一種西蘭花多肽組分微波輔助提取及活性測定方法
【專利摘要】本發明公開了一種西蘭花多肽組分微波輔助提取及活性測定方法，包括以下步驟：S100：液氮研磨備制，將西蘭花陰干，用液氮研磨備制；S200：微波輻射；S300：分離上清液；S400：加入有機溶劑；S500：分離西蘭花多肽組分。本發明可有效縮短提取時間、降低操作成本、減少有機溶劑用量，環保的優點，而且可顯著提高提取效率，獲得更多活性組分。
【專利說明】
一種西蘭花多肽組分微波輔助提取及活性測定方法
技術領域
[0001]本發明涉及一種提取方法，具體涉及一種西蘭花多肽組分微波輔助提取及活性測定方法。【背景技術】
[0002]西蘭花是一種很受人們歡迎的蔬菜，它味道鮮美，營養也很高，還有很高的藥用價值。它的維生素C含量非常豐富，它還具有抗癌功效，西蘭花的平均營養價值及防病作用遠遠超出其他蔬菜。西蘭花多肽為西蘭花中一種有效的抗癌成分，多肽類化合物廣泛存在于自然界中，其中對具有一定生物學活性的多肽的研究，一直是藥物開發的一個主要方向。西蘭花多肽活性組分應用于抗腫瘤細胞實驗，具有抑制腫瘤細胞增生、促進腫瘤細胞凋亡的作用。目前對于西蘭花多肽的提取一般采用有機溶劑沉淀法，該方法主要是通過加入親水性的有機溶劑能夠降低介質的介電常數，增加溶質分子之間的靜電引力以及親水性有機溶劑脫除蛋白質水化膜，降低蛋白質的親水性，促進蛋白質的聚集和沉淀。但此方法受多種因素影響，如有機溶劑的選擇，溫度的控制，酸堿度、離子強度等。有機溶劑一般選擇乙醇或丙酮。采用有機溶劑沉淀法提取蛋白質多肽提取時間長，有機溶劑用量大，成本高，由于長時間、大劑量的有機溶劑(乙醇或丙酮)作用導致多肽產物的活性降低。
【發明內容】

[0003]針對現有技術的缺陷，本發明提供了一種西蘭花多肽組分微波輔助提取及活性測定方法。
[0004]—種西蘭花多肽組分微波輔助提取方法，包括以下步驟:S100:液氮研磨備制，將西蘭花陰干，用液氮研磨備制；S200:微波輻射，取研磨后的西蘭花100份，加入鮮重的10% 的PVP、鮮重的300 %的Tr i s-HCl溶液，溶液濃度55mmo 1 /L-65mmo 1 /L，pH值6-7，混勻，進行微波輻射；S 3 0 0:分離上清液。將步驟S 2 0 0微波輻射后的溶液取出，放于4 °C中靜置1 h， 4000rpm/min離心lOmin，取上清液;S400:加入有機溶劑，將步驟S300中的上清液加入預冷 (-20°C)的有機溶劑中，混勻，放于-20°C中靜置20-60min; S500:分離西蘭花多肽組分，在步驟S400之后，4000rpm/min離心lOmin，取離心后沉淀，倒扣除去殘余液體后正放在-20°C中靜置10-20min，加入蒸餾水溶解混勾，10000rpm/min離心6min，分離得到西蘭花多肽粗提物。
[0005]優選的，步驟S200中西蘭花重量(克)與微波功率(瓦)之比為1:5-9。步驟S400中所述有機溶劑為乙醇，則加入終濃度40%-80%乙醇于4°C攪拌l_3h;所述步驟S500包括離心分離上清，旋轉蒸發除乙醇得到多肽粗提物。步驟S400中所述有機溶劑為丙酮，上清液與丙酮體積之比為1:2-3。
[0006]—種西蘭花多肽組分微波輔助提取方法所提取的西蘭花多肽粗提物組分分離及活性測定方法，包括以下步驟:S600:取西蘭花多肽粗提物l-3ml加樣到Sephadex G-25凝膠過濾色譜儀(16mmX100〇mm)，以蒸餾水進行洗脫，流速lmL ?mirT1，用蛋白核酸檢測儀進行監測，波長280nm，收集各洗脫峰；S700:取西蘭花多肽各組分體積100微升，放于試管中，加入5ml的考馬斯亮藍溶液，震蕩搖勻，靜置lOmin后，于595nm處測西蘭花多肽各組分的吸光度值;S800:取西蘭花多肽各分離組分樣品液或蒸餾水(對照)與0.05mol ?.2Tris-HC1緩沖液混合于試管中，放在25°C的恒溫水浴中20min。加入一定量鄰苯三酚溶液，震蕩混勻，測量吸光度值，計算各分離組分對超氧陰離子自由基的清除率。
[0007]本發明的有益效果:建立了一種從西蘭花中高效、快速提取植物蛋白多肽的現代提取工藝。該方法利用微波輔助技術結合化學沉淀法提取西蘭花多肽，凝膠層析分離活性組分。本發明克服了高濃度有機溶劑易引起蛋白質變性失活，操作需要在低溫下進行，加入有機溶劑時需要攪拌均勻以避免局部濃度過大等缺點。利用微波輔助提取技術具有試劑用量少，環保，洗脫時間快，分離完全、回收率較高等優點。葡聚糖凝膠層析分離多肽活性組分具有吸附容量大、流速快、分辨率高等特點。可有效縮短提取時間、降低操作成本、減少有機溶劑用量，環保的優點，而且可顯著提高提取效率，獲得更多活性組分。【附圖說明】
[0008]圖1是本發明提取方法的流程圖；
[0009]圖2A是采用有機溶劑提取的多肽分離圖譜；
[0010]圖2B是采用微波輔助提取的多肽分離圖譜。【具體實施方式】
[0011]為使本發明的上述目的、特征和優點能夠更加明顯易懂，下面結合附圖對本發明的【具體實施方式】做詳細的說明，使本發明的上述及其它目的、特征和優勢將更加清晰。在全部附圖中相同的附圖標記指示相同的部分。并未刻意按比例繪制附圖，重點在于示出本發明的主旨。
[0012]本發明采用微波輔助提取西蘭花多肽，由于微波的高頻電磁波能夠穿透介質到達物料內部，通過吸收微波能，細胞內部溫度上升，細胞膨脹、破裂，有效成分自由流出，并在較低的溫度下溶解于介質中；微波產生的電磁場還可加速被萃取組分的分子由固體內部向固液界面擴散的速率;此外，微波輻射能作用于分子時，可促進分子作極性變換運動，產生鍵的振動、撕裂和粒子間的摩擦和碰撞，生成熱能，促使細胞破裂，細胞液溢出并擴散至溶劑中。在微波提取中，吸收微波能的差異可使基體物質的某些區域或提取體系中的某些組分被選擇性加熱，從而使被提取物質從基體或體系中分離，進入到溶劑中。[〇〇13] 實施例1
[0014]請參閱圖1，本發明的微波輔助提取西蘭花多肽組分的方法主要包括以下步驟。 [〇〇15]S100:液氮研磨備制。將西蘭花用蒸餾水洗凈后，取花蕾，陰干，用液氮研磨備制。
[0016]S200:微波輻射。取研磨后的西蘭花100份(克)，加入鮮重的10 %的PVP、鮮重的300%的Tris-HCL溶液，溶液濃度55mmol/L-65mmol/L，pH值6-7，混勾，放入微波爐中，西蘭花重量(克)與微波功率(瓦)之比為1: 5-9，優選的為1:8，微波的功率對西蘭花多肽的提取至關重要，功率過大則會破壞多肽結構，功率過小則不能使得有效成分自由流出，為此本申請的發明人經過多次試驗發現其西蘭花重量(克)與微波功率(瓦)之比為1:7-9時，既可以不破壞多肽結構，又可以使得西蘭花中的細胞膨脹、破裂，采用這一比例可以達到最佳的輔助提取效果。實驗表明當西蘭花重量(克)與微波功率(瓦)之比為1:5時，西蘭花多肽的流出率為37% (大部分多肽成分還存留在細胞中)，1:8時多肽的流出率為87%，1:10時多肽的流出率為40.5% (大部分多肽成分被破壞)。在本實施例中，微波功率為800W下微波輻射8-15s〇
[0017]S300:分離上清液。將步驟S200微波輻射后的溶液取出，放于4°C中靜置lh，4000rpm/min離心1 Omin，取上清液。[〇〇18]S400:加入有機溶劑。將步驟S300中的上清液加入預冷(-20°C )的有機溶劑中，本申請中有機溶劑采用丙酮，上清液:丙酮=1:2.5，混勻，放于-20 °C中靜置10_20min。上清液與丙酮之比對于最終多肽的提取率和多肽的活性有著重要影響，如前所述過多的有機溶劑會導致多肽產物的活性降低，而有機溶劑過少則西蘭花中的多肽不能完全溶于有機溶劑中，造成提取率低。本
【申請人】通過大量實驗發現，在微波輔助提取中上清液:丙酮為1:2-3 (體積比)時可以獲得最佳的提取率。實驗表明當上清液:丙酮為1:1時(體積比)，西蘭花多肽的提取率為30.5%，含85.3%的活性多肽，當上清液:丙酮為1:2.5時(體積比)提取率為 80%，含83.3%的活性多肽，當上清液:丙酮為1:4時(體積比)提取率為73%，含30.3%的活性多肽。為此本申請中為了獲得最佳的提取率和多肽活性，采用上清液:丙酮= 1:2.5(體積比)。[0〇19]S500:分離西蘭花多肽組分。在步驟S400之后，4000rpm/min離心lOmin，取離心后沉淀，倒扣除去殘余液體后正放在_20°C中靜置10_20min，加入蒸餾水溶解混勻(lg: 100微升)10000rpm/min離心6min，取上清液。分離得到西蘭花多肽粗提物。
[0020]實施例2
[0021]進一步的，本申請還公開了一種西蘭花多肽組分的活性測定方法，包括以下步驟:[〇〇22]S600:取西蘭花多肽粗提物l-3ml加樣到Sephadex G-25凝膠過濾色譜儀(16mmX1000mm)，以蒸餾水進行洗脫，流速lmL ? mirT1，用蛋白核酸檢測儀進行監測，波長280nm，收集各洗脫峰。[〇〇23]S700:取西蘭花多肽各組分體積100微升，放于試管中，加入5ml的考馬斯亮藍溶液，震蕩搖勻，靜置lOmin后，于595nm處測西蘭花多肽各組分的吸光度值。[〇〇24]S800:取西蘭花多肽各分離組分樣品液或蒸餾水(對照)與0.05mol ? L^pH:8.2Tris-HCl緩沖液混合于試管中，放在25°C的恒溫水浴中20min。加入一定量鄰苯三酚溶液，震蕩混勻，測量吸光度值，計算各分離組分對超氧陰離子自由基的清除率。
[0025]實驗例
[0026]通過該實驗例的比較可以進一步說明本發明實施例1提取方法的優點。[〇〇27] 實驗工藝條件:
[0028]傳統的有機溶劑提取法:西蘭花洗凈，剪下花蕾，陰干備用。稱量濕重花蕾，按鮮重的10 %加入PVP，液氮研磨，加入濃度為62.5mmol/L Tris-HCl提取液，4°C放置lh，去沉淀， 取上清液，加入一定體積_20°C預冷丙酮，于_20°C放置，去上清，取沉淀。沉淀_20°C放置 20min。加入蒸餾水溶解沉淀得西蘭花多肽粗提物。
[0029]微波輔助提取法:西蘭花洗凈，取花蕾，陰干備用。稱量濕重花蕾，按鮮重的10%加入PVP，液氮研磨，加入濃度為62.5mmol/L Tris-HCl提取液，混勻，放入微波爐中，微波功率 800W，小火下微波輻射1 Os，取出，4 °C放置lh，去沉淀，取上清液，按一定比例加入-20 °C預冷丙酮，于-20°C放置，去上清，取沉淀。沉淀-20°C放置20min。加入蒸餾水溶解沉淀得西蘭花多肽粗提物。
[0030]實驗結果:
[0031](1)提取時間、丙酮用量的比較
[0032]以上兩種方法分別針對提取液pH值、料液比、液酮比、丙酮提取時間四個因素做正交實驗分析，結果表明:改良型丙酮沉淀法的最優提取條件為提取液pH值為7、料液比為1: 3、液酮比為1:4.5，提取時間為40min;微波輔助的丙酮提取法最優提取條件為提取液pH值為7、料液比為1:3、液酮比為1:2.5，提取時間為20min。從最優工藝條件的比較可見微波輔助提取法具有提取時間短、操作成本低、減少丙酮用量，環保的優點，而且丙酮作用時間短可以減少對多肽產物活性的影響。[〇〇33](2)提取率的比較
[0034]分別利用優化工藝，取相同質量陰干西蘭花花蕾，進行西蘭花多肽的提取，考馬斯亮藍染色法測定獲得西蘭花多肽粗提物的含量，計算提取率，各重復三次。改良型丙酮沉淀法的提取率為l〇〇g原料提取300-390mg粗多肽，微波輔助提取法的提取率為100g原料提取 565-760mg粗多肽。由此數據可見，微波輔助提取可顯著增加西蘭花多肽的提取率。[〇〇35](3)分離圖譜的比較
[0036]利用改良型丙酮沉淀法和微波輔助丙酮沉淀法提取西蘭花多肽后利用凝膠過濾層析進行多肽分離的譜圖分別如圖2A、2B所示，其中橫坐標為洗脫時間，縱坐標為吸光度。 從圖中可以看出微波輔助提取法各峰尖吸光度及峰面積明顯高于傳統溶劑提取法。
[0037]從上述實驗例可以看出，與有機溶劑提取法相比微波輔助提取法可有效縮短提取時間、降低操作成本、減少丙酮用量，環保的優點，而且可顯著提高提取效率，獲得更多活性組分。
[0038]在以上的描述中闡述了很多具體細節以便于充分理解本發明。但是以上描述僅是本發明的較佳實施例而已，本發明能夠以很多不同于在此描述的其它方式來實施，因此本發明不受上面公開的具體實施的限制。同時任何熟悉本領域技術人員在不脫離本發明技術方案范圍情況下，都可利用上述揭示的方法和技術內容對本發明技術方案做出許多可能的變動和修飾，或修改為等同變化的等效實施例。凡是未脫離本發明技術方案的內容，依據本發明的技術實質對以上實施例所做的任何簡單修改、等同變化及修飾，均仍屬于本發明技術方案保護的范圍內。
【主權項】
1.一種西蘭花多肽組分微波輔助提取及活性測定方法，其特征在于，包括以下步驟:S100:液氮研磨備制，將西蘭花陰干，用液氮研磨備制；S200:微波輻射，取研磨后的西蘭花100份，加入鮮重的10 %的PVP、鮮重的300 %的 Tris-HCL溶液，溶液濃度55mm〇l/L-65mm〇l/L，pH值6-7，混勻，進行微波輻射；S300:分離上清液，將步驟S200微波輻射后的溶液取出，放于4°C中靜置lh，4000rpm/ min離心lOmin，取上清液；S400:加入有機溶劑，將步驟S300中的上清液加入預冷的有機溶劑中，混勻，放于-20°C 中靜置20_60min;S500:分離西蘭花多肽組分，在步驟S400之后，離心，取離心后分離物，分離得到西蘭花 多妝粗提物。2.根據權利要求1所述的西蘭花多肽組分微波輔助提取方法，其特征在于，步驟S200中 西蘭花重量(克)與微波功率(瓦)之比為1:5-9。3.根據權利要求1所述的西蘭花多肽組分微波輔助提取方法，其特征在于，所述步驟 S400中所述有機溶劑為濃度40%-80%乙醇，所述步驟S500包括于4°C攪拌l_3h;離心分離 上清，旋轉蒸發除乙醇，分離得到西蘭花多肽粗提物。4.根據權利要求1所述的西蘭花多肽組分微波輔助提取方法，其特征在于，所述步驟 S400中所述有機溶劑為丙酮，所述步驟S500包括4000rpm/min離心lOmin，取離心后沉淀，倒 扣除去殘余液體后正放在-20 °C中靜置10_20min，加入蒸餾水溶解混勻，10000rpm/min離心 6min，分離得到西蘭花多肽粗提物。5.根據權利要求1所述的西蘭花多肽組分微波輔助提取方法，其特征在于，步驟S400中 所述有機溶劑為丙酮，上清液與丙酮體積之比為1:2-3。6.—種如權利要求1-5任一所述的西蘭花多肽組分微波輔助提取方法所提取的西蘭花 多肽粗提物組分分離及活性測定方法，其特征在于，包括以下步驟:S600:取西蘭花多肽粗提物l-3ml加樣到Sephadex G-25凝膠過濾色譜儀(16mmX 1000mm)，以蒸餾水進行洗脫，流速lmL ? mirT1，用蛋白核酸檢測儀進行監測，波長280nm，收 集各洗脫峰；S700:取西蘭花多肽各組分體積100微升，放于試管中，加入5ml的考馬斯亮藍溶液，震 蕩搖勻，靜置lOmin后，于595nm處測西蘭花多肽各組分的吸光度值；S800:取西蘭花多肽各分離組分樣品液或對照蒸餾水與0.05mol ? 1/^11 = 8.2 Tris-HC1緩沖液混合于試管中，放在25°C的恒溫水浴中20min，加入一定量鄰苯三酚溶液，震蕩混 勻，測量吸光度值，計算各分離組分對超氧陰離子自由基的清除率。
【文檔編號】G01N30/14GK106053191SQ201610333006
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年5月18日
【發明人】徐俊杰, 呂士杰, 李妍, 朱文赫, 張巍, 蘆曉晶, 劉洋
【申請人】吉林醫藥學院