CRISPR-Cas9特異性敲除豬SLA-1基因的方法及用于特異性靶向SLA-1基因的sgRNA的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及基因工程技術領域，尤其設及基因敲除技術領域，具體設及 CRISPR-化s9特異性敲除豬SLA-1基因的方法及用于特異性祀向SLA-1基因的sgRNA。
【背景技術】
[0002] 器官移植是治療器官衰竭疾病最有效的治療手段。迄今為止，全球已有近百萬的 患者通過器官移植而延續生命。隨著人口老齡化及醫療技術的進步，需要進行器官移植手 術的病人越來越多，但供體器官的短缺嚴重制約了器官移植手術的開展。W腎臟移植為例， 我國每年需要進行腎移植的患者多達30萬，而可用于移植的捐獻腎臟不超過1萬例，大部 分患者死于腎衰竭。依靠死后器官捐獻已不能滿足器官移植的需要。通過基因工程改造其 他物種，W提供合適于人體移植的器官，成為解決人類供體器官短缺問題的主要途徑。
[0003] 目前，根據生物安全性、生理功能指標、經濟性及稀有物種保護等多方面評價，豬 成為了最為理想的異種器官來源。但豬和人之間存在巨大的差異，直接將豬的器官移植到 人會產生強烈的免疫排斥反應。因此，通過基因工程對豬進行改造，W產生適合于人體移植 的器官，成為異種移植的終極目標。
[0004] 靈長類T細胞能識別豬源的抗原從而引起抗異種的免疫排斥反應。靈長類T細胞 受體與豬細胞表面的白細胞抗原/多膚復合體（SLA/p巧tide complex)相互識別，能夠直 接激活靈長類動物T細胞。在異種移植實驗中，激活靈長類T細胞的主要有兩類供體來源 的細胞類型：一種是遷移性抗原遞呈細胞如樹突狀細胞；另一種是高表達SLA的血管內皮 細胞。表達于豬供體細胞表面的MHC Class I分子能識別并激活CD8T+細胞。MHC-I類分 子是由非共價鍵連接的兩條膚鏈組成的糖蛋白；其中一條稱為重鏈或α鏈，另一條為輕鏈 或稱為6 2微球蛋白（β 2m)。α鏈的分子量為44kd，結構呈多態性。α鏈的膜外區膚段 折疊形成Ξ個功能區，分別稱為α1、α2、和α3區；每個功能區約含90個氨基酸殘基，其 結構與免疫球蛋白（Ig)相似；α 1和α 2區的氨基酸順序變化較大，決定著I類分子的多態 性。β 2m不是Μ肥基因編碼，而是第15號染色體上單個基因編碼的產物，分子量12kd。其 結構與ig恒定區（ch3)有較大同源性，屬于Ig超族成員，沒有同種異型決定簇，但具有種 屬特異性。I類分子的重要生理功能是對CD8+T細胞的抗原識別功能起限制性作用，也就是 參與向CD8+T細胞遞呈抗原的過程。CD8+T細胞只能識別與相同I類分子結合的抗原（多 為內源性的細胞抗原，如病毒感染的細胞和腫瘤細胞等），運種現象稱為MHC限制性。除了 CD8巧細胞W外，NK細胞識別祀細胞發揮殺傷功能時也需要MHC-I類分子的參與。所W如 果敲除MHC-I類分子將能很好的控制NK細胞和CD8+T細胞的細胞殺傷作用，將對異種移植 作出重要貢獻。實現此策略最好的途徑就是構建MHC-I類分子缺失的基因修飾豬。
[0005] 目前，常見的基因敲除技術包括同源重組化omologus Recombination, HR)技術、 類轉錄激活效應子核酸酶（Transcription Activator-Uke Effector Nuclease, TALEN) 技術、鋒指核酸酶狂inc-Finger Nuclease, ZFN)技術W及最近發展的規律成簇間隔短回 文重復（Clustered Regularly Interspaced 化ort Palin化omic R巧eat, CRISPR)技術。 皿技術由于重組效率低下（效率大約只有10 6)，對突變體的篩選工作非常耗時和低效，已 逐漸被取代。TALEN技術和ZFN技術的切割效率一般能達到20%，但都需要構建可W識別 特定序列的蛋白質模塊，前期工作繁瑣費時。ZFN技術的模塊設計較為復雜且有較高的脫祀 率，其應用有限。
[0006] CRISIS是一種源于原核生物的后天免疫系統，該系統執行干擾功能的復合物由蛋 白質Cas和CRISPR-RNA(crRNA)組成。目前該系統已發現有Ξ種類型，其中第二類化s9 系統組成簡單，已被積極應用于基因工程領域。化s9祀向切割DM是通過兩種小RNA-一 crRNA(CRISPR RNA)和 tracrRNA (trans-activating crRNA)與祀序列互補識別的原理實現 的。現在已經將兩種小RNA融合成一條RNA鏈，簡稱sgRNA(single guide RNA)，能夠識別 特定的基因序列，引導化s9蛋白進行切割。在真核生物中，DNA被切斷后發生非同源重組 末端連接，造成移碼突變，最終導致基因功能性敲除。
[0007] 相比于上述3種技術，CRISPR技術操作簡單、篩選效率高，能夠實現精確的祀向切 害d。因此，通過CRISPR技術敲除SLA-1基因能夠極大地提高SLA-1缺失細胞及基因工程豬 的篩選效率。但是該路徑的關鍵技術難題是設計并制備精確祀向的sgRNA，因為基因的祀向 精確度高度依賴于sgRNA祀序列，能否成功設計出精確祀向的sgRNA成為敲除目的基因的 關鍵技術問題，本發明意在解決該技術問題從而為敲除SLA-1基因提供堅實的基礎。

【發明內容】

[000引本發明的目的在于提供CRISPR-化s9特異性敲除豬SLA-1基因的方法及用于特異 性祀向SLA-1基因的SgRNA。
[0009] 根據本發明的第一方面，本發明提供在CRISPR-化s9特異性敲除豬SLA-1基因中 用于特異性祀向SLA-1基因的SgRNA,該SgRNA具有W下特點：
[0010] (1)該SgRNA在SLA-1基因上的祀序列符合5' -N(20)NGG-3'的序列排列規則，其 中N(20)表示20個連續的堿基，其中每個N表示A或T或C或G，符合規則的祀序列可W位 于正義鏈或反義鏈；
[0011] 似該SgRNA在SLA-1基因上的祀序列位于SLA-1基因的N端的4個外顯子編碼 區，或序列的主要部分位于SLA-1基因的N端的4個外顯子，其余部分跨越與相鄰內含子的 交界，位于相鄰內含子；
[001引 （3)該SgRNA在SLA-1基因上的祀序列是唯一的。
[0013] 作為本發明的優選方案，上述祀序列為序列表中SEQ ID NO :1~162中任一條序 列所示的序列。
[0014] 作為本發明的優選方案，上述祀序列為序列表中SEQ ID NO :1或2所示的序列。
[0015] 根據本發明的第二方面，本發明提供CRISPR-化s9特異性敲除豬SLA-1基因的方 法，該方法包括如下步驟：
[0016] (1)在第一方面所述的SgRNA的祀序列的5'-端加上用于形成粘性末端的序列， 合成得到正向寡核巧酸序列；在第一方面所述的SgRNA的祀序列對應的互補序列的兩端加 上合適的用于形成粘性末端的序列，合成得到反向寡核巧酸序列；將合成的正向寡核巧酸 序列與反向寡核巧酸序列退火、復性，形成具有粘性末端的雙鏈寡聚核巧酸；
[0017] (2)將上述雙鏈寡聚核巧酸連入線性化的攜帶化s9基因的表達載體，得到攜帶含 相應祀序列的sgRNA寡聚核巧酸和化s9基因的表達載體，轉化感受態細菌，篩選鑒定出正 確的陽性克隆，并對陽性克隆搖菌、提取質粒；
[001引 做用上述攜帶有sgRNA寡聚核巧酸和化s9基因的表達載體、包裝質粒和包裝細 胞系包裝出同時攜帶祀向SLA-1基因的sgRNA和化s9的假型慢病毒；
[0019] (4)使用上述假型慢病毒感染目的細胞，并進一步培養；然后收集被感染的目的 細胞，W其基因組DNA為模板擴增包含上述祀序列的基因片段，經過變性、復性及酶切，確 定SLA-1基因的獻除情況。
[0020] 作為本發明的優選方案，上述表達載體為序列表中SEQ ID NO : 163所示序列的載 體。
[0021] 作為本發明的優選方案，上述方法包括如下步驟：
[002引 （1)在第一方面所述的sgRNA的祀序列的5'-端加上CACCG序列，合成得到正向 寡核巧酸序列；在第一方面所述的sgRNA的祀序列對應的互補序列的5'-端加上AAAC序 列、3'-端加上C，合成得到反向寡核巧酸序列；將合成的正向寡核巧酸序列與反向寡核巧 酸序列退火、復性，形成具有粘性末端的雙鏈寡聚核巧酸；
[0023] (2)將上述雙鏈寡聚核巧酸連入如序列表中SEQ ID NO : 163所示序列的表達載體 lentiCRISPR v2經BsmB I限制性內切酶酶切得到的線性化載體，得到攜帶SgRNA寡聚核巧 酸的重組表達載體1 entiCRISPR V2-SLA-1，轉化感受態細菌，篩選鑒定出正確的陽性克隆， 并對陽性克隆搖菌、提取質粒；
[0024] (3)用上述表達載體lentiCRISPR V2-SLA-1、包裝質粒和包裝細胞系包裝出同時 攜帶祀向SLA-1基因的SgRNA和化s9的假型慢病毒；
[002引（4)使用上述CRISPR假型慢病毒感染目的細胞，并進一步培養；然后收集被感染 的目的細胞，W其基因組DNA為模板擴增包含上述祀序列的基因片段，經過變性、復性及酶 切，確定SLA-1基因的獻除情況。
[0026] 作為本發明的優選方案，上述包裝質粒為質粒pLPl、質粒pLP2和質粒pLP/VSVG ; 上述包裝細胞系為肥K293T細胞。
[0027] 作為本發明的優選方案，上述目的細胞為豬PIEC細胞。
[002引作為本發明的優選方案，上述W其基因組DNA為模板擴增包含上述祀序列的基因 片段，經過變性、復性及酶切，確定SLA-1基因的敲除情況，具體為：
[0029] (a) W感染病毒的目的細胞的基因組DNA為模板，用