一種通過分步補料提高l-纈氨酸產酸的發酵工藝的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及微生物發酵技術領域，具體涉及一種通過分步補料提高L-纈氨酸產酸的發酵工藝。
【背景技術】
[0002]L-繳氨酸屬于分支鏈氨基酸(branched chain amino acid,BCAA )，是人體必需氨基酸之一，具有多種生理功能，廣泛用于醫藥、食品及調味劑、動物飼料和化妝品的制造。在醫藥上，L-纈氨酸對肌肉蛋白合成和分解具有極大的耐受性，是制造復合氨基酸輸液和氨基酸注射液的原料，近年來已作為氨基酸原料藥中用量最大的品種之一，L-纈氨酸是合成一種免疫抗生素的重要中間體，由其合成的纈氨霉素是一種環肽類化合物，被認為是生物體內鉀離子穿過生物膜的載體之一，其與鉀離子配位可形成C3的對稱構象，在生物體的生命活動中扮演著重要角色。在食品上，由其合成的氨基酸埃絲肽可用作美容食品，能有效改善現代女性睡眠不足、解除疲勞、增強食欲，增強皮膚彈性、張力、光澤、柔性，改善皮膚粗糙，增強精力、活力，改善腰疼、肌肉痛、緩和應激等效果。在飼料上，對動物乳腺組織分泌乳汁有重要作用。目前國內外L-纈氨酸生產廠家日漸增多，但是發酵周期長，產酸偏低，副酸多影響提取質量的問題一直是困擾L-纈氨酸規模化生產的主要問題。

【發明內容】

[0003]本發明的目的是為解決上述技術問題的不足，提供一種通過分步補料提高L-纈氨酸產酸的發酵工藝，通過對培養基配方的調整，并同時采取分時段補料工藝及分段控制溶氧的方式，促進了纈氨酸的生物合成，避免了氨基酸生物合成途徑中的反饋調節作用，減少了副酸的生成。
[0004]本發明為解決上述技術問題，所提供的技術方案是:一種通過分步補料提高L-纈氨酸產酸的發酵工藝，包括以下步驟:
(I )、培養成熟的菌種:先進行空罐滅菌和實罐滅菌，滅菌結束后降溫冷卻，然后進行接種，在以下條件下進行培養后得到成熟的菌種:培養溫度34-36°(:，？!16.8-7.2，溶氧>25%，壓力 0.03-0.08MPa，風量 0.3VVM-2.0VVM ；
(2)、發酵罐培養:先進行空罐滅菌和實罐滅菌，滅菌結束后降溫冷卻，然后將步驟(I)得到的成熟菌種接種至發酵罐內在以下條件下進行培養以制取L-色氨酸:培養溫度34-360C，pH采用補充液氨分段控制，0-18h7.0-7.2，18h_放罐6.4-6.8，溶氧分段控制，0_18hl0_25%，18h-放罐 15-40%，壓力0.03-0.08MPa，風量 0.3VVM-2.0VVM，過程中殘糖控制0.01-
0.5%，在發酵進行的10-15h，18-24h，28_32h，分別補入培養基玉米漿用量的20%、20%、10%的滅菌玉米漿繼續進行發酵。
[0005]作為本發明一種通過分步補料提高L-繳氨酸產酸的發酵工藝的進一步優化:所述步驟(I)中使用的培養基為液體種子培養基，液體種子培養基的成分為:葡萄糖I.4-6.0%、酵母粉0.05-0.3%、(NH4)2HPO4 0.1-0.4%、KC1 0.05-0.3%、MgS04 0.08-0.45%、(NH4)2SO40.06-0.24%、檸檬酸0.08-0.42%、FeSO4 0.00014-0.00042%、MnS04 0.00006-0.00036%、維生素BI 0.000065-0.00039%、生物素0.00001-0.00012%，其余為水。
[0006]作為本發明一種通過分步補料提高L-繳氨酸產酸的發酵工藝的進一步優化:所述步驟(2)中使用的培養基為液體發酵培養基，液體發酵培養基的成分為:葡萄糖1%、酵母粉
0.1%^(NH4)2HPO4 0.12-0.8%^KCL 0.12-0.8%^MgSO4 0.05-0.5%^(NH4)2SO4 0.08-0.48%、檸樣酸0.05-0.5%、FeSO4 0.001-0.l%、Na2S〇4 0.0005-0.006%、MnS04 0.00015-0.0009%、CuSO4 0.00002-0.00018%、CoCl2 0.00014-0.00135%、ZnS04 0.0001-0.0018%，其余為水。
[0007]作為本發明一種通過分步補料提高L-纈氨酸產酸的發酵工藝的進一步優化:所述空罐滅菌的具體操作為:罐體清洗干凈，認真檢查閥門及人孔后，開蒸汽進行空罐滅菌，滅菌壓力為0.11-0.1210^，溫度121-123°(:，時間為45-6011^11。
[0008]作為本發明一種通過分步補料提高L-繳氨酸產酸的發酵工藝的進一步優化:所述實罐滅菌的具體操作為:將原料充分溶解后用栗栗入種子培養罐中，開列管升溫至80°C后，開蒸汽進入罐內對培養基進行滅菌，滅菌壓力為0.11-0.1210^，溫度121-123°(:，時間為10-30mino
[0009]作為本發明一種通過分步補料提高L-繳氨酸產酸的發酵工藝的進一步優化:所述步驟(I)中接種的具體操作為:采用壓差法進行接種，調PH至6.9，溫度35°C，壓力0.06MPa，在火焰下旋開接種口防護蓋，并迅速將種瓶接種管連接與接種口，緩慢調節壓力至0.03MPa，接種結束后，在火焰下拔下接種罐，并迅速將接種口防護蓋選在接種口上。
[0010]作為本發明一種通過分步補料提高L-纈氨酸產酸的發酵工藝的進一步優化:所述步驟(2)中接種的具體操作為:調pH至6.9，溫度35°C，壓力0.06MPa，將種子罐內培養成熟的種子液壓入發酵罐內。
[0011]作為本發明一種通過分步補料提高L-纈氨酸產酸的發酵工藝的進一步優化:所述步驟(I)中接種用菌液的制備方法為:取已經菌種生長飽滿的茄型瓶，用生理鹽水50ml在火焰保護下注入，并用接種環或者玻璃刮刀將表面菌種刮落入生理鹽水中，然后將含有菌種的生理鹽水在無菌操作下轉移到接種瓶內。
[0012]有益效果
申請人針對目前發酵工藝方法中的不足，在天津科技大學、中國氨基酸技術服務中心的幫助指導下，通過對培養基配方的調整，并同時采取分時段補料工藝及分段控制溶氧的方式，促進了纈氨酸的生物合成，避免了氨基酸生物合成途徑中的反饋調節作用，減少了副酸的生成。這種分時段的補料方式，不僅滿足了菌體在生長過程中對營養的需要，同時解除了高濃度營養成分對菌體生長的抑制作用，提高了原料的利用率，尤其對糖酸轉化率的提尚有極大的作用，而溶氧分段控制，對質粒穩定性的提尚及目的基因的尚效表達也有積極的作用。本發明的發酵工藝能使L-纈氨酸產酸由原來的70-80h產酸4.5-5.5%提高到現在的50-55h產酸7.0-8.0%，轉化率由原來的20-25%提高到30-32%，并且副酸較少有利于后續提純。
【具體實施方式】
[0013]下面結合實施例對本發明作進一步的說明:
實施例1 (I)、培養成熟的菌種菌液的制備:
取已經菌種生長飽滿的茄型瓶，將生理鹽水50ml在火焰保護下注入，并用接種環或者玻璃刮刀將表面菌種刮落入生理鹽水中，然后將含有菌種的生理鹽水在無菌操作下轉移到接種瓶內。
[0014]成熟的種子的培養:
a、空罐滅菌:罐體清洗干凈，認真檢查閥門及人孔后，開蒸汽進行空罐滅菌，滅菌壓力為0.12MPa，溫度121°C，時間為45min;
b、實罐滅菌:將按規定含有一定質量分數濃度的原料充分溶解后用栗栗入種子培養罐中，開列管升溫至80 0C后，開蒸汽進入罐內對培養基進行滅菌，滅菌壓力為0.12MPa，溫度121°C，時間為 15min;
c、降溫冷卻:滅菌結束后，打開列管內冷卻水進行降溫，降溫至36°C，關閉列管冷卻水；
d、接種:采用壓差法進行接種，調pH6.9，溫度32°C，壓力0.06MPa，在火焰下旋開接種口防護蓋，并迅速將種瓶接種管連接與接種口，緩慢調節壓力至0.03 MPa，此時種液在壓差下進入罐內，接種結束后，在火焰下拔下接種罐，并迅速將接種口防護蓋選在接種口上，火焰灼燒約Imin;
e、培養:培養溫度30-32°C，pH通過補充液氨自動控制6.8-7.2，溶氧>25%，壓力0.03-0.08MPa，風量 0.3WM-2.0VVM ；
使用的培養基為液體種子培養基，液體種子培養基的成分為:葡萄糖3.0%，玉米楽3.5%，酵母粉0.5%，磷酸二氫鉀0.1%，豆濃1.5%，硫酸鎂0.04%，維生素BI 0.00003%，生物素0.00002%，其余為水。
[0015](2)、發酵罐培養
b、空罐滅菌:罐體清洗干凈，認真檢查閥門及人孔后，開蒸汽進行空罐滅菌，滅菌壓力為0.12MPa，溫度121°C，時間為45min;
b、實罐滅菌:將按規定含有一定質量分數濃度的原料充分溶解后用栗栗入種子培養罐中，開列管升溫至80 0C后，開蒸汽進入罐內對培養基進行滅菌，滅菌壓力為0.12MPa，溫度121°C，時間為 15min;
c、降溫冷卻:滅菌結束后，打開列管內冷卻水進行降溫，降溫至32°C，關閉列管冷卻水；
d、接種:將種子罐內培養成熟的種子液壓入發酵罐內；
e、培養:培養溫度30-32°C，pH采用補充液氨自動控制7.0-7.2，溶氧分段控制，0-18h20-30%，18h-放罐 10-20%，壓力0.03-0.08MPa，風量0.3VVM-2.0VVM，過程中殘糖控制
0.01-0.5%。在發酵進行的1h，18h，28h，分別補入底料玉米漿用量的20%、20%、10%的滅菌玉米楽繼續進行發酵。
[0016]使用的培養基為液體發酵培養基，液體發酵培養基的成分為:葡萄糖8.0%，玉米漿5.0%，豆濃2.0%，磷酸二氫鉀0.18%，硫酸鎂0.08%，硫酸錢0.3%，L_蛋氨酸0.05%,L-異亮氨酸0.006%，L-亮氨酸0.02%，維生素BI 0.00002%，生物素0.00001%，其余為水。
[0017]通過該種方式培養，發酵周期:55h，產酸7.2%，轉化率31.3%。
[0018]實施例2
(I)、培養成熟的菌種菌液的制備:
取已經菌種生長飽滿的茄型瓶，將生理鹽水50ml在火焰保護下注入，并用接種環或者玻璃刮刀將表面菌種刮落入生理鹽水中，然后將含有菌種的生理鹽水在無菌操作下轉移到接種瓶內。
[0019]成熟的種子的培養:
c、空罐滅菌:罐體清洗干凈，認真檢查閥門及人孔后，開蒸汽進行空罐滅菌，滅菌壓力為0.12MPa，溫度121°C，時間為45min;
b、實罐滅菌:將按規定含有一定質量分數濃度的原料充分溶解后用栗栗入種子培養罐中，開列管升溫至80 0C后，開蒸汽進入罐內對培養基進行滅菌，滅菌壓力為0.12MPa，溫度121°C，時間為 15min;
c、降溫冷卻:滅菌結束后，打開列管內冷卻水進行降溫，降溫至36