化學活性表面基團（如氨基酸或糖側鏈)組成并且通常具 有特定Ξ維結構特征W及特定電荷特征。構象表位與非構象表位的區別在于，在變性溶劑 或熱處理存在下與前者(而非后者）的結合消失。
[0125] 構象表位是由祀分子構象折疊產生，此情形在來自祀分子線性序列不同部分的氨 基酸在3維空間中緊密接近時發生。
[0126] 趨化因子共有保守的3D結構，即所謂的IL8樣趨化因子折疊，該結構因半脫氨酸殘 基形成分子內二硫鍵而穩定。
[0127] 有趣的是，預測的CX化17的IL8樣趨化因子結構掲露在3D結構的非典型區域中存 在二硫鍵，同時仍保持活性折疊。與該家族其它已知成員的較低序列相似性及其與已知趨 化因子中不同的半脫氨酸模式是趨化因子CX化17無法通過基于標準序列的方法進行注釋 的原因（2)。
[0128] 趨化因子受體活化設及趨化因子N環與受體N末端殘基之間W及趨化因子N末端與 受體細胞外/跨膜殘基之間的相互作用(46)，表明運一相互作用的構象狀態是至關重要的。
[0129] 因此，通過加熱重組CX化17制劑(95°C，10分鐘），隨后立即熱休克(4°C，5分鐘），可 W使趨化因子變性并防止其復性成為活性構象。由此破壞該蛋白質的天然3維構象，但如通 過氨基酸序列所定義，該蛋白質的一級結構應保持完整。完整多膚可W利用SDS-PAGE或其 它分析方法評價，W確定該多膚和序列保持完整。
[0130] 當將具有"活性構象"的天然CX化17添加到預先負載有化+2敏感性染料(Fura Red 加化Icium Green)的經CXCR8轉染的細胞中時，可W利用流式細胞儀檢測到細胞內化+2濃 度增加(通過巧光度比率增加測量）。如果在該檢驗中添加熱變性的CX化17,那么如由不存 在化+2信號傳導增加所指示，細胞不具有反應性。運一反應證實，CX化17的多膚序列本身不 負責結合和功能性活化CXCR8,而是由其構象整體的天然形式負責。
[0131] 實施例4:
[0132] CX化17/CXCR8相互作用可能在胃腸炎性病癥中起到重要作用。（31)重要的是，全 基因組關聯研究(GWAS)鑒別出CXCR8/GPR35錯義單核巧酸多態現象與原發性硬化性膽管炎 及隨后發生的潰瘍性結腸炎密切關聯(5)。此類信息使得CX化17/CXCR8很可能參與胃腸炎 性病癥中。可W使用臨床前小鼠胃腸病癥模型來檢驗有關CX化17/CXCR8相互作用的激動劑 和/或括抗劑的有效性。使用葡聚糖硫酸鋼(DSSK47-48)或2,4,6-Ξ硝基苯橫酸（TNBS) (49-51)誘導兩個主要的鼠類結腸炎模型。DSS模型比TNBS模型更接近人類結腸炎，因為它 可W被誘導出急性或慢性形式(47-49)。
[0133] 運些模型得到了廣泛認可并且被證實可得到一致地可再現的結果。因此，在W治 療范圍內的所選藥物劑量比較激動劑/括抗劑處理的小鼠與未處理小鼠的反應時，應當易 于在檢驗讀數中檢測將激動劑或括抗劑添加到運些系統中的作用。具體說來，將在運兩組 動物之間比較疾病發病機理和嚴重程度。激動劑/括抗劑的理想施用劑量和遞送途徑也易 于使用運些模型改變、測試和最終確定。
[0134] 還可W使用CX化17/CXCR8缺陷型（基因敲除）小鼠品系在胃腸病癥中預測括抗劑 的功效。運些小鼠品系無法表達配體或受體，并因此表現類似于用括抗劑處理過的野生型 (WT)小鼠。可W將CX化17/CXCR8缺陷型小鼠對臨床前鼠類結腸炎模型的反應與WT小鼠相比 較，并可W得出有關特定括抗劑的功效的結論。動物模型還可W用于確定趨化因子或受體 評價是否能提供特定動物的診斷或治療子環境W確定劑量和治療策略。
[0135] 在一個實施例中，將祀向CX化17的單克隆抗體用于急性鼠類DSS結腸炎模型中 (52)。所選抗體證實，其通過抑制在CXCR8轉染的BA/F3細胞中所觀察到的巧流動來抑制 CX化17/CXCR8相互作用，如圖所示。該實驗可W使用四組小鼠，例如一組接受同型對照抗 體，一組接受抗CX化17抗體，一組接受同型對照抗體和DSS，而最后一組接受抗CX化17抗體 和DSS。在實驗期間，接受DSS的小鼠在第1天和第5天給予飲用水;對照小鼠僅僅給予高壓滅 菌的飲用水。在DSS處理期間的Ξ個不同時間通過腹膜內（i.p.)或靜脈內（i.v.)注射向小 鼠給予適當治療劑量的抗CX化17抗體或同型對照抗體:在開始DSS處理之前注射一次W及 在DSS處理期間注射兩次。
[0136] 可W通過分析在DSS處理過程期間小鼠的體重變化W及胃腸癥狀的發生，例如腹 瀉/帶血糞便，來檢驗抗CX化17抗體的功效(52)。在實驗結束時，例如使用Q-PCR、免疫組織 化學分析(IHC)和/或個別免疫細胞群的免疫表型分析來分析結腸炎癥水平(52)。
[0137] 該實施例可W用于可能患有如克羅恩氏病、潰瘍性結腸炎、脂瀉病等胃腸疾病的 其它受試者，包括人類。參見例如，化user,S.C.Mayo Clinic Gastroenterology and Hepatology Board Review,第四版，Mayo Clinic Scientific Press,2013;化wkey等人， Clinical and Gastroenterology and Hepatology,第二片反，Wiley-Blackwell ,2012;及 Yamada T.等人，Yamada' s Handbook of Gastroenterology,第3片反，Wiley-Blackwell, 2013。遺傳模型，例如基因敲除動物，特別適用于進行治療測試的測試受試者。
[0。引 實施例5:
[0139]可W使用臨床前鼠類呼吸系統疾病模型來顯示祀向CX化17/CXCR8相互作用的激 動劑和/或括抗劑的功效。人特發性肺纖維化(IPF)的鼠類博萊霉素模型被廣泛用于研究動 物的 IPF(53-55)。參見例如，Models of Lung Disease, Joan Gil 編輯，1990 出版；及 Fishman's Pulmonary Diseases and Disorders,Fishman等人，2008出片反。
[0140] 使用兩組動物(激動劑/括抗劑治療對比未治療），比較兩組中疾病的進展和嚴重 程度。將適當治療劑量和治療處理施用給動物。在分析運些實驗的結果之后，得出有關激動 劑/括抗劑功效的結論。另外，還使用運一模型比較激動劑/括抗劑的量和遞送途徑。
[0141] 使用CX化17/CXCR8缺陷型（基因敲除）小鼠品系預測括抗劑在呼吸系統病癥中的 功效。運些小鼠品系無法表達配體或受體，并因此表現類似于用括抗劑處理過的野生型 (WT)小鼠。將CX化17/CXCR8缺陷型小鼠對臨床前鼠類IPF模型的反應與WT小鼠相比較，并得 出有關特定括抗劑的功效的結論。
[0142] 在IPF的鼠類博萊霉素模型中，一個實施例使用了祀向CXCR8的單克隆抗體作為配 體括抗劑。所測試的抗體證實，其通過抑制在CXCR8轉染的BA/F3細胞中所觀察到的巧流動 來抑制CX化17/CXCR8相互作用，如圖所示。該實驗可W使用例如四組小鼠：一組接受同型對 照抗體，一組接受抗CXCR8抗體，一組接受同型對照抗體和博萊霉素，而最后一組接受抗 CXCR8抗體和博萊霉素。在實驗期間，接受博萊霉素的小鼠例如通過腹膜內α .P.)或氣管內 (i.t.)安裝給予劑量(22294226)。為了實現肺纖維化，經2到3周時間給予多次博萊霉素，之 后評價肺纖維化情況。在博萊霉素處理期間的Ξ個不同時間，通過腹膜內（i.P.)或靜脈內 (i . V.)注射向小鼠給予抗CXCR8抗體或同型對照抗體:在開始博萊霉素處理之前注射一次 W及在博萊霉素處理期間注射兩次。
[0143] 在DSS處理過程期間，例如通過分析小鼠體重的變化來檢驗抗CXCR8抗體的功效 (56)。在實驗結束時，例如通過測量肺中的膠原蛋白和/或徑脯氨酸含量和/或對肺進行免 疫組織化學分析(IHC)來分析肺部炎癥(56)。
[0144] 類似實施例適用于例如患有特發性肺纖維化或其它呼吸系統疾病的的其它受試 者，包括人類。參見例如，Judd,S,J,Respiratory Disorders Sourcebook,第2版,Health Reference Series ,2012;及Lechner,A.Respiratory ,An integrated approach to disease;McGrawHi11 LANGE,2012。
[0145] 實施例6:
[0146] 多發性硬化(MS)是一種免疫介導的人中樞神經系統(CNS)脫髓銷疾病，該疾病是 導致青少年失能的最常見的非創傷性原因。參見Holland,N.等人,Multiple Sclerosis,第 4版，demos化alth 2012。它是WT細胞和巨隧細胞活化并募集到病變部位W及產生脫髓銷 抗體為特征(57)。
[0147] 實驗性自體免疫性腦脊髓炎化AE)是MS的動物模型（58)。該模型是基于在小鼠和 大鼠中誘導針對所注射的髓憐脂蛋白質，如含蛋白脂質蛋白、髓憐脂堿性蛋白及髓憐脂少 突神經膠質細胞糖蛋白的自體免疫反應。
[0148] 還可W通過被動轉移髓憐脂抗原特異性T細胞來誘發EAE。使用各種免疫方案，可 W誘導急性和慢性復發性EAE模型。
[0149] 不同趨化因子和趨化因子受體在EAE發病機理中的作用已得到廣泛研究。據報道， CCL1、(XL2、(XL3、(XL4、(XL5、(XL7、CX化 1、CX化9、CX化 10、CX化 11 及CX化 16趨化因子在EAE 模型的CNS中表達。(XL2趨化因子(單核細胞趨化蛋白-1)通過結合到CCR2受體而作用于單 核細胞、活化的T細胞、自然殺傷(NK)細胞及小膠質細胞。CCL2可W由星形細胞、小膠質細 胞、內皮細胞及巨隧細胞產生。有趣的是，CCL2缺陷型小鼠對于EAE的誘發明顯具有抗性，并 且顯示CNS中巨隧細胞募集的顯著減少(59)。此外，CCR2基因敲除小鼠不展現所述疾病的臨 床病征，并且CNS中(XL2趨化因子和CCR2受體上調與EAE復發有關(60-61)。
[0150] 結果還顯示，CCR1基因敲除小鼠會發生所述疾病的衰減形式（62) XCR1配體有 (XL3 (MIPl-a，巨隧細胞炎性蛋白-1)和(XL5 (RANTES，活化時受調節，在正常T細胞中表達和 分泌），運些趨化因子在EAE的CNS病變中表達。已發現，用抗CCL3抗體治療抑制EAE發作并減 少CNS中單核細胞的累積(63)。
[0151] 由于CX化17/CXCR8軸是單核細胞/巨隧細胞的主要趨化作用決定子，故MS的治療 應包括阻斷趨化因子或受體誘導的運些細胞向CNS募集的療法。在本實施例中運一阻斷劑 (括抗劑)是CX化17突變蛋白，它能夠結合CXCR8,但不進行信號傳導。運一點通過其能夠阻 斷由天然（未突變）CXCL17誘導的CXCR8中由CX化17誘導的巧流動而得到證實。還顯示， CXCL17突變蛋白不誘導CXCR8轉染子中的巧流動。小鼠接受髓憐脂堿性蛋白W幫助誘導針 對其的免疫反應并在動物中引發實驗性變應性腦脊髓炎。對照組接受安慰劑，而實驗組接 受CX化17突變蛋白。CX化17突變蛋白的作用是例如通過跟蹤接受安慰劑或CX化17突變蛋白 的小鼠中EAE的進展來評價。將該突變蛋白施用給實驗小鼠使EAE的進展減慢。
[0巧。實施例7:
[0153] 本發明實施方案的另一應用是鑒別括抗CX化17/CXCR8相互作用或模擬CX化17(是 CXCR8的激動劑）的化合物。為此，可能使用如W上描述的化ira等技術針對阻斷CX化17誘導 CXCR8轉染子中巧流動的能力的化合物來篩選化合物文庫。在替代性策略中，可W使用 CXCR8轉染子來鑒別在運些轉染子中誘導巧流動而在對應的未轉染細胞中無誘導作用的化 合物。后一化合物是CXCR8的激動劑。
[0154] 在另一實施方案中，還可W使用本發明來鑒別阻斷CX化17/CXCR8相互作用的抗 體。為此，抗體可W針對配體(CX化17)或針對受體(CXCR8)。然而，可W預測僅一小組針對運 些蛋白質的抗體能夠阻斷CX化17通過CXCR8進行信號傳導的能力。為了鑒別運些阻斷抗體， 可W對其抑制CXCR8轉染子中由CX化17誘導的巧流動的能力進行測試。為此，將CXCR8轉染 子與有待測試的抗體放在一起，接著添加 CX化17W誘導巧流動，運可W通過各種儀器進行 檢測（巧光計、巧光活化細胞分選儀等）。抑制巧流動的那些抗體是阻斷抗體(CX化17/CXCR8 括抗劑）。運些抗體可W由經CX化17或經CXCR8轉染子免疫的動物(小鼠、大鼠、倉鼠、兔)產 生。一旦檢測到滴度，就可W使用脾與骨髓瘤細胞配偶體融合W便產生雜交瘤，或者可W產 生隧菌體展示文庫。任一技術都可W鑒別結合CX化17或CXCR8的抗體并且可W通過抑制巧 流動來測量其阻斷通過CXCR8進行的信號傳導的能力。
[01巧]實施例8
[0156] 對各種趨化受體進行放射性配體置換研究。對于放射性配體結合檢驗，將來自短 暫表達相應趨化因子受體的肥K293T細胞的膜與約50pmoli25I-趨化因子及遞增濃度的趨化 因子(對照物)或CX化17-起解育。細胞在4°C下解育3小時并用含有0.5M化C1的結合緩沖 液洗涂兩次。用溶解緩沖液收集樣品，隨后對殘留的細胞結合的放射活性進行計數。圖9(表 3)中的結果顯示，CX化17不能將各種配體從其相應受體中置換出來(η.d.=無法檢測）。
[0157] 使用化 thHunter?cCR5 或 CXCR2 表達 β-抑制蛋白細胞化 iscoveRx(Fremont，CA))進 行β-抑制蛋白募集檢驗W基于酶補充來監測趨化因子誘導的β-抑制蛋白募集。圖1〇(表4) 中的結果顯示，CX化17對細胞沒有影響。
[015引 實施例9
[0159] 對感染沙口氏菌的小鼠中CXCR8和CX化17的表達進行測定。在實驗結束（1周）時， 收集感染沙口氏菌的野生型巧7BL/6小鼠的小腸。從每個腸提取RNA，利用RT-qPCR進行基因 表達分析。如圖11中所示，感染沙口氏菌的小鼠中CXCR8和CXCL17的表達相較于模擬感染的 小鼠有所升高。運些結果表明，在腸發生炎性病癥時誘導CXCR8和CX化17表達，支持了 CXCR8/CX化17在腸道炎癥中的作用。
[0160] 實施例10
[0161] 在小鼠潰瘍性結腸炎模型中研究CXCR8水平。使用葡聚糖硫酸鋼(DSS)在野生型 (巧7B1/6)小鼠中誘導腸道炎癥作為潰瘍性結腸炎化C)模型。處理7天之后，從DSS處理的小 鼠和模擬處理的小鼠收集結腸進行基因表達分析。如圖12中所示，相較于H20處理的小鼠， 在DSS處理的小鼠中CXCR8的表達升高。運些結果支持了 CXCR8/CX化17軸在腸道炎性疾病的 發病機理中的作用。
[016。 實施例η
[0163] 將CXCR8:CX化17的趨化活性與CCR2:(XL2( -個得到充分表征的確定的巨隧細胞 趨化蛋白軸）的趨化活性相比較。將1 X 1〇~6個THP-1細胞負載于transwell趨化板的頂部小 室中，并且在底部小室中負載lOOng重組人趨化因子。20小時之后，通過對遷移到底部小室 中的細胞計數來測量趨化作用。使用百日咳毒素(PTX)來抑制趨化反應并確定其設及G蛋白 信號傳導。前列腺素-E2(PGE2)增進針對CX化17和CCL2的趨化作用。如圖13中所示，由 CXCR8: CX化17介導的趨化作用與(XL2相當。
[0164] 實施例12
[01化]使用transwell遷移檢驗來分析THP-1細胞對重組人CX化17的趨化反應。單獨測試 細胞，在用前列腺素 E2(PGE2)、百日咳毒素(PTX)預處理24小時之后或在用戊二醒處理之后 ii試細胞。PGE2使THP-1細胞對CX化17的反應性增大。PTX阻斷通過趨化因子受體(Gai G偶 合蛋白受體(GPCR))進行的信號傳導，因此THP-1細胞不能響應于CX化17發揮趨化作用。使 用0.05%戊二醒交聯THP-1細胞的所有膜蛋白，此舉破壞其趨化能力，而不降低細胞活力。 使用(XL2作為陽性對照物。使用200ng/ml趨化因子誘導趨化作用。交聯結果顯示于圖16中。 結果指示，膜蛋白的適度交聯消除了針對CXCL17的趨化作用。
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