本發(fa)明屬于化學藥物領域，涉及(ji)(ji)一種環肽(tai)類化合物及(ji)(ji)其制備方法和應用。
技術背景
魚腥(xing)草(cao)(cao)(cao)(cao)為三白(bai)草(cao)(cao)(cao)(cao)科蕺菜(cai)屬植(zhi)物蕺菜(cai)(Houttuynia cordata Thunb.)的(de)(de)(de)(de)(de)新鮮全草(cao)(cao)(cao)(cao)或干燥地上部(bu)分(fen)，早在(zai)《本(ben)草(cao)(cao)(cao)(cao)綱目(mu)》和(he)《新修本(ben)草(cao)(cao)(cao)(cao)》中(zhong)便有(you)記載(zai)。魚腥(xing)草(cao)(cao)(cao)(cao)味辛、微寒、歸肺(fei)經，具(ju)(ju)有(you)清熱(re)解毒、利尿通(tong)淋(lin)、止血、祛痰止咳、鎮痛等多種功效。現(xian)代(dai)藥理實驗(yan)研究表明魚腥(xing)草(cao)(cao)(cao)(cao)具(ju)(ju)有(you)抗(kang)菌(jun)、抗(kang)炎、抗(kang)病(bing)毒等作用，臨床上用于呼(hu)吸(xi)系統(tong)疾(ji)病(bing)、消化系統(tong)疾(ji)病(bing)、婦科疾(ji)病(bing)等的(de)(de)(de)(de)(de)治療，被(bei)(bei)譽(yu)為一(yi)種天然的(de)(de)(de)(de)(de)抗(kang)生(sheng)素。魚腥(xing)草(cao)(cao)(cao)(cao)早已被(bei)(bei)國家衛(wei)生(sheng)部(bu)正式確定為藥食同源(yuan)的(de)(de)(de)(de)(de)極具(ju)(ju)開(kai)發潛力(li)的(de)(de)(de)(de)(de)資(zi)源(yuan)之一(yi)。魚腥(xing)草(cao)(cao)(cao)(cao)的(de)(de)(de)(de)(de)揮發油類成分(fen)也已被(bei)(bei)證明為具(ju)(ju)有(you)顯著的(de)(de)(de)(de)(de)抗(kang)菌(jun)活(huo)性(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)有(you)效成分(fen)，其(qi)中(zhong)魚腥(xing)草(cao)(cao)(cao)(cao)素(癸酰乙醛)及其(qi)合成衍生(sheng)物已被(bei)(bei)開(kai)發成藥物應(ying)用于臨床，如(ru)用于治療慢(man)性(xing)(xing)支氣管炎及其(qi)他上呼(hu)吸(xi)道感染性(xing)(xing)疾(ji)病(bing)的(de)(de)(de)(de)(de)魚腥(xing)草(cao)(cao)(cao)(cao)素鈉(na)片。
環肽類化合物廣泛存在于各種生命物質中，并且是一類具有多種生物活性的物質，如具有抗菌、抗腫瘤、抗病毒、子宮收縮等活性。天然環肽主要由常見氨基酸組成，較線型多肽有更為穩定的結構，因此具有多種生理功能和醫藥價值。第一個被報道的天然環肽是從細菌中被分離得到的，命名為Gramicidin S，并且實驗證明其對G+菌有(you)很(hen)好(hao)的(de)(de)抗菌活性(xing)。隨后人們便(bian)開啟了對(dui)環(huan)(huan)肽類(lei)物(wu)(wu)(wu)(wu)質的(de)(de)深入研(yan)究(jiu)，從(cong)微生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)(wu)、植物(wu)(wu)(wu)(wu)以及海洋(yang)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)(wu)等生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)(wu)中(zhong)(zhong)陸(lu)續分(fen)離(li)(li)到(dao)很(hen)多具(ju)有(you)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)(wu)活性(xing)的(de)(de)特殊結構的(de)(de)環(huan)(huan)肽類(lei)化合(he)物(wu)(wu)(wu)(wu)。例如(ru)，從(cong)土(tu)壤絲狀真菌發酵(jiao)液中(zhong)(zhong)分(fen)離(li)(li)的(de)(de)環(huan)(huan)(亮(liang)氨酸(suan)-亮(liang)氨酸(suan))對(dui)青(qing)霉(mei)菌和黑(hei)曲霉(mei)菌有(you)較(jiao)好(hao)的(de)(de)抗真菌活性(xing)。從(cong)小紅參中(zhong)(zhong)分(fen)離(li)(li)的(de)(de)茜草(cao)科類(lei)型環(huan)(huan)肽是一類(lei)結構新穎的(de)(de)具(ju)有(you)強(qiang)抗腫瘤(liu)(liu)活性(xing)的(de)(de)雙環(huan)(huan)環(huan)(huan)六肽，其顯示出對(dui)P-388有(you)很(hen)強(qiang)的(de)(de)抗腫瘤(liu)(liu)活性(xing)。海洋(yang)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)(wu)中(zhong)(zhong)也富含環(huan)(huan)肽類(lei)物(wu)(wu)(wu)(wu)質，如(ru)從(cong)海鞘Lissoclinum patella中(zhong)(zhong)分(fen)離(li)(li)得(de)到(dao)的(de)(de)環(huan)(huan)肽也具(ju)有(you)很(hen)強(qiang)的(de)(de)抗腫瘤(liu)(liu)活性(xing)。
抗(kang)菌(jun)(jun)(jun)是指采(cai)用化學或物理方法殺滅細(xi)菌(jun)(jun)(jun)或妨礙細(xi)菌(jun)(jun)(jun)生(sheng)長繁殖及其(qi)活(huo)性(xing)的(de)過程(cheng)，包(bao)括(kuo)滅菌(jun)(jun)(jun)、殺菌(jun)(jun)(jun)、消毒、抑(yi)菌(jun)(jun)(jun)、防(fang)霉(mei)、防(fang)腐等(deng)。細(xi)菌(jun)(jun)(jun)分為(wei)革蘭氏陽性(xing)菌(jun)(jun)(jun)和(he)革蘭氏陰(yin)性(xing)菌(jun)(jun)(jun)。常(chang)(chang)見的(de)革蘭氏陽性(xing)菌(jun)(jun)(jun)包(bao)括(kuo)：葡萄球菌(jun)(jun)(jun)、鏈球菌(jun)(jun)(jun)、肺炎雙球菌(jun)(jun)(jun)、炭(tan)疽桿(gan)菌(jun)(jun)(jun)、白喉桿(gan)菌(jun)(jun)(jun)、破傷 風桿(gan)菌(jun)(jun)(jun)等(deng)，它們(men)(men)能產生(sheng)外(wai)毒素使(shi)人致病；常(chang)(chang)見的(de)革蘭氏陰(yin)性(xing)菌(jun)(jun)(jun)包(bao)括(kuo)：痢(li)疾桿(gan)菌(jun)(jun)(jun)、傷寒(han)桿(gan)菌(jun)(jun)(jun)、大腸桿(gan)菌(jun)(jun)(jun)、變形(xing)桿(gan)菌(jun)(jun)(jun)、綠膿桿(gan)菌(jun)(jun)(jun)、百日咳桿(gan)菌(jun)(jun)(jun)及霍亂弧菌(jun)(jun)(jun)等(deng)，它們(men)(men)產生(sheng)內(nei)毒素，靠內(nei)毒素使(shi)人致病。臨床上常(chang)(chang)用的(de)殺菌(jun)(jun)(jun)劑(ji)有：β-內(nei)酰(xian)胺(an)類(lei)(lei)、氨(an)基糖甙(dai)類(lei)(lei)、氟喹諾酮(tong)類(lei)(lei)、磺胺(an)類(lei)(lei)、多肽(tai)類(lei)(lei)等(deng)。如萬古霉(mei)素，為(wei)一種環肽(tai)類(lei)(lei)抗(kang)生(sheng)素，它通過抑(yi)制細(xi)菌(jun)(jun)(jun)細(xi)胞壁中磷(lin)脂和(he)多肽(tai)的(de)生(sheng)成，來抑(yi)制細(xi)菌(jun)(jun)(jun)的(de)生(sheng)長和(he)繁殖。
炎(yan)(yan)(yan)(yan)癥(zheng)是具(ju)有血管系統的活體組(zu)(zu)織對(dui)損傷因子所發生的防御反應。炎(yan)(yan)(yan)(yan)癥(zheng)表(biao)現為紅(hong)、腫、熱、痛，引(yin)起組(zu)(zu)織功能障礙。由(you)感(gan)(gan)染(ran)引(yin)起的炎(yan)(yan)(yan)(yan)癥(zheng)，稱(cheng)為感(gan)(gan)染(ran)性(xing)炎(yan)(yan)(yan)(yan)癥(zheng)，而不由(you)感(gan)(gan)染(ran)引(yin)起的炎(yan)(yan)(yan)(yan)癥(zheng)，稱(cheng)為非(fei)感(gan)(gan)染(ran)性(xing)炎(yan)(yan)(yan)(yan)癥(zheng)。炎(yan)(yan)(yan)(yan)癥(zheng)與許多疾病(bing)都相(xiang)關，例如癌癥(zheng)、動脈粥樣硬化、糖尿病(bing)、退行性(xing)疾病(bing)等。因此尋找更為有效的抗炎(yan)(yan)(yan)(yan)藥物刻不容緩。
因(yin)此臨床上迫切需要此類環肽類的(de)藥物(wu)(wu)，既具有抗炎抗菌效果，最好由具有生(sheng)物(wu)(wu)活(huo)性(xing)(xing)的(de)分(fen)子(zi)組成(cheng)，會具有更(geng)低的(de)生(sheng)物(wu)(wu)毒性(xing)(xing)和更(geng)高(gao)的(de)安全性(xing)(xing)。
技術實現要素：
為解決上述技術問題，本發明提供了一種從中藥魚腥草中分離提純的環肽類化合物，具有廣譜抗菌活性，對多種菌株均具有顯著的抗菌效果，具體為，一種環肽類化合物，全部由亮氨酸組成，通式為環-leu-[leu]n-，其特征在于，所述環(huan)肽(tai)類化合物(wu)中亮氨酸以肽(tai)鍵相(xiang)互連接(jie)成環(huan)，n為1到(dao)7的整(zheng)數，依次構(gou)成環(huan)二肽(tai)到(dao)環(huan)八肽(tai)。結構(gou)式分(fen)別為：
其(qi)中進一步優選(xuan)，n＝2，則該環肽類化合物(wu)為(wei)亮氨酸環三肽。
本發(fa)明進一步提(ti)供了一種(zhong)藥(yao)物(wu)組合(he)物(wu)，所述藥(yao)物(wu)組合(he)物(wu)包括環(huan)二(er)肽(tai)到(dao)環(huan)八肽(tai)共(gong)7種(zhong)化合(he)物(wu)或其藥(yao)學上可接受(shou)的衍生物(wu)及鹽類，該環(huan)二(er)肽(tai)到(dao)環(huan)八肽(tai)依次按重(zhong)量比為2-5：28-32：14-18：1-3：30-35：1：2-5。
本發明所述的(de)該系列環肽(tai)化合物(wu)的(de)組合物(wu)或其藥理學上容許的(de)鹽(yan)，可(ke)以列舉為無機酸(suan)(suan)(suan)：鹽(yan)酸(suan)(suan)(suan)、硫酸(suan)(suan)(suan)、磷酸(suan)(suan)(suan)、硝(xiao)酸(suan)(suan)(suan)、氫溴酸(suan)(suan)(suan)；有(you)機酸(suan)(suan)(suan)：馬來酸(suan)(suan)(suan)、酒石(shi)酸(suan)(suan)(suan)、乳酸(suan)(suan)(suan)、檸(ning)檬酸(suan)(suan)(suan)、乙酸(suan)(suan)(suan)、己二(er)酸(suan)(suan)(suan)、對(dui)-苯甲(jia)磺酸(suan)(suan)(suan)、棕(zong)櫚酸(suan)(suan)(suan)、單(dan)寧酸(suan)(suan)(suan)；金(jin)屬離子：鈉、鉀、鋰、鈣、鎂等成的(de)鹽(yan)。
本發明(ming)在采用萃取(qu)、硅膠(jiao)柱色(se)譜(pu)、正相(xiang)(xiang)高(gao)效液(ye)相(xiang)(xiang)色(se)譜(pu)、反相(xiang)(xiang)高(gao)效液(ye)相(xiang)(xiang)色(se)譜(pu)等多種分離手段(duan)得(de)到該(gai)系列(lie)環(huan)肽(tai)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)基(ji)礎上，又對該(gai)系列(lie)環(huan)肽(tai)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)組合(he)(he)(he)物(wu)(wu)進行了1)抗菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)活(huo)性(xing)研究(jiu)，包括：枯草芽(ya)孢桿(gan)菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)、金黃色(se)葡萄球(qiu)(qiu)菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)、表皮(pi)葡萄球(qiu)(qiu)菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)、糞腸(chang)球(qiu)(qiu)菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)、肺(fei)炎鏈(lian)(lian)球(qiu)(qiu)菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)、甲(jia)型溶血性(xing)鏈(lian)(lian)球(qiu)(qiu)菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)、弗氏志賀(he)菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)、大腸(chang)桿(gan)菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)、肺(fei)炎克雷伯(bo)氏桿(gan)菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)、銅綠(lv)假單(dan)胞菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)、普通(tong)變(bian)形桿(gan) 菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)、傷寒沙門(men)桿(gan)菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)，結果顯示該(gai)系列(lie)環(huan)肽(tai)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)組合(he)(he)(he)物(wu)(wu)有(you)良好的(de)(de)(de)(de)(de)(de)廣譜(pu)抗菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)活(huo)性(xing)，可(ke)作為潛(qian)在的(de)(de)(de)(de)(de)(de)抗菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)藥(yao)物(wu)(wu)。2)抗炎活(huo)性(xing)研究(jiu)，結果顯示該(gai)系列(lie)環(huan)肽(tai)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)組合(he)(he)(he)物(wu)(wu)有(you)顯著的(de)(de)(de)(de)(de)(de)抗炎活(huo)性(xing)，可(ke)作為潛(qian)在的(de)(de)(de)(de)(de)(de)抗炎藥(yao)物(wu)(wu)。另外，通(tong)過研究(jiu)發現環(huan)肽(tai)類化合(he)(he)(he)物(wu)(wu)或其(qi)藥(yao)學(xue)上可(ke)接受的(de)(de)(de)(de)(de)(de)鹽(yan)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)特定比例的(de)(de)(de)(de)(de)(de)組合(he)(he)(he)，即A～G的(de)(de)(de)(de)(de)(de)比例為：A:B:C:D:E:F:G＝2～5:28～32:14～18:1～3:30～35:1:2～5時具(ju)有(you)預料不到的(de)(de)(de)(de)(de)(de)技術效果，相(xiang)(xiang)對單(dan)體化合(he)(he)(he)物(wu)(wu)而言上述(shu)化合(he)(he)(he)物(wu)(wu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)組合(he)(he)(he)之間具(ju)有(you)協(xie)同作用，顯示優良的(de)(de)(de)(de)(de)(de)抗菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)活(huo)性(xing)和抗炎活(huo)性(xing)。
所述重量比進一(yi)步優選(xuan)，即A～G的比例為：A:B:C:D:E:F:G＝3：30：16：1：35：1：4。
本發明進一步提供了(le)一種藥物(wu)(wu)組合(he)物(wu)(wu)，所(suo)述(shu)藥物(wu)(wu)組合(he)物(wu)(wu)為藥物(wu)(wu)制(zhi)劑，由環肽類(lei)化合(he)物(wu)(wu)及其藥學上可(ke)接受的衍生物(wu)(wu)和(he)鹽類(lei)作為活性成分和(he)藥學上可(ke)接受的賦形(xing)劑組成。
其中固體制(zhi)劑(ji)(ji)包括：片(pian)劑(ji)(ji)、膠(jiao)囊劑(ji)(ji)、丸劑(ji)(ji)、顆粒劑(ji)(ji)等(deng)；液體制(zhi)劑(ji)(ji)包括：注(zhu)射(she)劑(ji)(ji)等(deng)；眼用制(zhi)劑(ji)(ji)包括：滴眼劑(ji)(ji)、眼用凝膠(jiao)劑(ji)(ji)等(deng)。
本發明還提(ti)供了(le)環肽類化合(he)物的提(ti)取方法，由以下步(bu)驟組成(cheng)：
1)取(qu)魚腥草(cao)全(quan)草(cao)粉碎，用水(shui)蒸(zheng)汽蒸(zheng)餾(liu)法得(de)(de)揮發油(you)粗(cu)品，晾干，再用乙醚溶(rong)(rong)解，加硫酸溶(rong)(rong)液(ye)萃取(qu)多次，合并上層有機相，得(de)(de)到混合溶(rong)(rong)液(ye)；
2)向混(hun)合溶(rong)液中加氫氧化鈉溶(rong)液萃取多次(ci)，合并下層水相(xiang)(xiang)，再加硫酸溶(rong)液和乙(yi)醚萃取多次(ci)，合并上層有機相(xiang)(xiang)，減壓蒸(zheng)去溶(rong)劑(ji)即得魚腥草揮發油；
3)將魚(yu)腥草(cao)揮發油進(jin)行(xing)快速減壓柱色譜或常壓柱色譜分(fen)(fen)離，石油醚-乙酸(suan)乙酯混合溶(rong)劑(ji)梯度洗(xi)脫，每固(gu)定體積為一餾(liu)分(fen)(fen)，收集(ji)多個餾(liu)分(fen)(fen)，經硅膠薄(bo)層層析檢識，合并餾(liu)分(fen)(fen)；餾(liu)分(fen)(fen)經正(zheng)相制備高(gao)效(xiao)液(ye)相色譜梯度洗(xi)脫分(fen)(fen)離得(de)到多個餾(liu)分(fen)(fen)，所(suo)述梯度洗(xi)脫餾(liu)分(fen)(fen)經反相制備高(gao)效(xiao)液(ye)相色譜梯度洗(xi)脫分(fen)(fen)離，蒸發回收溶(rong)劑(ji)，得(de)到所(suo)述環肽類化合物。
本(ben)發明進一(yi)(yi)步提(ti)供一(yi)(yi)種提(ti)取方法，由以下步驟(zou)組成(cheng)：
1)取魚腥草全草6000g，用(yong)水蒸汽蒸餾法加熱2～5小(xiao)時(shi)，得揮發油粗(cu)品，再用(yong)20～50倍乙(yi)醚溶解，置分液漏斗中加濃度8％～15％硫酸20～30ml萃取1～5次，取上層有(you)機相(xiang)，得到混合溶液；
2)向混合溶(rong)液中加(jia)質量體積分數(shu)1％～3％氫氧化鈉溶(rong)液20～30ml萃取(qu)1～5次，取(qu)下層水相，再加(jia)濃(nong)度8％～15％硫(liu)酸20～30ml與相較揮發油(you)粗品20～50倍的乙(yi)醚萃取(qu)1～5次，取(qu)上(shang)層有機(ji)相，減壓蒸干溶(rong)劑即得揮發油(you)樣品100～300g；
3)揮發(fa)油樣品進(jin)行(xing)快(kuai)速減壓(ya)柱(zhu)(zhu)色(se)譜(pu)或常壓(ya)柱(zhu)(zhu)色(se)譜(pu)分(fen)(fen)(fen)離(li)，所述石油醚的(de)沸(fei)程為(wei)30～ 60℃，或60～90℃，所述石油醚-乙(yi)酸乙(yi)酯混(hun)合(he)溶劑(ji)分(fen)(fen)(fen)別為(wei)體(ti)(ti)(ti)積(ji)比(bi)100:1、50:1、30:1、20:1、0:1五種流(liu)動(dong)相(xiang)(xiang),分(fen)(fen)(fen)別逐(zhu)次進(jin)行(xing)洗(xi)脫，柱(zhu)(zhu)子(zi)填(tian)料為(wei)200-300目柱(zhu)(zhu)層(ceng)析凝(ning)膠，每300～500ml體(ti)(ti)(ti)積(ji)為(wei)一餾(liu)分(fen)(fen)(fen)，共收集到40～60個(ge)餾(liu)分(fen)(fen)(fen)，經硅(gui)膠薄層(ceng)層(ceng)析檢識，合(he)并得(de)到5個(ge)餾(liu)分(fen)(fen)(fen)；5個(ge)餾(liu)分(fen)(fen)(fen)分(fen)(fen)(fen)別進(jin)行(xing)生(sheng)物活(huo)性測試，選(xuan)用活(huo)性最高的(de)餾(liu)分(fen)(fen)(fen)經正(zheng)(zheng)相(xiang)(xiang)制備(bei)高效液相(xiang)(xiang)色(se)譜(pu)正(zheng)(zheng)己(ji)烷-異丙醇等度洗(xi)脫，正(zheng)(zheng)己(ji)烷-異丙醇體(ti)(ti)(ti)積(ji)比(bi)為(wei)0.35％:1，流(liu)速1-3ml/min分(fen)(fen)(fen)離(li)，色(se)譜(pu)柱(zhu)(zhu)為(wei)安捷倫ZORBAX,9.4×250mm,5μm；得(de)到8個(ge)餾(liu)分(fen)(fen)(fen)，8個(ge)餾(liu)分(fen)(fen)(fen)分(fen)(fen)(fen)別進(jin)行(xing)生(sheng)物活(huo)性測試，選(xuan)用活(huo)性最高的(de)餾(liu)分(fen)(fen)(fen)經反相(xiang)(xiang)制備(bei)高效液相(xiang)(xiang)色(se)譜(pu)進(jin)行(xing)梯(ti)度洗(xi)脫，所述反相(xiang)(xiang)制備(bei)高效液相(xiang)(xiang)色(se)譜(pu)的(de)流(liu)動(dong)相(xiang)(xiang)為(wei)乙(yi)腈(jing)和水，洗(xi)脫流(liu)程為(wei)：0min，乙(yi)腈(jing)：水的(de)體(ti)(ti)(ti)積(ji)比(bi)20％：80％到30min，乙(yi)腈(jing)：水為(wei)100％：0，流(liu)速0.5-1.5ml/min,柱(zhu)(zhu)子(zi)為(wei)Thermo C18 ODS柱(zhu)(zhu),，旋轉蒸發(fa)去除溶劑(ji)，得(de)到環肽類(lei)化合(he)物A～G。。
本發明(ming)還提(ti)供(gong)一種提(ti)純方法，所述正己烷(wan)-異(yi)丙醇的流速(su)優選(xuan)2ml/min,
本發明還提供(gong)一種提純方法(fa)，所述(shu)反(fan)相制備高(gao)效(xiao)液相色(se)譜(pu)的流速優(you)選1ml/min。
所(suo)述(shu)活性測試(shi)為抗(kang)菌(jun)活性測試(shi)，為實施例26抗(kang)菌(jun)試(shi)驗的(de)精簡版(ban)，目的(de)為快(kuai)速篩選活性最高的(de)餾分。
本(ben)發明的現有技術為如專利CN102816212中提(ti)(ti)供了一種茜(qian)草(cao)科類(lei)型環(huan)(huan)肽及(ji)其(qi)藥物(wu)組(zu)合物(wu)和應用，取茜(qian)草(cao)屬(shu)植物(wu)的根莖(jing)，經干燥、粉(fen)碎后，進行環(huan)(huan)肽提(ti)(ti)取，經過我(wo)們(men)的驗(yan)證，現有方法(fa)(fa)并不能用于(yu)(yu)提(ti)(ti)取本(ben)環(huan)(huan)肽化(hua)合物(wu)，并且本(ben)環(huan)(huan)肽化(hua)合物(wu)首次(ci)使用正相(xiang)高(gao)效液(ye)相(xiang)色(se)(se)譜法(fa)(fa)，進過上(shang)述步驟的梯度(du)洗脫，才可以直(zhi)觀的看到色(se)(se)譜峰(feng)的分布情況，較硅膠柱色(se)(se)譜峰(feng)、制備薄(bo)層色(se)(se)譜峰(feng)分離效果(guo)，避(bi)免各組(zu)分分叉嚴重的問題(ti)，因(yin)此本(ben)方法(fa)(fa)既是(shi)首次(ci)提(ti)(ti)取該類(lei)新(xin)化(hua)合物(wu)的方法(fa)(fa)，也屬(shu)于(yu)(yu)一種直(zhi)觀高(gao)效提(ti)(ti)出該類(lei)化(hua)合物(wu)的新(xin)方法(fa)(fa)，具有突出的特點(dian)和實質(zhi)的進步。
本發明還提(ti)供一(yi)種合成(cheng)方法，由以(yi)下步驟組成(cheng)：
a)L-亮氨(an)酸和Boc-亮氨(an)酸為初(chu)始(shi)原(yuan)料合成保護(hu)型二肽(tai)；
b)在步驟a)保(bao)護型二肽基礎上(shang)，再(zai)與一分子(zi)Boc-亮氨酸合成保(bao)護型三(san)肽；
c)在步(bu)驟a)保(bao)(bao)護(hu)(hu)型(xing)二肽基(ji)(ji)礎上，由一分子脫Boc-保(bao)(bao)護(hu)(hu)基(ji)(ji)的(de)二肽和一分子脫酯基(ji)(ji)的(de)二肽，合成保(bao)(bao)護(hu)(hu)型(xing)四肽；依(yi)次合成保(bao)(bao)護(hu)(hu)型(xing)五肽到八肽；
d)所述步驟a所述保護型二肽(tai)脫去Boc-保護基，在甲醇中回流(liu)，環(huan)合成環(huan)二肽(tai)；
e)將(jiang)步驟(zou)b)，c)所(suo)述的保護(hu)下三肽(tai)到八肽(tai)分別(bie)進行進一步脫去Boc保護(hu)基和甲酯保護(hu)基，在縮合(he)劑的作用下，依次合(he)成環(huan)(huan)三肽(tai)到環(huan)(huan)八肽(tai)。
本發明(ming)進一步提供了一種合成(cheng)(cheng)方法，由以下步驟(zou)組成(cheng)(cheng)：
a)L-亮(liang)氨(an)酸(suan)(suan)與甲(jia)醇和氯化亞砜在(zai)低溫的下反(fan)應(ying)成(cheng)亮(liang)氨(an)酸(suan)(suan)甲(jia)酯鹽(yan)(yan)酸(suan)(suan)鹽(yan)(yan)，亮(liang)氨(an)酸(suan)(suan)甲(jia)酯鹽(yan)(yan)酸(suan)(suan)鹽(yan)(yan)與BOC-亮(liang)氨(an)酸(suan)(suan)以DIEA為縛酸(suan)(suan)劑(ji)，DCC與HOBT為混合縮合劑(ji)，二氯甲(jia)烷為溶劑(ji)縮合成(cheng)保護型二肽；
b)保護(hu)(hu)型二肽在(zai)三氟(fu)乙酸(suan)(suan)：二氯甲(jia)烷，體積(ji)比1:4的(de)(de)作用下脫(tuo)掉BOC-保護(hu)(hu)基，生成二肽的(de)(de)三氟(fu)乙酸(suan)(suan)鹽；在(zai)低溫的(de)(de)條件下，以DIEA為(wei)(wei)(wei)縛(fu)酸(suan)(suan)劑(ji)，DCC與HOBT為(wei)(wei)(wei)混合縮合劑(ji)，二氯甲(jia)烷為(wei)(wei)(wei)溶劑(ji)與Boc-亮氨(an)酸(suan)(suan)縮合成保護(hu)(hu)型的(de)(de)三肽；
c)上步的(de)保(bao)(bao)護型(xing)三(san)肽(tai)再在三(san)氟乙酸：二(er)(er)氯甲烷(wan)(wan)，體積比(bi)1:4的(de)作用下脫(tuo)掉(diao)Boc-保(bao)(bao)護基；脫(tuo)去BOC-保(bao)(bao)護基的(de)三(san)肽(tai)甲酯(zhi)在氫(qing)氧化鈉和水，體積比(bi)1:1的(de)作用下脫(tuo)去甲酯(zhi)保(bao)(bao)護，生(sheng)成三(san)肽(tai)，三(san)肽(tai)再在HATU與PyBOP縮合劑(ji)的(de)存在下，以(yi)DIEA為縛酸劑(ji)，以(yi)四氫(qing)呋喃和二(er)(er)氯甲烷(wan)(wan)為溶劑(ji)，縮合成環三(san)肽(tai)。
以下為各個(ge)化合(he)物(wu)具體合(he)成路(lu)線：
(1)本發明進(jin)一步提供一種(zhong)合成(cheng)(cheng)方法，由以下步驟(zou)組成(cheng)(cheng)：以L-亮(liang)氨酸(suan)、Boc-亮(liang)氨酸(suan)為初始(shi)原料合成(cheng)(cheng)保護型(xing)二肽：
(2)在保護型二(er)肽(tai)(tai)基礎上，再(zai)與(yu)一分(fen)子Boc-亮氨(an)酸合成保護型三肽(tai)(tai)：
(3)在保護(hu)型二肽(tai)基(ji)礎上(shang)，由一分子脫Boc-保護(hu)基(ji)的二肽(tai)和一分子脫酯基(ji)的二肽(tai)，合成保護(hu)型四肽(tai)：
(4)在(zai)保(bao)護(hu)(hu)型二肽、三肽的基礎上，由(you)一(yi)分(fen)子脫Boc-保(bao)護(hu)(hu)基的三肽和一(yi)分(fen)子脫酯基的二肽，合成(cheng)保(bao)護(hu)(hu)型五肽：
(5)在保(bao)護(hu)型(xing)三肽(tai)的基(ji)礎上，由(you)一分子脫(tuo)Boc-保(bao)護(hu)基(ji)的三肽(tai)和一分子脫(tuo)酯基(ji)的三肽(tai)， 合成(cheng)保(bao)護(hu)型(xing)六肽(tai)：
(6)在保護型五肽(tai)的(de)基礎上，由(you)一(yi)分(fen)子脫Boc-保護基的(de)五肽(tai)和一(yi)分(fen)子脫酯基的(de)二肽(tai)，合成保護型七肽(tai)：
(7)在保(bao)護(hu)型六肽(tai)(tai)的基(ji)礎上，由一(yi)分(fen)子(zi)脫(tuo)Boc-保(bao)護(hu)基(ji)的六肽(tai)(tai)和一(yi)分(fen)子(zi)脫(tuo)酯(zhi)基(ji)的二(er)肽(tai)(tai)，合成保(bao)護(hu)型八(ba)肽(tai)(tai)：
(7)保護型(xing)二(er)肽脫去Boc-保護基，在甲醇中回流，環合成環二(er)肽(A)：
(8)在脫去(qu)Boc-保(bao)護基(ji)的(de)(de)三肽(tai)的(de)(de)基(ji)礎上進一步(bu)脫去(qu)甲酯(zhi)保(bao)護基(ji)，在縮合(he)劑(ji)的(de)(de)作用(yong)下，環合(he)成環三肽(tai)(B)：
(9)在脫去(qu)Boc-保護基(ji)的(de)四肽(tai)的(de)基(ji)礎上(shang)進(jin)一步(bu)脫去(qu)甲酯保護基(ji)，在縮合劑的(de)作用下，環(huan)合成(cheng)環(huan)四肽(tai)(C)：
(10)在(zai)脫去(qu)Boc-保(bao)護基(ji)(ji)的(de)(de)(de)五肽(tai)(tai)的(de)(de)(de)基(ji)(ji)礎上進一(yi)步脫去(qu)甲酯保(bao)護基(ji)(ji)，在(zai)縮合(he)劑的(de)(de)(de)作用下(xia)，環(huan)合(he)成環(huan)五肽(tai)(tai)(D)：
(11)在脫去(qu)Boc-保護基的六(liu)肽的基礎(chu)上進一步脫去(qu)甲(jia)酯保護基，在縮合(he)劑的作用下(xia)，環合(he)成(cheng)環六(liu)肽(E)：
(12)保護型七肽脫(tuo)去兩端的保護基，在縮(suo)合劑的作(zuo)用下，環合成(cheng)環七肽(F)：
(13)保護(hu)(hu)型八肽脫去(qu)兩(liang)端的(de)保護(hu)(hu)基，在縮合劑(ji)的(de)作用(yong)下(xia)，環合成環八肽(G)：
以(yi)上合成路線(xian)所涉及縮寫分別(bie)代表：
BOC叔丁氧羰基
TFA三氟乙酸
BOP-Cl雙(2-氧代-3-惡唑烷(wan)基)次磷酰氯(lv)
PyBOP六氟磷酸(suan)苯(ben)并三唑-1-基-氧基三吡(bi)咯烷基磷
HATU 2-(7-氧化苯并三(san)氮唑)-N,N,N',N'-四(si)甲基脲六氟磷酸酯
DIEA N,N-二異丙基乙胺(an)
DMF四氫呋喃
目前(qian)也有環(huan)肽(tai)類化(hua)合(he)物的(de)報道，但均不(bu)適用(yong)與(yu)本環(huan)肽(tai)類化(hua)合(he)物的(de)合(he)成，或者合(he)成產(chan)物不(bu)理想，由于亮氨酸的(de)側鏈基團(tuan)較(jiao)大(da)的(de)環(huan)合(he)時空間位阻也較(jiao)大(da)，因此其中本方法(fa)創新性(xing)使(shi)用(yong)了PyBOP和(he)(he)HATU，這兩種(zhong)縮合(he)劑的(de)使(shi)用(yong)，可(ke)以(yi)高(gao)效地合(he)成亮氨酸環(huan)肽(tai)，并提高(gao)化(hua)合(he)物的(de)純度(du)和(he)(he)產(chan)量，具有很好(hao)的(de)創新性(xing)和(he)(he)實用(yong)性(xing)。
本(ben)發明(ming)進一步提供了所(suo)述的環(huan)肽類化合物(wu)在制(zhi)備(bei)治療(liao)炎癥或(huo)細菌性(xing)疾病的藥物(wu)中(zhong)的應用。
本發明的優點為：
1)首次從魚腥(xing)草的揮發油類成分(fen)中提取到(dao)一系列新型環肽類化合(he)物。
2)首次提供了該類化(hua)合(he)物的(de)提取(qu)方法，采用正相(xiang)制備高(gao)效液(ye)相(xiang)色譜法來對揮發油等小極性(xing)物質進行分離，該方法快速、高(gao)效，可得到微量環肽(tai)，避免了一些不穩定(ding)的(de)物質的(de)分解。
3)提(ti)供了(le)(le)該類化(hua)合物(wu)(wu)的制備方法，制備方法簡單(dan)易行(xing)，可快(kuai)速得到該類環肽類化(hua)合物(wu)(wu)，并為相似(si)結構化(hua)合物(wu)(wu)的合成提(ti)供了(le)(le)合成路線，也解(jie)決(jue)了(le)(le)極(ji)性(xing)物(wu)(wu)質(zhi)因極(ji)性(xing)小且極(ji)性(xing)相似(si)而造(zao)成的分離難、分離效果差的問題。
4)提供了該類化合(he)物在(zai)制(zhi)劑上的應(ying)用(yong)，包含多種制(zhi)劑的制(zhi)備。
5)提(ti)供了該類化合物在制備(bei)抗(kang)(kang)炎和抗(kang)(kang)菌(jun)(jun)藥物中的應用，該藥物具(ju)有(you)光譜抗(kang)(kang)菌(jun)(jun)活性，具(ju)有(you)廣闊的市場應用前景和實用性。
具體實施方式
以下實施(shi)例(li)是對本(ben)發(fa)明(ming)的(de)進一(yi)步說明(ming)，不(bu)是對本(ben)發(fa)明(ming)的(de)限(xian)制。
實施例1：該系列環肽的提取分離及結(jie)構(gou)鑒(jian)定
取(qu)魚腥草全草6000g，用水蒸汽蒸餾法加(jia)熱3小時(shi)，得揮(hui)發(fa)油(you)粗(cu)(cu)品，再(zai)用30倍(bei)乙醚溶解，置(zhi)分(fen)液(ye)漏(lou)斗中加(jia)濃度10％10％硫酸(suan)溶液(ye)25ml萃取(qu)一(yi)次(ci)，取(qu)上層有(you)機相，加(jia)質量體積比2％2％氫氧化鈉溶液(ye)25ml萃取(qu)一(yi)次(ci)，取(qu)下層水相，再(zai)加(jia)濃度10％10％硫酸(suan)溶液(ye)25ml和相當(dang)于(yu)揮(hui)發(fa)油(you)粗(cu)(cu)品的30倍(bei)乙醚萃取(qu)，取(qu)上層有(you)機相，減(jian)壓旋干溶劑即得揮(hui)發(fa)油(you)樣品220g。
將揮發油(you)樣品(pin)進(jin)行快速(su)減壓柱(zhu)(zhu)色譜(pu)或常壓柱(zhu)(zhu)色譜(pu)分(fen)(fen)(fen)離(li)，石油(you)醚(mi)(沸程60-90℃)-乙(yi)酸乙(yi)酯(100:1、50:1、30:1、20:1、0:1,V/V)混合溶劑(ji)梯度洗脫，硅膠(jiao)(200-300目)柱(zhu)(zhu)色譜(pu)，每(mei)400ml體(ti)積(ji)為(wei)一餾(liu)(liu)(liu)(liu)分(fen)(fen)(fen)，即(ji)100:1(4000ml)、50:1(4000ml)、30:1(5200ml)、20:1(5200ml)、0:1(800ml),V/V，共(gong)收(shou)集到(dao)48個(ge)餾(liu)(liu)(liu)(liu)分(fen)(fen)(fen)，經(jing)硅膠(jiao)薄層層析檢識，合并(bing)得到(dao)5個(ge)餾(liu)(liu)(liu)(liu)分(fen)(fen)(fen)；5個(ge)餾(liu)(liu)(liu)(liu)分(fen)(fen)(fen)分(fen)(fen)(fen)別進(jin)行生物(wu)活(huo)(huo)性測試(shi)，選(xuan)用活(huo)(huo)性最高(gao)(gao)的(de)(de)餾(liu)(liu)(liu)(liu)分(fen)(fen)(fen)經(jing)正(zheng)相(xiang)制(zhi)(zhi)(zhi)備(bei)高(gao)(gao)效(xiao)液相(xiang)色譜(pu)正(zheng)己烷(wan)-異(yi)丙(bing)醇等度洗脫，正(zheng)己烷(wan)-異(yi)丙(bing)醇體(ti)積(ji)比為(wei)0.35％:1，流(liu)(liu)速(su)2ml/min分(fen)(fen)(fen)離(li)，色譜(pu)柱(zhu)(zhu)為(wei)安捷(jie)倫ZORBAX,9.4×250mm,5μm；得到(dao)8個(ge)餾(liu)(liu)(liu)(liu)分(fen)(fen)(fen)，8個(ge)餾(liu)(liu)(liu)(liu)分(fen)(fen)(fen)分(fen)(fen)(fen)別進(jin)行生物(wu)活(huo)(huo)性測試(shi)，選(xuan)用活(huo)(huo)性最高(gao)(gao)的(de)(de)餾(liu)(liu)(liu)(liu)分(fen)(fen)(fen)經(jing)反(fan)相(xiang)制(zhi)(zhi)(zhi)備(bei)高(gao)(gao)效(xiao)液相(xiang)色譜(pu)進(jin)行梯度洗脫，所述(shu)反(fan)相(xiang)制(zhi)(zhi)(zhi)備(bei)高(gao)(gao)效(xiao)液相(xiang)色譜(pu)的(de)(de)流(liu)(liu)動相(xiang)為(wei)乙(yi)腈(jing)(jing)和水，洗脫流(liu)(liu)程為(wei)：0min，乙(yi)腈(jing)(jing)：水的(de)(de)體(ti)積(ji)比20％：80％到(dao)30min，乙(yi)腈(jing)(jing)：水100％：0，流(liu)(liu)速(su)1ml/min,柱(zhu)(zhu)子為(wei)Thermo C18 ODS柱(zhu)(zhu),，旋轉(zhuan)蒸發去除(chu)溶劑(ji)，得到(dao)一系列環肽類化合物(wu)A(3.3mg),B(30.7mg),C(16.2mg),D(1.3mg),E(31.5mg),F(1.1mg),G(4.9mg)。
環肽(tai)類化(hua)合物A～F的結構解析如下(xia)：
cyclo(leu-leu)(A)：白色固體，MS:m/z 227.1738[M+H]+,m/z 249.1537[M+Na]+,calcd for C12H23N2O2m/z 227.1754；MS2:m/z 209(M+H-H2O)；1H-NMR(400MHz,DMSO)δppm:8.24(2H,S,-NH-×2),3.99(2H,m,N-CH×2),1.54(4H,m,CH2×2),1.81(2H,m,CH×2),0.88～0.90(12H,over,CH3×4)；13C-NMR(300MHz,DMSO)δppm:173.9(C＝O×2),52.9(N-CH×2),43.4(CH2×2),23.7(CH×2),22.8(CH3×4)。
cyclo(leu-leu-leu)(B)：白色固體，MS:m/z 340.2566[M+H]+,m/z 362.2357[M+Na]+, calcd for C18H34N3O3m/z 340.2568；MS2:m/z 322(M+H-H2O),227(b2LL)；1H-NMR(400MHz,DMSO)δppm:8.11～7.67(3H,over,-NH-×3),3.72～3.99(3H,m,N-CH×3),1.49～1.51(6H,over,CH2×3),1.76(3H,over,CH×3),0.88～0.90(18H,over,CH3×6)；13C-NMR(300MHz,DMSO)δppm:170.3(C＝O×3),56.4(N-CH),56.3(N-CH×2),42.8(CH2×2),42.7(CH2),24.1(CH×3),21.9(CH3×4),22.0(CH3×2)。
cyclo(leu-leu-leu-leu)(C)：白色固體，MS:m/z 453.3423[M+H]+,m/z 475.3208[M+Na]+,calcd for C24H45N4O4m/z 453.3435；MS2:m/z 435(b4LL-H2O),340(b3LL),322(b3LL-H2O)； 1H-NMR(400MHz,DMSO)δppm:8.47～7.52(4H,over,-NH-×4),4.15～3.88(4H,m,N-CH×4),1.45～1.49(8H,over,CH2×4),1.75～1.73(4H,over,CH×4),0.86～0.87(24H,over,CH3×8)；13C-NMR(300MHz,DMSO)δppm:172.4(C＝O×4),55.5(N-CH×4),41.0(CH2×4),23.8(CH×2),23.6(CH×2),22.6～22.3(CH3×8)。
cyclo(leu-leu-leu-leu-leu)(D)：白色固體，MS:m/z 566.4242[M+H]+,m/z 588.4062[M+Na]+,calcd for C30H56N5O5m/z 566.4276；MS2:m/z 548(M+H-H2O),453(b4LL),435(b4LL-H2O),322(b3LL-H2O),227(b2LL)；1H-NMR(400MHz,DMSO)δppm:8.41～7.44(5H,over,-NH-×5),4.25～4.17(5H,m,N-CH×5),1.50～1.48(10H,over,CH2×5),1.77～1.73(5H,m,CH×5),0.90～0.92(30H,over,CH3×10)；13C-NMR(300MHz,DMSO)δppm:171.6～173.5(C＝O×5),56.3(N-CH×4),56.0(N-CH),41.2～41.0(CH2×5),24.3(CH×5),22.4(CH3×4),22.3(CH3×2),22.2(CH3×4)。
cyclo(leu-leu-leu-leu-leu-leu)(E)：白色固體，MS:m/z 679.5077[M+H]+,m/z 701.4913[M+Na]+,calcd for C36H67N6O6m/z 679.5117；MS2:m/z 661(M+H-H2O),548(b5LL-H2O),435(b4LL),340(b3LL),322(b3LL-H2O)；1H-NMR(400MHz,DMSO)δppm:8.22～7.49(6H,over,-NH-×6),4.30～4.27(6H,m,N-CH×6),1.50～1.47(12H,over,CH2×6),1.77～1.74(6H,over,CH×6),0.87～0.90(36H,over,CH3×12)；13C-NMR(300MHz,DMSO)δppm:172.9～172.4(C＝O×6),56.3(N-CH),56.1(N-CH×3),56.0(N-CH×2),41.4(CH2×6),24.4(CH×2),24.0(CH×4),22.5(CH3×4),22.6(CH3×8)。
cyclo(leu-leu-leu-leu-leu-leu-leu)(F)：白色固體，MS:m/z 792.5931[M+H]+,m/z814.5742[M+Na]+,calcd for C42H78N7O7m/z 792.5957,MS2:m/z 774(M+H-H2O),661(b6LL-H2O),548(b5LL-H2O),453(b4LL),340(b3LL),322(b3LL-H2O)；1H-NMR(400MHz,DMSO)δppm:7.99～7.66(7H,over,-NH-×7),4.44～4.40(7H,m,N-CH×7),1.58～1.55 (14H,over,CH2×7),1.81～1.79(7H,over,CH×7),0.90～0.92(42H,over,CH3×14)； 13C-NMR(300MHz,DMSO)δppm:174.3～174.0(C＝O×7)，56.9(N-CH×2),56.8(N-CH×4),55.9(N-CH),41.2(CH2×5),41.2(CH2×2),5.2(CH×7),22.6～22.1(CH3×14)。
cyclo(leu-leu-leu-leu-leu-leu-leu-leu)(G)：白色固體，MS:m/z 452.3314[M+2H]+,calcd for C48H88N8O8m/z 904.6714,MS2:m/z 792(b7LL),774(b7LL-H2O),679(b6LL),661(b6LL-H2O),566(b5LL),548(b5LL-H2O),453(b4LL),435(b4LL-H2O),340(b3LL),322(b3LL-H2O),227(b2LL),209(b2LL-H2O)；1H-NMR(400MHz,DMSO)δppm:7.95～7.50(8H,over,-NH-×8),4.19～4.17(7H,over,N-CH×8),1.49～1.51(14H,over,CH2×8),1.74～1.70(7H,over,CH×8),0.89～0.91(48H,over,CH3×16)；13C-NMR(300MHz,DMSO)δppm:173.9～173.7(C＝O×8),56.3(N-CH×8),41.6(CH2×4),41.3(CH2×4),25.4(CH×3),24.7(CH×2),24.6(CH×2),24.2(CH),22.5～22.2(CH3×16)。
實施例(li)2：該系列環(huan)肽的提取分離
取魚(yu)腥草(cao)全草(cao)6000g，用水(shui)蒸汽蒸餾法(fa)加(jia)熱4小時，得(de)揮(hui)發(fa)油(you)(you)(you)粗品，再(zai)用20倍(bei)乙(yi)醚溶(rong)解，置分液漏斗中加(jia)濃度8％硫酸溶(rong)液20ml萃取3次，取上層有機(ji)相，加(jia)質量體積(ji)分數(shu)2％氫氧化(hua)鈉溶(rong)液30ml萃取3次，取下層水(shui)相，再(zai)加(jia)濃度8％硫酸溶(rong)液30ml和相當于揮(hui)發(fa)油(you)(you)(you)粗品的20倍(bei)乙(yi)醚萃取3次，合(he)并上層有機(ji)相，減壓旋干溶(rong)劑即(ji)得(de)揮(hui)發(fa)油(you)(you)(you)樣(yang)品282g。
將揮(hui)發油樣品進行快速減壓柱色(se)譜(pu)或常(chang)壓柱色(se)譜(pu)分(fen)離，石油醚(沸程60-90℃)-乙酸乙酯(100:1、50:1、25:1、20:1、0:1,V/V)混合(he)溶劑梯度洗脫，每300ml體(ti)積為(wei)一餾分(fen)，即100:1(3300ml)、50:1(3300ml)、30:1(4500ml)、20:1(4200ml)、0:1(600ml),V/V，硅膠(200-300目)柱色(se)譜(pu)
共收集到(dao)53個(ge)餾(liu)分(fen)，經(jing)硅(gui)膠薄(bo)層層析檢識，合并得(de)到(dao)5個(ge)餾(liu)分(fen)；5個(ge)餾(liu)分(fen)分(fen)別(bie)進行(xing)生(sheng)物活(huo)性(xing)(xing)測試(shi)，選(xuan)用活(huo)性(xing)(xing)最高(gao)(gao)的(de)(de)餾(liu)分(fen)經(jing)正相制備(bei)高(gao)(gao)效(xiao)液(ye)相色(se)譜正己烷(wan)-異(yi)丙(bing)醇等(deng)度(du)洗(xi)(xi)脫(tuo)，正己烷(wan)-異(yi)丙(bing)醇體積(ji)比(bi)為0.35％:1，流(liu)(liu)速(su)2ml/min分(fen)離，色(se)譜柱為安捷倫(lun)ZORBAX,9.4×250mm,5μm；得(de)到(dao)8個(ge)餾(liu)分(fen)，8個(ge)餾(liu)分(fen)分(fen)別(bie)進行(xing)生(sheng)物活(huo)性(xing)(xing)測試(shi)，選(xuan)用活(huo)性(xing)(xing)最高(gao)(gao)的(de)(de)餾(liu)分(fen)經(jing)反相制備(bei)高(gao)(gao)效(xiao)液(ye)相色(se)譜進行(xing)梯(ti)度(du)洗(xi)(xi)脫(tuo)，所述反相制備(bei)高(gao)(gao)效(xiao)液(ye)相色(se)譜的(de)(de)流(liu)(liu)動相為乙(yi)(yi)腈(jing)和(he)水，洗(xi)(xi)脫(tuo)流(liu)(liu)程為：0min，乙(yi)(yi)腈(jing)：水的(de)(de)體積(ji)比(bi)20％：80％到(dao)30min，乙(yi)(yi)腈(jing)：水100％：0，流(liu)(liu)速(su)1ml/min,柱子為Thermo C18ODS柱,，旋轉(zhuan)蒸發去除溶劑，得(de)到(dao)一系列環肽類化合物A(2.1mg),B(28.1mg),C(6.8mg),D(1.7mg),E(27.8mg),F(8.8mg),G(15.2mg)。
實施例3：該(gai)系列環肽的提取(qu)分離
取(qu)魚腥草(cao)全(quan)草(cao)6000g，用水蒸汽蒸餾(liu)法加熱3小時，得揮發(fa)油粗品，再(zai)(zai)用20倍(bei)乙醚溶解，置分液漏斗中加濃度(du)15％硫酸(suan)溶液20ml萃取(qu)一(yi)次，取(qu)上(shang)層有機(ji)相(xiang)加質量體積分數5％氫氧化鈉(na)溶液30ml萃取(qu)2次，合并下層水相(xiang)，再(zai)(zai)加濃度(du)15％硫酸(suan)溶液30ml和相(xiang)當于揮發(fa)油粗品的30倍(bei)乙醚萃取(qu)2次，合并上(shang)層有機(ji)相(xiang)，減壓旋干溶劑即得揮發(fa)油樣品137g。
將揮發油樣品(pin)進(jin)行快速減(jian)壓(ya)柱(zhu)色(se)譜或常壓(ya)柱(zhu)色(se)譜分(fen)離，石油醚(沸程(cheng)60-90℃)-乙(yi)(yi)酸乙(yi)(yi)酯(100:1、50:1、25:1、20:1、0:1,V/V)混合溶劑(ji)梯度(du)(du)洗脫(tuo)，每500ml體積(ji)為一(yi)餾(liu)(liu)分(fen)，即100:1(5000ml)、50:1(5000ml)、30:1(6500ml)、20:1(6500ml)、0:1(1000ml),V/V，共收集到(dao)48個餾(liu)(liu)分(fen)，經(jing)硅(gui)膠薄(bo)層層析檢(jian)識，合并得(de)到(dao)5個餾(liu)(liu)分(fen)；5個餾(liu)(liu)分(fen)分(fen)別進(jin)行生物(wu)活(huo)性(xing)測試(shi)，選(xuan)用活(huo)性(xing)最高(gao)的(de)餾(liu)(liu)分(fen)經(jing)正(zheng)相制(zhi)備高(gao)效液相色(se)譜正(zheng)己(ji)烷-異(yi)丙醇等度(du)(du)洗脫(tuo)，正(zheng)己(ji)烷-異(yi)丙醇體積(ji)比為0.35％:1，流(liu)(liu)速2ml/min分(fen)離，色(se)譜柱(zhu)為安捷倫ZORBAX,9.4×250mm,5μm；得(de)到(dao)8個餾(liu)(liu)分(fen)，8個餾(liu)(liu)分(fen)分(fen)別進(jin)行生物(wu)活(huo)性(xing)測試(shi)，選(xuan)用活(huo)性(xing)最高(gao)的(de)餾(liu)(liu)分(fen)經(jing)反相制(zhi)備高(gao)效液相色(se)譜進(jin)行梯度(du)(du)洗脫(tuo)，所述反相制(zhi)備高(gao)效液相色(se)譜的(de)流(liu)(liu)動相為乙(yi)(yi)腈(jing)(jing)和水，洗脫(tuo)流(liu)(liu)程(cheng)為：0min，乙(yi)(yi)腈(jing)(jing)：水的(de)體積(ji)比20％：80％到(dao)30min，乙(yi)(yi)腈(jing)(jing)：水100％：0，流(liu)(liu)速1ml/min,柱(zhu)子為Thermo C18ODS柱(zhu),，旋轉蒸發去除溶劑(ji)，得(de)到(dao)一(yi)系(xi)列環肽類化合物(wu)A(4.0mg),B(29.9mg),C(4.3mg),D(1.1mg),E(30.7mg),F(1.4mg),G(3.6mg)。
實施(shi)例4：亮(liang)氨酸(suan)甲酯鹽(yan)酸(suan)鹽(yan)的制備
在裝有滴液漏斗、帶CaCl2干燥(zao)管和(he)回流(liu)管的二(er)口瓶中加(jia)入15ml甲(jia)醇和(he)40mmol L-亮氨酸(suan),于冰-鹽(yan)(yan)浴(yu)中冷至(zhi)-5℃,磁力攪拌(ban)下(xia)緩慢滴加(jia)50mmol氯化亞砜(feng),維持溫(wen)(wen)度0℃以下(xia),繼續(xu)反應(ying)1h,加(jia)熱升溫(wen)(wen)至(zhi)45℃攪拌(ban)30min,使固(gu)體全溶,冷卻(que),旋(xuan)干溶劑,剩(sheng)余物用10ml熱甲(jia)醇溶解(jie),冷卻(que)，加(jia)入大(da)量的乙醚,有大(da)量白色結(jie)晶(jing)析出,抽濾，再(zai)用少量甲(jia)醇洗滌濾餅(bing)。濾液會繼續(xu)析出大(da)量結(jie)晶(jing)，再(zai)進(jin)行抽濾，直至(zhi)不再(zai)出現結(jie)晶(jing)為止。合并兩次濾餅(bing)，即為白色亮氨酸(suan)甲(jia)酯鹽(yan)(yan)酸(suan)鹽(yan)(yan)，產率：95.1％。
實施例5：保護(hu)型二肽的(de)制(zhi)備(bei)
在0℃下,將二(er)異丙基(ji)乙胺(an)(DIEA)20mmol緩慢滴加到7mmol亮(liang)氨酸甲酯鹽(yan)酸鹽(yan)的 30ml二(er)氯甲烷(wan)中,并調(diao)PH 7-8,然后(hou)(hou)再加入Boc-Leu 7mmol與1-羥基(ji)苯并三(san)唑(HOBT)7mmol,在0℃下再反(fan)(fan)應(ying)15min,然后(hou)(hou)再加入DCC 7mmol,室溫(wen)下反(fan)(fan)應(ying)17h(TLC跟蹤反(fan)(fan)應(ying)),停止反(fan)(fan)應(ying)后(hou)(hou)，過濾，減壓蒸去溶劑，硅膠柱(zhu)層析進行純化,產(chan)率：90.7％。
實施例6：保(bao)護型二肽脫Boc-保(bao)護基(ji)的(de)制備
取2.8mmol Boc-Leu-Leu-OCH3溶(rong)解于圓底燒(shao)瓶(ping)中,用12ml二氯(lv)甲烷(wan)溶(rong)解,并冷卻到0℃,然(ran)后(hou)加入3ml三(san)氟醋酸,在0℃反(fan)(fan)應4h,反(fan)(fan)應結束后(hou),在減壓下旋走二氯(lv)甲烷(wan)與未反(fan)(fan)應的三(san)氟醋酸,得到白(bai)色固體，產率(lv)：86.4％。
實施(shi)例7：保(bao)護型三肽的制備(bei)
在(zai)0℃下,將DIEA 21mmol緩慢滴加(jia)到(dao)Leu-Leu甲酸(suan)三氟醋酸(suan)鹽(yan)7mmol的30ml二氯甲烷中(zhong),攪拌(ban)10min,然(ran)后(hou)再(zai)(zai)加(jia)入(ru)Boc-亮氨酸(suan)7mmol與HOBT 7mmol,在(zai)0℃下再(zai)(zai)反應(ying)15min,然(ran)后(hou)再(zai)(zai)加(jia)入(ru)DCC 7.5mmol,然(ran)后(hou)升到(dao)室溫反應(ying)18h(TLC跟蹤反應(ying)),停止反應(ying)后(hou),過濾,減壓蒸去溶劑,用硅膠(jiao)柱層析進(jin)行純(chun)化，產率(lv)：88.3％。
實施例(li)8：保護型(xing)二肽脫甲(jia)酯保護基的制(zhi)備
取2mmol Boc-Leu-Leu-OCH3加入1N NaOH 8ml和甲醇8ml,冰浴下加入,5min后讓其在室溫下皂化3h,點板至原料點消失，加HCl調PH 7-8,停止反應旋去甲醇。在冰浴下加HCl調PH 2-3,有大量的白色沉淀析出,用無水乙醚萃取一次,水相用乙酸乙酯萃取一次,合并有機相,用飽和NaCl洗3次,乙酸乙酯相用無水Na2SO4干燥2h,過濾濃縮，得白色固體,產率：88.8％。
實施例9：保護(hu)型四肽的制備
向裝有2mmol Boc-Leu-Leu-OH的25ml單口瓶中加入5ml二氯甲烷,再加入2mmol Leu-Leu-OCH3.TFA,攪拌下(xia)加入2.5mmol BOP-Cl。冰浴下(xia)滴加三乙胺0.5ml,緩慢升(sheng)至室溫后反應16h,停止(zhi)反應后,過濾,減壓(ya)蒸去溶劑,用硅膠(jiao)柱層(ceng)析進(jin)行純化,產率：37.7％。
實施例(li)10：保護型(xing)三肽(tai)脫Boc-保護基的制備(bei)
取2.5mmol Boc-Leu-Leu-Leu-OCH3溶解于25ml的(de)圓底(di)燒瓶中(zhong),用15ml二氯甲烷溶 解，并冷(leng)卻(que)到0℃,然后加入3ml三氟醋酸,在0℃反應2h,反應結束后,在減壓下(xia)旋(xuan)走二氯甲烷與(yu)未(wei)反應的(de)三氟醋酸,得到白色(se)固體(ti),產(chan)率：84.6％。
實施例(li)11：保護型(xing)五肽(tai)的制(zhi)備
向裝有2.2mmol Boc-Leu-Leu-OH的25ml單口瓶中加入5ml二氯甲烷,再加入2mmol Leu-Leu-Leu-OCH3.TFA,攪(jiao)拌下加入2.5mmol BOP-Cl。冰浴(yu)下滴加三乙胺0.5ml,緩(huan)慢升至室溫后反應16h,停止反應后,過濾,減(jian)壓蒸去溶劑,用硅膠(jiao)柱層析(xi)進(jin)行純化。產率(lv)：45.8％。
實施例12：保護型三肽脫甲酯保護基(ji)的(de)制備(bei)
取2mmol Boc-Leu-Leu-Leu-OCH3加入1N NaOH 8ml和甲醇8ml,冰浴下加入,5min后讓其在室溫下皂化3h,點板至原料點消失,加HCl調PH 7-8,停止反應旋去甲醇。在冰浴下加HCl調PH 2-3,有大量的白色沉淀析出,用無水乙醚萃取一次,水相用乙酸乙酯萃取一次,合并有機相,用飽和NaCl洗3次,乙酸乙酯相用無水Na2SO4干燥3h,過濾濃縮,得(de)白色固體,產率：81.7％。
實施例(li)13：保護型六(liu)肽的制備
向裝有2mmol Boc-Leu-Leu-Leu-OH的25ml單口瓶中加入5ml二氯甲烷,再加入2mmol Leu-Leu-Leu-OCH3.TFA,攪拌下(xia)加(jia)入2.5mmol BOP-Cl。冰浴下(xia)滴(di)加(jia)三乙胺(an)0.5ml,緩慢升至(zhi)室(shi)溫后反(fan)(fan)應(ying)12h,停止(zhi)反(fan)(fan)應(ying)后,過濾,減壓(ya)蒸去溶劑,用硅膠柱(zhu)層析進行(xing)純化(hua)，產(chan)率：45.5％。
實施例(li)14：保(bao)護(hu)型五肽脫Boc-保(bao)護(hu)基的制(zhi)備(bei)
取2mmol Boc-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-OCH3溶(rong)解(jie)于25ml的圓底燒瓶(ping)中,用15ml二氯(lv)甲烷溶(rong)解(jie),并冷(leng)卻到(dao)0℃,然(ran)后加入3ml三氟醋酸,在0℃反應2h,反應結(jie)束后,在減壓下旋(xuan)干溶(rong)劑,得到(dao)白色固體，產(chan)率：68.9％。
實施例15：保(bao)護(hu)型七肽的制備
向裝有1.7mmol Boc-Leu-Leu-OH的25ml單口瓶中加入5ml二氯甲烷,再加入1.7 mmol Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-OCH3.TFA,攪(jiao)拌(ban)下加入2.0mmol BOP-Cl。冰浴下滴加三乙胺0.5ml,緩慢(man)升(sheng)至室溫(wen)后反(fan)應(ying)16h(TLC跟(gen)蹤反(fan)應(ying)),停止(zhi)反(fan)應(ying)后,過濾,減(jian)壓蒸去溶劑,用(yong)硅膠柱層(ceng)析進行純(chun)化,產率：34.8％。
實施例16：保(bao)護型六肽脫Boc-保(bao)護基的制備
取3mmol Boc-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-OCH3溶(rong)(rong)解(jie)于25ml的圓底(di)燒瓶(ping)中,用(yong)20ml二氯甲烷溶(rong)(rong)解(jie),并冷(leng)卻到0℃，然后加入3ml三氟醋酸,在0℃反(fan)應2h,反(fan)應結束后,在減壓(ya)下旋干溶(rong)(rong)劑,得到白色(se)固體，產率66.4％。
實施例17：保護型八肽的制備
向裝有1.7mmol Boc-Leu-Leu-OH的25ml單口瓶中加入5.0ml二氯甲烷,再加入1.7mmol Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-OCH3.TFA,攪拌(ban)下加入(ru)2.0mmol BOP-Cl。冰浴下滴加三乙胺0.5ml,緩慢(man)升至室溫(wen)后反(fan)應(ying)16h(TLC跟(gen)蹤反(fan)應(ying)),停止(zhi)反(fan)應(ying)后,過濾,減壓蒸去溶劑,用硅(gui)膠柱層(ceng)析進行純化,產(chan)率：32.4％。
實施例18：環二肽的制備
2mmol Leu-Leu-OCH3.TFA加適量乙酸乙酯溶解，使用5％Na2CO3洗(xi)滌至PH 7-8，除(chu)去溶劑，再加入20ml甲醇，加熱(re)回流(liu)72h，減壓(ya)除(chu)去大部分甲醇，加入冰冷(leng)的30ml無水乙醚，立即放(fang)冰箱中(zhong)快速冷(leng)卻(que)至-5℃冷(leng)藏3h，過濾，用少量無水乙醚洗(xi)滌濾餅(bing)，真空干(gan)燥得(de)白(bai)色粉末，產(chan)率：71.3％。
實(shi)施(shi)例19：環三肽的制備
取實施例10所得(Leu)3-OCH3 3.2mmol加(jia)入1N NaOH 12ml和甲醇(chun)12ml,冰浴(yu)下加(jia)入,5min后(hou)(hou)讓(rang)其在(zai)室(shi)溫下3h,點板至原料點消失,加(jia)HCl調PH 7-8,停止反(fan)應旋去甲醇(chun)。在(zai)冰浴(yu)下加(jia)HCl調PH 5-7,有大(da)量的白(bai)色沉(chen)淀(dian)析出,過濾濃(nong)縮,得白(bai)色固體，將其溶(rong)于30ml DMF和270ml二(er)氯甲烷溶(rong)解后(hou)(hou)加(jia)入12.5mmol PyBOP、2.5mmol HATU、30mmol DIEA,常(chang)溫攪拌(ban)反(fan)應36h。減壓(ya)濃(nong)縮除去溶(rong)劑，在(zai)殘余液(ye)中加(jia)入250ml水，用(yong)100ml乙酸乙酯萃(cui)取3次，合(he)并(bing)有機相。經硅膠柱層析純化，產率：32.9％。
實施例(li)20：環四(si)肽的制備(bei)
取實施例9所得Boc-(Leu)4-OCH3 3.8mmol于圓底(di)燒(shao)瓶中,用30ml二氯甲(jia)(jia)烷溶(rong)(rong)(rong)解,并(bing)冷(leng)卻到(dao)0℃,然后加(jia)(jia)入10ml三氟(fu)醋酸(suan)(suan),在(zai)0℃反(fan)應2h,反(fan)應結束后,在(zai)減(jian)壓(ya)下旋干溶(rong)(rong)(rong)劑,得(de)到(dao)白色(se)固體,再加(jia)(jia)入1N NaOH 12ml和(he)(he)甲(jia)(jia)醇12ml,冰浴下加(jia)(jia)入,5min后讓其(qi)(qi)在(zai)室溫(wen)下3h,點板至原料點消失,加(jia)(jia)HCl調(diao)PH 7-8,停止反(fan)應旋去(qu)甲(jia)(jia)醇。在(zai)冰浴下加(jia)(jia)HCl調(diao)PH 5-7,過濾(lv)濃(nong)縮,得(de)白色(se)固體，再將其(qi)(qi)溶(rong)(rong)(rong)于30ml DMF和(he)(he)270ml二氯甲(jia)(jia)烷溶(rong)(rong)(rong)解后加(jia)(jia)入12.5mmol PyBOP、2.5mmol HATU、30mmol DIEA,常溫(wen)攪拌反(fan)應36h。減(jian)壓(ya)濃(nong)縮除(chu)去(qu)溶(rong)(rong)(rong)劑，在(zai)殘(can)余液(ye)中加(jia)(jia)入250ml水(shui)，用100ml乙(yi)酸(suan)(suan)乙(yi)酯萃取3次，合(he)并(bing)有機相(xiang)。經硅膠柱層析(xi)純化(hua)，產(chan)率：30.7％。
實(shi)施(shi)例21：環五肽(tai)的制備
取實施例14所得(Leu)5-OCH3 3mmol加(jia)(jia)(jia)入(ru)(ru)1N NaOH 12ml和甲醇(chun)12ml,冰浴下(xia)加(jia)(jia)(jia)入(ru)(ru),5min后讓其(qi)(qi)在室(shi)溫(wen)(wen)下(xia)3h,點板至原料點消失,加(jia)(jia)(jia)HCl調PH 7-8,停止反(fan)應旋去甲醇(chun)。在冰浴下(xia)加(jia)(jia)(jia)HCl調PH 5-7,有(you)大量的白(bai)色沉淀析(xi)出,過濾濃縮(suo),得白(bai)色固體，將其(qi)(qi)溶(rong)于30ml DMF和270ml二氯甲烷溶(rong)解后加(jia)(jia)(jia)入(ru)(ru)12.5mmol PyBOP、2.5mmol HATU、30mmol DIEA,常溫(wen)(wen)攪拌反(fan)應36h。減壓濃縮(suo)除去溶(rong)劑，在殘余(yu)液中加(jia)(jia)(jia)入(ru)(ru)250ml水(shui)，用100ml乙酸(suan)乙酯(zhi)萃取(qu)3次，合(he)并有(you)機相。經硅膠柱層析(xi)純化，產率：31.1％。
實施(shi)例22：環(huan)六肽的制備
取實施例16所得(Leu)6-OCH3 3mmol加入(ru)1N NaOH 12ml和甲醇12ml,冰浴下(xia)加入(ru),5min后(hou)讓其(qi)在(zai)(zai)室溫(wen)下(xia)3h,點板(ban)至(zhi)原(yuan)料點消失,加HCl調(diao)PH 7-8,停止(zhi)反應旋(xuan)去甲醇。在(zai)(zai)冰浴下(xia)加HCl調(diao)PH 5-7,有(you)大量的白(bai)色沉淀析(xi)出(chu),過濾濃縮,得(de)白(bai)色固(gu)體，將其(qi)溶于(yu)30ml DMF和270ml二氯甲烷溶解后(hou)加入(ru)12.5mmol PyBOP、2.5mmol HATU、30mmol DIEA,常(chang)溫(wen)攪(jiao)拌反應36h。減壓濃縮除去溶劑(ji)，在(zai)(zai)殘余液中加入(ru)250ml水，用(yong)100ml乙酸乙酯萃取(qu)3次(ci)，合(he)并(bing)有(you)機相(xiang)。經硅膠柱(zhu)層析(xi)純化，產率：28.0％。
實施例23：環七(qi)肽的制備
取實施例15所得Boc-(Leu)7-OCH3 3mmol于(yu)圓(yuan)底燒瓶中,用20ml二(er)氯(lv)甲烷溶解(jie),并冷卻(que)到0℃,然(ran)后(hou)加(jia)入(ru)(ru)5ml三氟醋酸,在(zai)(zai)0℃反(fan)應(ying)2h,反(fan)應(ying)結(jie)束后(hou),在(zai)(zai)減壓下旋干溶劑,得(de)到白色(se)固(gu)體，再加(jia)入(ru)(ru)1N NaOH 12ml和甲醇(chun)(chun)12ml,冰(bing)浴下加(jia)入(ru)(ru),5min后(hou)讓其在(zai)(zai)室(shi)溫(wen)下4h, 點(dian)板至原(yuan)料(liao)點(dian)消失,加(jia)HCl調(diao)PH 7-8,停(ting)止反(fan)應(ying)旋去甲醇(chun)(chun)。在(zai)(zai)冰(bing)浴下加(jia)HCl調(diao)PH 5-7,過濾濃縮,得(de)白色(se)固(gu)體，將(jiang)其溶于(yu)30ml DMF和270ml二(er)氯(lv)甲烷溶解(jie)后(hou)加(jia)入(ru)(ru)12.5mmol PyBOP、2.5mmol HATU、30mmol DIEA,常溫(wen)攪(jiao)拌(ban)反(fan)應(ying)36h。減壓濃縮除去溶劑，在(zai)(zai)殘余液中加(jia)入(ru)(ru)250ml水，用100ml乙酸乙酯萃取3次，合并有機相(xiang)。經(jing)硅膠(jiao)柱層析純(chun)化，產率(lv)：28.2％。
實施例24：環八肽的制備(bei)
取實施例17所得Boc-(Leu)8-OCH3 3mmol于圓底燒瓶中(zhong),用20ml二(er)氯甲(jia)烷溶解,并(bing)(bing)冷卻到(dao)0℃,然后加(jia)(jia)入(ru)(ru)5ml三氟(fu)醋酸,在0℃反應2h,反應結束后,在減壓下(xia)旋(xuan)干(gan)溶劑(ji),得到(dao)白(bai)色(se)固體(ti)，再加(jia)(jia)入(ru)(ru)1N NaOH 12ml和甲(jia)醇12ml,冰浴下(xia)加(jia)(jia)入(ru)(ru),5min后讓其在室溫(wen)下(xia)3h,點板(ban)至(zhi)原料點消失,加(jia)(jia)HCl調PH 7-8,停止反應旋(xuan)去(qu)甲(jia)醇。在冰浴下(xia)加(jia)(jia)HCl調PH 5-7,有(you)大量的(de)白(bai)色(se)沉淀析出,過濾濃(nong)(nong)縮(suo),得白(bai)色(se)固體(ti)，并(bing)(bing)將(jiang)其溶于30ml DMF和270ml二(er)氯甲(jia)烷溶解后加(jia)(jia)入(ru)(ru)12.5mmol PyBOP、2.5mmol HATU、30mmol DIEA,常溫(wen)攪拌反應36h。減壓濃(nong)(nong)縮(suo)除去(qu)溶劑(ji)，在殘(can)余(yu)液中(zhong)加(jia)(jia)入(ru)(ru)250ml水，用100ml乙(yi)酸乙(yi)酯萃取3次(ci)，合(he)并(bing)(bing)有(you)機相。經硅膠柱層析純化，產率：27.2％。
實(shi)施例25：抗(kang)炎(yan)活性的測定
a：實驗方法
SD大鼠(shu)(shu)，體重180-200g，雌雄各半，按右(you)(you)(you)后(hou)(hou)足(zu)(zu)(zu)(zu)(zu)周長長度分組(zu)，每(mei)(mei)組(zu)6只。分為模型組(zu)，樣品組(zu)(每(mei)(mei)組(zu)給(gei)藥(yao)0.2g)和扶他林(lin)組(zu)(0.2g)。于(yu)每(mei)(mei)只大鼠(shu)(shu)右(you)(you)(you)后(hou)(hou)足(zu)(zu)(zu)(zu)(zu)趾部皮(pi)下注射(she)1％角叉(cha)菜膠(jiao)溶液0.1ml致炎，致炎半小(xiao)時后(hou)(hou)，按上述各組(zu)劑量將藥(yao)物均勻涂抹于(yu)右(you)(you)(you)后(hou)(hou)足(zu)(zu)(zu)(zu)(zu)趾部，于(yu)給(gei)藥(yao)0.5，1，2，3，4.5h后(hou)(hou)分別(bie)測量右(you)(you)(you)后(hou)(hou)足(zu)(zu)(zu)(zu)(zu)的周長。計算致炎前后(hou)(hou)的右(you)(you)(you)后(hou)(hou)足(zu)(zu)(zu)(zu)(zu)周長差值，再計算足(zu)(zu)(zu)(zu)(zu)腫脹率，結果見表1。
表1各組化合(he)物(wu)角叉菜(cai)膠致炎后大(da)鼠足腫脹
*P<0.05 **P<0.01與模(mo)型組相比
注：組(zu)(zu)合(he)物(wu)(wu)1A:B:C:D:E:F:G(5:28:14:2:33:1:3)；組(zu)(zu)合(he)物(wu)(wu)2A:B:C:D:E:F:G(3:30:16:1:35:1:4)；組(zu)(zu)合(he)物(wu)(wu)3A:B:C:D:E:F:G(1:35:12:1:25:1:7)；組(zu)(zu)合(he)物(wu)(wu)4A:B:C:D:E:F:G(6:15:20:5:40:1:1)。
b、結論：
結果(guo)(guo)顯示(shi)：給藥后，樣品組(zu)和扶(fu)(fu)他林(lin)組(zu)都有顯著(zhu)的抗炎活性(xing)，化(hua)合物A～G單獨使(shi)用時，抗炎活性(xing)較弱且低于(yu)扶(fu)(fu)他林(lin)組(zu)。當7個(ge)化(hua)合物組(zu)合使(shi)用時，抗炎活性(xing)較強(qiang)且強(qiang)于(yu)扶(fu)(fu)他林(lin)組(zu)，且在A:B:C:D:E:F:G＝2～5:28～32:14～18:1～3:30～35:1:2～5的比例范(fan)圍(wei)內活性(xing)更好，顯示(shi)協同作用效(xiao)果(guo)(guo)。
實施例26：抗菌活性的測(ce)定
a：細菌培養
金黃色葡萄球菌(MRSA、MSSA)、表皮葡萄球菌(MRSE、MSSE)、枯草芽孢桿菌、 糞腸球菌、大腸桿菌、弗氏志賀菌、肺炎克雷伯氏桿菌、普通變形桿菌、傷寒沙門桿菌和銅綠假單胞菌在Mueller-Hinto(M-H)肉湯培養基中過夜培養并稀釋使其接種量控制為105-106CFU。
肺炎鏈球菌和甲型溶血性鏈球菌在含5％去纖維羊血的M-H肉湯培養基中過夜培養并稀釋使接種量控制為105-106CFU。
b：方法
抗菌活性的測定采用世界衛生組織推薦的瓊脂稀釋法。藥物濃度采用連續倍數稀釋法，加入到50-60℃M-H瓊脂中混合均勻。上述稀釋后的實驗菌懸液用多頭接種儀接種于含不同濃度化合物的培養皿中，在35℃培養18-24小時。其中稀釋后的肺炎鏈球菌和甲型溶血性鏈球菌加入到含5％去纖維羊血的M-H瓊脂中，在5％CO2、35℃培養18-24小時。
肉眼(yan)觀察結果，抑(yi)制實驗(yan)細菌(jun)生長的最低濃度為最小抑(yi)菌(jun)濃度(MIC)，結果見表1。
表2臨(lin)床分離菌株的最小抑菌濃度(μg/ml)
注(zhu)：1：化合(he)(he)(he)物(wu)A；2:化合(he)(he)(he)物(wu)B；3:化合(he)(he)(he)物(wu)C；4:化合(he)(he)(he)物(wu)D；5:化合(he)(he)(he)物(wu)E；6:化合(he)(he)(he)物(wu)F；7:化合(he)(he)(he)物(wu)G；8：組(zu)合(he)(he)(he)物(wu)1A:B:C:D:E:F:G(5:28:14:2:33:1:3)；9：組(zu)合(he)(he)(he)物(wu)2A:B:C:D:E:F:G(3:30:16:1:35:1:4)；10：組(zu)合(he)(he)(he)物(wu)3A:B:C:D:E:F:G(1:35:12:1:25:1:7)；11：組(zu)合(he)(he)(he)物(wu)4A:B:C:D:E:F:G(6:15:20:5:40:1:1)；12：替考拉寧；13：氧氟沙星。
c：結論
結果(guo)顯示：給藥后，化合(he)物A～G和他們的(de)(de)組(zu)(zu)合(he)物對多種臨床(chuang)分(fen)離菌(jun)株均有(you)抗菌(jun)作(zuo)用(yong)(yong)，化合(he)物A～G單獨使用(yong)(yong)時(shi)，抗菌(jun)活性(xing)較弱且低(di)于替考拉(la)寧、氧氟沙星(xing)。當7個化合(he)物組(zu)(zu)合(he)使用(yong)(yong)時(shi)，抗菌(jun)活性(xing)顯著(zhu)增加且強于替考拉(la)寧、氧氟沙星(xing)，且在A:B:C:D:E:F:G＝2～5:28～32:14～18:1～3:30～35:1:2～5的(de)(de)比例范圍內活性(xing)更好，顯示協同作(zuo)用(yong)(yong)效果(guo)。
實(shi)施(shi)例27：片劑的制(zhi)備
取(qu)上述實(shi)施(shi)(shi)例1～3任一(yi)方(fang)法或實(shi)施(shi)(shi)例4～24方(fang)法所得的化合物A～G，按(an)3:30:16:1:35:1:4比例混(hun)合，共50g，粉(fen)(fen)碎(sui)后過80目篩，與淀(dian)粉(fen)(fen)100g混(hun)勻(yun)，加10％淀(dian)粉(fen)(fen)漿10g制成(cheng)軟(ruan)材，干燥后加入硬脂酸(suan)鎂1g，干淀(dian)粉(fen)(fen)10g混(hun)勻(yun)后，總重量(liang)共計171g，制成(cheng)1000片(pian)。
實施例(li)28：膠囊劑的制備
取上(shang)述實(shi)施例(li)1～3任一(yi)方法或實(shi)施例(li)4～24方法所得(de)的(de)化(hua)合物A～G，按2:33:15:3:32:1:5比例(li)混合，共(gong)50g，粉碎后(hou)過80目篩，與淀粉100g混勻，加10％淀粉漿10g制成(cheng)軟材(cai)，用20目篩制粒后(hou)，置60℃-70℃干燥后(hou)于18目篩整(zheng)粒，套入1號空心膠囊中(zhong)，共(gong)裝(zhuang)1000粒。
實施例29：丸(wan)劑的制備
取上(shang)述實施例(li)1～3任一方(fang)法或實施例(li)4～24方(fang)法所得的化合物(wu)A～G，按3:28:14:2:33:1:3比(bi)例(li)混(hun)合，共50g，粉碎后過100-120目篩(shai)，適量蜂(feng)蜜作黏(nian)合劑制成丸。
實施例30：顆粒劑(ji)的(de)制(zhi)備
取上述實施例1～3任(ren)一方法或實施例4～24方法所得的化合物A～G，按3:30:16:1:35:1:4比例混合，共50g，粉(fen)碎后過80目篩(shai)，加10％淀(dian)粉(fen)漿制(zhi)成軟(ruan)材，用20目篩(shai)制(zhi)粒(li)(li)后，置60℃-70℃干燥(zao)后于18目篩(shai)整粒(li)(li)，分裝，密封，包(bao)裝既得。
實施例31：注射劑的制備
其(qi)中(zhong)注射劑包括小(xiao)針劑、粉針劑、大輸(shu)液。
取上述實施(shi)(shi)例1～3任一方法或實施(shi)(shi)例4～24方法所得的化合物A～G，按 5:28:16:1:35:1:5比例混(hun)合，共20g，加入甘露醇(chun)30g，加入乙(yi)醇(chun)5Kg、甘油(you)1Kg和丙二醇(chun)4Kg，過濾除(chu)菌(jun)，分(fen)裝1000瓶，灌封，滅菌(jun)即(ji)得小針劑(ji)。
取上述實施例1～3任一方法或實施例4～24方法所得的化合物A～G，按5:28:16:1:35:1:5比例混合，共10g，加入右旋糖酐20 30g，加水20L，溶解，過濾(lv)除菌，分裝1000瓶(ping)，冷(leng)凍(dong)干燥，得粉針劑。
取上述實(shi)施例1～3任一方法或(huo)實(shi)施例4～24方法所得的化合物A～G，按5:28:16:1:35:1:5比例混(hun)合，共50g，加入乙(yi)醇(chun)2Kg、丙二(er)醇(chun)3Kg、甘油2Kg、聚乙(yi)二(er)醇(chun)5Kg溶解，加入氯(lv)化鈉900g、注射(she)用水100Kg，溶解、混(hun)勻(yun)，過濾除菌，分(fen)裝1000瓶(ping)，灌裝，滅菌即(ji)得大輸液。
實施例32：滴(di)眼劑(ji)的制備
取上述(shu)實施例(li)1～3任一(yi)方法或(huo)實施例(li)4～24方法所得的(de)化(hua)合物A～G，按4:28:15:1:33:1:4比例(li)混合，共0.5g，溶解于適量(liang)(liang)注(zhu)射(she)用(yong)水中，加入甘油(you)15g，丙二醇13g，磷酸氫(qing)二鈉2g，EDTA 0.1g，羥苯乙(yi)酯0.3g，攪拌溶解，用(yong)注(zhu)射(she)用(yong)水補(bu)全量(liang)(liang)至1000g，微孔濾(lv)膜過(guo)濾(lv)，分裝容(rong)器中，封口，得成(cheng)品。
實(shi)施(shi)例(li)33：眼(yan)用凝膠(jiao)劑的制備
取上述(shu)實施(shi)例(li)(li)1～3任一方(fang)法(fa)或實施(shi)例(li)(li)4～24方(fang)法(fa)所得(de)的(de)化合物A～G，按5:32:18:3:35:1:5比(bi)例(li)(li)混合，共0.5g，加入甘油(you)15g，丙(bing)二醇13g，磷酸氫二鈉(na)2g，EDTA0.1g，羥(qian)苯乙(yi)酯(zhi)0.3g，溶解于適量(liang)注射(she)用水中，加入溶脹后的(de)1％羥(qian)丙(bing)甲纖維素400g中攪拌，用注射(she)用水補全量(liang)至1000g，微(wei)孔濾膜過濾，分(fen)裝容器(qi)中，封口，得(de)成(cheng)品。
以上所述實(shi)施例僅表達(da)了(le)本(ben)發(fa)明(ming)的(de)幾種實(shi)施方式(shi)，其(qi)描述較為具體和詳細，但并不(bu)能因此(ci)而理解為對本(ben)發(fa)明(ming)專利(li)范(fan)圍的(de)限制(zhi)，應當指出(chu)的(de)是(shi)，對于本(ben)領(ling)域的(de)技術人(ren)員來說(shuo)，在(zai)不(bu)脫(tuo)離本(ben)發(fa)明(ming)構思的(de)前提下，還可以做出(chu)若干變形(xing)和改造，這些都屬(shu)于本(ben)發(fa)明(ming)的(de)保(bao)護(hu)范(fan)圍，因此(ci)，本(ben)發(fa)明(ming)專利(li)的(de)保(bao)護(hu)范(fan)圍以所附權利(li)要(yao)求為準。