本發(fa)明涉及(ji)(ji)環(huan)肽(tai)領域，具體涉及(ji)(ji)一(yi)種環(huan)肽(tai)類抗真菌化(hua)合物(wu)及(ji)(ji)其制備方法(fa)。

背景技術：

棘白(bai)(bai)菌(jun)(jun)素(echinocandin)為寬(kuan)范圍的(de)一組抗(kang)真(zhen)菌(jun)(jun)劑，其典型的(de)包括環狀六肽和(he)親脂性(xing)(xing)(xing)尾端，后者通過酰胺鍵附(fu)接于六肽核心。盡管天然存在的(de)棘白(bai)(bai)菌(jun)(jun)素具有某種程度(du)的(de)抗(kang)真(zhen)菌(jun)(jun)活性(xing)(xing)(xing)，但(dan)它們并不適合(he)作(zuo)為治療劑，這主要是由于差的(de)水溶性(xing)(xing)(xing)、不充分的(de)功效，和(he)/或(huo)溶血作(zuo)用(yong)。通過全合(he)成或(huo)者通過對天然存在或(huo)天然產生的(de)前體進行合(he)成修飾(shi)或(huo)酶法改性(xing)(xing)(xing)獲得(de)的(de)棘白(bai)(bai)菌(jun)(jun)素化合(he)物(wu)(wu)被(bei)稱為半合(he)成棘白(bai)(bai)菌(jun)(jun)素化合(he)物(wu)(wu)。

已批準上市的(de)半合(he)成類棘(ji)白菌素(su)化(hua)合(he)物，包括(kuo)：阿尼芬凈(anidulafungin)、卡(ka)泊芬凈(caspofungin)和(he)米卡(ka)芬凈(micafungin)，它們(men)可用(yong)(yong)(yong)于治療真菌感染(ran)，特(te)別是由曲霉菌(Aspergillus)、芽生(sheng)菌(Blastomyces)、假絲酵母(Candida)、球孢(bao)子菌(Coccidioides) 和(he)組織(zhi)胞漿菌(Histoplasma) 引(yin)起(qi)(qi)的(de)真菌感染(ran)。其維持(chi)或改善對葡聚(ju)糖合(he)酶的(de)抑制(zhi)作用(yong)(yong)(yong)，但不引(yin)起(qi)(qi)溶血(xue)作用(yong)(yong)(yong)。

阿尼芬凈(jing)、米卡芬凈(jing)和卡泊芬凈(jing)都是由天然(ran)存(cun)在的(de)棘(ji)白(bai)菌素（例如棘(ji)白(bai)菌素B、紐莫(mo)康定A0 或紐莫(mo)康定B0）通過半(ban)(ban)合成得到。作為(wei)治療劑(ji)，它們在其全(quan)身(shen)的(de)半(ban)(ban)衰期、大(da)的(de)治療窗口(kou)、安全(quan)特性，及與其它藥(yao)物的(de)相(xiang)互(hu)作用(yong)的(de)相(xiang)對缺乏(fa)的(de)方面是有吸引(yin)力的(de)化(hua)(hua)合物。但(dan)由于這(zhe)些化(hua)(hua)合物水溶性差(cha)，腸道吸收率低，只能通過靜脈(mo)內給(gei)藥(yao)。并且(qie)臨床(chuang)上關于這(zhe)類產(chan)品(pin)種類相(xiang)對較少。開發半(ban)(ban)衰期長、抗(kang)菌譜廣的(de)新的(de)棘(ji)白(bai)菌素類藥(yao)物，提高患者用(yong)藥(yao)依從性，擴大(da)臨床(chuang)用(yong)藥(yao)品(pin)種，具有顯著的(de)意(yi)義。

技術實現要素：

為解決上述(shu)問題，本發明提供了(le)一種新(xin)的環六(liu)肽類(lei)抗真菌藥物，其具有增(zeng)加的水溶性，并且在體內半衰期長，治療指數高，具有對抗一種或(huo)多(duo)種真菌種類(lei)或(huo)屬的活性，具有靜脈內給藥適應性。

具(ju)體的，本發(fa)明提供了(le)一種式1化合(he)物：

，

或其(qi)藥學上(shang)可(ke)接受的鹽(yan)。

另一(yi)方面(mian)，本發明還提(ti)供了一(yi)種(zhong)藥用組合物(wu)，其(qi)包含本發明所(suo)提(ti)供的(de)(de)化合物(wu)，或其(qi)藥學(xue)上可接受的(de)(de)鹽，和(he)藥學(xue)上可接受的(de)(de)賦形劑。

在具體的實施方(fang)案中，藥(yao)用(yong)組合物(wu)包含本(ben)發(fa)明的化(hua)合物(wu)的乙酸鹽(yan)或(huo)鹽(yan)酸鹽(yan)。本(ben)發(fa)明的藥(yao)用(yong)組合物(wu)可被(bei)配制(zhi)為單位劑(ji)量形式或(huo)本(ben)文描(miao)述的任何其(qi)它劑(ji)型，供靜脈內、局部或(huo)口服(fu)給藥(yao)。

本領域熟(shu)知的(de)(de)(de)用于(yu)制(zhi)備制(zhi)劑(ji)(ji)的(de)(de)(de)方法例(li)如(ru)在“Remington: 藥物(wu)科學(xue)或實踐(The Science and Practice of Pharmacy)”(第20版, ed. A.R. Gennaro, 2000, Lippincott Williams & Wilkins)中(zhong)發現。胃腸外給(gei)藥的(de)(de)(de)制(zhi)劑(ji)(ji)，例(li)如(ru)含(han)(han)有(you)賦形劑(ji)(ji)、無菌(jun)水或鹽(yan)水，聚(ju)亞烷(wan)基二醇如(ru)聚(ju)乙二醇、植物(wu)來(lai)源的(de)(de)(de)油，或氫化萘。供吸入的(de)(de)(de)制(zhi)劑(ji)(ji)可(ke)(ke)包(bao)含(han)(han)賦形劑(ji)(ji)，例(li)如(ru)，乳(ru)糖，或可(ke)(ke)以(yi)是包(bao)含(han)(han)例(li)如(ru)，聚(ju)氧乙烯-9-十二烷(wan)基醚(mi)、羥(qian)乙酸鹽(yan)和去氧膽(dan)酸鹽(yan)的(de)(de)(de)水性(xing)溶(rong)液，或可(ke)(ke)以(yi)是以(yi)滴鼻(bi)劑(ji)(ji)形式給(gei)藥的(de)(de)(de)油性(xing)溶(rong)液，或作為(wei)凝膠劑(ji)(ji)。

用(yong)于口服利(li)用(yong)的(de)制劑(ji)包括片(pian)劑(ji)，本發明提供(gong)的(de)化合物和(he)至少一(yi)種藥學上(shang)可接(jie)受的(de)賦形(xing)劑(ji)。這些賦形(xing)劑(ji)可以是(shi)，例如惰性(xing)稀釋劑(ji)或填充劑(ji)（如，蔗糖和(he)山梨醇）、潤(run)滑劑(ji)、助流劑(ji)和(he)抗結合劑(ji)（如，硬脂(zhi)(zhi)酸(suan)鎂、硬脂(zhi)(zhi)酸(suan)鋅、硬脂(zhi)(zhi)酸(suan)、二氧化硅、氫化植物油或滑石粉(fen)）。用(yong)于口服利(li)用(yong)的(de)制劑(ji)也是(shi)咀嚼片(pian)、片(pian)劑(ji)、糖衣片(pian)，或膠(jiao)囊（即，作為硬明膠(jiao)膠(jiao)囊，其(qi)中的(de)活(huo)性(xing)成分與惰性(xing)固體稀釋劑(ji)混合，或作為軟(ruan)明膠(jiao)膠(jiao)囊）。

制劑中(zhong)的(de)(de)本發(fa)明提供的(de)(de)化合物的(de)(de)濃度將根據(ju)多種因素，包(bao)括(kuo)要(yao)給(gei)予的(de)(de)藥物劑量，以(yi)及(ji)給(gei)藥途徑(jing)而變(bian)化。

本發明所述化合(he)物(wu)藥學(xue)上(shang)可接受的(de)(de)(de)鹽(yan)，包括(kuo)但(dan)不限于(yu)，酸(suan)(suan)(suan)(suan)加成(cheng)鹽(yan)；通過用金屬(shu)(shu)(shu)，如堿金屬(shu)(shu)(shu)或(huo)堿土金屬(shu)(shu)(shu)鹽(yan)（如，鈉、鋰、鉀、鎂或(huo)鈣鹽(yan)）；或(huo)常用于(yu)制藥工業的(de)(de)(de)金屬(shu)(shu)(shu)復(fu)合(he)物(wu)替代(dai)酸(suan)(suan)(suan)(suan)性(xing)質(zhi)子而形成(cheng)的(de)(de)(de)金屬(shu)(shu)(shu)鹽(yan)。酸(suan)(suan)(suan)(suan)加成(cheng)鹽(yan)的(de)(de)(de)實例(li)包括(kuo)有(you)機(ji)酸(suan)(suan)(suan)(suan)如乙酸(suan)(suan)(suan)(suan)、乳(ru)酸(suan)(suan)(suan)(suan)、撲酸(suan)(suan)(suan)(suan)、馬來(lai)酸(suan)(suan)(suan)(suan)、檸檬酸(suan)(suan)(suan)(suan)、蘋果酸(suan)(suan)(suan)(suan)、抗(kang)壞血酸(suan)(suan)(suan)(suan)、琥珀酸(suan)(suan)(suan)(suan)、苯甲(jia)酸(suan)(suan)(suan)(suan)、棕櫚(lv)酸(suan)(suan)(suan)(suan)、辛二酸(suan)(suan)(suan)(suan)、水楊酸(suan)(suan)(suan)(suan)、酒石酸(suan)(suan)(suan)(suan)、甲(jia)烷磺酸(suan)(suan)(suan)(suan)、甲(jia)苯磺酸(suan)(suan)(suan)(suan)或(huo)三氟(fu)乙酸(suan)(suan)(suan)(suan)；聚合(he)酸(suan)(suan)(suan)(suan)如丹寧酸(suan)(suan)(suan)(suan)，和(he)羧甲(jia)基(ji)纖維素(su)；和(he)無機(ji)酸(suan)(suan)(suan)(suan)如鹽(yan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)、氫(qing)溴酸(suan)(suan)(suan)(suan)、硫酸(suan)(suan)(suan)(suan)、磷酸(suan)(suan)(suan)(suan)。金屬(shu)(shu)(shu)復(fu)合(he)物(wu)包括(kuo)鋅，和(he)鐵，及(ji)其它等(deng)。

另一方面，本(ben)發明還(huan)提(ti)供了包(bao)含本(ben)發明的(de)(de)化合物(wu)的(de)(de)藥物(wu)組(zu)合物(wu)在治療(liao)哺乳動(dong)物(wu)真菌(jun)(jun)(jun)感染中(zhong)的(de)(de)用途。進一步的(de)(de)，所述真菌(jun)(jun)(jun)感染選自頭皮癬(xian)(xian)、體(ti)癬(xian)(xian)、腳(jiao)癬(xian)(xian)、甲(jia)癬(xian)(xian)、甲(jia)周癬(xian)(xian)、變色性(xing)皮癬(xian)(xian)、陰(yin)道念(nian)(nian)珠(zhu)(zhu)(zhu)菌(jun)(jun)(jun)病(bing)(bing)(bing)、呼吸道念(nian)(nian)珠(zhu)(zhu)(zhu)菌(jun)(jun)(jun)病(bing)(bing)(bing)、膽(dan)道念(nian)(nian)珠(zhu)(zhu)(zhu)菌(jun)(jun)(jun)病(bing)(bing)(bing)、食道念(nian)(nian)珠(zhu)(zhu)(zhu)菌(jun)(jun)(jun)病(bing)(bing)(bing)、尿(niao)道念(nian)(nian)珠(zhu)(zhu)(zhu)菌(jun)(jun)(jun)病(bing)(bing)(bing)、全(quan)身性(xing)念(nian)(nian)珠(zhu)(zhu)(zhu)菌(jun)(jun)(jun)病(bing)(bing)(bing)、粘膜與皮膚念(nian)(nian)珠(zhu)(zhu)(zhu)菌(jun)(jun)(jun)病(bing)(bing)(bing)、曲霉(mei)病(bing)(bing)(bing)、毛霉(mei)病(bing)(bing)(bing)、副球孢(bao)子菌(jun)(jun)(jun)病(bing)(bing)(bing)、北美芽生(sheng)菌(jun)(jun)(jun)病(bing)(bing)(bing)、組(zu)織胞漿(jiang)菌(jun)(jun)(jun)病(bing)(bing)(bing)、球孢(bao)子菌(jun)(jun)(jun)病(bing)(bing)(bing)、真菌(jun)(jun)(jun)性(xing)鼻(bi)竇炎或(huo)慢性(xing)副鼻(bi)炎。

本發明的(de)化合物I，如(ru)在實施例(li)中所述，通過(guo)在標準(zhun)反應條件下(xia)，使棘白菌素類(lei)化合物與合適的(de)酰(xian)基(ji)、烷基(ji)、羥基(ji)和(he)/或氨(an)基(ji)基(ji)團的(de)偶合官能化或非官能化來合成。例(li)如(ru)，棘白菌素B ( Echinocandin B，簡稱ECB)可由構(gou)巢(chao)曲(qu)霉(Aspergilus nidulans)代謝產生，其結構(gou)如(ru)下(xia)：

。

棘(ji)白菌素B經(jing)脫酰酶作(zuo)用(yong)，得到環(huan)肽母核(Echinocandin B Nucleus，ECBN)，環(huan)肽母核再經(jing)過(guo)化學修飾可制備得到阿尼芬(fen)凈(jing)。美國專利US7785826B2詳細介紹了ECB 轉化ECBN 的工(gong)(gong)藝。此(ci)工(gong)(gong)藝主要流程(cheng)包(bao)括：將ECB 發酵完成以后，離心(xin)獲得菌絲(si)體(ti)，把菌絲(si)體(ti)重新(xin)懸浮(fu)于水中(zhong)然后加入純化的脫酰酶。CN102618606B、EP0561639B1等文獻也公開了ECB轉化ECBN的方法(fa)。

ZL95196643.X說(shuo)明書部(bu)分實施例156公開了化(hua)合物1側(ce)鏈MFE的制(zhi)備方法；US7199248B2也公開了化(hua)合物I側(ce)鏈MFE及其活化(hua)形式的制(zhi)備方法，

。

化合物1母核(ANL)的(de)制備(bei)(bei)可采(cai)用ECBN與MFE或其活化物反(fan)應制備(bei)(bei)獲得，反(fan)應式如下：

；

其中(zhong)(zhong)，ECBN與MFE活化物(wu)反(fan)應(ying)條件類似US7199248B2中(zhong)(zhong)公開的FR179642與MFE活化物(wu)反(fan)應(ying)的條件進行(xing)操(cao)作（在本發(fa)明具體(ti)實(shi)施(shi)例中(zhong)(zhong)也有(you)舉例說明）。

對于本發明的(de)(de)化合物(wu)的(de)(de)半合成途(tu)徑，化合物(wu)的(de)(de)立(li)體化學通(tong)過起(qi)始原料確定。因此(ci)，半合成的(de)(de)棘(ji)白菌(jun)素衍生物(wu)的(de)(de)立(li)體化學具有與其(qi)從中衍生的(de)(de)天然存(cun)在的(de)(de)棘(ji)白菌(jun)素構型(xing)相同的(de)(de)立(li)體化學。

因此，本發明的棘白(bai)菌素(su)類(lei)化合物可衍生自環狀肽抗(kang)真菌劑，如(ru)棘白(bai)菌素(su)B、棘白(bai)菌素(su)B母核（ECBN）、阿(a)尼芬凈(jing)。

另一方(fang)面，本發(fa)明還提供了化合物(wu)ANM的新晶(jing)型，其具有基本如圖3所示的X-射線粉末衍(yan)射（XRPD）譜(pu)圖。

其中(zhong)XRPD 測(ce)試(shi)使用(yong)Panalytical（帕納科）公(gong)司(si)的XPERT-3型X射(she)線衍(yan)射(she)儀。測(ce)試(shi)方法是(shi)，將約(yue)10 毫克(ke)樣(yang)品均(jun)勻平(ping)鋪(pu)在單(dan)晶硅樣(yang)品盤上，用(yong)以下描述參數進行XRPD 測(ce)試(shi)：

。

本發明提(ti)供的(de)帶有獨特(te)兩親性基(ji)團(tuan)的(de)環六肽化(hua)合物，特(te)別(bie)能增強(qiang)抗真菌效力，尤其是體內抗菌活性。

本發(fa)明(ming)的(de)化合物在(zai)水中與阿尼(ni)芬(fen)(fen)凈(jing)相比較(jiao)(jiao)具(ju)有增加的(de)溶解性；本發(fa)明(ming)化合物最低(di)抑菌濃度(du)優于阿尼(ni)芬(fen)(fen)凈(jing)，并且(qie)體內(nei)半衰期顯著長于阿尼(ni)芬(fen)(fen)凈(jing)，另外(wai)，與阿尼(ni)芬(fen)(fen)凈(jing)相比，本發(fa)明(ming)化合物體內(nei)分布體積較(jiao)(jiao)大(da)。

附圖說明

圖1顯示的是(shi)化合物(wu)1對系統性念珠菌感染小鼠腎臟載菌量的影響。

圖(tu)2顯示(shi)的(de)是(shi)化合(he)物ANM的(de)紅(hong)外譜圖(tu)。

圖3顯示的是化合物ANM的X-射(she)線(xian)粉末(mo)衍射(she)譜圖。

具體實施例：

下面結合具(ju)(ju)體實(shi)(shi)(shi)施(shi)例，進一步闡述本發明(ming)。應(ying)理解，這些實(shi)(shi)(shi)施(shi)例僅(jin)用(yong)于(yu)(yu)說明(ming)本發明(ming)而不(bu)用(yong)于(yu)(yu)限制(zhi)本發明(ming)的(de)(de)(de)(de)范圍(wei)。下列實(shi)(shi)(shi)施(shi)例中(zhong)(zhong)未注明(ming)具(ju)(ju)體條件(jian)的(de)(de)(de)(de)實(shi)(shi)(shi)驗方(fang)(fang)法(fa)，通常按(an)照常規條件(jian)或(huo)按(an)照制(zhi)造廠商所(suo)(suo)建議的(de)(de)(de)(de)條件(jian)。除(chu)非(fei)另外(wai)說明(ming)，否則所(suo)(suo)有的(de)(de)(de)(de)百分數、比率(lv)、比例、或(huo)份數按(an)重量計，除(chu)非(fei)另行定義(yi)，文中(zhong)(zhong)所(suo)(suo)使用(yong)的(de)(de)(de)(de)所(suo)(suo)有專業與科(ke)學用(yong)語與本領域熟練(lian)人(ren)員所(suo)(suo)熟悉(xi)的(de)(de)(de)(de)意義(yi)相同。此外(wai)，任何與所(suo)(suo)記(ji)載內(nei)容(rong)相似或(huo)均等的(de)(de)(de)(de)方(fang)(fang)法(fa)及材料(liao)皆可應(ying)用(yong)于(yu)(yu)本發明(ming)方(fang)(fang)法(fa)中(zhong)(zhong)。文中(zhong)(zhong)所(suo)(suo)述的(de)(de)(de)(de)較佳實(shi)(shi)(shi)施(shi)方(fang)(fang)法(fa)與材料(liao)僅(jin)作(zuo)示(shi)范之用(yong)。

實施例1：化合(he)物ANL的制(zhi)備

將化(hua)(hua)合(he)(he)物ANA（5g），化(hua)(hua)合(he)(he)物MFE1(3.1g)，磷酸(suan)氫二鉀（1.8g）加入至(zhi)丙酮和(he)純化(hua)(hua)水（4:1，v/v）的混合(he)(he)溶液（50ml），反應(ying)(ying)液升溫至(zhi)55℃±5℃反應(ying)(ying)2h后，趁熱過濾，濾液旋干，真(zhen)空干燥(zao)得(de)7.0g目標化(hua)(hua)合(he)(he)物ANL。

實施例2：化(hua)合物(wu)ANP的制備

（1）化合(he)物（ANL苯硼酸脂）制備(bei)

室溫氮氣保護下，將化合物ANL(7.0g)加(jia)入(ru)至無水(shui)(shui)(shui)四氫呋喃（35ml）中，然后(hou)加(jia)入(ru)苯硼(peng)酸（0.98g），攪(jiao)拌1h，室溫脫(tuo)溶(rong)(rong)至干(gan)，加(jia)入(ru)無水(shui)(shui)(shui)四氫呋喃（42ml）攪(jiao)拌0.5h后(hou)，脫(tuo)溶(rong)(rong)，除水(shui)(shui)(shui)，反復兩次(ci)。加(jia)入(ru)無水(shui)(shui)(shui)四氫呋喃（21ml）和無水(shui)(shui)(shui)乙腈（42ml）溶(rong)(rong)解(jie)攪(jiao)拌0.5h，脫(tuo)溶(rong)(rong)，除水(shui)(shui)(shui)，固體真(zhen)空干(gan)燥過夜。

（2）氯化膽(dan)堿的(de)反應前(qian)處理

室溫氮氣保護下，將氯化膽堿（25.97g）加入(ru)至(zhi)無水乙(yi)腈（210ml）中，超(chao)聲(sheng)溶解，然后室溫脫溶，重復加入(ru)無水乙(yi)腈（210ml），超(chao)聲(sheng)，脫溶。固體真空干燥過夜。

（3）化合(he)物ANP的(de)制(zhi)備

室(shi)溫氮(dan)氣保護下(xia)，將步(bu)驟（2）制(zhi)備(bei)的(de)干(gan)燥的(de)氯化膽堿加入至無水乙腈（70ml）中，加入三氟乙酸（17.5ml），攪(jiao)拌至溶(rong)清，快(kuai)速加入步(bu)驟（1）制(zhi)備(bei)的(de)干(gan)燥的(de)ANL苯硼酸脂，室(shi)溫氮(dan)氣保護下(xia)攪(jiao)拌2.5h。反應液滴加純(chun)化水（175ml），得到(dao)含化合(he)物ANP的(de)無色(se)澄清溶(rong)液。

實施例3：化合(he)物ANM的制備

將實(shi)施例2制備(bei)的含化(hua)合物ANP的無色澄清溶(rong)液通(tong)過0.45μm有(you)機膜過濾(lv)，濾(lv)液通(tong)過C18，10μm填料制備(bei)柱制備(bei)純化(hua)，制備(bei)方法如下表(biao)1所述：流(liu)動相分別為乙腈(jing)、1‰醋酸/水，

表1：制備方法

，

分段收(shou)集洗脫液(ye)，得(de)到化合(he)物ANM，凍干(gan)得(de)目(mu)標(biao)產物1.5g，收(shou)率：30%，HPLC：97.3%。化合(he)物ANM的紅外譜(pu)圖(tu)如圖(tu)2所示，其X-射線粉末(mo)衍射譜(pu)圖(tu)如圖(tu)3。

實施例4：化合物1的制備

用膽堿氯化物(13 mg，0.093 mmol) 和HCl (4M在1,4- 二氧六環中，1.0μL，0.004mmol) 處理溶于無水DMSO (0.2 mL)中的化合物ANL(4.5mg ；0.004 mmol)。將生成的溶液于室溫下攪拌2天并于40℃加熱約8小時，然后用水和乙腈稀釋并經制備型RP HPLC 純化，用水(0.1% TFA)/CH₃CN (0.1% TFA) 洗脫。產物經凍干分離，得到2.4mg化合物1。ESI⁺ m/z：1216.58 [M]⁺。

實施例5 化合物X的制備

用膽堿氯化物（13 mg；0.093 mmol）和HCl（4M在1,4-二氧六環中；1.0μL；0.004mmol）處理溶于無水DMSO（0.2 mL）中的阿尼芬凈（5 mg；0.004 mmol）。將生成的溶液于室溫下攪拌2天并于40℃加熱約8小時，然后用水和乙腈稀釋并經制備型RP HPLC 純化，用水（0.1% TFA）/CH3CN（0.1% TFA）洗脫。產物經凍干分離，得到2.0 mg 化合物X，為白色固體。HPLC T_R 10.84 min (90%)。LC/MS，ESI⁺ m/z 1225.60 [M]⁺。

實施例6體外對念珠菌屬的最低(di)抑菌濃度(du)（minimal inhibitory concentration, MIC）的測定(ding)

按照臨床和實驗室標準品研究所(Clinical and Laboratory Standards Institute) M27-A3文件所述的程序進行。取無菌96孔板，于每排1號孔加 RPMI 1640培養液200μl作空白對照；96孔板每排3～12號孔各加RPMI 1640培養液100 μl；2號孔分別加RPMI 1640培養液180μl 和640μg/ml 抗真菌化合物溶液20 μl，充分混勻；每排為1個待篩選化合物；最后一排為質控氟康唑；2～11號孔10 級倍比稀釋，使各孔的最終藥物濃度分別為64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25和0.125 μg/ml，各孔中DMSO含量均低于1％；12號孔不含藥物，作陽性對照；將受試菌株于SDA平皿上活化2次，以保證其活力；將活化菌株劃線接種于SDA平皿，35℃培養24小時；挑取直徑>1mm的菌落5個，將其溶解于滅菌三蒸水中，于振蕩器上震蕩15秒制備成菌懸液；用血細胞計數板將菌懸液濃度用RPMI 1640培養液調整至1×10⁶~5×10⁶(相當于麥氏濁度0.5)CFU/ml將上述已經配置好的菌懸液用RPMI 1640培養液稀釋1000倍(首先稀釋50倍，然后稀釋20倍)，使其濃度介于1×10³~5×10³ CFU/ml之間。菌懸液稀釋至1×10³~5×10³ CFU/ml之間后，用多道移液器將菌液接終至96孔板第2~12號孔，最終接種濃度為0.5×10³~2.5×10³ CFU/ml；96孔板最后一(yi)排為質控菌(jun)株近平滑念珠菌(jun)ATCC22019。新(xin)型隱球菌(jun)孵箱(xiang)中(zhong)孵箱(xiang)中(zhong)35℃培養72小(xiao)時后觀察結果(guo)，其他念珠菌(jun)35℃培養24小(xiao)時后觀察結果(guo)。

實驗結果如下表1和2所示。

表1：對念珠菌（國際標準株）的MIC值

，

由上述結果(guo)(guo)可看(kan)成，本發(fa)明化(hua)合物1對國際標準株念珠(zhu)(zhu)菌(jun)和臨床分離(li)株的(de)念珠(zhu)(zhu)菌(jun)具有較(jiao)(jiao)好的(de)抑菌(jun)效果(guo)(guo)，其與阿(a)尼芬凈相比體外具有類似的(de)抗念珠(zhu)(zhu)菌(jun)譜和較(jiao)(jiao)優的(de)抗念珠(zhu)(zhu)菌(jun)活性(xing)。

表2：對念珠菌（臨床分離株）的MIC值

。

實施例7體外對(dui)絲(si)狀菌的最(zui)低抑菌濃度(MIC)/最(zui)低有效濃度（MEC）的測定

按照臨床和實驗室標準品研究所(Clinical and Laboratory Standards Institute) M38-A2文件所述的程序進行。取無菌 96 孔板，于每排 1 號孔加 RPMI 1640培養液200 μl 作空白對照；96孔板每排3～12 號孔各加RPMI 1640培養液100 μl；96孔板每排2 號孔分別加RPMI 1640培養液180μl 和640μg/ml 抗真菌化合物溶液20 μl，充分混勻；每排為1個待篩選化合物；最后一排為質控伏立康唑；2～11 號孔10 級倍比稀釋，使各孔的最終藥物濃度分別為 64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25和0.125 μg/ml，各孔中DMSO含量均低于1％；12 號孔不含藥物，作陽性對照；將受試菌株于PDA平皿上活化7天，以誘導分生孢子以及孢囊孢子的形成；在孵育7天的菌落上加入含有0.01ml吐溫20（1滴）的0.85%鹽水1ml，制備菌懸液；菌懸液靜置3～5 min 后,大顆粒沉于底部,取上層均質液體(含孢囊孢子或分生孢子以及菌絲片段)；用血細胞計數板將菌懸液濃度用RPMI 1640培養液調整至1×10⁶~5×10⁶CFU/ml將上述已經配置好的菌懸液用RPMI 1640培養液稀釋250倍(首先稀釋25倍，然后稀釋10倍)，使其濃度介于0.4×10⁴~2×10⁴ CFU/ml之間。菌懸液稀釋至0.4×10⁴~2×10⁴ CFU/ml之間后，用多道移液器將菌液接終至96孔板第2~12號孔，最終接種菌懸液濃度為0.2×10⁴~1×10⁴CFU/ml。孵箱中35℃培養48小時后觀察(cha)結果(guo)（皮膚癬菌7天后觀察(cha)結果(guo)）。

實驗結果見表3。

表3：對絲狀菌（國際標準株）的MIC和MEC值

，

由(you)上述結果(guo)可以看出化合(he)物1對絲(si)狀(zhuang)真菌(jun)也(ye)具有較好的(de)(de)抑菌(jun)效果(guo)，其與阿尼(ni)芬凈體(ti)外具有相似(si)的(de)(de)抗(kang)菌(jun)譜和較優的(de)(de)抗(kang)絲(si)狀(zhuang)真菌(jun)活性

實施例8 化合物1在比(bi)格犬體內藥代動力學(xue)研究

選取17~20月齡雄性比格犬9條（北京瑪斯生物技術有限公司），動物飼養在普通動物房內。動物房通風良好，裝備空調，溫度保持在18~26 °C，濕度保持在40%~70%。明暗照明各12小時，每只犬獨立飼養，可自由進食和飲水。經獸醫檢驗合格后，入選本實驗。比格犬每只犬均用耳部紋身標記，并在籠具上標注試藥編號、劑量。實驗前一天，比格犬禁食過夜，給藥4 h后可恢復進食，實驗過程中可自由飲水。阿尼芬凈組比格犬分別進行10 min靜脈推注1 mg/kg 阿尼芬凈溶液，于給藥前及推注完成后5、15、30 min、1、2、4、8、12、24、48和72 h，由頸靜脈采血0.5 mL，置于含K₂-EDTA抗凝劑試管中。化合物X組比格犬分別進行10 min靜脈推注1 mg/kg 化合物X溶液，于給藥前及推注完成后5、15、30 min、1、2、4、8、12、24、48、72、96、120、144和168 h，由頸靜脈采血0.5 mL，置于含K₂-EDTA抗凝劑試管中。化合物1組比格犬分別進行10 min靜脈推注1 mg/kg BG-10048溶液，于給藥前及推注完成后5、15、30 min、1、2、4、8、12、24、48、72、96、120、144和168 h，由頸靜脈采血0.5 mL，置于含K₂-EDTA抗凝(ning)劑試(shi)管中(zhong)。采(cai)集的全血樣(yang)品(pin)(pin)在離心前都置于(yu)冰上，同一時(shi)間點采(cai)集的全血樣(yang)品(pin)(pin)需(xu)在采(cai)集完成半(ban)小時(shi)內離心完，低溫(wen)離心（5500 rpm）10 min后分(fen)離血漿(jiang)(jiang)，保存(cun)在-70 °C冰箱(xiang)。建立測定比格犬(quan)血漿(jiang)(jiang)中(zhong)阿尼(ni)芬凈、化(hua)(hua)合物X和化(hua)(hua)合物1濃(nong)度(du)(du)的LC-MS/MS分(fen)析(xi)方法，用(yong)(yong)于(yu)本(ben)實(shi)驗(yan)(yan)獲得(de)的生物樣(yang)品(pin)(pin)的濃(nong)度(du)(du)測定。采(cai)用(yong)(yong)Pharsight Phoenix 6.3中(zhong)的非房室模型(xing)計算藥(yao)代動力學(xue)參數，并計算絕對(dui)生物利用(yong)(yong)度(du)(du)。實(shi)驗(yan)(yan)結果(guo)見(jian)表4。

表4：

，

從上表可看(kan)出，比格犬靜(jing)脈注射(she)給予阿尼芬(fen)凈(jing)、化合物(wu)X和(he)(he)化合物(wu)1后半(ban)衰期分別為(wei)17、65和(he)(he)71 h。化合物(wu)X和(he)(he)化合物(wu)1具有較(jiao)大的(de)(de)分布體積和(he)(he)較(jiao)長的(de)(de)半(ban)衰期。這些藥(yao)(yao)代動(dong)力學特性可提供(gong)諸(zhu)如降(jiang)低的(de)(de)給藥(yao)(yao)量(liang)、減少的(de)(de)給藥(yao)(yao)頻(pin)率，和(he)(he)/或在治療/預防某些真菌感染(ran)中的(de)(de)改進的(de)(de)功(gong)效(xiao)的(de)(de)優點。

實施例9化(hua)合物1對系統性(xing)念珠菌感染小(xiao)鼠腎臟載菌量的(de)影響(xiang)

選取6~8周齡雄性C57小鼠20只，隨機分為5組。實驗動物飼養在SPF動物房內。動物房通風良好，裝備空調，溫度保持在20~25 °C，濕度保持在40%~70%，明暗照明各12小時，實驗動物能自由進食和飲水。正常喂養7天后，經獸醫檢驗，體征狀況良好小鼠可入選本實驗。每只小鼠均用尾標號標記。動物分別于接菌前4天和1天腹腔注射150 mg/kg環磷酰胺。將受試白念珠菌SC5314于SDA平皿上活化2次，以保證其活力。將活化菌株劃線接種于SDA平皿，35℃培養24小時；挑取直徑>1mm克隆，將其接種于YPD培養基中，過夜培養。將上述菌液調整至1×10⁴ CFU/ml用于系統性真菌感染動物模型復制。實驗動物尾靜脈注射1×10⁴ CFU/ml復制系統性真菌感(gan)染模型(xing)。模型(xing)復制后2小(xiao)時，四組(zu)動(dong)物(wu)(wu)分別腹腔注射給予溶劑對照、4.5 mg/kg的阿(a)尼(ni)芬凈、1.5 mg/kg的化(hua)合(he)物(wu)(wu)X和(he)4.5 mg/kg的化(hua)合(he)物(wu)(wu)1。給藥(yao)12小(xiao)時后，處死所有動(dong)物(wu)(wu)，取雙(shuang)側腎臟(zang)，加入(ru)2ml PBS緩沖液進行勻(yun)漿(jiang)，將勻(yun)漿(jiang)液涂布(bu)于SDA平皿上，35℃培養48小(xiao)時，計算單(dan)位重量(liang)腎臟(zang)組(zu)織內(nei)的菌落數(shu)。實驗結果見下表5和(he)圖1。

表5：化合物1對系統性(xing)念(nian)珠菌(jun)感染(ran)小(xiao)鼠腎臟載(zai)菌(jun)量的影響

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由表(biao)5可看出，模型(xing)對照組(zu)、阿(a)(a)尼(ni)芬凈組(zu)、化(hua)合(he)物(wu)(wu)(wu)X組(zu)和(he)化(hua)合(he)物(wu)(wu)(wu)1組(zu)給藥12小時后腎臟載(zai)菌(jun)(jun)量(liang)分別為4.69、3.86、3.87和(he)2.89 Log 10 CFU/g。給藥后阿(a)(a)尼(ni)芬凈與化(hua)合(he)物(wu)(wu)(wu)X腎臟載(zai)菌(jun)(jun)量(liang)顯著低于模型(xing)組(zu)，表(biao)明(ming)阿(a)(a)尼(ni)芬凈和(he)化(hua)合(he)物(wu)(wu)(wu)X具(ju)有良(liang)好(hao)的(de)體(ti)內抗真菌(jun)(jun)活性。化(hua)合(he)物(wu)(wu)(wu)1腎臟載(zai)菌(jun)(jun)量(liang)顯著低于阿(a)(a)尼(ni)芬凈組(zu)和(he)化(hua)合(he)物(wu)(wu)(wu)X組(zu)，表(biao)明(ming)化(hua)合(he)物(wu)(wu)(wu)1比(bi)阿(a)(a)尼(ni)芬凈和(he)化(hua)合(he)物(wu)(wu)(wu)X具(ju)有更好(hao)的(de)體(ti)內抗真菌(jun)(jun)活性。

實施例10 化合物ANM的溶解性測試

在各種不同pH條件下測(ce)定化(hua)合物ANM和阿尼(ni)芬(fen)凈的溶解性(xing)，以評價該(gai)化(hua)合物在含水載體中的經注(zhu)射給藥（如(ru)靜脈內(nei)或肌內(nei)注(zhu)射）的制(zhi)劑(ji)的適應性(xing)。實驗結果發現化(hua)合物ANM與阿尼(ni)芬(fen)凈相比(bi)，在較(jiao)大pH范圍內(nei)（pH 1~8）均具有更優(you)的溶解性(xing)。