一種鐮孢菌菌劑、含脂肽類化合物的農藥及用圖
【專利摘要】本發明公開了一種鐮孢菌菌劑、含脂肽類化合物的農藥及用途。具體地，本發明的菌劑包含有效量的海洋來源鐮孢Fusarium sp.L691的發酵液或發酵提取物。由所述提取物中分離得到的化合物1和化合物2為脂肽類化合物，可用作農藥。研究發現本發明的菌劑及化合物可以拮抗多種植物病原真菌和細菌，特備是對特別是對小麥赤霉菌和小麥根腐菌有很強拮抗效果，可用用于預防、抑制和/或殺滅植物真菌和/或細菌病害。CGMCC No.27
【專利說明】
一種鐮孢菌菌劑、含脂肽類化合物的農藥及用途
技術領域
[0001] 本發明總地涉及酯肽類化合物，更具體地，涉及從真菌中提取的酯肽類化合物及 其抗菌用途。
【背景技術】
[0002] 鐮刀屬（Fusarium)又稱為鐮孢屬，分布廣，種類多，是污染糧食和飼料的常見霉 菌菌屬之一，目前已發現44個種和7個變種。鐮孢生長過程中產生多種有毒代謝產物，不 但造成植物萎蔫、根腐、穗腐等腐爛病，而且是自然產生的最危險的食品污染物之一，對人 畜健康危害十分嚴重。
[0003] 鐮孢屬產生的毒素種類很多，其中與動物和人類有關的主要是玉米赤霉烯酮、 單端孢霉毒素、串珠鐮刀菌素和伏馬菌素等，其中的單端孢霉毒素又分為A和B兩類 (侯然然，張敏紅.霉菌毒素對畜禽的危害及其防控方法的研究進展[J].中國畜牧獸 醫，2007, 34 (1) : 13-16)。大多數鐮孢都能產生玉米赤霉烯酮，該毒素往往與其它單端孢霉 毒素共存于飼料之中而引起動物中毒（王怡凈，張立實.玉米赤霉烯酮毒性研究進展[J]. 中國食品衛生雜志，2002, 14(5) :40-44)。伏馬菌素是一組結構類似的霉菌代謝產物，目 前已明確伏馬菌素 Bl和B2可引起動物中毒（江濤，羅雪云，計融.伏馬菌素的研究進展 [J] ·中國食品衛生雜志，1998, 10 (4) : 28-30)。
[0004] 鐮孢能生活在各種宿主上，其中有許多種類與昆蟲有密切的關系，作為 蟲生真菌報道過一些種類（薄蟄龍.昆蟲真菌學[M].合肥：安徽科學技術出版 社.1996. 310-313, 519-524)。此外，不少人報道了從該屬真菌中篩選到對昆蟲有明顯殺蟲 活性的物質，如T-2毒素、玉米赤霉烯酮和單端孢素等（薄蟄龍.昆蟲真菌學[M].合肥： 安徽科學技術出版社.1996. 310-313, 519-524)。因此，這類真菌在農林害蟲的生物防治上 有廣闊的應用前景。
[0005] 然而，目前為止，還沒有涉及鐮孢屬微生物在植物病害防治方面的研究。

【發明內容】

[0006] 本發明以海洋來源鐮孢Fusarium sp. L691為研究對象，對其大米發酵產物進行了 提取、分離、純化，得到了 2個酯肽類化合物，對這些化合物進行了結構鑒定和生物活性研 究，發現發酵提取物以及這兩個化合物具有很好的抗植物病害活性，對多種植物病原真菌 和細菌有明顯抑制作用。
[0007] 為此，本發明的第一方面提供一種菌劑，所述菌劑中包含有效量的海洋來源鐮孢 Fusarium sp.的發酵液或發酵提取物。所述鐮孢Fusarium sp.L691已于2015年01月27 日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址：北京市朝陽區北辰西路 1號院3號，保藏號為CGMCC10326。
[0008] 此外，所述菌劑中還可包括輔料。輔料的作用是使菌劑中的活性成分更好地吸附 或附著于對于所述活性成分來說是惰性的載體上，同時輔料也起到適當稀釋菌劑的作用， 以便均勻施加。優選采用對土壤具有改善作用和/或對植物具有肥力的那些物質。所述輔 料可以是如各類作物的秸桿、松殼、稻草、花生皮、動物糞便、草炭等。
[0009] 所述活性成分包括以下化合物1和化合物2 :
[0010]
[0011] 根據本發明的第二方面，提供一種農藥，其中包含有效量的上述化合物1和/或化 合物2作為活性成分。
[0012] 所述農藥可為溶液、油乳液、水乳液或微乳液形式。形成不同形式的劑型作用是起 到適當稀釋活性成分的作用，以便均勻施加。另外各種形式的農藥應當能夠穩定存放。其 中所用的溶劑優選對土壤和/植物沒有不良作用，且無環境污染的那些溶劑。優選地，用于 溶解化合物1和/或化合物2的溶劑，例如，醇類，如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇等；酯類，如乙酸 乙酯、乙酸甲酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯等；芳烴類，如苯、甲苯、二甲苯等；酮類，如丙酮、環己 酮等，但不限上述這些。
[0013] 所述農藥還可以包含輔料。所述輔料可以是使所述活性成分更好地吸附或附著于 對于所述活性成分來說是惰性的載體上，同時輔料也優選采用對土壤具有改善作用和/或 對植物具有肥力的那些物質。所述輔料可以是如各類作物的秸桿、松殼、稻草、花生皮、動物 奠便、草炭等。
[0014] 上述菌劑或農藥用于預防、抑制和/或殺滅植物真菌和/或細菌病害。
[0015] 其中所述植物真菌和/或細菌病害是指由小麥赤霉菌Wheat Gibberella zeae、小 麥根腐菌Bipolaris sorokiniana、黃瓜立枯絲核菌Rhizoctonia Solani kuhn、稻痕病菌 Pyricularia grisea和/或黃單胞菌Xanthomonas sp.中的一種或多種引起的植物病害。
[0016] 根據本發明的第三方面，提供上述菌劑或農藥用于預防、抑制和/或殺滅植物真 菌和/或細菌病害的應用。
[0017] 其中所述植物真菌和/或細菌病害是指由小麥赤霉菌Wheat Gibberella zeae、小 麥根腐菌Bipolaris sorokiniana、黃瓜立枯絲核菌Rhizoctonia Solani kuhn、稻痕病菌 Pyricularia grisea和/或黃單胞菌Xanthomonas sp.中的一種或多種引起的植物病害。
[0018] 本發明的菌劑和農藥施加在植物根部附近的土壤中。
[0019] 本發明研究發現上述酯肽類化合物對多種植物病原菌也具有很好的抑制作用，因 此所述化合物以及鐮孢Fusarium sp.的發酵液或提取物具有作為農藥的廣闊用途。
【附圖說明】
[0020] 以下附圖用于更好地說明本發明。
[0021 ] 圖1顯示的是根據本發明的鐮孢Fusarium sp.發酵粗提物對小麥赤霉菌 Wheat Gibberella zeae (A)、小麥根腐菌 Bipolaris sorokiniana(B)、黃瓜立枯絲核菌 Rhizoctonia Solani kuhn (C)、稻痕病菌Pyricularia grisea (D)和黃單胞菌Xanthomonas sp. (E)增殖的抑制效果。
[0022] 圖2顯示的是化合物1和化合物2分別對小麥赤霉菌Wheat Gibberella zeae (A)、 小麥根腐菌 Bipolaris sorokiniana (B)、黃瓜立枯絲核菌 Rhizoctonia Solani kuhn (C)、 稻痕病菌Pyricularia grisea(D)和黃單胞菌Xanthomonas sp. (E)增殖的抑制效果。
【具體實施方式】
[0023] 下列實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0024] 下列實施例中所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑中得到。
[0025] 下列實施例中所用的小麥赤霉菌Wheat Gibberella zeae，小麥根腐菌Bipolaris sorokiniana，黃瓜立枯絲核菌 Rhizoctonia Solani kuhn，稻痕病菌 Pyricularia grisea 均為中國科學院真菌學國家重點實驗室李少杰實驗室惠贈。
[0026] 下列實施例中所用的黃單胞菌Xanthomonas sp.為中國科學院植物基因組學國家 重點實驗室錢韋實驗室保存。
[0027] 實施例1鐮孢Fusarium sp.的發酵培養
[0028] 將鐮孢Fusarium sp.接種到PDA試管瓊脂培養基斜面上，進行預培養。預培養的 條件為：25°C，避光培養7天（PDA培養基組成：土豆200g，葡萄糖20g，瓊脂粉16g，蒸餾水 定容至1L)。待菌絲長滿整個斜面后，在無菌條件下將菌絲體轉接到液體培養基中進行培 養，得到種子培養液。液體培養的條件為：25°C，避光培養7天。液體培養基：葡萄糖4. Og/ L，麥芽提取物（Malt Extract) 10.0 g/L，酵母提取物（Yeast Extract，購自 Oxoid Ltd.，批 號為1074139)4. Og/L，水定容至1L。
[0029] 取10 _升種子培養液接種到經過滅菌的裝有固體培養基（固體培養基由80g大 米和100mL水組成）的500毫升三角瓶中，供接種20瓶。在25°C，避光發酵培養30天。 大米發酵產物乙酸乙酯提取，在室溫溫度條件下超聲提取。將提取液蒸餾，得到粗浸膏 (FS) 81. 6g〇
[0030] 實施例2、化合物1和2的提取分離
[0031] HPLC分析儀為Agilent 1200分析型液相色譜儀。HPLC的條件如下：以色譜甲醇 將樣品配制為l〇mg/ml的溶液，上樣量為每次15ul，色譜柱為Kromasil 10X250mm C18半 制備柱，柱溫為25°C，2IOnm波長進行檢測。
[0032] 將實施例1中獲得的粗浸膏FS通過硅膠柱色譜分離，以正己烷-乙酸乙酯體系 (正己烷：乙酸乙酯的體積比為 100:1、100:2、100:3、100:4、100:5、10:1、9:1、8:2、7:3、 6:4)，二氯甲烷：甲醇體系（二氯甲烷：甲醇的體積比為100:1、100:2、30:1、20:1、10:1、 9:1、8: 2、7:3)依次進行梯度洗脫，每個梯度洗4個保留體積，每個體積750ml。
[0033] 根據薄層層析色譜行為和HPLC分析，保留活性物質較多的洗脫餾分。其中，在正 己烷：乙酸乙酯（體積比為100:0)體系得到餾分FS-I ;在正己烷：乙酸乙酯（體積比為 100:1和100:2)體系得到餾分FS-2 ;在正己烷：乙酸乙酯（體積比為100:3)體系得到餾 分FS-3 ;在正己烷：乙酸乙酯（體積比為100:4)體系得到餾分FS-4 ;在正己烷：乙酸乙酯 (體積比為100:5和10:1)體系得到餾分FS-5 ;在正己烷：乙酸乙酯（體積比為9:1)體系 得到餾分FS-6 ;在正己烷：乙酸乙酯（體積比為8:2)體系得到餾分FS-7 ;在正己烷：乙酸 乙酯（體積比為7:3)體系得到餾分FS-8 ;在正己烷：乙酸乙酯（體積比為6:4)體系得到餾 分FS-9和FS-10 ;在二氯甲烷：甲醇（體積比為100:1，100:2,30:1)中得到餾分FS-Il ;在 二氯甲烷：甲醇（體積比為20:1)中得到餾分FS-12;在二氯甲烷：甲醇（體積比為10:1) 中得到餾分FS-13;在二氯甲烷：甲醇（體積比為9:1和8:2)中得到餾分FS-14。共得到 14個餾分。將各餾分分別除去溶劑，并干燥。
[0034] 其中，將FS-8通過ODS柱色譜分離，以甲醇-水體系（甲醇-水體積百分數為 50 %、60 %、70 %、80 %、90 % )進行梯度洗脫，每個梯度洗4個保留體積，每個體積250ml。根 據薄層層析色譜行為和HPLC分析，在甲醇-水（體積比為50% )得到餾分FS-8-UFS-8-2 和FS-8-3 ;在甲醇-水（體積比為60% )得到餾分FS-8-4 ;在甲醇-水（體積比為70% ) 得到餾分FS-8-5 ;在甲醇-水（體積比為80% )得到餾分FS-8-6和FS-8-7 ;在甲醇-水 (體積比為90%)得到餾分？3-8-8、？3-8-9、？3-8-10和？3-8-11，共11個餾分。將以上餾 分中的FS-8-7通過高效液相色譜用制備柱分離，以69%乙腈-酸水（0.01 %三氟乙酸）洗 脫，分離得到化合物1。
[0035] FS-7通過凝膠柱色譜分離，以70%甲醇-水體系進行等度洗脫，根據薄層層析色 譜行為和 HPLC 分析，共得到 6 個子餾分（FS-7-1、FS-7-2、FS-7-3、FS-7-4、FS-7-5、FS-7-6)。 FS-7-2通過ODS柱色譜分離，以甲醇-水體系（甲醇-水體積比為50 %、60 %、70 %、80 %、 90%)進行梯度洗脫，每個梯度洗4個保留體積，每個體積500ml。根據薄層層析色譜行為 和HPLC分析，在甲醇-水（體積比為50%和60% )得到餾分FS-7-2-1 ;在甲醇-水（體 積比為70% )得到餾分FS-7-2-2、FS-7-2-3和FS-7-2-4 ;在甲醇-水（體積比為80% ) 得到餾分 FS-7-2-5、FS-7-2-6、FS-7-2-7、FS-7-2-8 和 FS-7-2-9 ;在甲醇-水（體積比為 90% )得到餾分FS-7-2-10,共得到10個餾分。將其中得到的FS-7-2-4通過高效液相色譜 的制備柱分離，以67%乙腈-酸水（0. 01 %三氟乙酸）洗脫，分離得到化合物2。
[0036] 實施例3、化合物1和2的確認
[0037] 本實施例中所使用的核磁共振儀為Varian Mercury-500和-600兆赫，紅外色譜 儀為NicoletIS5FT-IR，質譜儀為BrukerAPEXIII7·0T和APEXIIFT-ICR。
[0038] 經NMR的碳譜和氫譜鑒定并確認以上實施例提取的化合物1和2分別具有以下結 構。
[0039]


[0042] 實施例4鐮孢Fusarium sp.發酵提取物對植物病原真菌/細菌的詰抗作用研究
[0043] 測試用菌株：小麥赤霉菌Wheat Gibberella zeae，小麥根腐菌Bipolaris sorokiniana，黃瓜立枯絲核菌Rhizoctonia Solani kuhn，稻痕病菌Pyricularia grisea， 黃單胞菌 Xanthomonas sp. 〇
[0044] 待測樣品溶液：將實施例1中得到的鐮孢Fusarium sp.發酵提取的粗浸膏FS溶 于DMSO中配制成500mg/ml的溶液，待用。
[0045] 測定方法：在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基PDA平板中央接入新鮮的棉花小麥赤 霉菌Wheat Gibberella zeae，小麥根腐菌Bipolaris sorokiniana，黃瓜立枯絲核菌 Rhizoctonia Solani kuhn，稻痕病菌 Pyricularia grisea，或黃單胞菌 Xanthomonas sp.的菌塊（打孔器打下5mm左右的菌塊進行接種），在平板周邊的三個點加上樣品溶液， 另一點加上等量DMSO作為陰性對照，放置于培養箱中，28攝氏度恒溫倒置對峙培養。7天 后觀察，記錄對峙情況。
[0046] 結果如圖1所示，Fusarium sp.發酵提取物對小麥赤霉菌和小麥根腐菌有很強的 抑制活性，對稻瘟霉、黃瓜立枯絲核菌也有一定的抑制活性；
[0047] Fusarium sp.發酵提取物浸膏對植物病原細菌黃單胞菌有弱活性。
[0048] 實施例5化合物1和化合物2對植物病原菌的拮抗作用研究
[0049] 如實施例2所述菌株。待測樣品為實施例2中分離得到的化合物1和化合物2,分 別溶于DMSO中配制成20mM的溶液，待用。測定方法如實施例4所述，分別以蒸餾水和DMSO 作為陰性對照。
[0050] 結果如圖2所示，化合物1和2對小麥赤霉菌、黃瓜立枯絲核菌有很好的抗植物病 原真菌的活性，化合物1和2對小麥根腐菌有弱的活性，化合物2對稻瘟霉有弱的活性；化 合物1和2對植物病原細菌黃單胞菌有弱活性。
【主權項】
1. 一種菌劑，包含有效量的海洋來源鑲抱化sarium SP.L691的發酵液或發酵提取物， 所述鑲抱化sarium SP. L691保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、，保藏 號為 CGMCC 10326。2. 根據權利要求1所述的菌劑，進一步包括選自賴桿、松殼、稻草、花生皮、動物糞便和 草炭中至少一種的輔料。3. 根據權利要求1或2所述的菌劑，其中包含包括W下化合物1和化合物2作為活性 成分：；〇,4. 一種農I O5. 根據權利要求4所述的農藥，其中所述農藥為溶液、油乳液、水乳液或微乳液形式。6. 根據權利要求4所述的農藥，其中所述農藥進一步包括選自賴桿、松殼、稻草、花生 皮、動物糞便和草炭中至少一種的輔料。7. 根據權利要求1~3中任一項所述的菌劑或根據權利要求4~6中任一項所述的農 藥用于預防、抑制和/或殺滅植物真菌和/或細菌病害的應用。8. 根據權利要求7所述的應用，其中所述植物真菌和/或細菌病害是指由小麥赤 霉菌Wheat Git)berella zeae、小麥根腐菌Bipolaris sorokiniana、黃瓜立枯絲核菌 Rhizoctonia Solani kuhn、稻攝病菌 Pyricularia grisea 和 / 或黃單胞菌 Xanthomonas SP.中的一種或多種引起的植物病害。9. 根據權利要求7所述的應用，其中所述菌劑或所述農藥施加在植物根部附近的±壤 中。
【文檔編號】A01P3/00GK105981745SQ201510062445
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2015年2月5日
【發明人】劉宏偉, 李少杰, 錢韋, 張立新
【申請人】中國科學院微生物研究所, 中國大洋礦產資源研究開發協會