雜環構建的三肽環氧酮類化合物及制備和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及藥物生產領域，具體的，本發明涉及一類新的肽骨架中包含有一個雜 環的三肽環氧酮類化合物、其制備方法和應用，以及所述化合物在制備抗腫瘤藥物中的應 用。
【背景技術】
[0002] 隨著全球人口的不斷增加和人口老齡化趨勢的不斷加深，同時也因為包括吸煙在 內的各種不健康生活方式的廣泛存在及環境的污染，腫瘤已經成為了發達國家威脅人類 健康的頭號殺手和發展中國家威脅人類健康的第二號殺手（CA-Cancer. J. Clin. 2011， 61，69-90)。在我國，癌癥已成首位死因。2014年2月3日，世界衛生組織（WHO)發表《全 球癌癥報告2014》，稱中國新增癌癥病例和死亡病例高居全球第一位。傳統的化學治療藥物 如烷化劑、抗代謝物等普遍存在毒副作用大、易產生耐藥性等缺點，而針對信號通路中的關 鍵蛋白或激酶而設計的抗腫瘤藥物正在腫瘤治療領域中發揮著越來越重要的作用，開發新 型、低毒、高效的抗腫瘤藥物關系民生，意義重大。
[0003] 蛋白酶體是一個廣泛分布于真核細胞細胞質和細胞核內的多亞基大分子復合物， 具有多種催化功能，控制著細胞內80%-90%蛋白質的代謝，參與細胞周期調控、細胞凋亡、 細胞信號轉導、DNA修復及多種生理功能，對細胞生長、發育起到重要的作用。蛋白酶體通 過調控影響細胞信號通路的關鍵蛋白（如P53，NF-κ B)的水平，進而對各種生命活動發揮 調節作用，而很多這些調節蛋白（如細胞周期蛋白）在腫瘤的發生生長過程中都發揮著重要 作用。蛋白酶體抑制劑通過抑制蛋白酶體活性，影響細胞內多個周期蛋白的降解，促進細胞 凋亡。
[0004] 過去的數十年中，許多結構類型的小分子化合物被發現具有蛋白酶體抑制活性并 且有較強的抗腫瘤作用。目前，已有兩個小分子蛋白酶體抑制劑進入臨床應用，分別是硼酸 肽類化合物Bortezomib和環氧酮肽類化合物Carfilzomib,這更加驗證了蛋白酶體作為腫 瘤治療靶點的正確性。
[0005] 與Bortezomib相比，環氧酮類化合物Carfilzomib不僅具有良好的腫瘤抑 制作用，還不具有一般蛋白酶體抑制劑的毒副作用：引起神經損害。究其原因，是因 為C ar f i I z 〇 m i b具有更加特異的蛋白酶體抑制活性，對其他蛋白酶的抑制活性明顯較 Bortezomib 低（Clin Cancer Res. 2011，17，2734-2743)。Carfilzomib 由美國 ONXY 公 司開發研制，于2012年通過FDA加速審批程序后獲批，主要用于已至少接受兩種優先級更 高的多發性骨髓瘤患者的治療(包括第一代蛋白酶體抑制劑Bortezomib和一種免疫調節 劑)。該藥和第一代蛋白酶體抑制劑相比有明顯的優越性，它能克服傳統抗腫瘤藥物的耐受 性并有更好的安全性，為多發性骨髓瘤的治療帶來了更多希望。

【發明內容】

[0006] 本發明的目的是提供一種雜環構建的三肽環氧酮類化合物，具有下述式I的結構 通式：
R1, R2, R3各自獨立選自H、CV6烷基-D、鹵代的CV6烷基-DXp 6羥基烷基、Cp6巰基烷基、 CV6烷氧基烷基、芳基、芳烷基、雜芳基或雜芳烷基； 其中：D為N(Ra) (Rb)或缺失，Ra，Rb各自獨立選自H、OH、CV6烷基、鹵代的Cp 6烷基或N 末端保護基； R4, R5各自獨立選自H、OH、Cp6烷基、鹵代的Cp6烷基或芳烷基； R6選自H，CV6烷基，鹵代的Cp6烷基，Cp6羥基烷基，Cp 6烷氧基，鹵代的Cp6烷氧基， C (O) O-CV6 烷基，C (O) NH-Cp6 烷基，芳烷基； X為0、S、NH、N-Ch烷基或N-鹵代的CV6烷基；
〃或者缺失， 其中R選自H、CV6烷基或鹵代的Cp6烷基； 環A選自5~7元的飽和脂肪雜環、不飽和雜環、或者有取代的5~7元的飽和脂肪雜 環、不飽和雜環，所述的雜環包含0~3個選自0、N和S的雜原子并任選地被R8、R9和B 1 基團取代； R8, R9分別獨立選自Η、0H，Cp6烷基，Cp6烷氧基，CV6羥基烷基，CV 6巰基烷基，Cp6烷 基-D，芳基，雜環芳基，環烷基和雜環基，這些基團可以被1?素、硝基、氣基、CN、Cp6烷基、齒 代的CV 6烷基，Cp6烷氧基或鹵代的Cp6烷氧基取代，每個基團可與一個或多個芳基或雜環 芳基稠合，或與一個或多個飽和或部分不飽和環烷基或雜環稠合； 81和氏相同或不同，分別獨立選自0、5』〇〇、(：〇?(1)〇〇或缺失，其中1?。為和&分別 獨立選自H、Cp6烷基、鹵代的Cp6烷基、Cp6烷氧基、鹵代的Cp 6烷氧基，R。、Rd和R6相同或 不同； B選自
'Rf或者是缺失，其中Rf選自HXp 6烷基 或鹵代的Cp6烷基； R7選自H、Cp6烷基、Cp6烯基、Cp6炔基、碳環基、雜環基、芳基、C^ 6芳烷基、雜芳基、 C^6雜芳烷基、Rg-ZEZ-C^8烷基、Rg-ZEZ-C^ 8烷基-ZEZ-Cp8烷基、雜環基-MZEZ-Cp8烷基、 (R g)2N-Cp8烷基、雜環基-M或碳環基-M-，這些基團可以被鹵素、硝基、氨基、CN、C^ 6烷基、 鹵代的Cp6烷基、Cp6烷氧基或鹵代的Cp6烷氧基取代，其中，E當旁邊出現Z時任選為共價 鍵，M缺失或為Cp 12烷基，Z當旁邊出現E時任選為共價鍵。
[0007] 優選的，X為0原子； 優選的，L為
、其中R選自H、CV6烷基、鹵代的CV 6烷基； B1和B2分別獨立優選0、S、N(Rc)或者是缺失，Rc選自H、Cp6烷基、鹵代的Cp 6烷基、 (V6烷氧基、鹵代的(V6烷氧基；
優選的，環A為六元飽和脂肪雜環、不飽和雜環。
[0008] 優選的，本發明提供了下述化合物，其中，若不作特別說明，所涉及氨基酸均為 L-型氨基酸。
[0009] 4-(批嗪-2-基氨甲酰基）哌陡-1-酰基-Phe-Leu-Leu-環氧酮（5a), 4-(批嗪-2-基氨甲酰基）哌陡-1-酰基-Leu-Phe-Leu-環氧酮（5b)， 4-(批嗪-2-酰基）哌嗪-1-酰基-Phe-Leu-Leu-環氧酮（5c)， 4-(批嗪-2-酰基）哌嗪-1-酰基-Leu-Phe-Leu-環氧酮（5d)， 4- (4-氟苯基氨甲酰基）哌陡-1-酰基-Leu-Phe-Leu-環氧酮（5e)， 4- (4-苯甲酰基苯基氨甲酰基）哌陡-1-酰基-Leu-Phe-Leu-環氧酮（5f), 4-(聯苯-4-基氨甲酰基）哌陡-1-酰基-Leu-Phe-Leu-環氧酮（5g)， 4- (4-氯苯基氨甲酰基）哌陡-1-酰基-Leu-Phe-Leu-環氧酮（5h)， 4- (4-甲氧基苯基氨甲酰基）哌陡-1-酰基-Leu-Phe-Leu-環氧酮（5i)， 4-(異惡唑-3-基氨甲酰基）哌陡-1-酰基-Leu-Phe-Leu-環氧酮（5 j)， 4-(噻唑-2-基氨甲酰基）哌陡-1-酰基-Leu-Phe-Leu-環氧酮（5k), 4-(批陡-2-基氨甲酰基）哌陡-1-酰基-Leu-Phe-Leu-環氧酮（51)， 4-(批陡-3-基氨甲酰基）哌陡-1-酰基-Leu-Phe-Leu-環氧酮（5m), 4- (4-氯苯基氨甲酰基）哌嗪-1-酰基-Leu-Phe-Leu-環氧酮（5n)， 4- (4-甲氧基苯基氨甲酰基）哌嗪-1-酰基-Leu-Phe-Leu-環氧酮（5〇)， 4- (4-氯苯甲酰氨基）哌陡-1-酰基-Leu-Phe-Leu-環氧酮（5p)， 4- (4-甲氧基苯甲酰氨基）哌陡-1-酰基-Leu-Phe-Leu-環氧酮（5q), 4-(嗎啉-4-醜基）哌陡-1-醜基-Leu-Phe-Leu-環氧酮（5r)， 3-(批嗪-2-基氨甲酰基）哌陡-1-酰基-Leu-Phe-Leu-環氧酮（5s)， 3- (4-氯苯基氨甲酰基）哌陡-1-酰基-Leu-Phe-Leu-環氧酮（5t)。
[0010] 本發明的另一個目的是提供上述目標化合物的制備方法，通過以下步驟實現： (1)化合物6與保護的氨基酸在縮合試劑作用下反應得化合物7,選用的縮合試劑有二 環己基碳二亞胺/4-二甲氨基吡啶、二環己基碳二亞胺/1-羥基苯并三氮唑、N-(3-二甲氨 基丙基）-Ν' -乙基碳二亞胺鹽酸鹽/1-羥基苯并三氮唑。反應溫度0-50°C，反應時間2-8 小時，粗產品可直接用于下步反應。
[0011] (2)化合物7在酸性條件下脫去Boc保護基，選用酸性條件為HCl的乙醚溶液，HCl 的乙酸乙酯溶液，HCl的甲醇溶液，HCl的二氧六環溶液和三氟乙酸。反應溫度-10-40°C, 反應時間0. 5-3小時。所得粗產品直接用于下步反應。
[0012] (3)化合物1在酸性條件下脫去Boc保護基得化合物2。選用反應條件同步驟（2)。 所得粗產品直接用于下步反應。
[0013] (4)氨基酸甲酯在堿性條件下與三光氣反應得氨基酸甲酯異氰酸酯，選用堿性條 件為碳酸鈉，碳酸氫鈉，三乙胺或二異丙基乙胺，反應溫度-20-0°C，反應時間10分鐘-1小 時。異氰酸酯和化合物2在堿性條件下縮合得化合物3,所用堿性條件為三乙胺或二異丙基 乙胺，反應溫度0_50°C，反應時間1-6小時，所得粗產品直接用于下步反應。
[0014] (5)化合物3在堿性條件下水解得化合物4。選用堿性條件為氫氧化鈉、氫氧化鋰、 氫氧化鉀，反應溫度0_40°C，反應時間0. 5-2小時，所得產品直接用于下步反應。
[0015] (6)化合物4與化合物8在縮合試劑作用下反應得目標產物化合物5。選用縮合 試劑同步驟（1 )，所得粗產品經柱層析分離得純品。
[0016] 反應式：
其中所用原料6的合成參見文獻J JfeiZ泛￡皿2009，公，3028。
[0017] 本發明的再一個目的是提供三肽環氧酮類化合物在制備治療由蛋白酶體介導的 疾病的藥物中的應用。所述蛋白酶體介導的疾病包括惡性腫瘤、神經退行性疾病、免疫性疾 病等。所述腫瘤為骨髓瘤、淋巴瘤等血液腫瘤。
[0018] 本發明的藥物劑型為固體制劑或液體制劑，給藥途徑為口服、注射、吸入或植入。 優選注射給藥和口服給藥方式，例如注射劑、凍干粉針劑、片劑、膠囊和顆粒劑等。
[0019] 本發明的藥物由所述的化合物或其多晶型物、立體異構體、前體藥物、溶劑合物或 可藥用的鹽作為活性組分，與可藥用的載體或賦形劑制備。
[0020] 實驗證明，本發明的由雜環構建的三肽環氧酮類化合物具有很好的蛋白酶體抑制 活性，對RPMI8226、H929等多發性骨髓瘤細胞株有極強的體外增殖抑制作用。
[0021] 本發明以Carfilzomib為先導化合物，設計并合成了一系列全新的小分子短肽類 蛋白酶體抑制劑，以雜環構建的三肽環氧酮類化合物作為其結構特點，并對該類化合物進 行了分子、細胞以及動物水平的蛋白酶體活性抑制評價；同時進行了細胞水平與動物水平 的的抗腫瘤活性研究。結果表明，該類化合物具有極強的蛋白酶體抑制活性及細胞增殖抑 制活性，是有前景的蛋白酶體抑制劑，為癌癥治療藥物的研究提供了新的思路。本發明化合 物的合成所需原料易得，路線設計合理，反應條件溫和，各步產率高，操作簡便，適合工業化 生產。
【附圖說明】
[0022] 圖1是部分化合物對血細胞中蛋白酶體CT-L的抑制活性。
[0023] 圖2 (A-B)是部分化合物對正常小鼠血細胞及心臟組織的蛋白酶體抑制活性。
[0024] 圖3 (A-C)是部分化合物對荷瘤小鼠血液及組織的蛋白酶體CT-L抑制活性。
[0025] 圖4是化合物對人骨髓瘤RPMI 8226 N0D/SCID小鼠體重的影響。
【具體實施方式】
[0026] 本發明結合附圖和實施例作進一步的說明，以下實施例僅是說明本發明，而不是 以任何方式限制本發明。
[0027] 制備實施例1、4-(吡嗪-2-基氨甲酰基）哌啶-1-甲酸叔丁酯（la，Ib) 將1-(叔丁氧羰基）哌啶-4-甲酸（2. 75g，12mmol)置于50mL三頸瓶中，N2保護下加 入25mL無水CH2Cl2，然后緩緩滴入吡啶（2. 5mL，30mmol)和二氯亞砜（I. lmL，14mmol)，該 反應液置于室溫反應半小時。隨后，2-氨基吡嗪（0. 95g，IOmmol)和三乙胺（5. 7mL，40mmol) 溶于15mL CH2Cl2后緩緩滴入上述反應液，室溫反應6小時。反應液加30mL飽和食鹽水稀 釋，分出有機層，水層CH 2Cl2提取（15mLX 3)，合并有機層，無水硫酸鈉干燥后減壓除去溶 劑，柱層析分離得白色固體 2. 3g，收率 74%。！!!. p. : 134-136°C; 1HNMR (500MHz，CDCl3): δ= 9.55 (s, 1H, pyrazine-H), 8.35 (d, 1H, /=2. OHz, pyrazine-H), 8.23 (s, 1H, pyrazine-H), 7.97 (s, 1H, NH), 4.20 (m, 2H, CH2), 2.81 (m, 2H, CH2), 2.48 (m, 1H, CH), 1.93 (d, 2H, /=12. 5Hz, CH2), 1.76 (m, 2H, CH2), 1.47 (s, 9H, CH3) ppm; ESI-MS: m/z = 307[M+H]+。
[0028] 制備實施例2、4_ (吡嗪-2-酰基）哌嗪-I-甲酸叔丁酯（lc，Id) 吡嗪-2-羧酸（I. 5g，12mmol)置于50ml反應瓶中，加入35mL無水CH2Cl2溶解，隨即 加入1-羥基苯并三氮唑（I. 6g，12mmol)和N-(3_二甲氨基丙基）_N' -乙基碳二亞胺鹽酸 鹽（3. 5g，18mmol)，室溫反應半小時。隨后，哌嗪-1-甲酸叔丁酯（I. 9g，IOmmol)加入反應 液中，室溫反應3小時。反應液加入30mL飽和碳酸氫鈉水溶液稀釋，分出有機層，飽和食鹽 水洗（20mLX 2)，無水硫酸鈉干燥后減壓除去溶劑，柱層析分離得白色固體2. 4g，收率83%。 m.p·: 146-148?; 1HNMR (500MHz，CDCl3): 5=8.97 (d，1H，/=1.5Hz，pyrazine-H)， 8.65 (d, 1Η, /=2. 5Hz, pyrazine-H), 8.54 (s, 1Η, pyrazine-H), 3.79 (t, 2H, /=5. 0Hz, CH2), 3. 62 (t, 2H, /=5. 0Hz, CH2), 3. 56 (t, 2H, /=5. 0Hz, CH2), 3. 49 (t, 2H, /=5.0Hz, CH2), 1.47 (s, 9H, CH3) ppm; ESI-MS: m/z = 293[M+H] +。
[0029] 制備實施例3、4_ (4-氟苯基氨甲酰基）哌啶-I-甲酸叔丁酯（Ie) 以4-氟苯胺為原料，合成及后處理同制備實施例1。得白色固體2. 4g，收率75%。 m.p·: 147-149°C; 1HNMR (500MHz，CDCl3): 5= 7.47 (m，2H，Ar-H), 7.20 (s，1H， NH), 7.01 (t, 2H, /=8.0Hz, Ar-H), 4.18 (d, 2H, /=12.0Hz, CH2), 2.80 (t, 2H, /=12. 5Hz, CH2), 2.37 (m, 1H, CH), 1.90 (d, 2H, /=12. 5Hz, CH2), 1.75 (m, 2H, CH2), 1.47 (s, 9H, CH3) ppm; ESI-MS: m/z = 323[M+H] +。
[0030] 制備實施例4、4- (4-苯甲酰基苯基氨甲酰基）哌啶-I-甲酸叔丁酯（If) 以（4-氨基苯基)苯甲酮為原料，合成及后處理同制備實施例1。得白色固體3. Og，收率 73%。m. P. : 162-164? ; 1H NMR (500MHz，CDCl3) : S= 7.82 (d, 2H, /=8. 5Hz, Ar-H), 7. 77 (d, 2H, /=8. 5Hz, Ar-H), 7. 67 (d, 2H, /=9. 5Hz, Ar-H), 7. 58 (t, 1H, /=7. 0Hz, Ar-H), 7.48 (t, 2H, /=8. OHz, Ar-H), 7.41 (s, 1H, NH), 4.18 (d, 2H, /=12. 5Hz, CH2), 2.78 (t, 2H, /=13.0Hz, CH2), 2.44 (m, 1H, CH), 1.90 (d, 2H, /=11. 5Hz, CH2), 1.77 (m, 2H, CH2), 1.48 (s, 9H, CH3) ppm; ESI-MS: m/z = 409[M+H] +。
[0031] 制備實施例5、4_ (聯苯-4-基氨甲酰基）哌啶-I-甲酸叔丁酯（Ig) 以4-氨基聯苯為原料，合成及后處理同制備實施例1。得白色固體2. 3g，收率60%。 m.p·: 219-221 °C ; 1H NMR (500MHz，CDCl3): 5= 7.57 (m，6H，Ar-H), 7.43 (t， 2H, /=7. 5Hz, Ar-H), 7. 33 (t, 1H, /=7. 5Hz, Ar-H), 7. 22 (s, 1H, NH), 4. 20 (d, 2H, /=12. 5Hz, CH2), 2.81 (t, 2H, /=12.0Hz, CH2), 2.40 (m, 1H, CH), 1.93 (d, 2H, /=11. 5Hz, CH2), 1.76 (m, 2H, CH2), 1.47 (s, 9H, CH3) ppm; ESI-MS: m/z = 381[M+H]+。
[0032] 制備實施例6、4_ (4-氯苯基氨甲酰基）哌啶-I-甲酸叔丁酯（Ih) 以4-氯苯胺為原料，合成及后處理同制備實施例1。得白色固體3. 3g，收率98%。m. p.: 187-189°C; 1HNMR (500MHz，CDCl3): 5= 7.47 (d，2H，/=9.0Hz，Ar-H), 7.42 (s， 1H, NH), 7.27 (d, 2H, /=7. 5Hz, Ar-H), 4.18 (d, 2H, /=13. 5Hz, CH2), 2.77 (t, 2H, /=12.0Hz, CH2), 2.38 (m, 1H, CH), 1.88 (d, 2H, /=ILOHz, CH2), 1.73 (m, 2H, CH2), 1.47 (s, 9H, CH3) ppm; ESI