抗腫瘤環肽化合物gg-8及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬化學領域，涉及環肽化合物GG-8的同分異構體和它們的制備方法，以及化合物在抗腫瘤藥物中的用途。
【背景技術】
[0002]現有技術公開了環肽由氨基酸組成，在結構組成方面與肽類藥物具有相似性；另一方面，環肽中的氨基酸殘基連接成環，分子中羧基和氨基等親水基團消失，造成了使得這類成分的水溶性大大減小，它在溶劑中的極性接近于有機小分子藥物或經典生物堿等化合物。有研究顯示，與鏈狀肽類相比，環肽在溶液中的構象因為環的存在受到了一定的限制(Salvatella，2003)，因此從結構上分析，環肽類化合物作為藥物，與肽類和有機小分子藥物都有所不同，具有其獨特性，是獨特的一類藥物作用分子。天然環肽類化合物主要來源于微生物代謝產物(Harada，2004)、真菌和海洋生物(Bewley，1996)。高等植物石竹科、鼠李科(Rubiaceae)和番蒸枝科(Annonaceae)等中也有報道分離出環肽類化合物(GourneI is, 1997, Tan&Zhou, 2006)。
[0003]本申請的發明人擬提供新的環肽化合物GG-8的同分異構體及其制備方法和用途
[0004]于本發明相關的現有技術有:
[0005]1.Ning-hua Tan*, Jun Zhou.2006.Plant cyclopeptides.ChemicalReviews, 2006, 106(3): 840-895.。

【發明內容】

[0006]本發明的目的是提供新的環狀肽類化合物GG-8同分異構體及其制備方法。
[0007]本發明的進一步目的是提供所述化合物GG-8異構體的抗腫瘤的用途。
[0008]本發明所述的抗腫瘤活性化合物GG-8來源于抗腫瘤活性植物的化學成分提取分離，本發明提供了它們的有機合成方法。
[0009]本發明公開了化合物GG-8的化學結構和生物活性特征。
[0010]本發明中，所述的GG-8結構類型屬于環狀肽類化合物，又稱為環肽，具有如下特征:
[0011]1、化合物的波譜學性質特征:
[0012]分子量為974，其質譜離子峰顯示為975 (MH+, 100);同時質譜圖中具有862，749，635，522，423，310，211 一系列碎片峰信號。
[0013]2、化合物的氨基酸組成特征
[0014]本發明文中組成化合物的“氨基酸”均為氨基酸殘基，即一端脫去氨基中的一個質子，另一端脫去羧基上的羥基:
[0015]準確稱量干燥的化合物樣品置于安瓿瓶中，加12當量濃度鹽酸，充氮氣密封水解后，在日立835-50型氨基酸自動分析儀上分析，標準樣品對照。環肽化合物GG-8由以下類型氨基酸組成:亮氨酸(Leu),異亮氨酸(lie),纈氨酸(Val),脯氨酸(Pro)。
[0016]3、化合物的氨基酸構成和順序及分子式:即本發明化合物GG-8由亮氨酸(Leu),異亮氨酸(He)，纈氨酸(Val),脯氨酸(Pro)形成六種可能的同分異構體結構，其中，異亮氨酸的順序由核磁共振二維譜中相應的遠程偶合(HMBC)和TOCSY等信號確定，由質譜數據并結合核磁共振氫譜和碳譜，推斷化合物分子式為C51H91N9O9,分子量為974。
[0017]本發明中，優選的氨基酸殘基通過酰胺鍵構成首尾相連形成的單環肽，形成下述六種不
[0018]同氨基酸連結順序的環肽同分異構體化合物GG-8-1?GG-8-6:
[0019]Cyclo- (Leul-Leu2-Leu3-Leu4-Val1-Leu5-Val2-1le-Pro) GG-8-1
[0020]Cyclo- (Leul-Leu2-Leu3-Leu4-Val1-1le-Val2-Leu5-Pro) GG-8-2[0021 ] Cyclo- (Leul-Leu2-Leu3-1le4-Val1-Leu4-Val2-Leu5-Pro) GG-8-3
[0022]Cyclo- (Leul-Leu2-1le-Leu3-Val1-Leu4-Val2-Leu5-Pro) GG-8-4
[0023]Cyclo- (Leul-1le-Leu2-Leu3-Val1-Leu4-Val2-Leu5-Pro) GG-8-5
[0024]Cyclo- (Ile-Leul-Leu2-Leu3-Val1-Leu4-Val2-Leu5-Pro) GG—8—6
[0025]4、化合物的化學性質特征:
[0026]在鹽酸介質中110攝氏度水解I小時,產物對水合茚三酮的5%丙溶液顯桃紅色；未經水解的化合物與上述茚三酮溶液混合，不發生顏色變化。
[0027]5、化合物的色譜特征:
[0028]化合物GG-8在硅膠層析板上，在氯仿-甲醇(95-5)、乙酸乙酯-甲醇(95_5)等溶劑展開系統中，比移值(Rf)在0.4-0.6之間；反相硅膠層析板(RP-18)上，甲醇-水(85-15)展開系統中，比移值(Rf)為0.4;所用層析板商業來源不同，展開溶劑不同，實驗室環境條件不同，對上述比移值均有不同程度的影響；
[0029]化合物GG-8在反相高效液相色譜層析中，在甲醇-醋酸-水或乙腈-醋酸-水多種不同配比的層析系統中，紫外光200至400納米范圍內的多個波長檢測下，均顯示一對稱尖銳的峰；其中在其中一個條件下的保留時間為8.5分，所采用的儀器為Agilent-1100系列高效液相色譜儀系統，G1315B DAD紫外光檢測器，G1311A四極泵；色譜柱型號:phenomenex Luna C18, 4.6毫米/150mm毫米，檢測波210納米；層析溶劑:甲醇-1%醋酸水溶液(85-15)，流速1.0毫升/分鐘。
[0030]6、抗腫瘤藥理活性特征:
[0031]使用MTT方法檢測腫瘤細胞在化合物存以不同濃度存在存活率，活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性藍紫色結晶甲瓚(Formazan)并沉積在細胞中，而死細胞無此功能；二甲基亞砜(DMSO)能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯免疫檢測儀在490nm波長處測定其吸光值，可間接反應活細胞數量；在一定細胞數范圍內，MTT結晶形成的量與活細胞數成正比。
[0032]本發明中，經腫瘤細胞檢測，結果顯示，所述的化合物GG-8對人源腫瘤細胞在體外實驗中具有抑制生長活性，對人胃癌細胞SGC-7901半數抑制率IC5tl為11.0 μ M，人肝癌細胞SMMC-7721半數抑制率17.5 μ M0
[0033]本發明所述的化合物GG-8可單獨應用于抗癌藥物的制備，也可以與其他藥物輔料組成抗癌藥物的多種制劑類型以及抗癌藥物組合物。
[0034]本發明提供了化合物GG-8的化學合成制備方法，其包括:
[0035]通過Fmoc保護基(9-fuorenylmethyloxycarbonyl)固相合成法化學合成制備化合物GG-8:
[0036](I)接樹月旨:將Wang樹月旨在DMF (N, N-dimethylformamide)中溶漲I小時，然后用4A分子篩處理過的二氯甲烷(DCM)溶劑洗滌2次，將帶有Fomc保護基的氨基酸(HO-AA-Fomc)與 DIEA (N, N-diisopropytethlamine)以 1:4 的當量比加入 2.5mL 干燥過的二氯甲烷，混合物在氮氣保護下攪拌2小時后除去混合物，樹脂用二氯甲烷/甲醇/ 二異丙胺(17:2:1)混合溶劑洗滌3次，再依次用二氯甲烷、DMF、二氯甲烷洗滌，每次洗用2_3毫升洗漆3分鐘,樹脂上所接氨基酸為帶Fmoc保護基的纟顏氨酸(HO-Val-N-Fmoc),其立體構型是D-型或L-型；
[0037]檢測氨基酸與樹脂的連接:樹脂的接載利用Fmoc-Piperidine加成物的紫外光譜定量確定，上述接載Fmoc保護氨基酸的樹脂約3毫克在25毫升容量瓶中與0.4mlPiperidine, 0.4ml 二氯甲烷在室溫下反應30分鐘，然后加入1.6ml甲醇最后用二氯甲烷稀釋至25毫升,參比溶液為0.4ml Piperidine, 0.4ml 二氯甲燒，1.6ml甲醇最后用二氯甲燒稀釋至25ml，檢測波長為301nm ;接載度表示為每克樹脂中接載氨基酸的毫摩爾數，即:毫摩爾氨基酸 / 克樹脂(AAmmol/g resin),計算方法為:mmolgH= (A3Q1/7800) x25mlgH ;
[0038](2) Fmoc去保護:對已接載氨基酸的樹脂用3毫升20%piperidine DMF溶液洗滌I分鐘，10分鐘；再依次用3毫升DMF、二氯甲烷、DMF洗滌，各2次；
[0039](3)形成肽鍵:3-4倍過量的Fmoc保護的氨基酸，活化試劑HOBt/HBTU，NMM在3mlDMF中氮氣保護下攪拌2小時，鍵合反應完成后依次用3ml DMF和3ml 二氯甲烷各洗三次，本發明制備目標產物為GG-8的六種不同異構體時，其步聚中使用的帶Fmoc保護基的氨基酸依結構而定，合環氨基酸選擇纈氨酸-脯氨酸或者纈氨酸-異亮氨酸。
[0040]本發明合成所選用的Fmoc保護基的氨基酸原料表示為AAl至AA9，還可以包括任何可以構成分子式為C51H91N9O9,或分子量為974環狀肽化合物的氨基酸；所述氨基酸的結構可以是α-氨基酸、β-氨基酸或Y-氨基酸；所述氨基酸的立體化學構型可以是D-型或L-型；所選用的氨基酸原料也可以帶有叔丁基氧羰基(Boc)保護基。
[0041]本發明中所選用的活化劑為:H0Bt,N-hydroxybenzotriazole;HBTU, 0-(benzotriazol-1)-1， I,3,3-tetrame-thyluronium hexafluorophosphate;N MM, N-methylmorpholine ；
[0042]用所需的Fmoc保護基氨基酸重復步驟(2)，(3)得到目標化合物的直鏈肽；
[0043](4)脫樹脂:干燥過的接有目標直鏈肽的樹脂，在混合溶劑TEA//DCM(1:1:3,每毫克樹脂10微升)中攪拌處理2小時，將樹脂過濾并用上述混合溶劑3ml洗滌3次，加入15倍的正已烷作為共沸劑除去醋酸后，將濾液濃縮后凍干，所述的混合溶劑其中，TEA, 2, 2, 2-trif Iuoroethanol (三氟乙酸);DCM, dimethylmthane ( 二氯甲燒)，以及微量乙二硫醇和苯甲硫醚；
[0044](5)肽鏈合環:在濃度為 7.7 X 1-4M, HATU (2.0eq)和 DIEA (2.5eq)存在下二氯甲燒中進行，
[0045]上述反應物溶液在4攝氏度下攪拌I小時后，室溫下放置過夜，減壓蒸干，其中選用下述試劑 HATU, N-[ (dimethylamino)-1H-1, 2, 3-triazolo-[4, 5-b]pyridin-l-yl-methylene] - N-methylmethanaminium hexafluoroposphate N-oxide;DIEA, N，N-diisopropylethylamine ；
[0046](6)粗產物用分別用1ml乙酸乙脂超聲固相萃取5次至固相中不再檢測出環肽產物為止。萃取液蒸干，用硅膠柱層析分離。化合物結構用質譜和核磁共振方法檢測，確證結構。
[0047]本發明還提供了從植物中提取制備化合物GG-8的方法，其包括:
[0048]本發明所述的化合物GG-8可以從番蒸枝科(Annonaceae)植物的種子、枝葉、根莖等部位，或植物組織培養產物，用甲醇、乙醇、丙酮等有機溶劑或二氧化碳超臨界提取，經反復層析分離的方法制備；
[0049]所述的番荔枝科植物包括哥納香屬(Gon1thalamus)植物大花哥納香(G.griffithii)、金平哥納香(G.1eocarpus)、景洪哥納香(G.cheliensis)、番蒸枝屬植物(Annona spp)、紫玉盤屬(Uvaria spp.)植物。
[0050]本發明中，上述的化合物采用如下層析方法，
[0051](I)硅膠柱層析
[0052]硅膠為柱層析硅膠，孔徑通常為200-300目，或0.043-0.060mm，相應的層析洗脫溶劑為氯仿-甲醇(97:3-92:8)，或氯仿-丙酮(9:1-8:2)或乙酸乙酯-甲醇(95:5-90:10)，或石油醚-丙酮(3:7-5:5)或石油醚-乙酸乙酯(3:7-4:6);或，
[0053](2)反相硅膠柱層析
[0054]層析材料為硅膠鍵合碳十八凝膠(RP-18)，相應的層析洗脫劑為甲醇-水(6:4-9:1)或丙酮-水(5:5-9:1);或，
[0055](3)葡聚糖凝膠LH-20相應層析，洗脫溶劑為甲醇或甲醇-水(9:1)，或
[0056]⑷M