu)10A和10B)。這(zhe)兩(liang)種形式都在內(nei)質網(wang)中表(biao)達，并且在高爾(er)基體(ti)或細胞核中未觀察到染(ran)色(圖(tu)(tu)10A和10B)，表(biao)明(ming)所述(shu)突(tu)變未導致蛋(dan)白(bai)定(ding)位改變。

實施例3：遺傳非互補證實cub是Rhbdf2基(ji)因的(de)突變(bian)等位(wei)基(ji)因，并(bing)且是功(gong)能獲得性突變(bian)

為了測試Rhbdf2^cub是否是功能獲得性突變而非無效突變，我們使用來自敲除小鼠項目(KOMP)庫的ES細胞產生了Rhbdf2敲除(Rhbdf2^-/-)小鼠，其中lacZ表達是在內源Rhbdf2啟動子的控制下(圖3A)。主要在皮膚的表皮和毛囊的內鞘層和外鞘層中觀察到Rhbdf2啟動子驅動的lacZ表達(圖3B)。但是，在Rhbdf2^cub/cub小鼠中觀察到的傷口愈合(圖3C)和毛發脫落(圖3D)表型未見于Rhbdf2^-/-小鼠中，其在其他方面看起來是正常的。Rhbdf2^cub/cub和Rhbdf2^-/-小鼠的等位基因測試交配產生了具有稀疏毛皮的復合突變(Rhbdf2^-/cub)小鼠，表明遺傳非互補，并且證實cub是Rhbdf2基因的突變等位基因。另外，Rhbdf2^-/cub復合突變小鼠的毛發生長水平介于Rhbdf2^cub/cub小鼠和Rhbdf2^+/+或Rhbdf2^-/-小鼠之間，證實突變Rhbdf2^cub蛋白產物的表達而非Rhbdf2缺乏導致Rhbdf2^cub/cub表型。

實施例4：Rhbdf2^cub表(biao)型(xing)的(de)(de)遺(yi)傳修飾因子(zi)(Mcub)是Areg基(ji)因的(de)(de)功(gong)能喪(sang)失性(xing)突變

接下來我們試圖定位引起Rhbdf2^cub修飾基因(Mcub)的突變。我們檢驗了4個作為Mcub突變的候選基因座的編碼EGFR配體的基因(Epng、Ereg、Areg和Btc)。通過對Mcub/Mcub Rhbdf2^cub/cub小鼠中各基因(yin)(yin)的(de)外顯(xian)子和(he)側(ce)翼區進行測序(參見表(biao)II)，我們發現Mcub是Areg(編碼(ma)自分泌角化細胞生(sheng)長(chang)因(yin)(yin)子雙(shuang)調蛋白(本文(wen)中稱為AREG)的(de)基因(yin)(yin))中的(de)功能喪失性突變(圖4A)。

Mcub是T至G的點突變，所述突變破壞外顯子1的典型供體剪接位點并導致排他使用可變的下游剪接位點，其向Areg轉錄物添加22個額外的核苷酸；這破壞了編碼框并引入提前終止密碼子(圖11)。該突變將在下文中被稱為Areg^Mcub。值得注意的是，當存在單拷貝的顯性Areg^Mcub等位基因時，Rhbdf2^cub/cub小鼠的活性過高的EGFR信號傳導(圖12A)和快速的傷口閉合的能力顯著降低(圖4B和4C)，并阻止了毛發缺失表型的出現。顯性Areg^Mcub突變并不賦予Rhbdf2^cub/cub小鼠正常(chang)(chang)毛皮(pi)，而是(shi)賦予卷曲(qu)毛發表(biao)型，表(biao)明EGFR途徑中(zhong)的(de)其余異常(chang)(chang)情況。

我們接下來測量了Rhbdf2^cub/cub Areg^+/+、Rhbdf2^cub/cub Areg^Mcub/Mcub和Rhbdf2^+/+Areg^+/+小鼠中AREG的血清水平。我們發現Rhbdf2^cub/cub Areg^Mcub/Mcub小鼠的血清中無可檢測的AREG，但是與Rhbdf2^+/+Areg^+/+小鼠相比在Rhbdf2^cub/cub Areg^+/+小鼠中(zhong)觀察到血(xue)清AREG水(shui)平(ping)的顯(xian)著升(sheng)高(圖4D)。

對來自Rhbdf2^cub/cub Areg^+/+、Rhbdf2^cub/cub Areg^Mcub/Mcub和Rhbdf2^+/+Areg^+/+小鼠的經培養的小鼠表皮角化細胞(MEK)的上清液AREG水平進行的測量產生了相似的結果(圖4E)。AREG在正常皮膚中大量表達；因此，我們接下來對來自Rhbdf2^cub/cub Areg^+/+和Rhbdf2^+/+Areg^+/+小鼠的皮膚樣品進行qPCR以測量Areg以及6種其他已知編碼EGFR配體的基因(Egf、Tgfα、Btc、Epgn、Ereg和Hbegf)的轉錄物水平。與對照相比，我們在Rhbdf2^cub/cub Areg^+/+小(xiao)鼠中觀察到(dao)Areg的4倍增(zeng)加，以及(ji)Epgn和Hbegf mRNA的微小(xiao)但統計(ji)(ji)學上(shang)顯著的增(zeng)加。此外，Btc和Egf轉(zhuan)錄物水平出現統計(ji)(ji)學上(shang)顯著的降低(圖4F)。

最后，為了檢驗AREG是否介導活性過高的EGFR表型，我們使用慢病毒shRNA使Rhbdf2^+/+和Rhbdf2^cub/cub MEF中的Areg表達沉默(圖12B)并進行了增殖測定。Areg沉默對Rhbdf2^+/+MEF的增殖具有微小的影響(圖12C)，而Rhbdf2^cub/cub MEF的增殖率顯著降低(圖12D)。總之，這些數據表明提高的AREG水平通過增加EGFR信號傳導來介導Rhbdf2^cub/cub小鼠的突變表型。此外，我們的數據表明Rhbdf2^cub表型由Areg^Mcub表達修飾。

實施例5：N-末端截短的iRhom2(Rhbdf2^cub)的(de)肽(tai)酶(mei)域誘導不依賴(lai)于ADAM17的(de)EGFR配體(ti)的(de)底物特異性(xing)分(fen)泌

為了測試Rhbdf2^cub是否能夠——通過其短(duan)的(de)(de)(de)(de)N-末端(duan)結構域(yu)——誘導(dao)不(bu)依賴于(yu)金屬蛋白酶活性的(de)(de)(de)(de)AREG分(fen)泌(mi)(mi)，我(wo)們在(zai)馬立馬司他(MM)——一種能夠同時阻止ADAM17和(he)ADAM10依賴性底物脫落的(de)(de)(de)(de)強(qiang)效廣譜金屬蛋白酶抑制劑——存(cun)(cun)在(zai)或(huo)不(bu)存(cun)(cun)在(zai)的(de)(de)(de)(de)情況下進行了體外裂解測定。由于(yu)小鼠和(he)人(ren)RHBDF2基因(yin)(yin)之間(jian)的(de)(de)(de)(de)顯(xian)著同源(yuan)性，我(wo)們單(dan)獨使用(yong)人(ren)AREG或(huo)使用(yong)人(ren)AREG與(yu)人(ren)野生型(xing)(Hu Wt)或(huo)人(ren)Cub(HuCub)RHBDF2基因(yin)(yin)轉染(ran)(ran)293T細(xi)胞(bao)(圖5A)，并在(zai)條件培養基中測量(liang)AREG水(shui)平。在(zai)不(bu)存(cun)(cun)在(zai)MM時，我(wo)們觀察到表(biao)達AREG的(de)(de)(de)(de)細(xi)胞(bao)和(he)共表(biao)達AREG/HuCub的(de)(de)(de)(de)細(xi)胞(bao)之間(jian)的(de)(de)(de)(de)AREG水(shui)平沒有差異(yi)，而Hu Wt和(he)AREG的(de)(de)(de)(de)共表(biao)達使AREG水(shui)平降低約60％(圖5B)。在(zai)存(cun)(cun)在(zai)MM時，與(yu)用(yong)Hu Wt和(he)AREG轉染(ran)(ran)或(huo)單(dan)獨用(yong)AREG轉染(ran)(ran)的(de)(de)(de)(de)細(xi)胞(bao)相(xiang)比，HuCub/AREG共轉染(ran)(ran)的(de)(de)(de)(de)細(xi)胞(bao)中AREG水(shui)平約高出兩倍(圖5B)。這些數據表(biao)明，N-末端(duan)截(jie)短(duan)的(de)(de)(de)(de)iRhom2能夠增(zeng)強(qiang)AREG分(fen)泌(mi)(mi)，該分(fen)泌(mi)(mi)僅在(zai)金屬蛋白酶活性減小時變得明顯(xian)。

可通過在用細菌內毒素脂多糖(LPS)刺激之后檢查腫瘤壞死因子α(TNFα)分泌來測量小鼠中的ADAM17活性。我們使用該方法，通過將LPS注射到Rhbdf2^cub/cub、Rhbdf2^-/-和Rhbdf2^+/+小鼠中并測量血清TNFα水平以測試Rhbdf2^cub小鼠中ADAM17活性的變化。我們發現相對于注射LPS的Rhbdf2^+/+小鼠，注射LPS的Rhbdf2^cub/cub和Rhbdf2^-/-小鼠均具有顯著更低的TNFα誘導(圖5C)。這些結果表明在Rhbdf2^cub/cub和Rhbdf2^-/-小鼠中ADAM17活性顯著減弱，也顯示了iRhom2的N-末端結構域在調節ADAM17依賴性TNFα釋放中的作用。值得注意的是，LPS刺激的Rhbdf2^cub/cub小鼠中血清TNFα水平并未完全消除，表明ADAM17活性減弱但并未消失。觀察到的Rhbdf2^cub/cub小鼠中的ADAM17活性減弱解釋了與Adam17^-/-小鼠相比或與過表達雙調蛋白的轉基因小鼠相比Rhbdf2^-/-和Rhbdf2^cub/cub小鼠(shu)中的非(fei)致死性或(huo)非(fei)炎性皮膚(fu)表型。

接下來，評估了活性(xing)(xing)(xing)菱形蛋(dan)白(bai)酶(mei)(mei)對(dui)其他EGF樣底物的(de)(de)蛋(dan)白(bai)酶(mei)(mei)選(xuan)擇(ze)性(xing)(xing)(xing)，以(yi)及這(zhe)些是(shi)否與(yu)(yu)HuCub有區別。我們(men)發現，與(yu)(yu)空載體轉(zhuan)染的(de)(de)對(dui)照相比，RHBDL2選(xuan)擇(ze)性(xing)(xing)(xing)地增(zeng)加(jia)EGF的(de)(de)分(fen)(fen)泌(mi)(mi)但(dan)不(bu)增(zeng)加(jia)AREG或HB-EGF的(de)(de)分(fen)(fen)泌(mi)(mi)(圖(tu)5D)。相比之下，與(yu)(yu)空載體轉(zhuan)染的(de)(de)細胞相比，HuCub選(xuan)擇(ze)性(xing)(xing)(xing)地增(zeng)加(jia)AREG和HB-EGF的(de)(de)分(fen)(fen)泌(mi)(mi)但(dan)不(bu)增(zeng)加(jia)EGF的(de)(de)分(fen)(fen)泌(mi)(mi)(圖(tu)5E-5G)。這(zhe)些結果表(biao)明(ming)，菱形蛋(dan)白(bai)酶(mei)(mei)肽(tai)酶(mei)(mei)域賦予底物選(xuan)擇(ze)性(xing)(xing)(xing)。N-末端截短的(de)(de)iRhom1能夠誘導AREG分(fen)(fen)泌(mi)(mi)但(dan)不(bu)能誘導EGF分(fen)(fen)泌(mi)(mi)與(yu)(yu)該論斷(duan)一致(圖(tu)13A和13B)。

為了(le)確(que)定iRhom2肽(tai)(tai)酶域(yu)(yu)如何(he)有助于調(diao)節EGF樣(yang)底(di)物的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)分(fen)泌(mi)(mi)，我們(men)首先比(bi)對(dui)了(le)人和(he)(he)小鼠iRhom的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)肽(tai)(tai)酶域(yu)(yu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)氨(an)(an)(an)基(ji)酸(suan)序列。我們(men)發(fa)現人iRhom2和(he)(he)RHBDL2的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)肽(tai)(tai)酶域(yu)(yu)之(zhi)間(jian)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)蛋(dan)白(bai)序列同源性(xing)具有顯(xian)(xian)著差異(圖(tu)13C)。相比(bi)之(zhi)下，iRhom1和(he)(he)2的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)肽(tai)(tai)酶域(yu)(yu)顯(xian)(xian)示(shi)出96％的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)同源性(xing)。這共同表(biao)(biao)明有活(huo)性(xing)和(he)(he)無活(huo)性(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)菱(ling)形蛋(dan)白(bai)酶之(zhi)間(jian)形成活(huo)性(xing)位(wei)(wei)點或在底(di)物識別(bie)中(zhong)發(fa)揮作用(yong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)殘(can)基(ji)顯(xian)(xian)著不同。此(ci)外，我們(men)發(fa)現，與天然HuCub相比(bi)，HuCub肽(tai)(tai)酶域(yu)(yu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)缺失(shi)顯(xian)(xian)著減少了(le)AREG分(fen)泌(mi)(mi)(圖(tu)5G)，表(biao)(biao)明所述肽(tai)(tai)酶域(yu)(yu)對(dui)于EGF樣(yang)底(di)物的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)分(fen)泌(mi)(mi)是必需的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)。為了(le)鑒定關(guan)鍵(jian)殘(can)基(ji)，我們(men)進(jin)行了(le)定點誘變(bian)，以使HuCub肽(tai)(tai)酶域(yu)(yu)中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)關(guan)鍵(jian)殘(can)基(ji)突變(bian)為丙氨(an)(an)(an)酸(suan)。我們(men)發(fa)現第4跨(kua)膜結構域(yu)(yu)中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)第426位(wei)(wei)谷(gu)氨(an)(an)(an)酰胺和(he)(he)第432位(wei)(wei)半胱氨(an)(an)(an)酸(suan)以及分(fen)別(bie)在第2和(he)(he)6跨(kua)膜結構域(yu)(yu)中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)第336位(wei)(wei)和(he)(he)第475位(wei)(wei)組氨(an)(an)(an)酸(suan)不僅(jin)對(dui)于介導AREG/HB-EGF的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)分(fen)泌(mi)(mi)增(zeng)加是關(guan)鍵(jian)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)，而(er)且(qie)對(dui)于EGF的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)抑制也是關(guan)鍵(jian)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(圖(tu)5H、I)。但是，絲氨(an)(an)(an)酸(suan)突變(bian)S362A、402A和(he)(he)425A，谷(gu)氨(an)(an)(an)酸(suan)突變(bian)E436A，以及谷(gu)氨(an)(an)(an)酰胺突變(bian)Q439A不改變(bian)AREG分(fen)泌(mi)(mi)(圖(tu)13D)。這些結果共同表(biao)(biao)明N-末端截短的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)iRhom的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)肽(tai)(tai)酶域(yu)(yu)中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)關(guan)鍵(jian)殘(can)基(ji)(圖(tu)5J和(he)(he)圖(tu)13E)調(diao)節不依賴于金屬蛋(dan)白(bai)酶活(huo)性(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)EGF樣(yang)底(di)物的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)分(fen)泌(mi)(mi)。

實施例6：N-末端截短的iRhom2(Rhbdf2^cub)增強對上(shang)皮癌的易感性(xing)

RHBDF2的(de)(de)(de)(de)(de)(de)錯義突變(bian)(bian)(bian)(bian)(p.I186T、p.P189L和p.D188N)可(ke)以是家族性胼胝癥以及食管(guan)癌綜(zong)合征(zheng)(TOC)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)起因。為了測試(shi)由于RHBDF2中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)顯(xian)性N-末端(duan)突變(bian)(bian)(bian)(bian)而增(zeng)加的(de)(de)(de)(de)(de)(de)AREG分(fen)泌是否可(ke)能通過在(zai)(zai)293T細(xi)胞中(zhong)共(gong)表達AREG與含有人(ren)錯義突變(bian)(bian)(bian)(bian)(RHBDF2p.I186T)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)HuWt克(ke)隆(long)、HuCub或Hu Wt在(zai)(zai)體外驅(qu)動(dong)這些人(ren)類病理變(bian)(bian)(bian)(bian)化(hua)。與Hu Wt相比，RHBDF2p.I186T或HuCub的(de)(de)(de)(de)(de)(de)表達導致AREG在(zai)(zai)條件培養基中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)更高水(shui)平(ping)和更低的(de)(de)(de)(de)(de)(de)細(xi)胞內(nei)水(shui)平(ping)(圖6A和6B)。此外，RHBDF2p.I186T產生(sheng)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)AREG水(shui)平(ping)與HuCub所產生(sheng)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)那些相當，表明iRhom2N-末端(duan)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)缺失或顯(xian)性突變(bian)(bian)(bian)(bian)導致AREG分(fen)泌增(zeng)加。另外，我們發現，RHBDF2p.I186T突變(bian)(bian)(bian)(bian)體的(de)(de)(de)(de)(de)(de)肽酶域中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)4個(ge)關鍵(jian)殘(can)基(H、C、Q和H)中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)至少(shao)一(yi)個(ge)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)缺失導致AREG分(fen)泌顯(xian)著減(jian)少(shao)(圖6C)。

為了確定Rhbdf2^cub等位基因是否增強腫瘤易感性，我們研究了在Apc^Min/+小鼠(人家族性腺瘤性息肉病的小鼠模型)中其表達如何影響腺瘤形成。在Apc^Min/+小鼠中，一個野生型Apc等位基因的自發缺失誘導腸內上皮腺瘤形成，以及在169天的中值年齡時的過早死亡。值得注意的是，在小腸中觀察到Rhbdf2(圖6D)和Areg表達，表明可能的功能性關系。我們產生并觀察了Apc^Min/+Rhbdf2^+/cub和Apc^Min/+Rhbdf2^+/+小鼠，但是由于致死率增加我們無法產生足夠的Apc^Min/+Rhbdf2^cub/cub小鼠用于有意義的比較。盡管如此，我們確實觀察到Apc^Min/+Rhbdf2^+/+(172天)和Apc^Min/+Rhbdf2^+/cub(135天)小鼠的中值生存期的顯著差異(圖6E)。對3月齡的Apc^Min/+Rhbdf2^+/+和Apc^Min/+Rhbdf2^+/cub小鼠的尸檢揭示Apc^Min/+小鼠中單一Rhbdf2^cub等位基因的存在顯著增加了息肉的數目(圖6F和6G)和腺瘤大小(圖6F和6H)，表明cub突變使上皮腫瘤生長增加。但是，在最長達2年齡的Rhbdf2^cub/cub小鼠中沒有自發的癌癥發生，表明Rhbdf2^cub突變(bian)產生(sheng)了有利于(yu)腫瘤發(fa)展的環境，但是并不單獨地驅使腫瘤發(fa)展。

實施(shi)例7：RHBDF2基因的細胞溶質N-末(mo)端的缺(que)失或(huo)N-末(mo)端中的顯性突變(bian)增加了其蛋(dan)白穩定性

iRhom2通(tong)(tong)過(guo)促進EGF樣配體(ti)(ti)經蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)酶(mei)體(ti)(ti)通(tong)(tong)路降(jiang)解而負調控EGFR信號傳導。我(wo)們(men)確定(ding)，當缺少細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)溶質N-末端時(shi)，iRhom誘導AREG/HB-EGF的(de)分泌(圖(tu)5)。為了測試iRhom2的(de)氨基(ji)端的(de)功能獲得性(xing)突(tu)變是否干擾蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)酶(mei)體(ti)(ti)加(jia)(jia)工(gong)并(bing)由此增加(jia)(jia)其穩定(ding)性(xing)，我(wo)們(men)檢(jian)驗了胼胝RHBDF2突(tu)變體(ti)(ti)p.I186T是否能夠(gou)與AREG相互作用。我(wo)們(men)發現，類似(si)于Hu Wt和(he)(he)HuCub，p.I186T與AREG形成物理復(fu)合體(ti)(ti)(圖(tu)7A)。我(wo)們(men)之后通(tong)(tong)過(guo)免(mian)疫細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)化學和(he)(he)流式(shi)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)術(shu)比(bi)(bi)(bi)較(jiao)了293T和(he)(he)COS7細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)中Hu Wt、HuCub和(he)(he)p.I186T的(de)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)表達(da)水(shui)平(ping)(ping)。我(wo)們(men)觀(guan)察到，與HuCub和(he)(he)p.I186T相比(bi)(bi)(bi)，HuWt蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)表達(da)水(shui)平(ping)(ping)顯著(zhu)更(geng)低(di)(圖(tu)7B、C)。此外，當我(wo)們(men)對COS7細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)進行所示(shi)時(shi)間(jian)的(de)環(huan)己(ji)酰胺(一種蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)合成抑制劑)追蹤時(shi)，在1小時(shi)內我(wo)們(men)觀(guan)察到與HuCub或(huo)p.I186T相比(bi)(bi)(bi)Hu Wt的(de)免(mian)疫反應性(xing)約(yue)下(xia)降(jiang)50％(圖(tu)7D、E)。

為了測試iRhom2是否是蛋白酶體降解的靶標，我們測定了在強效蛋白酶體抑制劑MG-132的存在下Hu Wt和HuCub的蛋白半衰期。意料之中的，Hu Wt的蛋白半衰期顯著增大，但是HuCub的并沒有(圖7F)，表明iRhom2的蛋白酶體降解可能影響其蛋白穩定性。我們得出結論，類似于Rhbdf2^cub突(tu)變，iRhom2的(de)氨基端的(de)錯義突(tu)變增加(jia)(jia)了(le)其穩定性并有助(zhu)于增加(jia)(jia)不依賴(lai)于金屬蛋白酶活性的(de)AREG的(de)分泌。

實施例8

此處，我(wo)(wo)們(men)報道了(le)iRhom2(被熟知作(zuo)為果蠅屬中EGFR信(xin)(xin)號(hao)傳導的(de)調節子的(de)菱形蛋白(bai)酶家族的(de)成(cheng)員)在皮(pi)膚愈合和腫瘤(liu)(liu)發展中能夠(gou)(gou)調節EGFR信(xin)(xin)號(hao)傳導。我(wo)(wo)們(men)證明(ming)(ming)了(le)iRhom2是短壽命蛋白(bai)，其穩定性可通過N-末端結構(gou)域(yu)的(de)選(xuan)擇突(tu)變(bian)而增(zeng)(zeng)加(jia)。這些穩定的(de)變(bian)體進而發揮增(zeng)(zeng)加(jia)不依賴(lai)于金屬蛋白(bai)酶活(huo)性的(de)AREG分(fen)泌的(de)作(zuo)用(yong)。我(wo)(wo)們(men)鑒定了(le)iRhom在EGFR依賴(lai)性細胞增(zeng)(zeng)殖和創傷愈合中的(de)重要作(zuo)用(yong)，并證明(ming)(ming)了(le)在適當(dang)的(de)情況下增(zeng)(zeng)加(jia)EGFR信(xin)(xin)號(hao)傳導的(de)iRhom2突(tu)變(bian)如何(he)能夠(gou)(gou)促進腫瘤(liu)(liu)發展。

N-末端結(jie)構域和(he)肽酶域在調節EGFR信(xin)號傳導中(zhong)具有獨(du)立的(de)功(gong)能

iRhom是復合多結構域酶，其包含長的細胞溶質N-末端、休眠的肽酶域和保守的iRhom同源結構域(IRHD)；這些結構域的功能仍然是未知的。在正常情況下，iRhom通過促進EGF樣底物的降解而負調控EGFR信號傳導。但是，Rhbdf2^cub突變不可能只是功能喪失性突變。Rhbdf2^-/-小鼠無法重現(recapitulate)Rhbdf2^cub表型。此外，我們證明，與Rhbdf2^cub突變類似，iRhom2的N-末端的顯性錯義突變以由肽酶域的跨膜螺旋2、4和6中的關鍵氨基酸介導的方式誘導AREG和HB-EGF的分泌。因此，我們的結果表明，iRhom2的細胞溶質N-末端通過抑制肽酶域而負調控EGFR信號傳導，從而負調控AREG/HB-EGF的分泌(圖8)。我們的發現還揭示出iRhom2的更精細的調控功能，其在N-末端突變(例如Rhbdf2^cub)中被揭示出。

Rhbdf2^cub可被認為是功能獲得性突變。該結論由若干證據支持。首先，iRhom2的負調控作用似乎是最小的，因為除非與Rhbdf2^cub突變結合，Rhbdf2^-/-小鼠(shu)并不(bu)表(biao)現出明(ming)(ming)顯的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)“EGFR活性過高”的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)表(biao)型(xing)。第(di)二(er)，與Hu Wt和AREG的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)轉(zhuan)染(ran)或單獨(du)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)AREG轉(zhuan)染(ran)相比，HuCub和AREG的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)共轉(zhuan)染(ran)使AREG水平約高出2-3倍。第(di)三，HuCub的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)表(biao)達誘導(dao)不(bu)依(yi)賴(lai)于金屬蛋(dan)白酶活性的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)膜(mo)錨定的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)AREG和HB-EGF的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)分泌(mi)。第(di)四，突變的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)iRhom2等位基因(yin)在(zai)(zai)(zai)不(bu)存在(zai)(zai)(zai)肽酶域的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)情況下(xia)無法誘導(dao)AREG/HB-EGF的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)分泌(mi)。與這些觀察一(yi)致(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)是(shi)，N-末(mo)端截短的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)RHBDF1而非全長(chang)RHBDF1的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)轉(zhuan)基因(yin)表(biao)達在(zai)(zai)(zai)果(guo)蠅屬中誘導(dao)強EGFR信(xin)號(hao)傳導(dao)相關的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)翅表(biao)型(xing)。另外(wai)，被截短的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)RHBDF1與HB-EGF的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)共表(biao)達在(zai)(zai)(zai)果(guo)蠅屬中強化(hua)了(le)改(gai)變的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)翅表(biao)型(xing)，表(biao)明(ming)(ming)被截短的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)iRhom1可能誘導(dao)HB-EGF的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)分泌(mi)，從(cong)而激活EGFR信(xin)號(hao)傳導(dao)。這些結果(guo)驗證了(le)以下(xia)觀點：細胞溶質N-末(mo)端有助于iRhom引起的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)EGF家族配體的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)泛素加(jia)工(gong)，而iRhom肽酶域在(zai)(zai)(zai)不(bu)被N-末(mo)端抑制時刺激EGFR信(xin)號(hao)傳導(dao)。

我們發現在飽和濃度的馬立馬司他(一種強效、廣譜的金屬蛋白酶抑制劑)存在下，突變的iRhom2等位基因誘導AREG和HB-EGF的分泌。ADAM家族其他成員的成熟不受這兩種iRhom的缺乏的影響。此外，我們證明了在Rhbdf2^cub小鼠中ADAM17活性減弱。因此，我們得出結論，Rhbdf2^cub和胼胝(zhi)突變選擇性地誘(you)導不依賴于金屬蛋白酶(mei)活性的AREG和HB-EGF分泌，并且跨膜肽酶(mei)域對該功能(neng)是(shi)必需的。

在Rhbdf2^cub小鼠(shu)中(zhong)活性過高(gao)的EGFR通路是皮膚加(jia)速愈合(he)的原因

傷(shang)口愈合(he)的(de)(de)(de)生物學是復雜(za)的(de)(de)(de)。在人(ren)(ren)類中(zhong)，成年人(ren)(ren)的(de)(de)(de)傷(shang)口易(yi)受(shou)到非功能(neng)性纖(xian)維組織形(xing)成的(de)(de)(de)影響，而胎兒(er)期的(de)(de)(de)傷(shang)口能(neng)實現完全再生，類似于脊椎(zhui)動物(例如美西螈)和真渦蟲中(zhong)的(de)(de)(de)無傷(shang)疤愈合(he)。

組織再生(sheng)和重塑領域(yu)仍處于初級(ji)階段。在人(ren)角化細(xi)胞(bao)系中進行的(de)體外傷(shang)口愈合測定表(biao)(biao)明(ming)，與未受傷(shang)的(de)對照相比(bi)，受傷(shang)后RHBDL2的(de)表(biao)(biao)達顯著上調。

Rhbdf2^cub小鼠能夠快速使傷口愈合而不形成明顯傷疤的原因可能是以下二者的結合：由于ADAM17活性減弱而使TNFα分泌減少，以及增加的AREG產生/EGFR過度激活所引起的快速上皮再生。我們提出，在Rhbdf2^cub小鼠(shu)中盡管TNFα減少有助于使(shi)炎癥程度更低，但AREG產生增(zeng)加促(cu)進(jin)增(zeng)殖加速和角化細胞遷移(yi)到傷口(kou)處。此(ci)外，iRhom2主要(yao)在(zai)皮(pi)膚(fu)中表(biao)達，使(shi)其成為受損的(de)皮(pi)膚(fu)傷口(kou)愈合(he)中潛在(zai)的(de)新治療靶標(biao)。

在一些上皮癌中(zhong)iRhom2-AREG-EGFR通路具有組成型(xing)活(huo)性

在本研究中，我們發現N-末端截短的iRhom2促進不依賴于ADAM17活性的AREG產生的增加，從而誘導EGFR激活。特別地，Apc^Min/+Rhbdf2^+/cub小鼠的表型重現了在具有顯性RHBDF2突變的患者中所見的對上皮癌的增強的易感性。但是，Rhbdf2^cub/cub小鼠并未自發地發展腫瘤，表明Rhbdf2^cub突變可能(neng)并(bing)不驅使癌癥(zheng)發展，而是可能(neng)通過(guo)產生有利環境而促進(jin)腫瘤生長和(he)進(jin)展。

材料和方法

在Jackson實驗室(Bar Harbor，ME)在改良的屏障(barrier)條件下獲得、飼養并維持小鼠。將所有基因型(包括cub和Mcub)維持在C57BL/6J(B6)遺傳背景上。為了產生Rhbdf2^-/-小鼠，將從敲除小鼠項目(KOMP)庫獲得的ES細胞克隆(EPD0208_1_A09)注射到B6-Tyr^c(B6白化病)胚泡中。使表現出>50％嵌合性的雄性與B6白化病雌性交配；通過PCR對黑色后代進行基因分型。使雜合體相互交配以產生純合體，或使雜合體與Rhbdf2^cub/cub小鼠交配以產生Rhbdf2^-/cub小鼠。Jackson實驗室的動物保護(hu)與使用委(wei)員會批準了全(quan)部實驗操(cao)作(zuo)。

細胞培養和試劑——如之前所述我們分離了MEF。根據制造商的說明書(CELLnTEC/Zenbio，Research Triangle Park，NC)分離小鼠表皮角化細胞(MEK)。使細胞生長在37℃、含有5％CO₂的增濕室中。分別(bie)從Fisher Scientific(Boston，MA)和(he)(he)(he)Zen-Bio(Research Triangle Park，NC)購買MEF試(shi)劑(ji)[(磷酸鹽(yan)緩沖(chong)溶(rong)液(PBS)、HyClone Dulbeccos Modified Eagles培(pei)(pei)養基、高葡萄糖(DMEM)、青(qing)霉素(su)-鏈霉素(su)和(he)(he)(he)HyClone胎牛血清)]和(he)(he)(he)MEK試(shi)劑(ji)(祖細(xi)胞靶向培(pei)(pei)養基CnT-07、抗(kang)生素(su)/抗(kang)真(zhen)菌溶(rong)液ABM和(he)(he)(he)蛋白酶Dispase)。從Life technologies(Chicago，IL)獲得TrypLETM Select。使293T和(he)(he)(he)COS7細(xi)胞分別(bie)生長在(zai)DMEM和(he)(he)(he)RPMI培(pei)(pei)養基中。

組(zu)織學——如之前所述制備用于組(zu)織學檢查的組(zu)織。

耳(er)孔閉合(he)：使(shi)(shi)(shi)用(yong)(yong)外科手術用(yong)(yong)的(de)耳(er)打(da)孔裝(zhuang)置Napox KN-292B使(shi)(shi)(shi)小鼠(shu)受傷以在(zai)左耳(er)中央(yang)制造2mm通孔，并在(zai)28天(tian)期(qi)間分析閉合(he)率。在(zai)所示(shi)的(de)時(shi)間點，使(shi)(shi)(shi)小鼠(shu)安(an)樂(le)死并使(shi)(shi)(shi)用(yong)(yong)4×物(wu)鏡(Olympus BX41顯微鏡)捕獲耳(er)孔及周圍組織的(de)圖像。ImageJ軟件(jian)分析受傷區域。在(zai)室溫下將耳(er)固定(ding)在(zai)10％中性(xing)緩沖(chong)福爾馬林(lin)(NBF)中24h并進行石(shi)蠟(la)包埋和(he)切片(pian)處(chu)理。在(zai)第(di)0天(tian)測量物(wu)理創傷面積并將在(zai)所有隨后時(shi)間點的(de)測量值計算為初始面積的(de)百分數(shu)。

增殖和劃痕測定：使用MEF進行這兩組測定。對于增殖測定，在37℃使所示數目的細胞生長在膠原包被的96孔板中。孵育24h之后，移除生長培養基并在-80℃冷凍平板直至使用。使用細胞增殖試劑盒測定相對細胞數目(Life technologies)。使用Victor³多標記孔(kong)板讀數儀(PerkinElmer，Boston，MA)測量熒(ying)光強度。對(dui)于劃(hua)痕(hen)(hen)測定，使(shi)MEF在(zai)(zai)膠(jiao)原包被的(de)6孔(kong)板中生長至匯合(he)，并通過(guo)將無菌p200吸管端(duan)拉過(guo)孔(kong)從匯合(he)的(de)單層除去一條(tiao)細胞。使(shi)用(yong)Zeiss Observer相差顯微(wei)鏡上的(de)5×物鏡和(he)Axio Vision 4.6.3軟(ruan)件在(zai)(zai)0、3、6、9和(he)12h時(shi)獲(huo)取劃(hua)痕(hen)(hen)圖(tu)像(xiang)(xiang)。使(shi)用(yong)GRID插件，我們在(zai)(zai)每個圖(tu)像(xiang)(xiang)上覆(fu)蓋了網格。所(suo)述網格大小(xiao)使(shi)至少10條(tiao)線(xian)等分(fen)劃(hua)痕(hen)(hen)圖(tu)像(xiang)(xiang)。匯集各劃(hua)痕(hen)(hen)的(de)寬度并計算平均值。用(yong)ImageJ軟(ruan)件分(fen)析來自0、3、6、9和(he)12h時(shi)間序列(lie)的(de)捕獲(huo)圖(tu)像(xiang)(xiang)。

人AREG、HB-EGF和EGF ELISA：在被接種于(yu)24孔板的(de)293T細(xi)胞中進行瞬時轉染。使用(yong)(yong)脂質體LTX以及(ji)Plus試劑，將16.5fmol HuWt或HuCub與(yu)25ng AREG或50ng HB-EGF或200ng EGF共轉染。使每個孔中轉染的(de)DNA總量與(yu)pCMV6-AC-HA載體等量。24h之后，用(yong)(yong)溶于(yu)1ml新鮮培養(yang)基(ji)的(de)DMSO或10μM MM替換舊培養(yang)基(ji)。24h之后，將100μl上(shang)清液不稀(xi)釋(HB-EGF和EGF)或稀(xi)釋5倍(AREG)，并(bing)根據制造(zao)商的(de)說(shuo)明書進行ELISA(DY262、DY259和DY236)。

從(cong)OriGene(Rockville，MD)獲(huo)得包含(han)編碼人(ren)(ren)(ren)AREG(RC203150)、人(ren)(ren)(ren)HB-EGF(SC108485)、人(ren)(ren)(ren)EGF(SC127840)、人(ren)(ren)(ren)RHBDF2(RC203923)、小(xiao)鼠Rhbdf1(MC205414)和人(ren)(ren)(ren)RHBDL2(RC219882)的cDNA的表(biao)達質粒。根(gen)據(ju)制造商(shang)的說明書(shu)使(shi)用QuikChange II XL誘(you)變試劑盒(Agilent Technologies，Santa Clara，CA)在全長RHBDF2或小(xiao)鼠Rhbdf1中引入突變(缺(que)失或插入)，并通過DNA測序來驗(yan)證。使(shi)用引物設計程序( Primer Design，Agilent Technologies)產生用于定向誘(you)變的引物。

免疫化學：使鋪在BD BioCoat^TM膠原I 2-孔培養載片中的MEF生長至約60％匯合，并根據制造商的說明書用Lipofectamine^TM LTX(Life technologies)瞬時轉染。48h之后，將MEF固定在丙酮中并進行免疫細胞化學。簡言之，在-20℃將于1X冰冷的PBS中沖洗的細胞固定在丙酮中10min，然后在PBS中再沖洗3次。用3％H₂O₂阻斷內源過氧(yang)化酶(mei)活性，然(ran)后在阻斷緩沖液(ye)(PBST，10％山(shan)羊血清和1％BSA)中(zhong)孵(fu)(fu)育(yu)1h，并(bing)在4℃下在DDK特異性抗體(Origene)中(zhong)過夜孵(fu)(fu)育(yu)。第(di)二天，將細胞在PBST中(zhong)沖洗25min，并(bing)在室(shi)溫下在HRP綴(zhui)合(he)的(de)二級(ji)抗體中(zhong)孵(fu)(fu)育(yu)30min。在PBST中(zhong)沖洗三次之后，將細胞在DAPI溶(rong)液(ye)(IHC World，Woodstock，MD)中(zhong)孵(fu)(fu)育(yu)10min，然(ran)后覆蓋蓋玻片(pian)(pian)并(bing)密(mi)封載玻片(pian)(pian)。從Abcam(Cambridge，MA)獲得鈣聯(lian)蛋白和giatin抗體。從Life technologies獲得二級(ji)抗體。

免疫沉(chen)淀：根據制造商(shang)的(de)說明書(Life technologies)進行293T和COS7細(xi)胞(bao)轉染。用(yong)400μl包(bao)含完全(quan)小蛋白(bai)酶抑(yi)制劑(Roche Applied Science，Indianapolis，IN)的(de)細(xi)胞(bao)裂解緩沖(chong)液(ye)(ye)(Cell Signaling，Danvers，MA)處理鋪在(zai)6孔板中的(de)細(xi)胞(bao)，將(jiang)細(xi)胞(bao)在(zai)冰上(shang)(shang)(shang)孵(fu)育(yu)10min并(bing)在(zai)冷室中以14,000g離(li)心10min。在(zai)冷室中，在(zai)振(zhen)蕩平臺(tai)上(shang)(shang)(shang)將(jiang)細(xi)胞(bao)上(shang)(shang)(shang)清液(ye)(ye)和20μl與(yu)抗(kang)DDK抗(kang)體(ti)(Origene)綴合的(de)磁珠(zhu)孵(fu)育(yu)過(guo)夜。過(guo)夜孵(fu)育(yu)之后，將(jiang)磁珠(zhu)/漿體(ti)用(yong)TBS-T沖(chong)洗三次，使用(yong)2X SDS-PAGE上(shang)(shang)(shang)樣緩沖(chong)液(ye)(ye)收集蛋白(bai)質。

SDS-PAGE和免疫印跡(ji)：將(jiang)細胞(bao)用冰冷的(de)(de)(de)PBS沖(chong)(chong)洗一(yi)(yi)次并用包含完(wan)全小蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)酶抑(yi)制劑(Roche Applied Science，Indianapolis，IN)的(de)(de)(de)RIPA緩沖(chong)(chong)液(ye)(Cell Signaling，Danvers，MA)在(zai)(zai)(zai)(zai)冰上孵(fu)育(yu)10min。在(zai)(zai)(zai)(zai)4℃將(jiang)細胞(bao)裂解物以14,000g離心10min。收集上清液(ye)并貯(zhu)存于-80℃直(zhi)至(zhi)(zhi)進一(yi)(yi)步使用。使用Qubit熒光(guang)計(Life technologies)對蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)總量(liang)進行定量(liang)，并將(jiang)10μg蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)上樣(yang)到4-12％預(yu)制凝膠(jiao)(Lonza，Allendale，NJ)上，在(zai)(zai)(zai)(zai)140V下運(yun)行直(zhi)至(zhi)(zhi)低分(fen)子量(liang)Precision plus蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)標準品(Bio-Rad)到達凝膠(jiao)底部。使用iBLOT(Life technologies)將(jiang)已(yi)分(fen)開的(de)(de)(de)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)質(zhi)通過電泳轉移至(zhi)(zhi)PVDF膜(mo)上，然后(hou)(hou)在(zai)(zai)(zai)(zai)室溫下在(zai)(zai)(zai)(zai)溶于TBST(20mM Tris、137mM氯化鈉(na)和0.1％Tween-20)的(de)(de)(de)5％BSA(Cell Signaling Technology)中(zhong)封(feng)閉1h。然后(hou)(hou)在(zai)(zai)(zai)(zai)4℃將(jiang)膜(mo)在(zai)(zai)(zai)(zai)一(yi)(yi)級抗(kang)(kang)體(1:1000)中(zhong)孵(fu)育(yu)過夜(ye)，然后(hou)(hou)在(zai)(zai)(zai)(zai)TBST中(zhong)沖(chong)(chong)洗三(san)次(每(mei)次15min)，然后(hou)(hou)在(zai)(zai)(zai)(zai)室溫下在(zai)(zai)(zai)(zai)二級抗(kang)(kang)體(1:2000)中(zhong)孵(fu)育(yu)1h。在(zai)(zai)(zai)(zai)TBST中(zhong)再沖(chong)(chong)洗90min之后(hou)(hou)，將(jiang)膜(mo)暴(bao)露于SuperSignal West Femto Substrate(Fisher Scientific)5min以檢(jian)測(ce)辣(la)根過氧化物酶產(chan)生的(de)(de)(de)信號(hao)。用肌動(dong)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)特異性抗(kang)(kang)體對膜(mo)進行預(yu)探測(ce)。所有的(de)(de)(de)抗(kang)(kang)體購自(zi)Cell Signaling Technology(Danvers，MA)。DDK抗(kang)(kang)體購自(zi)Origene(Rockville，MD)。

原代MEF中的(de)雙調蛋白(bai)沉默：鼠(shu)Areg shRNA克(ke)隆TRCN0000089050(在(zai)慢(man)(man)(man)病(bing)毒(du)(du)載體pLKO.1中)和pLKO.1中的(de)scramble對(dui)照shRNA(質粒#1864)分別獲得(de)自(zi)Sigma Aldrich(St.Louis，MO)和Addgene(Cambridge，MA)。使用質粒pMDLg/pRRE、pRSV-rev和pMD2.g(Addgene)在(zai)293T/17細胞(ATCC)中產生慢(man)(man)(man)病(bing)毒(du)(du)粒子。在(zai)48h和60h時收集慢(man)(man)(man)病(bing)毒(du)(du)上(shang)清液(ye)，合并上(shang)清液(ye)并通過0.45μm PVDF過濾器(qi)過濾。在(zai)5μg/ml聚凝(ning)胺的(de)存在(zai)下，連續兩天用慢(man)(man)(man)病(bing)毒(du)(du)上(shang)清液(ye)感染MEF兩次，然(ran)后(hou)用嘌(piao)呤(ling)霉(mei)素(2μg/ml)選(xuan)擇72小時，之(zhi)后(hou)用于(yu)下游(you)實驗。

息(xi)肉計(ji)數(shu)和(he)腫瘤面積(ji)——對(dui)從12周(zhou)齡的(de)(de)被安樂(le)死的(de)(de)小鼠中(zhong)摘除的(de)(de)腸道(dao)進(jin)行(xing)沖(chong)洗并將其(qi)固定于10％中(zhong)性(xing)緩沖(chong)福爾馬林中(zhong)至少(shao)24h，進(jin)行(xing)息(xi)肉計(ji)數(shu)或(huo)組織學檢(jian)查。使用(yong)數(shu)字(zi)(zi)掃(sao)描儀NanoZoomer 2.0HT(Hamamatsu，Japan)掃(sao)描H&E染色的(de)(de)載(zai)片。在(zai)解剖顯(xian)微(wei)鏡下對(dui)息(xi)肉直(zhi)接計(ji)數(shu)或(huo)從掃(sao)描的(de)(de)數(shu)字(zi)(zi)圖(tu)像(xiang)進(jin)行(xing)計(ji)數(shu)。值(zhi)得注意的(de)(de)是，所(suo)述兩種(zhong)方法之間息(xi)肉計(ji)數(shu)無顯(xian)著差異。還(huan)使用(yong)NanoZoomer 2.0HT軟件(jian)從掃(sao)描的(de)(de)數(shu)字(zi)(zi)圖(tu)像(xiang)測量腫瘤面積(ji)。

定(ding)(ding)量(liang)實(shi)時PCR(qPCR)——使用 Plus RNA純(chun)化(hua)試(shi)劑盒(Life Technologies，Chicago，IL)，根據制造商的(de)說明書從(cong)皮膚分離純(chun)化(hua)的(de)RNA。用Agilent 2100生物分析儀測定(ding)(ding)純(chun)化(hua)的(de)RNA的(de)質量(liang)。之前已公開(kai)了(le)qPCR循(xun)環條(tiao)件。我們從(cong)Life Technologies(Chicago，IL)獲得以下預(yu)設計的(de)TaqMan基因(yin)表達測定(ding)(ding)的(de)列表，表I。

小(xiao)鼠TNFα和AREG ELISA——對(dui)于(yu)小(xiao)鼠TNFαELISA，對(dui)8-12周齡的所示基因型(xing)的雌性小(xiao)鼠靜脈注射70μg來自大(da)腸桿菌O111:B4的脂多糖(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)。3h之后收集(ji)血清并(bing)冷凍于(yu)-80℃。對(dui)于(yu)AREG ELISA，將(jiang)從所有基因型(xing)采集(ji)的血清立即使用或在-20℃貯存不超過24h。根據(ju)制造商(shang)的說(shuo)明書，使用DuoSet ELISA Developmental試劑盒(R&D Systems，Minneapolis，MN)對(dui)樣(yang)品進行測定(DY989和DY410)。

流式細胞術——使用Lipofectamine^TM LTX試劑，用(yong)600ng HuWt或HuCub或Hu Wt p.I186T cDNA瞬時轉染鋪(pu)于(yu)6孔板中(zhong)的293T和COS7細(xi)胞(bao)。40h之(zhi)(zhi)后(hou)(hou)，在(zai)150μg/ml環己酰(xian)胺(an)中(zhong)孵育細(xi)胞(bao)0、0.5、1、2和4h。之(zhi)(zhi)后(hou)(hou)，在(zai)室(shi)溫下將(jiang)(jiang)細(xi)胞(bao)固定于(yu)150μl新鮮制備的冰冷的4％PFA中(zhong)40min。用(yong)2ml PBST沖洗(xi)細(xi)胞(bao)一次(ci)并在(zai)室(shi)溫下在(zai)黑暗(an)中(zhong)將(jiang)(jiang)細(xi)胞(bao)重(zhong)懸(xuan)于(yu)150μl PBST中(zhong)。再次(ci)沖洗(xi)后(hou)(hou)，將(jiang)(jiang)細(xi)胞(bao)重(zhong)懸(xuan)于(yu)在(zai)冰上的包含藻(zao)紅蛋白標記的抗DDK一級抗體(ti)(1:50)的125μl PBST中(zhong)30min。最后(hou)(hou)一次(ci)沖洗(xi)之(zhi)(zhi)后(hou)(hou)，將(jiang)(jiang)細(xi)胞(bao)重(zhong)懸(xuan)于(yu)FACS緩沖液并進行流式細(xi)胞(bao)術分析(BD FACSCalibur)。

逆轉(zhuan)錄酶PCR(RT-PCR)——根據制造商(shang)的方案使用

RNAqueousTM-4PCR(Ambion)從(cong)MEF中(zhong)提取RNA。使用逆(ni)轉(zhuan)錄(lu)酶(Promega逆(ni)轉(zhuan)錄(lu)系(xi)統，Promega)從(cong)1μg RNA合成cDNA。使用特(te)異(yi)性(xing)引物以(yi)及HotMaster TAQ(5-Prime Inc.)擴增cDNA。

統計(ji)學(xue)分析——使用GraphPad Prism v4(GraphPad Software，San Diego，CA)產生Kaplan-Meier存活曲(qu)線并計(ji)算蛋白(bai)質半(ban)衰(shuai)期(單(dan)相指數(shu)衰(shuai)減方程)。用單(dan)因素ANOVA和t-檢(jian)驗測定統計(ji)學(xue)上(shang)的(de)差異。小(xiao)于0.05P值的(de)被認為是統計(ji)學(xue)上(shang)顯著的(de)。

項

1.一(yi)種鑒(jian)定(ding)化合物的(de)方法(fa)，所述化合物激活iRhom多肽(tai)對底物的(de)蛋白水解活性，所述方法(fa)包括：

a)使表達(da)iRhom多肽的細胞與測(ce)試化合物接(jie)觸；以(yi)及(ji)

b)測定iRhom多肽(tai)穩(wen)定性相對(dui)于合適對(dui)照(zhao)的(de)(de)增(zeng)加，其中iRhom多肽(tai)穩(wen)定性的(de)(de)增(zeng)加表明所述(shu)化合物激活iRhom多肽(tai)對(dui)底(di)物的(de)(de)蛋白水解活性。

2.第1項的方法，其中通過分析暴(bao)露于所述(shu)化合物之后iRhom多肽的半衰期(qi)來測(ce)定iRhom多肽穩定性的增加。

3.第1項(xiang)的方法，其中所述底物(wu)是EGFR配(pei)體(ti)或EGF樣底物(wu)。

4.第1項的方法，其中通過檢測EGFR配(pei)體(ti)分泌的增(zeng)加來測定所述iRhom多肽穩(wen)定性的增(zeng)加。

5.第4項的方法，其中所述EGFR配體選自AREG、HB-EGF、TGFα和EPGN。

6.第1項的(de)方法，其中通過檢測可溶(rong)性EGFR配體水平的(de)提高(gao)來(lai)測定iRhom多(duo)肽穩定性的(de)增加。

7.第6項(xiang)的方法，其中所述EGFR配體選自(zi)AREG、HB-EGF、TGFα和(he)EPGN。

8.第1項的(de)方法，其中(zhong)通過檢測(ce)EGFR信號傳導活性來測(ce)定iRhom多肽穩定性的(de)增加。

9.第1項的方(fang)法，其中所述(shu)化合(he)物抑制iRhom多肽和蛋(dan)白酶(mei)體之(zhi)間的相互作用(yong)。

10.第1項的方法，其(qi)中所述化合物(wu)使(shi)iRhom多肽的胞質結(jie)構(gou)域(yu)失活。

11.第10項的方法，其中所述胞質(zhi)結(jie)構域的失(shi)活是短暫的。

12.第(di)1項的(de)(de)方法，其中所述(shu)化合(he)物使iRhom多(duo)肽的(de)(de)胞質結構域裂解和(he)/或缺失，以使所述(shu)多(duo)肽具有(you)蛋白水(shui)解活(huo)性或改(gai)變的(de)(de)生物活(huo)性。

13.第(di)12項的方法，其中小鼠iRhom2在(zai)第(di)1和268位氨基(ji)(ji)酸殘(can)基(ji)(ji)之間被(bei)裂(lie)解，或人iRhom2在(zai)第(di)1和298位氨基(ji)(ji)酸殘(can)基(ji)(ji)之間被(bei)裂(lie)解。

14.第(di)12項的方法，其(qi)中小鼠iRhom1在第(di)1和272位氨基(ji)酸殘(can)基(ji)之間(jian)被裂解，或(huo)人(ren)iRhom1在第(di)1和316位氨基(ji)酸殘(can)基(ji)之間(jian)被裂解。

15.第(di)1項的方法，其(qi)中所述化合物激活iRhom多肽的肽酶(mei)域。

16.第(di)1-15項(xiang)中任(ren)一項(xiang)的方法，其中所述iRhom多肽是iRhom1或(huo)iRhom2。

17.第(di)15項的方法，其(qi)中(zhong)所(suo)述iRhom多(duo)肽是(shi)人或(huo)小鼠iRhom多(duo)肽。

18.第1項(xiang)的方法(fa)，其(qi)中(zhong)所(suo)述化(hua)合物選自小分子、肽(tai)或多肽(tai)誘餌。

19.第18項的方法(fa)，其中所述化合(he)物連接至細(xi)胞穿透肽。

20.第1項的方法，其(qi)中所述化(hua)合物加速角化(hua)細胞的遷(qian)移(yi)。

21.第(di)1項的方(fang)法，其中(zhong)所述化合物加速成纖維細胞的增(zeng)殖。

22.第1項的方(fang)法，其中所述(shu)化合物是細胞可透過性(xing)的。

23.第1項(xiang)的方法，其中所述化合物是泛素(su)蛋白酶(mei)抑制劑(ji)。

24.一種(zhong)鑒(jian)定化(hua)合物的(de)方(fang)法(fa)，所述(shu)化(hua)合物抑(yi)制iRhom多肽對底物的(de)蛋(dan)白水解(jie)活性(xing)，所述(shu)方(fang)法(fa)包括：

a)使表達iRhom多肽的(de)細胞與測試(shi)化合物(wu)接觸；和

b)測定iRhom多(duo)(duo)肽(tai)(tai)的(de)生理靶標(biao)的(de)分泌(mi)相(xiang)對(dui)(dui)于(yu)(yu)合(he)適對(dui)(dui)照的(de)減少，或EGFR活(huo)性相(xiang)對(dui)(dui)于(yu)(yu)合(he)適對(dui)(dui)照的(de)降(jiang)低(di)，其中iRhom多(duo)(duo)肽(tai)(tai)的(de)生理靶標(biao)分泌(mi)的(de)減少或EGFR活(huo)性的(de)降(jiang)低(di)表明(ming)所述(shu)化合(he)物(wu)抑制iRhom多(duo)(duo)肽(tai)(tai)對(dui)(dui)底物(wu)的(de)蛋白水解活(huo)性。

25.第25項(xiang)的方法，其中所述底物是EGFR配體或EGF樣底物。

26.第(di)24項(xiang)的(de)方法，其中通過檢(jian)測(ce)iRhom多(duo)(duo)肽的(de)生理靶標分泌的(de)減少來(lai)測(ce)定對iRhom多(duo)(duo)肽蛋白水(shui)解活性(xing)的(de)抑制。

27.第26項的方法(fa)，其中所(suo)述iRhom多肽的生(sheng)理靶(ba)標是EGFR配體。

28.第27項(xiang)的(de)方法(fa)，其中所述(shu)EGFR配體選自AREG、HB-EGF、TGFα和EPGN。

29.第24項的(de)方法，其中通過(guo)檢測(ce)可溶性(xing)EGFR配體水平的(de)降低來測(ce)定對iRhom多肽蛋(dan)白水解活性(xing)的(de)抑(yi)制。

30.第29項的方法，其(qi)中所(suo)述EGFR配體(ti)選(xuan)自(zi)AREG、HB-EGF、TGFα和EPGN。

31.第24項的(de)方法(fa)，其(qi)中通過(guo)檢測EGFR活(huo)性的(de)降低(di)來(lai)測定(ding)對(dui)iRhom多肽的(de)蛋(dan)白水解活(huo)性的(de)抑制。

32.第24項的方(fang)法，其中所述化(hua)合物(wu)抑(yi)制iRhom多肽的肽酶域(yu)。

33.第24項的(de)方法，其中(zhong)(zhong)所(suo)述化合(he)物(wu)通(tong)過使iRhom多肽肽酶域的(de)蛋白(bai)水解(jie)位(wei)點中(zhong)(zhong)的(de)一個(ge)或多個(ge)氨基(ji)酸(suan)殘基(ji)失活(huo)來影響iRhom多肽的(de)活(huo)性(xing)。

34.第(di)33項(xiang)的(de)方法，其中所述(shu)iRhom多肽是小(xiao)鼠iRhom2并且所述(shu)化(hua)合物使(shi)小(xiao)鼠iRhom2的(de)蛋白水解位點中的(de)一個或多個氨(an)(an)基(ji)酸(suan)(suan)(suan)殘基(ji)失活，所述(shu)氨(an)(an)基(ji)酸(suan)(suan)(suan)殘基(ji)選自TM螺(luo)(luo)旋2上的(de)第(di)635位組(zu)氨(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)、TM螺(luo)(luo)旋4上的(de)第(di)695位谷(gu)氨(an)(an)酰(xian)胺(an)、跨(kua)膜螺(luo)(luo)旋4上的(de)第(di)701位半胱氨(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)和(he)TM螺(luo)(luo)旋6上的(de)第(di)744位組(zu)氨(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)。

35.第(di)33項的(de)方法，其中所述iRhom多(duo)肽是人(ren)iRhom2并且(qie)所述化合物使人(ren)iRhom2的(de)蛋白水解位(wei)點中的(de)一個(ge)或多(duo)個(ge)氨(an)基酸(suan)殘(can)基失活，所述氨(an)基酸(suan)殘(can)基選自TM螺旋(xuan)2上(shang)的(de)第(di)664位(wei)組氨(an)酸(suan)、TM螺旋(xuan)4上(shang)的(de)第(di)724位(wei)谷(gu)氨(an)酰胺、跨膜螺旋(xuan)4上(shang)的(de)第(di)730位(wei)半胱氨(an)酸(suan)和(he)TM螺旋(xuan)6上(shang)的(de)第(di)773位(wei)組氨(an)酸(suan)。

36.第24-33項中任一項的方法(fa)，其中所述iRhom家族成員為iRhom1或iRhom2。

37.第33項的方法，其中所述(shu)iRhom家族成員(yuan)是人(ren)或小鼠iRhom家族成員(yuan)。

38.第24項的方(fang)法，其中所述(shu)化(hua)合物選(xuan)自小分子、肽或多肽誘餌(er)。

39.第38項的方法，其(qi)中所述化合物(wu)連接至(zhi)細胞穿透肽。

40.第(di)24項(xiang)的方法(fa)，其(qi)中所(suo)述化合(he)物(wu)是細胞可(ke)透過性的。

41.一種(zhong)鑒定化合(he)物的(de)(de)(de)方(fang)(fang)法(fa)，所(suo)述(shu)(shu)化合(he)物能夠在受試者中(zhong)加(jia)速傷口(kou)(kou)愈合(he)或組織修復，所(suo)述(shu)(shu)方(fang)(fang)法(fa)包括：a)使表達iRhom多肽(tai)和(he)EGFR配(pei)體(ti)的(de)(de)(de)細胞與測試化合(he)物接觸；b)測定iRhom多肽(tai)穩(wen)定性(xing)相對(dui)于合(he)適對(dui)照的(de)(de)(de)增(zeng)加(jia)；和(he)c)測定細胞分(fen)(fen)泌(mi)的(de)(de)(de)EGFR配(pei)體(ti)相對(dui)于合(he)適對(dui)照的(de)(de)(de)增(zeng)加(jia)，其中(zhong)iRhom多肽(tai)穩(wen)定性(xing)的(de)(de)(de)增(zeng)加(jia)和(he)細胞分(fen)(fen)泌(mi)的(de)(de)(de)EGFR配(pei)體(ti)的(de)(de)(de)增(zeng)加(jia)表明所(suo)述(shu)(shu)化合(he)物能夠加(jia)速傷口(kou)(kou)愈合(he)。

42.第41項的方法，其中所(suo)述(shu)iRhom家族成員是iRhom1或iRhom2。

43.第41項的(de)方法，其(qi)中所述iRhom家族(zu)成(cheng)員(yuan)是人或小鼠iRhom家族(zu)成(cheng)員(yuan)。

44.一種鑒(jian)定化(hua)(hua)合(he)物(wu)的(de)(de)方法，所(suo)述化(hua)(hua)合(he)物(wu)能夠在(zai)(zai)受試(shi)(shi)者中(zhong)(zhong)降低腫(zhong)(zhong)瘤(liu)生長(chang)和(he)/或(huo)(huo)進展或(huo)(huo)治療癌癥(zheng)，所(suo)述方法包括：a)使表達iRhom多肽的(de)(de)細胞(bao)與測(ce)試(shi)(shi)化(hua)(hua)合(he)物(wu)接觸；和(he)b)測(ce)定iRhom多肽的(de)(de)生理(li)靶標的(de)(de)分泌(mi)相對于(yu)合(he)適(shi)對照(zhao)的(de)(de)減少(shao)或(huo)(huo)EGFR活(huo)性(xing)相對于(yu)合(he)適(shi)對照(zhao)的(de)(de)降低，其中(zhong)(zhong)iRhom多肽的(de)(de)生理(li)靶標分泌(mi)的(de)(de)減少(shao)或(huo)(huo)EGFR活(huo)性(xing)的(de)(de)降低表明(ming)所(suo)述化(hua)(hua)合(he)物(wu)能夠在(zai)(zai)受試(shi)(shi)者中(zhong)(zhong)降低腫(zhong)(zhong)瘤(liu)生長(chang)和(he)/或(huo)(huo)進展或(huo)(huo)治療癌癥(zheng)。

45.第44項的方法，其中所述腫瘤是實體瘤。

46.第44項的(de)方法，其中所述癌(ai)(ai)癥是上(shang)皮癌(ai)(ai)。

47.第(di)44項的方法(fa)，其中(zhong)所述癌(ai)(ai)(ai)(ai)(ai)癥是食管癌(ai)(ai)(ai)(ai)(ai)、肺癌(ai)(ai)(ai)(ai)(ai)、腦癌(ai)(ai)(ai)(ai)(ai)、結腸癌(ai)(ai)(ai)(ai)(ai)、腎(shen)癌(ai)(ai)(ai)(ai)(ai)、前列腺(xian)(xian)癌(ai)(ai)(ai)(ai)(ai)、皮膚癌(ai)(ai)(ai)(ai)(ai)、肝癌(ai)(ai)(ai)(ai)(ai)、胰(yi)腺(xian)(xian)癌(ai)(ai)(ai)(ai)(ai)、胃癌(ai)(ai)(ai)(ai)(ai)、子(zi)宮(gong)癌(ai)(ai)(ai)(ai)(ai)、卵巢癌(ai)(ai)(ai)(ai)(ai)、乳(ru)腺(xian)(xian)癌(ai)(ai)(ai)(ai)(ai)、淋巴腺(xian)(xian)癌(ai)(ai)(ai)(ai)(ai)或膀胱癌(ai)(ai)(ai)(ai)(ai)。

48.一種鑒定(ding)化合物的方(fang)法，所述化合物抑制iRhom多(duo)(duo)(duo)肽(tai)的胞質(zhi)結(jie)(jie)構域(yu)，所述方(fang)法包括(kuo)：a)使表達iRhom多(duo)(duo)(duo)肽(tai)的細(xi)胞與測試化合物接(jie)觸；b)測定(ding)iRhom多(duo)(duo)(duo)肽(tai)穩定(ding)性相對于(yu)合適對照的增(zeng)加(jia)，其中iRhom多(duo)(duo)(duo)肽(tai)穩定(ding)性的增(zeng)加(jia)表明所述化合物抑制iRhom多(duo)(duo)(duo)肽(tai)的胞質(zhi)結(jie)(jie)構域(yu)。

49.第44-48項中任(ren)一項的方法，其中所述iRhom家族成員是iRhom1或iRhom2。

50.第(di)44-48項中(zhong)任一項的方法，其(qi)中(zhong)所述iRhom家(jia)族成(cheng)員是人(ren)或小鼠(shu)iRhom家(jia)族成(cheng)員。

51.第41項的方法，其(qi)(qi)中(zhong)所述化合物(wu)(wu)選自小分(fen)子(zi)(zi)、多(duo)肽誘(you)餌、miRNA分(fen)子(zi)(zi)、siRNA分(fen)子(zi)(zi)、shRNA分(fen)子(zi)(zi)、dsRNA分(fen)子(zi)(zi)、反義分(fen)子(zi)(zi)、特異性針對Rhbdf2的核(he)酶；或(huo)編(bian)碼miRNA、siRNA、shRNA、dsRNA的多(duo)聚核(he)苷酸；或(huo)其(qi)(qi)各自的生物(wu)(wu)等價物(wu)(wu)。

52.一種分離(li)的多(duo)肽，其包含變體iRhom多(duo)肽。

53.一種分(fen)離的多肽，其包含細胞溶質N-末端結(jie)構域缺失的人iRhom2。

54.一種分離的多肽，其(qi)包含細胞溶(rong)質N-末端結構(gou)域缺失的小鼠iRhom2。

55.一(yi)種分離(li)的(de)(de)小鼠iRhom2多肽，其在小鼠iRhom2的(de)(de)蛋白水解位(wei)點中的(de)(de)一(yi)個或多個氨(an)基酸殘基處(chu)包含(han)突(tu)變(bian)，所述氨(an)基酸殘基選自(zi)TM螺(luo)旋(xuan)2上(shang)的(de)(de)第635位(wei)組(zu)氨(an)酸、TM螺(luo)旋(xuan)4上(shang)的(de)(de)第695位(wei)谷氨(an)酰(xian)胺、TM螺(luo)旋(xuan)4上(shang)的(de)(de)第701位(wei)半(ban)胱氨(an)酸和TM螺(luo)旋(xuan)6上(shang)的(de)(de)第744位(wei)組(zu)氨(an)酸。

56.一(yi)種分離的(de)(de)(de)人iRhom2多肽(tai)，其在人iRhom2的(de)(de)(de)蛋白(bai)水解位(wei)點中(zhong)的(de)(de)(de)一(yi)個或多個氨基酸(suan)殘(can)基處包含(han)突變，所(suo)述氨基酸(suan)殘(can)基選自TM螺(luo)旋2上(shang)的(de)(de)(de)第(di)664位(wei)組氨酸(suan)、TM螺(luo)旋4上(shang)的(de)(de)(de)第(di)724位(wei)谷氨酰胺、TM螺(luo)旋4上(shang)的(de)(de)(de)第(di)730位(wei)半胱氨酸(suan)和(he)TM螺(luo)旋6上(shang)的(de)(de)(de)第(di)773位(wei)組氨酸(suan)。

57.一種分離的核酸分子(zi)，其(qi)編碼第52-56項(xiang)中(zhong)任一項(xiang)的多肽。

58.一(yi)種載體，其包含第57項的核酸分子。

59.一種(zhong)宿主細胞，其(qi)表達(da)第58項的載體。

60.一種(zhong)鑒(jian)定化合(he)(he)物的(de)(de)方(fang)法(fa)，所述化合(he)(he)物能(neng)夠在受(shou)試者(zhe)中促進毛發(fa)(fa)生(sheng)長，所述方(fang)法(fa)包(bao)括：a)使表(biao)達(da)iRhom多(duo)肽的(de)(de)細胞與測(ce)試化合(he)(he)物接觸；和(he)b)測(ce)定iRhom多(duo)肽的(de)(de)生(sheng)理靶標的(de)(de)分泌相(xiang)(xiang)對(dui)(dui)于(yu)(yu)合(he)(he)適對(dui)(dui)照(zhao)的(de)(de)減(jian)少或EGFR活性相(xiang)(xiang)對(dui)(dui)于(yu)(yu)合(he)(he)適對(dui)(dui)照(zhao)的(de)(de)降低(di)，其中iRhom多(duo)肽的(de)(de)生(sheng)理靶標分泌的(de)(de)減(jian)少或EGFR活性的(de)(de)降低(di)表(biao)明所述化合(he)(he)物能(neng)夠在受(shou)試者(zhe)中促進毛發(fa)(fa)生(sheng)長。

序列

小鼠iRhom2蛋(dan)白(bai)序列全(quan)長(chang)SEQ ID NO：1

MASADKNGSNLPSVSGSRLQSRKPPNLSITIPPPESQAPGEQDSMLPERRKNPAYLKSVSLQEPRGRWQEGAEKRPGFRRQASLSQSIRKSTAQWFGVSGDWEGKRQNWHRRSLHHCSVHYGRLKASCQRELELPSQEVPSFQGTESPKPCKMPKIVDPLARGRAFRHPDEVDRPHAAHPPLTPGVLSLTSFTSVRSGYSHLPRRKRISVAHMSFQAAAALLKGRSVLDATGQRCRHVKRSFAYPSFLEEDAVDGADTFDSSFFSKEEMSSMPDDVFESPPLSASYFRGVPHSASPVSPDGVHIPLKEYSGGRALGPGTQRGKRIASKVKHFAFDRKKRHYGLGVVGNWLNRSYRRSISSTVQRQLESFDSHRPYFTYWLTFVHIIITLLVICTYGIAPVGFAQHVTTQLVLKNRGVYESVKYIQQENFWIGPSSIDLIHLGAKFSPCIRKDQQIEQLVRRERDIERTSGCCVQNDRSGCIQTLKKDCSETLATFVKWQNDTGPSDKSDLSQKQPSAVVCHQDPRTCEEPASSGAHIWPDDITKWPICTEQAQSNHTGLLHIDCKIKGRPCCIGTKGSCEITTREYCEFMHGYFHEDATLCSQVHCLDKVCGLLPFLNPEVPDQFYRIWLSLFLHAGIVHCLVSVVFQMTILRDLEKLAGWHRISIIFILSGITGNLASAIFLPYRAEVGPAGSQFGLLACLFVELFQSWQLLERPWKAFFNLSAIVLFLFICGLLPWIDNIAHIFGFLSGMLLAFAFLPYITFGTSDKYRKRALILVSLLVFAGLFASLVLWLYIYPINWPWIEYLTCFPFTSRFCEKYELDQVLH

Rhbdf2^cub小鼠突變SEQ ID NO：2

MSSMPDDVFESPPLSASYFRGVPHSASPVSPDGVHIPLKEYSGGRALGPGTQRGKRIASKVKHFAFDRKKRHYGLGVVGNWLNRSYRRSISSTVQRQLESFDSHRPYFTYWLTFVHIIITLLVICTYGIAPVGFAQHVTTQLVLKNRGVYESVKYIQQENFWIGPSSIDLIHLGAKFSPCIRKDQQIEQLVRRERDIERTSGCCVQNDRSGCIQTLKKDCSETLATFVKWQNDTGPSDKSDLSQKQPSAVVCHQDPRTCEEPASSGAHIWPDDITKWPICTEQAQSNHTGLLHIDCKIKGRPCCIGTKGSCEITTREYCEFMHGYFHEDATLCSQVHCLDKVCGLLPFLNPEVPDQFYRIWLSLFLHAGIVHCLVSVVFQMTILRDLEKLAGWHRISIIFILSGITGNLASAIFLPYRAEVGPAGSQFGLLACLFVELFQSWQLLERPWKAFFNLSAIVLFLFICGLLPWIDNIAHIFGFLSGMLLAFAFLPYITFGTSDKYRKRALILVSLLVFAGLFASLVLWLYIYPINWPWIEYLTCFPFTSRFCEKYELDQVLH

小(xiao)鼠(shu)iRhom1蛋白(bai)序列全(quan)長SEQ ID NO：3

MSEARRDSTSSLQRKKPPWLKLDIPAAVPPAAEEPSFLQPLRRQAFLRSVSMPAETARVPSPHHEPRRLVLQRQTSITQTIRRGTADWFGVSKDSDSTQKWQRKSIRHCSQRYGKLKPQVIRELDLPSQDNVSLTSTETPPPLYVGPCQLGMQKIIDPLARGRAFRMADDTADGLSAPHTPVTPGAASLCSFSSSRSGFNRLPRRRKRESVAKMSFRAAAALVKGRSIRDGTLRRGQRRSFTPASFLEEDMVDFPDELDTSFFAREGVLHEEMSTYPDEVFESPSEAALKDWEKAPDQADLTGGALDRSELERSHLMLPLERGWRKQKEGGPLAPQPKVRLRQEVVSAAGPRRGQRIAVPVRKLFAREKRPYGLGMVGRLTNRTYRKRIDSYVKRQIEDMDDHRPFFTYWLTFVHSLVTILAVCIYGIAPVGFSQHETVDSVLRKRGVYENVKYVQQENFWIGPSSEALIHLGAKFSPCMRQDPQVHSFILAAREREKHSACCVRNDRSGCVQTSKEECSSTLAVWVKWPVHPSAPDLAGNKRQFGSVCHQDPRVCDEPSSEDPHEWPEDITKWPICTKSSAGNHTNHPHMDCVITGRPCCIGTKGRCEITSREYCDFMRGYFHEEATLCSQVHCMDDVCGLLPFLNPEVPDQFYRLWLSLFLHAGILHCLVSVCFQMTVLRDLEKLAGWHRIAIIYLLSGITGNLASAIFLPYRAEVGPAGSQFGILACLFVELFQSWQILARPWRAFFKLLAVVLFLFAFGLLPWIDNFAHISGFVSGLFLSFAFLPYISFGKFDLYRKRCQIIIFQVVFLGLLAGLVVLFYFYPVRCEWCEFLTCIPFTDKFCEKYELDAQLH

小鼠iRhom1 N-末端截短的蛋白序列(等價于Rhbdf2^cub突變——無細胞(bao)溶質結構(gou)域(yu)但保留跨(kua)膜(mo)肽酶域(yu))SEQ ID NO：4

MSTYPDEVFESPSEAALKDWEKAPDQADLTGGALDRSELERSHLMLPLERGWRKQKEGGPLAPQPKVRLRQEVVSAAGPRRGQRIAVPVRKLFAREKRPYGLGMVGRLTNRTYRKRIDSYVKRQIEDMDDHRPFFTYWLTFVHSLVTILAVCIYGIAPVGFSQHETVDSVLRKRGVYENVKYVQQENFWIGPSSEALIHLGAKFSPCMRQDPQVHSFILAAREREKHSACCVRNDRSGCVQTSKEECSSTLAVWVKWPVHPSAPDLAGNKRQFGSVCHQDPRVCDEPSSEDPHEWPEDITKWPICTKSSAGNHTNHPHMDCVITGRPCCIGTKGRCEITSREYCDFMRGYFHEEATLCSQVHCMDDVCGLLPFLNPEVPDQFYRLWLSLFLHAGILHCLVSVCFQMTVLRDLEKLAGWHRIAIIYLLSGITGNLASAIFLPYRAEVGPAGSQFGILACLFVELFQSWQILARPWRAFFKLLAVVLFLFAFGLLPWIDNFAHISGFVSGLFLSFAFLPYISFGKFDLYRKRCQIIIFQVVFLGLLAGLVVLFYFYPVRCEWCEFLTCIPFTDKFCEKYELDAQLH

人iRhom2蛋白序列全長SEQ ID NO：5

MASADKNGGSVSSVSSSRLQSRKPPNLSITIPPPEKETQAPGEQDSMLPEGFQNRRLKKSQPRTWAAHTTACPPSFLPKRKNPAYLKSVSLQEPRSRWQESSEKRPGFRRQASLSQSIRKGAAQWFGVSGDWEGQRQQWQRRSLHHCSMRYGRLKASCQRDLELPSQEAPSFQGTESPKPCKMPKIVDPLARGRAFRHPEEMDRPHAPHPPLTPGVLSLTSFTSVRSGYSHLPRRKRMSVAHMSLQAAAALLKGRSVLDATGQRCRVVKRSFAFPSFLEEDVVDGADTFDSSFFSKEEMSSMPDDVFESPPLSASYFRGIPHSASPVSPDGVQIPLKEYGRAPVPGPRRGKRIASKVKHFAFDRKKRHYGLGVVGNWLNRSYRRSISSTVQRQLESFDSHRPYFTYWLTFVHVIITLLVICTYGIAPVGFAQHVTTQLVLRNKGVYESVKYIQQENFWVGPSSIDLIHLGAKFSPCIRKDGQIEQLVLRERDLERDSGCCVQNDHSGCIQTQRKDCSETLATFVKWQDDTGPPMDKSDLGQKRTSGAVCHQDPRTCEEPASSGAHIWPDDITKWPICTEQARSNHTGFLHMDCEIKGRPCCIGTKGSCEITTREYCEFMHGYFHEEATLCSQVHCLDKVCGLLPFLNPEVPDQFYRLWLSLFLHAGVVHCLVSVVFQMTILRDLEKLAGWHRIAIIFILSGITGNLASAIFLPYRAEVGPAGSQFGLLACLFVELFQSWPLLERPWKAFLNLSAIVLFLFICGLLPWIDNIAHIFGFLSGLLLAFAFLPYITFGTSDKYRKRALILVSLLAFAGLFAALVLWLYIYPINWPWIEHLTCFPFTSRFCEKYELDQVLH

人截短的iRhom2(等價于Rhbdf2^cub突變——無細胞溶質結構域(yu)但保(bao)留(liu)跨膜(mo)肽酶域(yu))SEQ ID NO：6

MSSMPDDVFESPPLSASYFRGIPHSASPVSPDGVQIPLKEYGRAPVPGPRRGKRIASKVKHFAFDRKKRHYGLGVVGNWLNRSYRRSISSTVQRQLESFDSHRPYFTYWLTFVHVIITLLVICTYGIAPVGFAQHVTTQLVLRNKGVYESVKYIQQENFWVGPSSIDLIHLGAKFSPCIRKDGQIEQLVLRERDLERDSGCCVQNDHSGCIQTQRKDCSETLATFVKWQDDTGPPMDKSDLGQKRTSGAVCHQDPRTCEEPASSGAHIWPDDITKWPICTEQARSNHTGFLHMDCEIKGRPCCIGTKGSCEITTREYCEFMHGYFHEEATLCSQVHCLDKVCGLLPFLNPEVPDQFYRLWLSLFLHAGVVHCLVSVVFQMTILRDLEKLAGWHRIAIIFILSGITGNLASAIFLPYRAEVGPAGSQFGLLACLFVELFQSWPLLERPWKAFLNLSAIVLFLFICGLLPWIDNIAHIFGFLSGLLLAFAFLPYITFGTSDKYRKRALILVSLLAFAGLFAALVLWLYIYPINWPWIEHLTCFPFTSRFCEKYELDQVLH

人iRhom1蛋白序列全長SEQ ID NO：7

MSEARRDSTSSLQRKKPPWLKLDIPSAVPLTAEEPSFLQPLRRQAFLRSVSMPAETAHISSPHHELRRPVLQRQTSITQTIRRGTADWFGVSKDSDSTQKWQRKSIRHCSQRYGKLKPQVLRELDLPSQDNVSLTSTETPPPLYVGPCQLGMQKIIDPLARGRAFRVADDTAEGLSAPHTPVTPGAASLCSFSSSRSGFHRLPRRRKRESVAKMSFRAAAALMKGRSVRDGTFRRAQRRSFTPASFLEEDTTDFPDELDTSFFAREGILHEELSTYPDEVFESPSEAALKDWEKAPEQAD

LTGGALDRSELERSHLMLPLERGWRKQKEGAAAPQPKVRLRQEVVSTAGPRRGQRIAVPVRKLFAREKRPYGLGMVGRLTNRTYRKRIDSFVKRQIEDMDDHRPFFTYWLTFVHSLVTILAVCIYGIAPVGFSQHETVDSVLRNRGVYENVKYVQQENFWIGPSSEALIHLGAKFSPCMRQDPQVHSFIRSAREREKHSACCVRNDRSGCVQTSEEECSSTLAVWVKWPIHPSAPELAGHKRQFGSVCHQDPRVCDEPSSEDPHEWPEDITKWPICTKNSAGNHTNHPHMDCVITGRPCCIGTKGRCEITSREYCDFMRGYFHEEATLCSQVHCMDDVCGLLPFLNPEVPDQFYRLWLSLFLHAGILHCLVSICFQMTVLRDLEKLAGWHRIAIIYLLSGVTGNLASAIFLPYRAEVGPAGSQFGILACLFVELFQSWQILARPWRAFFKLLAVVLFLFTFGLLPWIDNFAHISGFISGLFLSFAFLPYISFGKFDLYRKRCQIIIFQVVFLGLLAGLVVLFYVYPVRCEWCEFLTCIPFTDKFCEKYELDAQLH

人iRhom1 N-末端截短的蛋白序列(等價于Rhbdf2^cub突變——無(wu)細胞溶質結構域但保留跨膜肽(tai)酶域)SEQ ID NO：8

MLPLERGWRKQKEGAAAPQPKVRLRQEVVSTAGPRRGQRIAVPVRKLFAREKRPYGLGMVGRLTNRTYRKRIDSFVKRQIEDMDDHRPFFTYWLTFVHSLVTILAVCIYGIAPVGFSQHETVDSVLRNRGVYENVKYVQQENFWIGPSSEALIHLGAKFSPCMRQDPQVHSFIRSAREREKHSACCVRNDRSGCVQTSEEECSSTLAVWVKWPIHPSAPELAGHKRQFGSVCHQDPRVCDEPSSEDPHEWPEDITKWPICTKNSAGNHTNHPHMDCVITGRPCCIGTKGRCEITSREYCDFMRGYFHEEATLCSQVHCMDDVCGLLPFLNPEVPDQFYRLWLSLFLHAGILHCLVSICFQMTVLRDLEKLAGWHRIAIIYLLSGVTGNLASAIFLPYRAEVGPAGSQFGILACLFVELFQSWQILARPWRAFFKLLAVVLFLFTFGLLPWIDNFAHISGFISGLFLSFAFLPYISFGKFDLYRKRCQIIIFQVVFLGLLAGLVVLFYVYPVRCEWCEFLTCIPFTDKFCEKYELDAQLH

本(ben)領域技(ji)術人員(yuan)會理解(jie)或僅使用常規實驗即能夠(gou)確定本(ben)文(wen)所(suo)述的本(ben)發明的具體實施方(fang)案(an)的許多(duo)等(deng)同(tong)方(fang)案(an)。這樣的等(deng)同(tong)方(fang)案(an)意欲包含(han)于以下權利要(yao)求中。

序列表

<110> The Jackson Laboratory

<120> 鑒定改(gai)變iRhom多肽活性(xing)的化合物的方(fang)法及(ji)其用(yong)途

<130> JLA-11352/47

<150> 61/991,423

<151> 2014-05-09

<150> 61/992,152

<151> 2014-05-12

<160> 90

<170> PatentIn版本(ben)3.5

<210> 1

<211> 827

<212> PRT

<213> 小家(jia)鼠（Mus musculus）

<400> 1

Met Ala Ser Ala Asp Lys Asn Gly Ser Asn Leu Pro Ser Val Ser Gly

1 5   10 15

Ser Arg Leu Gln Ser Arg Lys Pro Pro Asn Leu Ser Ile Thr Ile Pro

20  25 30

Pro Pro Glu Ser Gln Ala Pro Gly Glu Gln Asp Ser Met Leu Pro Glu

35 40  45

Arg Arg Lys Asn Pro Ala Tyr Leu Lys Ser Val Ser Leu Gln Glu Pro

50  55 60

Arg Gly Arg Trp Gln Glu Gly Ala Glu Lys Arg Pro Gly Phe Arg Arg

65  70 75 80

Gln Ala Ser Leu Ser Gln Ser Ile Arg Lys Ser Thr Ala Gln Trp Phe

85 90  95

Gly Val Ser Gly Asp Trp Glu Gly Lys Arg Gln Asn Trp His Arg Arg

100 105  110

Ser Leu His His Cys Ser Val His Tyr Gly Arg Leu Lys Ala Ser Cys

115 120 125

Gln Arg Glu Leu Glu Leu Pro Ser Gln Glu Val Pro Ser Phe Gln Gly

 130  135 140

Thr Glu Ser Pro Lys Pro Cys Lys Met Pro Lys Ile Val Asp Pro Leu

145 150 155  160

Ala Arg Gly Arg Ala Phe Arg His Pro Asp Glu Val Asp Arg Pro His

165 170  175

Ala Ala His Pro Pro Leu Thr Pro Gly Val Leu Ser Leu Thr Ser Phe

180  185  190

Thr Ser Val Arg Ser Gly Tyr Ser His Leu Pro Arg Arg Lys Arg Ile

195  200 205

Ser Val Ala His Met Ser Phe Gln Ala Ala Ala Ala Leu Leu Lys Gly

210 215 220

Arg Ser Val Leu Asp Ala Thr Gly Gln Arg Cys Arg His Val Lys Arg

225 230 235  240

Ser Phe Ala Tyr Pro Ser Phe Leu Glu Glu Asp Ala Val Asp Gly Ala

245  250 255

Asp Thr Phe Asp Ser Ser Phe Phe Ser Lys Glu Glu Met Ser Ser Met

 260 265  270

Pro Asp Asp Val Phe Glu Ser Pro Pro Leu Ser Ala Ser Tyr Phe Arg

275  280  285

Gly Val Pro His Ser Ala Ser Pro Val Ser Pro Asp Gly Val His Ile

290   295 300

Pro Leu Lys Glu Tyr Ser Gly Gly Arg Ala Leu Gly Pro Gly Thr Gln

305  310 315 320

Arg Gly Lys Arg Ile Ala Ser Lys Val Lys His Phe Ala Phe Asp Arg

325 330 335

Lys Lys Arg His Tyr Gly Leu Gly Val Val Gly Asn Trp Leu Asn Arg

340 345  350

Ser Tyr Arg Arg Ser Ile Ser Ser Thr Val Gln Arg Gln Leu Glu Ser

355  360 365

Phe Asp Ser His Arg Pro Tyr Phe Thr Tyr Trp Leu Thr Phe Val His

370 375  380

Ile Ile Ile Thr Leu Leu Val Ile Cys Thr Tyr Gly Ile Ala Pro Val

385 390 395  400

Gly Phe Ala Gln His Val Thr Thr Gln Leu Val Leu Lys Asn Arg Gly

405 410  415

Val Tyr Glu Ser Val Lys Tyr Ile Gln Gln Glu Asn Phe Trp Ile Gly

420 425 430 

Pro Ser Ser Ile Asp Leu Ile His Leu Gly Ala Lys Phe Ser Pro Cys

435 440 445

Ile Arg Lys Asp Gln Gln Ile Glu Gln Leu Val Arg Arg Glu Arg Asp

450  455 460 

Ile Glu Arg Thr Ser Gly Cys Cys Val Gln Asn Asp Arg Ser Gly Cys

465  470 475 480

Ile Gln Thr Leu Lys Lys Asp Cys Ser Glu Thr Leu Ala Thr Phe Val

485  490 495

Lys Trp Gln Asn Asp Thr Gly Pro Ser Asp Lys Ser Asp Leu Ser Gln

500  505 510

Lys Gln Pro Ser Ala Val Val Cys His Gln Asp Pro Arg Thr Cys Glu

515  520 525

Glu Pro Ala Ser Ser Gly Ala His Ile Trp Pro Asp Asp Ile Thr Lys

530  535  540

Trp Pro Ile Cys Thr Glu Gln Ala Gln Ser Asn His Thr Gly Leu Leu

545 550  555 560

His Ile Asp Cys Lys Ile Lys Gly Arg Pro Cys Cys Ile Gly Thr Lys

 565 570 575

Gly Ser Cys Glu Ile Thr Thr Arg Glu Tyr Cys Glu Phe Met His Gly

580 585 590 

Tyr Phe His Glu Asp Ala Thr Leu Cys Ser Gln Val His Cys Leu Asp

 595 600 605

Lys Val Cys Gly Leu Leu Pro Phe Leu Asn Pro Glu Val Pro Asp Gln

610 615   620

Phe Tyr Arg Ile Trp Leu Ser Leu Phe Leu His Ala Gly Ile Val His

625  630 635 640

Cys Leu Val Ser Val Val Phe Gln Met Thr Ile Leu Arg Asp Leu Glu

 645 650 655

Lys Leu Ala Gly Trp His Arg Ile Ser Ile Ile Phe Ile Leu Ser Gly

660 665 670 

Ile Thr Gly Asn Leu Ala Ser Ala Ile Phe Leu Pro Tyr Arg Ala Glu

675  680 685

Val Gly Pro Ala Gly Ser Gln Phe Gly Leu Leu Ala Cys Leu Phe Val

690 695   700

Glu Leu Phe Gln Ser Trp Gln Leu Leu Glu Arg Pro Trp Lys Ala Phe

705 710  715 720

Phe Asn Leu Ser Ala Ile Val Leu Phe Leu Phe Ile Cys Gly Leu Leu

 725  730 735

Pro Trp Ile Asp Asn Ile Ala His Ile Phe Gly Phe Leu Ser Gly Met

740 745 750 

Leu Leu Ala Phe Ala Phe Leu Pro Tyr Ile Thr Phe Gly Thr Ser Asp

755  760 765

Lys Tyr Arg Lys Arg Ala Leu Ile Leu Val Ser Leu Leu Val Phe Ala

770  775 780

Gly Leu Phe Ala Ser Leu Val Leu Trp Leu Tyr Ile Tyr Pro Ile Asn

785  790 795  800

Trp Pro Trp Ile Glu Tyr Leu Thr Cys Phe Pro Phe Thr Ser Arg Phe

 805 810 815

Cys Glu Lys Tyr Glu Leu Asp Gln Val Leu His

820 825

<210> 2

<211> 559

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 2

Met Ser Ser Met Pro Asp Asp Val Phe Glu Ser Pro Pro Leu Ser Ala

1 5  10  15

Ser Tyr Phe Arg Gly Val Pro His Ser Ala Ser Pro Val Ser Pro Asp

 20 25 30

Gly Val His Ile Pro Leu Lys Glu Tyr Ser Gly Gly Arg Ala Leu Gly

35 40 45 

Pro Gly Thr Gln Arg Gly Lys Arg Ile Ala Ser Lys Val Lys His Phe

50  55  60

Ala Phe Asp Arg Lys Lys Arg His Tyr Gly Leu Gly Val Val Gly Asn

65 70  75 80

Trp Leu Asn Arg Ser Tyr Arg Arg Ser Ile Ser Ser Thr Val Gln Arg

85  90 95

Gln Leu Glu Ser Phe Asp Ser His Arg Pro Tyr Phe Thr Tyr Trp Leu

100 105 110

Thr Phe Val His Ile Ile Ile Thr Leu Leu Val Ile Cys Thr Tyr Gly

115 120  125

Ile Ala Pro Val Gly Phe Ala Gln His Val Thr Thr Gln Leu Val Leu

130  135 140

Lys Asn Arg Gly Val Tyr Glu Ser Val Lys Tyr Ile Gln Gln Glu Asn

145 150  155 160

Phe Trp Ile Gly Pro Ser Ser Ile Asp Leu Ile His Leu Gly Ala Lys

165 170   175

Phe Ser Pro Cys Ile Arg Lys Asp Gln Gln Ile Glu Gln Leu Val Arg

180 185  190

Arg Glu Arg Asp Ile Glu Arg Thr Ser Gly Cys Cys Val Gln Asn Asp

195 200  205 

Arg Ser Gly Cys Ile Gln Thr Leu Lys Lys Asp Cys Ser Glu Thr Leu

210  215 220 

Ala Thr Phe Val Lys Trp Gln Asn Asp Thr Gly Pro Ser Asp Lys Ser

225  230 235  240

Asp Leu Ser Gln Lys Gln Pro Ser Ala Val Val Cys His Gln Asp Pro

245 250  255

Arg Thr Cys Glu Glu Pro Ala Ser Ser Gly Ala His Ile Trp Pro Asp

260 265 270 

Asp Ile Thr Lys Trp Pro Ile Cys Thr Glu Gln Ala Gln Ser Asn His

 275 280 285

Thr Gly Leu Leu His Ile Asp Cys Lys Ile Lys Gly Arg Pro Cys Cys

290 295  300 

Ile Gly Thr Lys Gly Ser Cys Glu Ile Thr Thr Arg Glu Tyr Cys Glu

305 310 315  320

Phe Met His Gly Tyr Phe His Glu Asp Ala Thr Leu Cys Ser Gln Val

 325 330 335

His Cys Leu Asp Lys Val Cys Gly Leu Leu Pro Phe Leu Asn Pro Glu

340 345  350

Val Pro Asp Gln Phe Tyr Arg Ile Trp Leu Ser Leu Phe Leu His Ala

 355  360 365

Gly Ile Val His Cys Leu Val Ser Val Val Phe Gln Met Thr Ile Leu

370 375 380

Arg Asp Leu Glu Lys Leu Ala Gly Trp His Arg Ile Ser Ile Ile Phe

385  390 395 400

Ile Leu Ser Gly Ile Thr Gly Asn Leu Ala Ser Ala Ile Phe Leu Pro

405 410 415

Tyr Arg Ala Glu Val Gly Pro Ala Gly Ser Gln Phe Gly Leu Leu Ala

420 425 430 

Cys Leu Phe Val Glu Leu Phe Gln Ser Trp Gln Leu Leu Glu Arg Pro

435  440  445

Trp Lys Ala Phe Phe Asn Leu Ser Ala Ile Val Leu Phe Leu Phe Ile

450 455  460

Cys Gly Leu Leu Pro Trp Ile Asp Asn Ile Ala His Ile Phe Gly Phe

465 470  475  480

Leu Ser Gly Met Leu Leu Ala Phe Ala Phe Leu Pro Tyr Ile Thr Phe

485  490 495

Gly Thr Ser Asp Lys Tyr Arg Lys Arg Ala Leu Ile Leu Val Ser Leu

500 505 510

Leu Val Phe Ala Gly Leu Phe Ala Ser Leu Val Leu Trp Leu Tyr Ile

515 520  525

Tyr Pro Ile Asn Trp Pro Trp Ile Glu Tyr Leu Thr Cys Phe Pro Phe

530 535 540 

Thr Ser Arg Phe Cys Glu Lys Tyr Glu Leu Asp Gln Val Leu His

545 550 555 

<210> 3

<211> 856

<212> PRT

<213> 小(xiao)家鼠

<400> 3

Met Ser Glu Ala Arg Arg Asp Ser Thr Ser Ser Leu Gln Arg Lys Lys

1 5 10 15

Pro Pro Trp Leu Lys Leu Asp Ile Pro Ala Ala Val Pro Pro Ala Ala

 20 25 30

Glu Glu Pro Ser Phe Leu Gln Pro Leu Arg Arg Gln Ala Phe Leu Arg

35  40  45

Ser Val Ser Met Pro Ala Glu Thr Ala Arg Val Pro Ser Pro His His

50  55 60 

Glu Pro Arg Arg Leu Val Leu Gln Arg Gln Thr Ser Ile Thr Gln Thr

65 70 75 80

Ile Arg Arg Gly Thr Ala Asp Trp Phe Gly Val Ser Lys Asp Ser Asp

85 90  95

Ser Thr Gln Lys Trp Gln Arg Lys Ser Ile Arg His Cys Ser Gln Arg

100 105 110 

Tyr Gly Lys Leu Lys Pro Gln Val Ile Arg Glu Leu Asp Leu Pro Ser

115  120 125

Gln Asp Asn Val Ser Leu Thr Ser Thr Glu Thr Pro Pro Pro Leu Tyr

130 135  140

Val Gly Pro Cys Gln Leu Gly Met Gln Lys Ile Ile Asp Pro Leu Ala

145 150  155 160

Arg Gly Arg Ala Phe Arg Met Ala Asp Asp Thr Ala Asp Gly Leu Ser

165 170 175 

Ala Pro His Thr Pro Val Thr Pro Gly Ala Ala Ser Leu Cys Ser Phe

180  185  190

Ser Ser Ser Arg Ser Gly Phe Asn Arg Leu Pro Arg Arg Arg Lys Arg

195 200  205

Glu Ser Val Ala Lys Met Ser Phe Arg Ala Ala Ala Ala Leu Val Lys

210 215  220

Gly Arg Ser Ile Arg Asp Gly Thr Leu Arg Arg Gly Gln Arg Arg Ser

225 230 235 240

Phe Thr Pro Ala Ser Phe Leu Glu Glu Asp Met Val Asp Phe Pro Asp

 245 250 255

Glu Leu Asp Thr Ser Phe Phe Ala Arg Glu Gly Val Leu His Glu Glu

 260 265 270

Met Ser Thr Tyr Pro Asp Glu Val Phe Glu Ser Pro Ser Glu Ala Ala

275 280  285

Leu Lys Asp Trp Glu Lys Ala Pro Asp Gln Ala Asp Leu Thr Gly Gly

290  295 300

Ala Leu Asp Arg Ser Glu Leu Glu Arg Ser His Leu Met Leu Pro Leu

305 310  315 320

Glu Arg Gly Trp Arg Lys Gln Lys Glu Gly Gly Pro Leu Ala Pro Gln

325 330  335

Pro Lys Val Arg Leu Arg Gln Glu Val Val Ser Ala Ala Gly Pro Arg

340 345  350

Arg Gly Gln Arg Ile Ala Val Pro Val Arg Lys Leu Phe Ala Arg Glu

355  360 365

Lys Arg Pro Tyr Gly Leu Gly Met Val Gly Arg Leu Thr Asn Arg Thr

370 375 380

Tyr Arg Lys Arg Ile Asp Ser Tyr Val Lys Arg Gln Ile Glu Asp Met

385  390 395 400

Asp Asp His Arg Pro Phe Phe Thr Tyr Trp Leu Thr Phe Val His Ser

405 410 415

Leu Val Thr Ile Leu Ala Val Cys Ile Tyr Gly Ile Ala Pro Val Gly

420  425 430 

Phe Ser Gln His Glu Thr Val Asp Ser Val Leu Arg Lys Arg Gly Val

435  440 445

Tyr Glu Asn Val Lys Tyr Val Gln Gln Glu Asn Phe Trp Ile Gly Pro

 450 455 460

Ser Ser Glu Ala Leu Ile His Leu Gly Ala Lys Phe Ser Pro Cys Met

465  470 475 480

Arg Gln Asp Pro Gln Val His Ser Phe Ile Leu Ala Ala Arg Glu Arg

485 490   495

Glu Lys His Ser Ala Cys Cys Val Arg Asn Asp Arg Ser Gly Cys Val

500 505 510 

Gln Thr Ser Lys Glu Glu Cys Ser Ser Thr Leu Ala Val Trp Val Lys

515 520 525

Trp Pro Val His Pro Ser Ala Pro Asp Leu Ala Gly Asn Lys Arg Gln

 530  535 540

Phe Gly Ser Val Cys His Gln Asp Pro Arg Val Cys Asp Glu Pro Ser

545 550   555 560

Ser Glu Asp Pro His Glu Trp Pro Glu Asp Ile Thr Lys Trp Pro Ile

565 570   575

Cys Thr Lys Ser Ser Ala Gly Asn His Thr Asn His Pro His Met Asp

580  585 590

Cys Val Ile Thr Gly Arg Pro Cys Cys Ile Gly Thr Lys Gly Arg Cys

595  600  605

Glu Ile Thr Ser Arg Glu Tyr Cys Asp Phe Met Arg Gly Tyr Phe His

610 615 620

Glu Glu Ala Thr Leu Cys Ser Gln Val His Cys Met Asp Asp Val Cys

625 630  635 640

Gly Leu Leu Pro Phe Leu Asn Pro Glu Val Pro Asp Gln Phe Tyr Arg

  645 650 655

Leu Trp Leu Ser Leu Phe Leu His Ala Gly Ile Leu His Cys Leu Val

660 665   670

Ser Val Cys Phe Gln Met Thr Val Leu Arg Asp Leu Glu Lys Leu Ala

675 680 685 

Gly Trp His Arg Ile Ala Ile Ile Tyr Leu Leu Ser Gly Ile Thr Gly

690 695 700 

Asn Leu Ala Ser Ala Ile Phe Leu Pro Tyr Arg Ala Glu Val Gly Pro

705 710 715  720

Ala Gly Ser Gln Phe Gly Ile Leu Ala Cys Leu Phe Val Glu Leu Phe

725  730 735

Gln Ser Trp Gln Ile Leu Ala Arg Pro Trp Arg Ala Phe Phe Lys Leu

 740 745 750

Leu Ala Val Val Leu Phe Leu Phe Ala Phe Gly Leu Leu Pro Trp Ile

755 760 765 

Asp Asn Phe Ala His Ile Ser Gly Phe Val Ser Gly Leu Phe Leu Ser

770  775 780

Phe Ala Phe Leu Pro Tyr Ile Ser Phe Gly Lys Phe Asp Leu Tyr Arg

785 790  795 800

Lys Arg Cys Gln Ile Ile Ile Phe Gln Val Val Phe Leu Gly Leu Leu

805  810  815

Ala Gly Leu Val Val Leu Phe Tyr Phe Tyr Pro Val Arg Cys Glu Trp

820 825  830

Cys Glu Phe Leu Thr Cys Ile Pro Phe Thr Asp Lys Phe Cys Glu Lys

835 840  845

Tyr Glu Leu Asp Ala Gln Leu His

850 855

<210> 4

<211> 584

<212> PRT

<213> 小家鼠(shu)

<400> 4

Met Ser Thr Tyr Pro Asp Glu Val Phe Glu Ser Pro Ser Glu Ala Ala

1 5  10 15

Leu Lys Asp Trp Glu Lys Ala Pro Asp Gln Ala Asp Leu Thr Gly Gly

20 25  30

Ala Leu Asp Arg Ser Glu Leu Glu Arg Ser His Leu Met Leu Pro Leu

35  40  45

Glu Arg Gly Trp Arg Lys Gln Lys Glu Gly Gly Pro Leu Ala Pro Gln

50 55 60 

Pro Lys Val Arg Leu Arg Gln Glu Val Val Ser Ala Ala Gly Pro Arg

65 70  75 80

Arg Gly Gln Arg Ile Ala Val Pro Val Arg Lys Leu Phe Ala Arg Glu

85 90  95 

Lys Arg Pro Tyr Gly Leu Gly Met Val Gly Arg Leu Thr Asn Arg Thr

100  105  110

Tyr Arg Lys Arg Ile Asp Ser Tyr Val Lys Arg Gln Ile Glu Asp Met

115 120 125

Asp Asp His Arg Pro Phe Phe Thr Tyr Trp Leu Thr Phe Val His Ser

130  135 140

Leu Val Thr Ile Leu Ala Val Cys Ile Tyr Gly Ile Ala Pro Val Gly

145  150 155 160

Phe Ser Gln His Glu Thr Val Asp Ser Val Leu Arg Lys Arg Gly Val

165  170  175

Tyr Glu Asn Val Lys Tyr Val Gln Gln Glu Asn Phe Trp Ile Gly Pro

180 185  190

Ser Ser Glu Ala Leu Ile His Leu Gly Ala Lys Phe Ser Pro Cys Met

 195 200  205

Arg Gln Asp Pro Gln Val His Ser Phe Ile Leu Ala Ala Arg Glu Arg

210 215 220

Glu Lys His Ser Ala Cys Cys Val Arg Asn Asp Arg Ser Gly Cys Val

225 230  235 240

Gln Thr Ser Lys Glu Glu Cys Ser Ser Thr Leu Ala Val Trp Val Lys

245   250 255

Trp Pro Val His Pro Ser Ala Pro Asp Leu Ala Gly Asn Lys Arg Gln

260 265 270

Phe Gly Ser Val Cys His Gln Asp Pro Arg Val Cys Asp Glu Pro Ser

275 280 285

Ser Glu Asp Pro His Glu Trp Pro Glu Asp Ile Thr Lys Trp Pro Ile

290 295  300 

Cys Thr Lys Ser Ser Ala Gly Asn His Thr Asn His Pro His Met Asp

305  310 315 320

Cys Val Ile Thr Gly Arg Pro Cys Cys Ile Gly Thr Lys Gly Arg Cys

 325 330 335

Glu Ile Thr Ser Arg Glu Tyr Cys Asp Phe Met Arg Gly Tyr Phe His

340  345 350

Glu Glu Ala Thr Leu Cys Ser Gln Val His Cys Met Asp Asp Val Cys

355  360 365 

Gly Leu Leu Pro Phe Leu Asn Pro Glu Val Pro Asp Gln Phe Tyr Arg

370  375  380

Leu Trp Leu Ser Leu Phe Leu His Ala Gly Ile Leu His Cys Leu Val

385 390  395 400

Ser Val Cys Phe Gln Met Thr Val Leu Arg Asp Leu Glu Lys Leu Ala

 405 410 415

Gly Trp His Arg Ile Ala Ile Ile Tyr Leu Leu Ser Gly Ile Thr Gly

420 425  430

Asn Leu Ala Ser Ala Ile Phe Leu Pro Tyr Arg Ala Glu Val Gly Pro

435  440 445

Ala Gly Ser Gln Phe Gly Ile Leu Ala Cys Leu Phe Val Glu Leu Phe

450 455 460

Gln Ser Trp Gln Ile Leu Ala Arg Pro Trp Arg Ala Phe Phe Lys Leu

465 470   475 480

Leu Ala Val Val Leu Phe Leu Phe Ala Phe Gly Leu Leu Pro Trp Ile

  485 490 495

Asp Asn Phe Ala His Ile Ser Gly Phe Val Ser Gly Leu Phe Leu Ser

500 505  510

Phe Ala Phe Leu Pro Tyr Ile Ser Phe Gly Lys Phe Asp Leu Tyr Arg

515 520   525

Lys Arg Cys Gln Ile Ile Ile Phe Gln Val Val Phe Leu Gly Leu Leu

530 535 540

Ala Gly Leu Val Val Leu Phe Tyr Phe Tyr Pro Val Arg Cys Glu Trp

545  550 555  560

Cys Glu Phe Leu Thr Cys Ile Pro Phe Thr Asp Lys Phe Cys Glu Lys

 565  570 575

Tyr Glu Leu Asp Ala Gln Leu His

580

<210> 5

<211> 856

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 5

Met Ala Ser Ala Asp Lys Asn Gly Gly Ser Val Ser Ser Val Ser Ser

1 5  10 15

Ser Arg Leu Gln Ser Arg Lys Pro Pro Asn Leu Ser Ile Thr Ile Pro

20  25 30

Pro Pro Glu Lys Glu Thr Gln Ala Pro Gly Glu Gln Asp Ser Met Leu

 35 40 45 

Pro Glu Gly Phe Gln Asn Arg Arg Leu Lys Lys Ser Gln Pro Arg Thr

50   55 60

Trp Ala Ala His Thr Thr Ala Cys Pro Pro Ser Phe Leu Pro Lys Arg

65 70 75 80

Lys Asn Pro Ala Tyr Leu Lys Ser Val Ser Leu Gln Glu Pro Arg Ser

85  90 95

Arg Trp Gln Glu Ser Ser Glu Lys Arg Pro Gly Phe Arg Arg Gln Ala

 100 105 110

Ser Leu Ser Gln Ser Ile Arg Lys Gly Ala Ala Gln Trp Phe Gly Val

115 120  125

Ser Gly Asp Trp Glu Gly Gln Arg Gln Gln Trp Gln Arg Arg Ser Leu

130 135 140

His His Cys Ser Met Arg Tyr Gly Arg Leu Lys Ala Ser Cys Gln Arg

145 150  155 160

Asp Leu Glu Leu Pro Ser Gln Glu Ala Pro Ser Phe Gln Gly Thr Glu

165  170 175 

Ser Pro Lys Pro Cys Lys Met Pro Lys Ile Val Asp Pro Leu Ala Arg

180 185  190

Gly Arg Ala Phe Arg His Pro Glu Glu Met Asp Arg Pro His Ala Pro

195  200 205 

His Pro Pro Leu Thr Pro Gly Val Leu Ser Leu Thr Ser Phe Thr Ser

210 215  220 

Val Arg Ser Gly Tyr Ser His Leu Pro Arg Arg Lys Arg Met Ser Val

225 230 235  240

Ala His Met Ser Leu Gln Ala Ala Ala Ala Leu Leu Lys Gly Arg Ser

245 250  255

Val Leu Asp Ala Thr Gly Gln Arg Cys Arg Val Val Lys Arg Ser Phe

 260 265 270

Ala Phe Pro Ser Phe Leu Glu Glu Asp Val Val Asp Gly Ala Asp Thr

275 280 285

Phe Asp Ser Ser Phe Phe Ser Lys Glu Glu Met Ser Ser Met Pro Asp

290 295  300

Asp Val Phe Glu Ser Pro Pro Leu Ser Ala Ser Tyr Phe Arg Gly Ile

305 310 315 320

Pro His Ser Ala Ser Pro Val Ser Pro Asp Gly Val Gln Ile Pro Leu

325 330   335

Lys Glu Tyr Gly Arg Ala Pro Val Pro Gly Pro Arg Arg Gly Lys Arg

340 345 350 

Ile Ala Ser Lys Val Lys His Phe Ala Phe Asp Arg Lys Lys Arg His

 355 360 365

Tyr Gly Leu Gly Val Val Gly Asn Trp Leu Asn Arg Ser Tyr Arg Arg

370 375  380 

Ser Ile Ser Ser Thr Val Gln Arg Gln Leu Glu Ser Phe Asp Ser His

385 390 395  400

Arg Pro Tyr Phe Thr Tyr Trp Leu Thr Phe Val His Val Ile Ile Thr

405  410 415

Leu Leu Val Ile Cys Thr Tyr Gly Ile Ala Pro Val Gly Phe Ala Gln

 420 425 430

His Val Thr Thr Gln Leu Val Leu Arg Asn Lys Gly Val Tyr Glu Ser

435 440 445

Val Lys Tyr Ile Gln Gln Glu Asn Phe Trp Val Gly Pro Ser Ser Ile

450  455 460 

Asp Leu Ile His Leu Gly Ala Lys Phe Ser Pro Cys Ile Arg Lys Asp

465  470 475 480

Gly Gln Ile Glu Gln Leu Val Leu Arg Glu Arg Asp Leu Glu Arg Asp

 485 490 495

Ser Gly Cys Cys Val Gln Asn Asp His Ser Gly Cys Ile Gln Thr Gln

500 505 510  

Arg Lys Asp Cys Ser Glu Thr Leu Ala Thr Phe Val Lys Trp Gln Asp

515  520 525

Asp Thr Gly Pro Pro Met Asp Lys Ser Asp Leu Gly Gln Lys Arg Thr

530 535 540

Ser Gly Ala Val Cys His Gln Asp Pro Arg Thr Cys Glu Glu Pro Ala

545  550 555  560

Ser Ser Gly Ala His Ile Trp Pro Asp Asp Ile Thr Lys Trp Pro Ile

565  570 575

Cys Thr Glu Gln Ala Arg Ser Asn His Thr Gly Phe Leu His Met Asp

580   585 590

Cys Glu Ile Lys Gly Arg Pro Cys Cys Ile Gly Thr Lys Gly Ser Cys

595 600 605

Glu Ile Thr Thr Arg Glu Tyr Cys Glu Phe Met His Gly Tyr Phe His

610 615 620

Glu Glu Ala Thr Leu Cys Ser Gln Val His Cys Leu Asp Lys Val Cys

625 630 635 640

Gly Leu Leu Pro Phe Leu Asn Pro Glu Val Pro Asp Gln Phe Tyr Arg

645 650 655 

Leu Trp Leu Ser Leu Phe Leu His Ala Gly Val Val His Cys Leu Val

 660  665 670

Ser Val Val Phe Gln Met Thr Ile Leu Arg Asp Leu Glu Lys Leu Ala

675 680 685

Gly Trp His Arg Ile Ala Ile Ile Phe Ile Leu Ser Gly Ile Thr Gly

690 695  700

Asn Leu Ala Ser Ala Ile Phe Leu Pro Tyr Arg Ala Glu Val Gly Pro

705 710  715 720

Ala Gly Ser Gln Phe Gly Leu Leu Ala Cys Leu Phe Val Glu Leu Phe

725 730 735

Gln Ser Trp Pro Leu Leu Glu Arg Pro Trp Lys Ala Phe Leu Asn Leu

740 745  750

Ser Ala Ile Val Leu Phe Leu Phe Ile Cys Gly Leu Leu Pro Trp Ile

755  760 765

Asp Asn Ile Ala His Ile Phe Gly Phe Leu Ser Gly Leu Leu Leu Ala

770 775  780 

Phe Ala Phe Leu Pro Tyr Ile Thr Phe Gly Thr Ser Asp Lys Tyr Arg

785 790  795 800

Lys Arg Ala Leu Ile Leu Val Ser Leu Leu Ala Phe Ala Gly Leu Phe

 805 810 815

Ala Ala Leu Val Leu Trp Leu Tyr Ile Tyr Pro Ile Asn Trp Pro Trp

820 825 830

Ile Glu His Leu Thr Cys Phe Pro Phe Thr Ser Arg Phe Cys Glu Lys

835 840 845

Tyr Glu Leu Asp Gln Val Leu His

850 855

<210> 6

<211> 558

<212> PRT

<213> 智人

<400> 6

Met Ser Ser Met Pro Asp Asp Val Phe Glu Ser Pro Pro Leu Ser Ala

1  5 10 15

Ser Tyr Phe Arg Gly Ile Pro His Ser Ala Ser Pro Val Ser Pro Asp

20 25 30 

Gly Val Gln Ile Pro Leu Lys Glu Tyr Gly Arg Ala Pro Val Pro Gly

35   40 45

Pro Arg Arg Gly Lys Arg Ile Ala Ser Lys Val Lys His Phe Ala Phe

50  55 60

Asp Arg Lys Lys Arg His Tyr Gly Leu Gly Val Val Gly Asn Trp Leu

65  70 75 80

Asn Arg Ser Tyr Arg Arg Ser Ile Ser Ser Thr Val Gln Arg Gln Leu

 85 90 95

Glu Ser Phe Asp Ser His Arg Pro Tyr Phe Thr Tyr Trp Leu Thr Phe

100  105 110

Val His Val Ile Ile Thr Leu Leu Val Ile Cys Thr Tyr Gly Ile Ala

115 120 125 

Pro Val Gly Phe Ala Gln His Val Thr Thr Gln Leu Val Leu Arg Asn

130   135 140

Lys Gly Val Tyr Glu Ser Val Lys Tyr Ile Gln Gln Glu Asn Phe Trp

145  150 155 160

Val Gly Pro Ser Ser Ile Asp Leu Ile His Leu Gly Ala Lys Phe Ser

165   170 175

Pro Cys Ile Arg Lys Asp Gly Gln Ile Glu Gln Leu Val Leu Arg Glu

180  185 190

Arg Asp Leu Glu Arg Asp Ser Gly Cys Cys Val Gln Asn Asp His Ser

195 200  205

Gly Cys Ile Gln Thr Gln Arg Lys Asp Cys Ser Glu Thr Leu Ala Thr

210 215  220

Phe Val Lys Trp Gln Asp Asp Thr Gly Pro Pro Met Asp Lys Ser Asp

225  230  235 240

Leu Gly Gln Lys Arg Thr Ser Gly Ala Val Cys His Gln Asp Pro Arg

245  250 255

Thr Cys Glu Glu Pro Ala Ser Ser Gly Ala His Ile Trp Pro Asp Asp

260  265 270

Ile Thr Lys Trp Pro Ile Cys Thr Glu Gln Ala Arg Ser Asn His Thr

275  280 285 

Gly Phe Leu His Met Asp Cys Glu Ile Lys Gly Arg Pro Cys Cys Ile

290  295 300 

Gly Thr Lys Gly Ser Cys Glu Ile Thr Thr Arg Glu Tyr Cys Glu Phe

305  310 315 320

Met His Gly Tyr Phe His Glu Glu Ala Thr Leu Cys Ser Gln Val His

325 330  335

Cys Leu Asp Lys Val Cys Gly Leu Leu Pro Phe Leu Asn Pro Glu Val

 340 345 350

Pro Asp Gln Phe Tyr Arg Leu Trp Leu Ser Leu Phe Leu His Ala Gly

355  360 365

Val Val His Cys Leu Val Ser Val Val Phe Gln Met Thr Ile Leu Arg

370 375 380 

Asp Leu Glu Lys Leu Ala Gly Trp His Arg Ile Ala Ile Ile Phe Ile

385 390 395 400

Leu Ser Gly Ile Thr Gly Asn Leu Ala Ser Ala Ile Phe Leu Pro Tyr

405 410  415

Arg Ala Glu Val Gly Pro Ala Gly Ser Gln Phe Gly Leu Leu Ala Cys

420  425 430

Leu Phe Val Glu Leu Phe Gln Ser Trp Pro Leu Leu Glu Arg Pro Trp

435 440   445

Lys Ala Phe Leu Asn Leu Ser Ala Ile Val Leu Phe Leu Phe Ile Cys

450 455  460

Gly Leu Leu Pro Trp Ile Asp Asn Ile Ala His Ile Phe Gly Phe Leu

465  470 475 480

Ser Gly Leu Leu Leu Ala Phe Ala Phe Leu Pro Tyr Ile Thr Phe Gly

 485 490 495

Thr Ser Asp Lys Tyr Arg Lys Arg Ala Leu Ile Leu Val Ser Leu Leu

500   505 510

Ala Phe Ala Gly Leu Phe Ala Ala Leu Val Leu Trp Leu Tyr Ile Tyr

515  520 525

Pro Ile Asn Trp Pro Trp Ile Glu His Leu Thr Cys Phe Pro Phe Thr

530 535 540 

Ser Arg Phe Cys Glu Lys Tyr Glu Leu Asp Gln Val Leu His

545 550  555

<210> 7

<211> 855

<212> PRT

<213> 智人(ren)

<400> 7

Met Ser Glu Ala Arg Arg Asp Ser Thr Ser Ser Leu Gln Arg Lys Lys

1 5 10 15 

Pro Pro Trp Leu Lys Leu Asp Ile Pro Ser Ala Val Pro Leu Thr Ala

20 25  30 

Glu Glu Pro Ser Phe Leu Gln Pro Leu Arg Arg Gln Ala Phe Leu Arg

35 40  45

Ser Val Ser Met Pro Ala Glu Thr Ala His Ile Ser Ser Pro His His

50 55 60 

Glu Leu Arg Arg Pro Val Leu Gln Arg Gln Thr Ser Ile Thr Gln Thr

65  70 75  80

Ile Arg Arg Gly Thr Ala Asp Trp Phe Gly Val Ser Lys Asp Ser Asp

 85 90 95

Ser Thr Gln Lys Trp Gln Arg Lys Ser Ile Arg His Cys Ser Gln Arg

100 105  110

Tyr Gly Lys Leu Lys Pro Gln Val Leu Arg Glu Leu Asp Leu Pro Ser

115  120 125

Gln Asp Asn Val Ser Leu Thr Ser Thr Glu Thr Pro Pro Pro Leu Tyr

130  135 140

Val Gly Pro Cys Gln Leu Gly Met Gln Lys Ile Ile Asp Pro Leu Ala

145  150 155 160

Arg Gly Arg Ala Phe Arg Val Ala Asp Asp Thr Ala Glu Gly Leu Ser

165  170  175

Ala Pro His Thr Pro Val Thr Pro Gly Ala Ala Ser Leu Cys Ser Phe

180  185 190 

Ser Ser Ser Arg Ser Gly Phe His Arg Leu Pro Arg Arg Arg Lys Arg

195 200 205

Glu Ser Val Ala Lys Met Ser Phe Arg Ala Ala Ala Ala Leu Met Lys

210   215 220

Gly Arg Ser Val Arg Asp Gly Thr Phe Arg Arg Ala Gln Arg Arg Ser

225  230 235 240

Phe Thr Pro Ala Ser Phe Leu Glu Glu Asp Thr Thr Asp Phe Pro Asp

245 250 255

Glu Leu Asp Thr Ser Phe Phe Ala Arg Glu Gly Ile Leu His Glu Glu

 260 265 270 

Leu Ser Thr Tyr Pro Asp Glu Val Phe Glu Ser Pro Ser Glu Ala Ala

275 280 285

Leu Lys Asp Trp Glu Lys Ala Pro Glu Gln Ala Asp Leu Thr Gly Gly

290  295 300 

Ala Leu Asp Arg Ser Glu Leu Glu Arg Ser His Leu Met Leu Pro Leu

305 310  315 320

Glu Arg Gly Trp Arg Lys Gln Lys Glu Gly Ala Ala Ala Pro Gln Pro

 325 330  335

Lys Val Arg Leu Arg Gln Glu Val Val Ser Thr Ala Gly Pro Arg Arg

340 345 350

Gly Gln Arg Ile Ala Val Pro Val Arg Lys Leu Phe Ala Arg Glu Lys

355  360  365

Arg Pro Tyr Gly Leu Gly Met Val Gly Arg Leu Thr Asn Arg Thr Tyr

370 375  380 

Arg Lys Arg Ile Asp Ser Phe Val Lys Arg Gln Ile Glu Asp Met Asp

385 390  395 400

Asp His Arg Pro Phe Phe Thr Tyr Trp Leu Thr Phe Val His Ser Leu

405 410  415

Val Thr Ile Leu Ala Val Cys Ile Tyr Gly Ile Ala Pro Val Gly Phe

420  425 430

Ser Gln His Glu Thr Val Asp Ser Val Leu Arg Asn Arg Gly Val Tyr

435  440  445

Glu Asn Val Lys Tyr Val Gln Gln Glu Asn Phe Trp Ile Gly Pro Ser

  450 455 460

Ser Glu Ala Leu Ile His Leu Gly Ala Lys Phe Ser Pro Cys Met Arg

465 470 475 480

Gln Asp Pro Gln Val His Ser Phe Ile Arg Ser Ala Arg Glu Arg Glu

485  490 495

Lys His Ser Ala Cys Cys Val Arg Asn Asp Arg Ser Gly Cys Val Gln

500 505 510 

Thr Ser Glu Glu Glu Cys Ser Ser Thr Leu Ala Val Trp Val Lys Trp

515 520 525 

Pro Ile His Pro Ser Ala Pro Glu Leu Ala Gly His Lys Arg Gln Phe

530 535  540 

Gly Ser Val Cys His Gln Asp Pro Arg Val Cys Asp Glu Pro Ser Ser

545 550 555  560

Glu Asp Pro His Glu Trp Pro Glu Asp Ile Thr Lys Trp Pro Ile Cys

 565 570 575

Thr Lys Asn Ser Ala Gly Asn His Thr Asn His Pro His Met Asp Cys

580 585 590 

Val Ile Thr Gly Arg Pro Cys Cys Ile Gly Thr Lys Gly Arg Cys Glu

595 600 605

Ile Thr Ser Arg Glu Tyr Cys Asp Phe Met Arg Gly Tyr Phe His Glu

610   615 620

Glu Ala Thr Leu Cys Ser Gln Val His Cys Met Asp Asp Val Cys Gly

625 630  635 640

Leu Leu Pro Phe Leu Asn Pro Glu Val Pro Asp Gln Phe Tyr Arg Leu

645 650 655 

Trp Leu Ser Leu Phe Leu His Ala Gly Ile Leu His Cys Leu Val Ser

660 665 670 

Ile Cys Phe Gln Met Thr Val Leu Arg Asp Leu Glu Lys Leu Ala Gly

675  680 685

Trp His Arg Ile Ala Ile Ile Tyr Leu Leu Ser Gly Val Thr Gly Asn

690 695  700

Leu Ala Ser Ala Ile Phe Leu Pro Tyr Arg Ala Glu Val Gly Pro Ala

705 710  715 720

Gly Ser Gln Phe Gly Ile Leu Ala Cys Leu Phe Val Glu Leu Phe Gln

725 730 735 

Ser Trp Gln Ile Leu Ala Arg Pro Trp Arg Ala Phe Phe Lys Leu Leu

740 745  750

Ala Val Val Leu Phe Leu Phe Thr Phe Gly Leu Leu Pro Trp Ile Asp

755 760 765

Asn Phe Ala His Ile Ser Gly Phe Ile Ser Gly Leu Phe Leu Ser Phe

770  775  780

Ala Phe Leu Pro Tyr Ile Ser Phe Gly Lys Phe Asp Leu Tyr Arg Lys

785 790  795 800

Arg Cys Gln Ile Ile Ile Phe Gln Val Val Phe Leu Gly Leu Leu Ala

805  810 815

Gly Leu Val Val Leu Phe Tyr Val Tyr Pro Val Arg Cys Glu Trp Cys

820  825 830

Glu Phe Leu Thr Cys Ile Pro Phe Thr Asp Lys Phe Cys Glu Lys Tyr

835 840 845  

Glu Leu Asp Ala Gln Leu His

850 855

<210> 8

<211> 539

<212> PRT

<213> 智人(ren)

<400> 8

Met Leu Pro Leu Glu Arg Gly Trp Arg Lys Gln Lys Glu Gly Ala Ala

1 5  10 15

Ala Pro Gln Pro Lys Val Arg Leu Arg Gln Glu Val Val Ser Thr Ala

20 25  30

Gly Pro Arg Arg Gly Gln Arg Ile Ala Val Pro Val Arg Lys Leu Phe

35 40 45 

Ala Arg Glu Lys Arg Pro Tyr Gly Leu Gly Met Val Gly Arg Leu Thr

50  55 60

Asn Arg Thr Tyr Arg Lys Arg Ile Asp Ser Phe Val Lys Arg Gln Ile

65 70 75 80

Glu Asp Met Asp Asp His Arg Pro Phe Phe Thr Tyr Trp Leu Thr Phe

85 90  95

Val His Ser Leu Val Thr Ile Leu Ala Val Cys Ile Tyr Gly Ile Ala

100  105 110

Pro Val Gly Phe Ser Gln His Glu Thr Val Asp Ser Val Leu Arg Asn

115  120 125 

Arg Gly Val Tyr Glu Asn Val Lys Tyr Val Gln Gln Glu Asn Phe Trp

130 135  140

Ile Gly Pro Ser Ser Glu Ala Leu Ile His Leu Gly Ala Lys Phe Ser

145  150 155 160

Pro Cys Met Arg Gln Asp Pro Gln Val His Ser Phe Ile Arg Ser Ala

 165 170 175

Arg Glu Arg Glu Lys His Ser Ala Cys Cys Val Arg Asn Asp Arg Ser

180  185  190

Gly Cys Val Gln Thr Ser Glu Glu Glu Cys Ser Ser Thr Leu Ala Val

195  200 205

Trp Val Lys Trp Pro Ile His Pro Ser Ala Pro Glu Leu Ala Gly His

210 215  220 

Lys Arg Gln Phe Gly Ser Val Cys His Gln Asp Pro Arg Val Cys Asp

225 230 235  240

Glu Pro Ser Ser Glu Asp Pro His Glu Trp Pro Glu Asp Ile Thr Lys

245  250  255

Trp Pro Ile Cys Thr Lys Asn Ser Ala Gly Asn His Thr Asn His Pro

260 265  270

His Met Asp Cys Val Ile Thr Gly Arg Pro Cys Cys Ile Gly Thr Lys

 275  280 285

Gly Arg Cys Glu Ile Thr Ser Arg Glu Tyr Cys Asp Phe Met Arg Gly

290  295 300 

Tyr Phe His Glu Glu Ala Thr Leu Cys Ser Gln Val His Cys Met Asp

305 310  315  320

Asp Val Cys Gly Leu Leu Pro Phe Leu Asn Pro Glu Val Pro Asp Gln

325  330  335

Phe Tyr Arg Leu Trp Leu Ser Leu Phe Leu His Ala Gly Ile Leu His

340 345 350

Cys Leu Val Ser Ile Cys Phe Gln Met Thr Val Leu Arg Asp Leu Glu

 355 360 365

Lys Leu Ala Gly Trp His Arg Ile Ala Ile Ile Tyr Leu Leu Ser Gly

370  375 380

Val Thr Gly Asn Leu Ala Ser Ala Ile Phe Leu Pro Tyr Arg Ala Glu

385  390 395 400

Val Gly Pro Ala Gly Ser Gln Phe Gly Ile Leu Ala Cys Leu Phe Val

405  410 415

Glu Leu Phe Gln Ser Trp Gln Ile Leu Ala Arg Pro Trp Arg Ala Phe

420 425  430

Phe Lys Leu Leu Ala Val Val Leu Phe Leu Phe Thr Phe Gly Leu Leu

435  440 445

Pro Trp Ile Asp Asn Phe Ala His Ile Ser Gly Phe Ile Ser Gly Leu

450 455 460

Phe Leu Ser Phe Ala Phe Leu Pro Tyr Ile Ser Phe Gly Lys Phe Asp

465 470 475  480

Leu Tyr Arg Lys Arg Cys Gln Ile Ile Ile Phe Gln Val Val Phe Leu

485  490  495

Gly Leu Leu Ala Gly Leu Val Val Leu Phe Tyr Val Tyr Pro Val Arg

500  505  510

Cys Glu Trp Cys Glu Phe Leu Thr Cys Ile Pro Phe Thr Asp Lys Phe

515  520 525

Cys Glu Lys Tyr Glu Leu Asp Ala Gln Leu His

530 535

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人(ren)工(gong)序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 9

aaaaccctcc acccttcc 18

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(lie)

<220>

<223> PCR引物

<400> 10

cggggaacaa ctctgaatcc 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(ren)工序列(lie)

<220>

<223> PCR引物

<400> 11

agagccactt tgggtctgtc 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 12

acgcaacgtt ctgtcaaaag 20

<210> 13

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工(gong)序(xu)列

<220>

<223> PCR引物

<400> 13

tgtattgaac atgtattatg aagttgg 27

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(ren)工序列(lie)

<220>

<223> PCR引(yin)物

<400> 14

caactgtgct gtgtgcatcc 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 15

ccttgtgcct tagcaaatgt 20

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工(gong)序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 16

agacacacac atcaacaata ggg 23

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 17

tccatcacca tcaacacaca g 21

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 18

ccctgaaatt ccataaggac ag 22

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人(ren)工序列(lie)

<220>

<223> PCR引物

<400> 19

tcaatcaagt ccaagtaatg cc 22

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(ren)工序列

<220>

<223> PCR引(yin)物

<400> 20

attccacatg ctgttgttcc 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物(wu)

<400> 21

tcacacttgg tatccatcgc 20

<210> 22

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工(gong)序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 22

aaaagaaata agcccatggt tc 22

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(lie)

<220>

<223> PCR引物

<400> 23

ctagtaagtc ctcgcgtgcc 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 24

gtcctatgac aaatgcaccg 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引(yin)物

<400> 25

aacgaaagtt gctttcctgg 20

<210> 26

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序(xu)列(lie)

<220>

<223> PCR引物

<400> 26

ttcattggca tgtacttata ttgac 25

<210> 27

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 27

gctatacagc cagagtccca g 21

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序(xu)列

<220>

<223> PCR引(yin)物

<400> 28

cagaagaggc gaggaaagtg 20

<210> 29

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序(xu)列

<220>

<223> PCR引物(wu)

<400> 29

ggtttcttat attgcagtgg gg 22

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(lie)

<220>

<223> PCR引物(wu)

<400> 30

cgcagattcc actttgttcc 20

<210> 31

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引(yin)物

<400> 31

tgtctgggca ttttacataa gc 22

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物(wu)

<400> 32

tgtgccaagc cataattcag 20

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 33

tgacattcct gcgagcttag 20

<210> 34

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(lie)

<220>

<223> PCR引(yin)物

<400> 34

caagatctgg ttagcgccc 19

<210> 35

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序(xu)列(lie)

<220>

<223> PCR引物

<400> 35

tctgaagaca aatttgaacc cc 22

<210> 36

<211> 23

<212> DNA

<213> 人(ren)工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 36

ttccatgggt atggataatg aag 23

<210> 37

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物(wu)

<400> 37

ggtgcccaga ttcaaaatg 19

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序(xu)列

<220>

<223> PCR引(yin)物

<400> 38

tagtgcacca gaatgccttg 20

<210> 39

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工(gong)序列

<220>

<223> PCR引物(wu)

<400> 39

aagtgccaag ggaccaatc 19

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(ren)工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 40

taccccaagg ttcttgcatc 20

<210> 41

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工(gong)序列

<220>

<223> PCR引(yin)物

<400> 41

gaaaacaggc gttttagata ttgg 24

<210> 42

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 42

cacggagtgg atctactgga c 21

<210> 43

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工(gong)序列(lie)

<220>

<223> PCR引物

<400> 43

cactatactg agaaccaaag caacc 25

<210> 44

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 44

aagtgctgtt tatgctcccc 20

<210> 45

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序(xu)列

<220>

<223> PCR引物

<400> 45

caaatttgtc acgtttggtt c 21

<210> 46

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序(xu)列

<220>

<223> PCR引物

<400> 46

ccgacactac tttcaagccc 20

<210> 47

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(ren)工序(xu)列

<220>

<223> PCR引物(wu)

<400> 47

tccagcgggt ctataaaagc 20

<210> 48

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工(gong)序列

<220>

<223> PCR引物(wu)

<400> 48

gacgtttggg gaatgtcaag 20

<210> 49

<211> 21

<212> DNA

<213> 人(ren)工序列

<220>

<223> PCR引物(wu)

<400> 49

tgtctacaca gcaatgctca c 21

<210> 50

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 50

ctttgcagag gtaaaacccg 20

<210> 51

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序(xu)列

<220>

<223> PCR引物

<400> 51

aaaagagaac gtgggcagtc 20

<210> 52

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 52

ccttggttta cacactggaa aag 23

<210> 53

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工(gong)序列

<220>

<223> PCR引(yin)物(wu)

<400> 53

gtatgtttga gatgcagaaa acc 23

<210> 54

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引(yin)物

<400> 54

tgacagtaga gtctgatagg aatactg 27

<210> 55

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(ren)工序(xu)列

<220>

<223> PCR引物(wu)

<400> 55

gtcacaggag gaaagtcccc 20

<210> 56

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工(gong)序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 56

cttcttttgc cttgagataa gtg 23

<210> 57

<211> 27

<212> DNA

<213> 人(ren)工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 57

tggtggtttt ctataagaat atttagc 27

<210> 58

<211> 22

<212> DNA

<213> 人(ren)工(gong)序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 58

aagcccttgt aaatgattgt cc 22

<210> 59

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序(xu)列(lie)

<220>

<223> PCR引物

<400> 59

aaggttcaca ggactccagc 20

<210> 60

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引(yin)物

<400> 60

aagtggtgtg cctctccg 18

<210> 61

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物(wu)

<400> 61

aaaaggatta agcatttggg g 21

<210> 62

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序(xu)列

<220>

<223> PCR引物

<400> 62

tgggtcatga cactaaaagg ac 22

<210> 63

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工(gong)序(xu)列

<220>

<223> PCR引物

<400> 63

tttccaatgc tgtcaaaccc 20

<210> 64

<211> 21

<212> DNA

<213> 人(ren)工序列

<220>

<223> PCR引(yin)物(wu)

<400> 64

gaatcaatga ataaaacggg g 21

<210> 65

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序(xu)列

<220>

<223> PCR引物

<400> 65

tgggaagagg agaaaagcaa g 21

<210> 66

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(lie)

<220>

<223> PCR引物

<400> 66

gaaaacagtg ctaattactt ccaaag 26

<210> 67

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工(gong)序(xu)列

<220>

<223> PCR引物

<400> 67

attagacatg gtgaagcccc 20

<210> 68

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工(gong)序列

<220>

<223> PCR引物(wu)

<400> 68

tttgcatact gacaggaact cac 23

<210> 69

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引(yin)物

<400> 69

tgctgagcag acagtcacg 19

<210> 70

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序(xu)列(lie)

<220>

<223> PCR引(yin)物

<400> 70

ttgggctcat gtgcgag 17

<210> 71

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工(gong)序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 71

tgctttggtc agtcaaccag 20

<210> 72

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引(yin)物

<400> 72

ttttcccact cttgtggtcc 20

<210> 73

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 73

ttcccattgg ctgctgtaag 20

<210> 74

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(ren)工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 74

ccaactgaac cacactttgc 20

<210> 75

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工(gong)序(xu)列(lie)

<220>

<223> PCR引物

<400> 75

tccatgaagt caatcctgaa g 21

<210> 76

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物(wu)

<400> 76

gaggcaggca aatctctgtg 20

<210> 77

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 77

tggttggttg gttggttagg 20

<210> 78

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物(wu)

<400> 78

tgaagcacaa aagccaactc 20

<210> 79

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 79

cggtggaacc aatgagaact 20

<210> 80

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引(yin)物(wu)

<400> 80

ctcaccctcc tagcatgagc 20

<210> 81

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工(gong)序列

<220>

<223> PCR引(yin)物(wu)

<400> 81

cggtggaacc aatgagaact 20

<210> 82

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序(xu)列

<220>

<223> PCR引物

<400> 82

gtcgtagtcc cctgtggaga 20

<210> 83

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(ren)工序(xu)列

<220>

<223> PCR引物(wu)

<400> 83

cggtggaacc aatgagaact 20

<210> 84

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(ren)工序列

<220>

<223> PCR引(yin)物(wu)

<400> 84

ttgcctccct ttttcttcct 20

<210> 85

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(lie)

<220>

<223> PCR引物(wu)

<400> 85

cggtggaacc aatgagaact 20

<210> 86

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 86

ccacaccgtt caccaaagta 20

<210> 87

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引(yin)物(wu)

<400> 87

gttgctgcag agaccgagac 20

<210> 88

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工(gong)序(xu)列(lie)

<220>

<223> PCR引物

<400> 88

gtcgtagtcc cctgtggaga 20

<210> 89

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(lie)

<220>

<223> PCR引物(wu)

<400> 89

ctggcagtga actctccaca 20

<210> 90

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(ren)工(gong)序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 90

ccacaccgtt caccaaagta 20