技術領域：
本發明屬于工業微生物
技術領域：
，具體涉及一種高純度的環己肽類化合物FR179642的制備方法。
背景技術：
：真菌對于健康人體而言通常是條件致病菌，當肌體免疫力下降，外部因素不良時，就可能造成局部或全身真菌感染。近年來，隨著廣譜抗生素免疫抑制劑和糖皮質激素的不當應用以及器官移植、放療化療、外科介入等的廣泛應用，導致深部真菌感染發病率日益增高。真菌感染會侵犯內臟器官和深部組織，因此，有效控制深部真菌病具有十分重要的臨床意義。棘白菌素類是近年來新上市的一種抗真菌藥物，能抑制真菌細胞壁的β-1,3-D-葡萄糖合成酶，由于哺乳動物細胞缺乏β-1,3-D-葡萄糖合成酶，故該類化合物對真菌細胞具有高度的特異性，能迅速殺滅真菌而對人體正常細胞影響較小，因而療效好，安全性高。目前已上市的此類藥物有：卡泊芬凈、米卡芬凈和阿尼芬凈。米卡芬凈(Micafungin，其結構式如式1所示)由日本藤澤公司開發，于2002年12月在日本上市，商品名為Fungusrd，2005年3月通過美國FDA認證，目前被批準用于治療食道念珠菌感染、骨髓移植及ADS患者中性粒細胞減少癥的預防治療。米卡芬凈由環己肽類化合物FR179642(結構式如式2所示)修飾而得到的水溶性半合成的新型抗真菌藥，環己肽類化合物FR179642是鞘莖點霉Coleophomaempetri發酵代謝產物。因此，要得到高純度的米卡芬凈，純度高的式2即環己肽類化合物FR179642是關鍵。式1：米卡芬凈式2：FR179642目前，關于環己肽類化合物FR179642提取分離的文獻報道較少。中國專利CN102443050A披露了以一種環脂肽化合物為前體通過酶解掉側鏈得到FR179642，并報道了該種前體環脂肽化合物的分離提純方法，但沒有涉及到FR179642的提純方法。此外還有文獻中報道由FR179642制備米卡芬凈的合成方法(Ueda,S.；Ezaki,M.；Tanaka,M.；etal.StudiesonanovellipopeptideacylasefromStreptomycesspp.forproductionofFR179642,akeyintermediateofantifungallipopeptidedrugFK463.38thIntersciConfAntimicrobAgentsChemother(Sept241998,SanDiego)1998,AbstF-145)。中國專利CN201110244301.5公開了一種純化環己肽類化合物FR179642的方法：將發酵液過濾后進行樹脂吸附、解吸、濃縮、結晶后得到環己肽類化合物FR179642粗品，然后再借助反向填料C18對粗提物進行層析分離，最后得到較高純度(98.1％～98.6％)的環己肽類化合物FR179642。與本發明技術方案相比，現有技術有如下缺點：1)進行樹脂吸附后再進行反向填料層析分離，增加了操作步驟和生產成本；2)借助反向填料C18，價格較貴；3)解吸、結晶、層析分離過程中均使用了甲醇這種有毒溶劑，對操作人員的身體健康構成威脅，且對環境造成污染，不適合工業化大規模生產。因此，本領域急需找到一種操作步驟簡單、減小生產成本的純化方法，克服上述現有技術中存在的缺陷，并且，同時能進一步提高環己肽類化合物FR179642產品的純度。技術實現要素：本發明的目的在于開發一種操作簡便、所用溶劑毒性低、適合于工業生產的環己肽類化合物FR179642的制備方法，其特征在于采用大孔樹脂提取分離FR179642，工藝簡單易行，適宜于工業化生產；并通過低溫重結晶進一步純化，以制備高純度的環己肽類化合物FR179642產品。本發明提供了一種環己肽類化合物FR179642的純化方法，所述的方法包括如下步驟：1)向環己肽類化合物FR179642的發酵液中加入助濾劑，攪拌均勻；2)將步驟1)中加入助濾劑的發酵液進行過濾或者離心，得到環己肽類化合物FR179642的濾液，并將濾液濃縮；3)將步驟2)中的濃縮液導入大孔吸附樹脂進行富集；4)將極性溶劑與水混合而成的溶液作為解吸液對上述大孔吸附樹脂進行解吸并收集，得到解吸混合液；5)向解吸混合液中加入脫色物質，攪拌均勻、過濾，得到脫色液；6)將脫色液濃縮，結晶，真空加熱干燥，得到環己肽類化合物FR179642的精粉。其中，步驟1)中的助濾劑為珍珠巖或硅藻土，其用量為發酵液的2～6％(w/v)。步驟2)中的固液分離方式為離心或板框過濾。步驟2)和步驟6)中的濃縮方法為納濾、旋蒸或閃蒸中的一種或多種，步驟2)濃縮至濃縮液中環己肽類化合物FR179642含量為1mg/ml～10mg/ml，步驟6)濃縮至濃縮液中環己肽類化合物FR179642含量為10mg/ml～50mg/ml。步驟3)中的大孔吸附樹脂是非極性或中等極性吸附樹脂。步驟3)中的大孔吸附樹脂選自XAD1600、XAD16HP、XAD1180、XAD7HP、XAD18、XAD16N或XAD761，樹脂柱徑高比為1/5～1/10，其用量與納濾濃縮液中環己肽類化合物FR179642粗品的體積重量比為70～150：1(ml/g)，吸附流速為0.8～3.2BV/h。步驟4)在解吸前，需用純化水水洗大孔吸附樹脂3～7BV，流速1～2BV；解吸極性溶劑為異丙醇、乙醇、丙酮中的一種，含量為2％～15％(v/v)，體積為2～10BV，流速為0.5～2.0BV；解吸后，收集產品含量在500μg/ml，純度在90％以上的組分，組成解吸混合液。步驟5)中的脫色物質為767針用活性炭，加入量為0.05～0.15％(w/v)，優選0.08～0.10％；攪拌脫色時間為10～60min，優選20～30min。步驟6)中的結晶溫度控制在0～25℃，優選10～15℃；結晶時間為2～16h，優選8～12h；真空加熱干燥溫度控制在25～30℃，干燥時間為4～16h。步驟6)中結晶可以為一次結晶或重復多次結晶，重復結晶時可采用純化水作為溶劑溶解前次結晶品，用量為每克濕晶體需加入純化水0.5～5ml。環己肽類化合物FR179642是合成新型抗真菌藥米卡芬凈的關鍵中間體，本發明所得的FR179642產品的含量為97％(重量)以上，純度高達99％以上，樣品總的回收率大于60％。相對于現有技術，本發明的主要優點在于：1、本發明提供了一種成本低廉的純化環己肽類化合物，特別是棘白菌素類化合物FR179642的新方法；2、本發明采用大孔吸附樹脂結合使用脫色劑和低溫重結晶的方法對環己肽類化合物FR179642進行純化，具有純化路線短、純化條件溫和、產品收率高、操作簡便等優點，在較大程度上減輕了工藝操作和對設備的要求，降低了生產成本；3、本發明在采用低濃度的極性有機溶劑(2％～15％)做洗脫劑，洗脫效率高，大大提高產品的收率，洗脫液用量較少(洗脫液體積為2～10倍濃縮液體積)，對環境污染小，對操作人員危害較小；4、本發明后處理過程加入脫色劑對產品進行處理，可顯著提高產品色澤和純度；5、本發明提供的方法制備的環己肽類化合物FR179642精粉較穩定，純度高，有利于終產品的質量控制，適宜于工業化生產；6、使用本發明提供的方法制備的目標產物FR179642完全可以滿足合成新型抗真菌藥米卡芬凈要求，便于米卡芬凈規模化合成。附圖說明圖1為實施例1中FR179642發酵液濾液的HPLC圖譜。圖2為實施例1中FR179642一次結晶潮品的HPLC圖譜。圖3為實施例1中FR179642二次結晶精粉的HPLC圖譜。具體實施例下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不意味著對本發明有任何限制。本發明所用的環己肽類化合物FR179642發酵液為重慶乾泰生物醫藥有限公司發酵部門用微生物培育手段，得到的FR179642發酵液或者現有技術中公開的方法制備得到含有FR179642的發酵液，包括但不限于CN102443050A、CN201110244301.5公開的方法得到的FR179642發酵液；XAD1600樹脂、XAD1180樹脂均來自于鄭州勤實科技有限公司；乙醇、丙酮等溶劑均為市售。本發明所用的高效液相色譜儀為島津公司。下述實施例中環己肽類化合物FR179642HPLC檢測所用的方法：反相HPLC分析采用的色譜柱為C18柱(4.6mm*250mm*5um)，保持在40℃，以0.05mol/LNaH2PO4:乙腈＝97:3(v/v)作流動相，流速為1.0ml/min，并在210nm下UV檢測。具體實施例實施例1含有FR179642發酵液22.7L，發酵單位為700μg/ml。向其中加入1kg硅藻土，攪拌半小時后離心分離，得到18.9L濾液(HPLC的圖譜見圖1和表1)。將濾液進行閃蒸濃縮，得到濃縮液3.8L，單位為3642μg/ml。將濃縮液導入XAD1600吸附樹脂(φ8*80cm)，裝量為1500ml，上樣流速為2700ml/h。樹脂用12L純化水水洗，流速1800ml/h，然后用12L，5％的乙醇水溶液解吸，流速2700ml/h。每隔300ml收集一個解吸組分，并將純度在90％以上的組分混合，得到7.2L解吸混合液。向解吸混合液中加入767針用活性炭7.2g，攪拌30min后過濾得到脫色液。將脫色液進行納濾濃縮，濃縮至380ml。再將納濾液用旋轉蒸發器在45℃下濃縮至13ml，然后濃縮液在4℃下攪拌結晶2h后，得到13.52g潮晶(HPLC的圖譜見圖2和表2)，純度為98.4％。然后用8ml純化水將潮晶溶解，于9℃下攪拌過夜，抽濾，得到的白色晶體進行真空加熱干燥，得到9.60g二次結晶FR179642精粉(HPLC的圖譜見圖3和表3)，純度為99.8％，總收率為60.4％。表1：FR179642濾液的HPLC譜圖數據峰保留時間面積峰高％面積11.80.12022.7720712.26032.528083.96542.907797674539462.16653.3401.75663.475520249512621.41374.252754.99185.859251468.36197.0501872110090.051107.3831768210970.048118.20.160129.2653308014440.0901310.468.2921413.52043.9151515.6863519412260.0961618.974.316總計3682500.000表2：FR179642一次潮晶的HPLC譜圖數據峰保留時間面積峰高％面積13.38326242810.01923.8231.28334..03245.28267098.44856.167129600.00966.96450043000.035711.0.174總計901100.00表3：FR179642精粉的HPLC譜圖數據峰保留時間面積峰高％面積13.86.17724.111441490.00735.349627269746745299.80747.068582430.009總計6284842468903100.00實施例2發酵液FR179642放罐73.6L，發酵單位為628μg/ml。向其中加入1.5kg硅藻土，攪拌半小時后板框壓濾，得到62.1L濾液(HPLC峰型與圖1相似)。將濾液進行旋轉蒸發濃縮，得到濃縮液13.3L，發酵單位為3642μg/ml。將濃縮液導入XAD1600吸附樹脂(φ15*100cm)，裝量為3.4L，上樣流速為10.8L/h。樹脂用80L純化水水洗，流速13.2L/h，然后用26L，5％的丙酮水溶液解吸，流速13.2ml/h。每隔600ml收集一個解吸組分，并將純度在90％以上的組分混合，得到解吸混合液22.4L。向解吸混合液中加入767針用活性炭20g，攪拌脫色處理30min后過濾得到脫色液。然后將脫色液進行納濾濃縮，濃縮至5600ml，再將納濾液用旋轉蒸發器在45℃下濃縮至600ml。然后濃縮液在4℃下攪拌結晶2h后，得到28.6g潮晶(HPLC的峰型與圖2相似)，純度為98.7％。然后用50ml純化水將潮晶50℃下攪拌20min，再在室溫條件下攪拌30min，最后于8℃下攪拌過夜，抽濾得到的白色晶體進行真空加熱干燥，得到26.7g二次結晶FR179642精粉(HPLC的峰型與圖3相似)，純度為99.3％，總收率為58.3％。實施例3發酵液FR179642放罐4.9L，發酵單位為1350μg/ml。向其中加入0.2kg珍珠巖，攪拌半小時后，抽濾分離，得到4.7L濾液(HPLC峰型與圖1相似)。將濾液進行閃蒸濃縮，得到濃縮液1.5L，發酵單位為4410μg/ml。將濃縮液導入XAD1180吸附樹脂(φ4*50cm)，裝量為790ml，上樣流速為1000ml/h。樹脂用4L純化水水洗，流速1000ml/h，然后用15L，15％的乙醇水溶液解吸，流速800ml/h。每隔200ml收集一個解吸組分，并將純度在90％以上的組分混合，得到解吸混合液1.4L。向解吸混合液中加入767針用活性炭1.5g，攪拌脫色處理25min后，過濾，得到脫色液。然后將脫色液進行納濾濃縮至350ml后用旋轉蒸發器在45℃下濃縮至10ml，然后濃縮液在8℃下攪拌結晶3h后，得到4.7g潮晶(HPLC峰型與圖2相似)，純度為98.5％。再用4ml純化水將潮晶溶解，于10℃下攪拌過夜，抽濾，得到的晶體進行真空加熱干燥，得到4.12g二次結晶FR179642精粉(HPLC峰型與圖3相似)，純度為99.1％，總收率為62.3％。實施例4發酵液FR179642放罐34.3L，發酵單位為850μg/ml。向其中加入2.1kg硅藻土，攪拌半小時后抽濾分離，得到28.5L濾液(HPLC峰型與圖1相似)。將濾液進行閃蒸濃縮，得到濃縮液5000ml，發酵單位為,5830μg/ml。將濃縮液導入XAD1180吸附樹脂(φ8*80cm)，裝量為2.0L，上樣流速為2400ml/h。樹脂用12L純化水水洗，流速2000ml/h，然后用12L，15％的丙酮水溶液解吸，流速2400ml/h。每隔500ml收集一個解吸組分，并將純度在90％以上的組分混合，得到解吸混合液10.9L。向解吸混合液中加入767針用活性炭10.5g，攪拌脫色處理25min后，過濾，得到脫色液。然后將脫色液進行納濾濃縮，濃縮至650ml。再將納濾液用旋轉蒸發器在45℃下濃縮至16ml后在8℃下攪拌結晶4h后，得到21.5g潮晶(HPLC峰型與圖2相似)，純度為98.3％。然后用12ml純化水將潮晶溶解，于4℃下攪拌過夜，抽濾，得到的白色晶體進行真空加熱干燥，得到17.3gFR179642精粉(HPLC峰型與圖3相似)，純度為99.0％，總收率為59.3％。對比實施例1含有FR179642發酵液22.7L，發酵單位為700μg/ml。向其中加入1kg硅藻土，攪拌半小時后離心分離，得到18.9L濾液。將濾液進行閃蒸濃縮，得到濃縮液3.8L，單位為3642μg/ml。將濃縮液導入XAD1600吸附樹脂(φ8*80cm)，裝量為1500ml，上樣流速為2700ml/h。樹脂用20％的乙醇洗滌，流速1800ml/h，然后用50％的乙醇水溶液解吸，流速2700ml/h。每隔300ml收集一個解吸組分，并將純度在90％以上的組分混合，組成解吸混合液。然后將解吸混合液進行納濾濃縮，濃縮至380ml。最后將納濾液用旋轉蒸發器在45℃下濃縮至13ml，純度為90.2％，總收率為31.8％。對比實施例2含有FR179642發酵液22.7L，發酵單位為700μg/ml。向其中加入1kg硅藻土，攪拌半小時后離心分離，得到18.9L濾液。將濾液進行閃蒸濃縮，得到濃縮液3.8L，單位為3642μg/ml。將濃縮液導入XAD1600吸附樹脂(φ8*80cm)，裝量為1500ml，上樣流速為2700ml/h。樹脂用40％的乙醇洗滌，流速1800ml/h，然后用60％的乙醇水溶液解吸，流速2700ml/h。每隔300ml收集一個解吸組分，并將純度在90％以上的組分混合，組成解吸混合液。然后將解吸混合液進行納濾濃縮，濃縮至380ml。最后將納濾液用旋轉蒸發器在45℃下濃縮至13ml，純度為90.5％，總收率為30.2％。當前第1頁1 2 3