抗人ccr7抗體、雜交瘤、核酸、載體、細胞、醫藥組合物和抗體固定化擔載體的制作方法
【專利摘要】本發明的課題在于提供作為組織的纖維化或癌的治療藥有用的新型的抗人CCR7抗體、以及含有該抗人CCR7抗體的醫藥組合物等。提供一種抗人CCR7抗體，其為與人CCR7的細胞外結構域特異性結合的抗人CCR7抗體，具有包含序列編號7、17、27、37、47、57、67或77所示的氨基酸序列的重鏈CDR3。還提供一種具有包含序列編號5～10、15～20、25～30、35～40、45～50、55～60、65～70或75～80所示的氨基酸序列的重鏈CDR1～3和輕鏈CDR1～3的抗人CCR7抗體。優選具有阻斷通過刺激CCR7配體而產生的CCR7依賴性細胞內信號傳導機制的活性。本發明的抗人CCR7抗體能夠作為組織的纖維化或癌的治療藥的有效成分使用。FERM BP-28 FERM BP-28 FERM BP-28 FERM BP-28 FERM BP-28 FERM BP-28 FERM BP-28 FERM BP-28
【專利說明】抗人CCR7抗體、雜交瘤、核酸、載體、細胞、醫藥組合物和抗體 固定化擔載體
[00011本申請是中國申請號為201180056955.3、發明名稱為"抗人CCR7抗體、雜交瘤、核 酸、載體、細胞、醫藥組合物和抗體固定化擔載體"且申請日為2011年9月27日的專利申請的 分案申請。
技術領域
[0002] 本發明涉及抗人CCR7抗體、雜交瘤、核酸、載體、細胞、醫藥組合物以及抗體固定化 擔載體，更詳細而言涉及與人CCR7的細胞外結構域特異性結合的抗人CCR7抗體、生產該抗 體的雜交瘤、編碼該抗體的重鏈可變區或輕鏈可變區的核酸、具有該核酸的載體、具有該載 體的細胞、包含該抗體的醫藥組合物以及將該抗體固定化得到的抗體固定化擔載體。
【背景技術】
[0003] 趨化因子是調節各種細胞的游走或細胞功能的細胞因子。趨化因子及其受體的功 能異常成為自身免疫性疾病、急性和慢性炎癥、癌這樣的各種疾病的原因。目前為止，進行 了控制趨化因子及其受體的活性的藥劑的開發，并得到臨床應用，但是難以說充分地解決 了問題。
[0004]為了表現特定的趨化因子調節細胞的游走或細胞功能的這樣的活性，需要趨化因 子選擇性地與細胞膜受體結合。已經發現了約20種趨化因子受體，任何一種趨化因子受體 均為與三聚體G蛋白質結合的7次膜貫通型蛋白質(GPCR)。當趨化因子與受體結合時，就使 得三聚體G蛋白質的Ga單位游離。其結果，使細胞內的Ca濃度上升，或者使 phosphatidylinositol 3_kinase(PI3K)(磷脂酰肌醇3激酶）、small Rho GTPases路徑或 其他路徑活化而體現功能。任何一種趨化因子受體都由相對選擇性的趨化因子進行活化， 但蛋白質的一級結構或細胞內的活化結構非常類似。因此，選擇性地阻斷特定的趨化因子 受體的功能并不容易。生理的以及病態的各趨化因子和趨化因子受體的功能表達是通過 各個蛋白質在特定的細胞或組織中在特定的時期(炎癥時)表達來控制的(非專利文獻1)。
[0005] 人CC模體受體7(CC M0TIF，RECEPT0R 7;別名：EBI1、CMKBR7;以下，稱為 "CCR7"。） 最初作為因埃-巴二氏(EPSTEIN-BARR)病毒感染而在淋巴球中選擇性地表達的GPCR而被發 現(非專利文獻2)。其后得知，CCR7是CCL19 (別名：ELC)以及CCL21 (別名：SLC、EXODUS 2)的 選擇性的趨化因子受體。CCR7在生理的條件下，在CD4陽性T細胞(Thl、Th2、Treg細胞）、成熟 樹狀細胞、B細胞這樣的細胞中相對選擇性地表達。已知這樣的細胞經由CCR7被導引至炎癥 部位等的病灶，炎癥反應或免疫反應亢進。另外，CCR7異常活化是造成自身免疫性疾病、急 性以及慢性炎癥后的纖維癥、癌轉移這樣的各種疾病的原因。
[0006] 人CCR7的氨基酸序列和基因的堿基序列已知(例如，GenBank: EAW60669.1)。
[0007] 炎癥是組織對于損傷或感染的防御反應。對各種炎癥刺激進行應答，炎癥性分子 (趨化因子或細胞因子）的表達亢進持續，促進嗜中性粒細胞以及單核細胞的浸潤。進而當 炎癥反應亢進時，T以及B淋巴球流入而疾病狀態轉入慢性。另一方面，在炎癥的消退階段， 發生由過剩的白血球的細胞凋亡或組織巨噬細胞引起的吞噬作用，可見由間質細胞(例如 纖維芽細胞)進行的損傷組織的修復。
[0008] 過剩的間質細胞的分化增殖與各種纖維癥(肝纖維癥、腎纖維癥、肺纖維癥、皮膚 纖維癥、心血管纖維癥、消化管纖維癥以及其他纖維性疾病）的惡化密切相關。慢性肺纖維 癥是引起遍及肺整體的瘢痕形成、預后不良的疾病。具有抗纖維化作用的毗非尼酮 (Pirfenidone)、皮質類固醇(Corticosteroid)類(例如強的松)和/或抑制體內的免疫系統 的其他藥物由于抑制與纖維癥相關的過程而被作為處方。然而，難說如今獲得了充分的治 療效果。
[0009] 另一方面，近年來，炎癥反應后的修復過程中的纖維化的分子結構不斷被解明。在 這樣的修復機構中，局部的休止纖維芽細胞向損傷區域移動，生成細胞外基質蛋白質，促進 創傷的收縮和纖維形成(瘢痕）。另外表明，循環的纖維芽前體細胞、纖維芽細胞(它們存在 于血液中）向創傷或纖維形成的部位移動，在此處它們分化并介導組織的修復或其他的纖 維化反應。
[0010] 血液中纖維芽前體細胞，CD14+末梢血單核細胞前體細胞群在炎癥部位浸潤，局 部分化為間質細胞樣(膠原蛋白I型以及III型與纖維連接蛋白）（非專利文獻3)。這些細胞 分泌炎癥性細胞因子，并且分泌細胞外基質蛋白質、其他細胞因子類，它們能夠引起纖維形 成。只要能夠選擇性地抑制血液中纖維芽前體細胞向炎癥部位的過剩的浸潤，就能夠期待 將纖維化阻止在最小限度，但尚未實現臨床應用。
[0011] 近年來，作為在纖維芽前體細胞中表達的趨化因子受體，上述CCR7備受注目（專利 文獻1)。公開了即使對將CCR7缺損后的基因轉換動物施加使肺纖維癥或腎纖維癥發病那樣 的刺激，纖維癥也不發病（非專利文獻4)。因此，只要能夠用低分子化合物、單克隆抗體、 RNAi等抑制CCR7的功能，就能夠期待抑制各種纖維化。但是，由于趨化因子受體的蛋白質的 一級結構或細胞內的活化結構非常類似，所以希望有能夠進一步選擇性地抑制CCR7的物 質。目前為止進行著抑制CCR7的功能的物質(單克隆抗體或者RNAi)的研究，但還沒有達到 臨床應用的事例。
[0012] 另外另一方面，在癌治療中，原發癌的增殖抑制和伴隨遠端轉移的復發預防很重 要。在以往的外科療法和化學療法的基礎上，利用分子靶向藥物(例如激酶抑制劑)和抗體 醫藥療法，治療效果有所提高。然而，伴隨遠端轉移的復發，癌預后不良，希望開發新的治療 藥物。作為遠端轉移的機理，存在由原發癌經由血管的情況和經由淋巴組織的情況。目前為 止，雖然細胞外基質蛋白質分解酶抑制劑(MMP抑制劑)等作為轉移預防藥得到開發，但還沒 有達到臨床應用的事例。
[0013]通過各種研究表明，CCR7在B細胞慢性淋巴性白血病、非霍奇金淋巴瘤、乳腺癌細 胞、惡性乳房腫瘤等各種腫瘤細胞中表達。另外，解明了 CCR7在胃癌、黑色素瘤、非小細胞肺 癌、T細胞白血病細胞等各種癌的淋巴結轉移中發揮作用(非專利文獻1)。由于作為CCR7的 配體的CCL19以及CCL21在淋巴結中高表達，所以選擇性的CCR7功能抑制能夠期待抑制癌細 胞的淋巴性轉移。
[0014]抗體醫藥對于膜蛋白質（受體）的主要的作用機制一般為在抗體識別表達該蛋白 質的細胞后，基于補體依賴性細胞溶解作用（CDC)以及抗體依賴性細胞介導性細胞毒性 (ADCC)進行除去。然而，CDC或ADCC伴隨巨噬細胞等的炎癥細胞的活化，并不能說作為纖維 癥治療一定適合。因此，在將能夠選擇性地抑制CCR7的單克隆抗體應用于纖維癥治療的情 況下，希望不依賴于CDC和ADCC的功能性抗體。即，希望選擇性地阻斷CCR7的CCL19或者 CCL21依賴性細胞內信號傳導的抗體。但是，一般而言，難以有效地獲得對于GPCR的功能性 抗體。
[0015] 現有技術文獻
[0016] 專利文獻
[0017] 專利文獻1:日本特表號公報 [0018]非專利文獻
[0019] 非專利文獻 1: Viola A，Luster AD"Chemokines and their receptors : drug targets in immunity and inflammation"，Annu Rev Pharmacol Toxicol.2008；48:171-97
[0020] 非專利文獻2 : Birkenbach，M.，Josefsen，K.，Yalamanchi 1 i，R ·，Lenoir，G ·， Kieff，E·，〃Epstein_Barr virus-induced genes :f irst lymphocyte-specif ic G protein-coupled peptide receptors^,J.Virol.67:2209-2220,1993.
[0021] 非專利文獻3:Pilling D,Fan T,Huang D,Kaul B,Gomer RH."Identification of markers that distinguish monocyte-derived f ibrocytes from monocytes, macrophages,and fibroblasts^,PLoS 0ne.20090ct 16；4(10):e7475
[0022] 非專利文獻4:Wada T,Sakai N,Matsushima K,Kaneko S."Fibrocytes:a new insight into kidney fibrosis^,Kidney Int.2007Aug；72(3):269-73.

【發明內容】

[0023] 發明所要解決的問題
[0024] 本發明的目的在于提供作為纖維癥或癌的治療藥有用的新型的抗人CCR7抗體、和 含有該抗人CCR7抗體的醫藥組合物等。
[0025]解決問題的方法
[0026] 用于解決上述問題的本發明的一種方式為一種抗人CCR7抗體，其為與人CCR7的細 胞外結構域特異性結合的抗人CCR7抗體，具有包含序列編號7、序列編號17、序列編號27、序 列編號37、序列編號47、序列編號57、序列編號67或序列編號77所示的氨基酸序列的重鏈互 補決定區3(重鏈CDR3)。
[0027] 用于解決同樣的問題的本發明的另一種方式為一種抗人CCR7抗體，其為與人CCR7 的細胞外結構域特異性結合的抗人CCR7抗體，其互補決定區1~3(CDR1~3)的氨基酸序列 滿足下述(A1)~(A8)中的任意一項：
[0028] (A1)具有包含序列編號5所示的氨基酸序列的重鏈⑶R1、
[0029] 包含序列編號6所示的氨基酸序列的重鏈⑶R2、以及
[0030] 包含序列編號7所示的氨基酸序列的重鏈⑶R3;
[0031] (A2)具有包含序列編號15所示的氨基酸序列的重鏈⑶R1、
[0032] 包含序列編號16所示的氨基酸序列的重鏈⑶R2、以及
[0033] 包含序列編號17所示的氨基酸序列的重鏈⑶R3;
[0034] (A3)具有包含序列編號25所示的氨基酸序列的重鏈⑶R1、
[0035] 包含序列編號26所示的氨基酸序列的重鏈⑶R2、以及
[0036] 包含序列編號27所示的氨基酸序列的重鏈⑶R3;
[0037] (A4)具有包含序列編號35所示的氨基酸序列的重鏈⑶R1、
[0038]包含序列編號36所示的氨基酸序列的重鏈⑶R2、以及
[0039] 包含序列編號37所示的氨基酸序列的重鏈⑶R3;
[0040] (A5)具有包含序列編號45所示的氨基酸序列的重鏈⑶R1、
[0041] 包含序列編號46所示的氨基酸序列的重鏈⑶R2、以及 [0042]包含序列編號47所示的氨基酸序列的重鏈⑶R3;
[0043] (A6)具有包含序列編號55所示的氨基酸序列的重鏈⑶R1、
[0044] 包含序列編號56所示的氨基酸序列的重鏈⑶R2、以及
[0045] 包含序列編號57所示的氨基酸序列的重鏈⑶R3;
[0046] (A7)具有包含序列編號65所示的氨基酸序列的重鏈⑶R1、
[0047]包含序列編號66所示的氨基酸序列的重鏈⑶R2、以及 [0048]包含序列編號67所示的氨基酸序列的重鏈⑶R3;
[0049] (A8)具有包含序列編號75所示的氨基酸序列的重鏈⑶R1、
[0050]包含序列編號76所示的氨基酸序列的重鏈⑶R2、以及 [0051 ]包含序列編號77所示的氨基酸序列的重鏈⑶R3。
[0052]用于解決同樣的問題的本發明的另一種方式為一種抗人CCR7抗體，其為與人CCR7 的細胞外結構域特異性結合的抗人CCR7抗體，其互補決定區1~3(CDR1~3)的氨基酸序列 滿足下述(B1)~(B8)中的任意一項：
[0053] (B1)具有包含序列編號5所示的氨基酸序列的重鏈⑶R1、
[0054] 包含序列編號6所示的氨基酸序列的重鏈⑶R2、
[0055] 包含序列編號7所示的氨基酸序列的重鏈⑶R3、
[0056]包含序列編號8所示的氨基酸序列的輕鏈⑶R1、
[0057]包含序列編號9所示的氨基酸序列的輕鏈⑶R2、以及 [0058]包含序列編號10所示的氨基酸序列的輕鏈⑶R3;
[0059] (B2)具有包含序列編號15所示的氨基酸序列的重鏈⑶R1、
[0060] 包含序列編號16所示的氨基酸序列的重鏈⑶R2、
[0061] 包含序列編號17所示的氨基酸序列的重鏈⑶R3、
[0062]包含序列編號18所示的氨基酸序列的輕鏈⑶R1、
[0063]包含序列編號19所示的氨基酸序列的輕鏈⑶R2、以及 [0064]包含序列編號20所示的氨基酸序列的輕鏈⑶R3;
[0065] (B3)具有包含序列編號25所示的氨基酸序列的重鏈⑶R1、
[0066]包含序列編號26所示的氨基酸序列的重鏈⑶R2、
[0067]包含序列編號27所示的氨基酸序列的重鏈⑶R3、
[0068]包含序列編號28所示的氨基酸序列的輕鏈⑶R1、
[0069] 包含序列編號29所示的氨基酸序列的輕鏈⑶R2、以及
[0070] 包含序列編號30所示的氨基酸序列的輕鏈⑶R3;
[0071] (B4)具有包含序列編號35所示的氨基酸序列的重鏈⑶R1、
[0072] 包含序列編號36所示的氨基酸序列的重鏈⑶R2、
[0073] 包含序列編號37所示的氨基酸序列的重鏈⑶R3、
[0074]包含序列編號38所示的氨基酸序列的輕鏈⑶R1、
[0075]包含序列編號39所示的氨基酸序列的輕鏈⑶R2、以及 [0076]包含序列編號40所示的氨基酸序列的輕鏈⑶R3;
[0077] (B5)具有包含序列編號45所示的氨基酸序列的重鏈⑶R1、
[0078]包含序列編號46所示的氨基酸序列的重鏈⑶R2、
[0079]包含序列編號47所示的氨基酸序列的重鏈⑶R3、
[0080]包含序列編號48所示的氨基酸序列的輕鏈⑶R1、
[0081]包含序列編號49所示的氨基酸序列的輕鏈⑶R2、以及 [0082]包含序列編號50所示的氨基酸序列的輕鏈⑶R3;
[0083] (B6)具有包含序列編號55所示的氨基酸序列的重鏈⑶R1、
[0084]包含序列編號56所示的氨基酸序列的重鏈⑶R2、
[0085]包含序列編號57所示的氨基酸序列的重鏈⑶R3、
[0086]包含序列編號58所示的氨基酸序列的輕鏈⑶R1、
[0087]包含序列編號59所示的氨基酸序列的輕鏈⑶R2、以及 [0088]包含序列編號60所示的氨基酸序列的輕鏈⑶R3;
[0089] (B7)具有包含序列編號65所示的氨基酸序列的重鏈⑶R1、
[0090]包含序列編號66所示的氨基酸序列的重鏈⑶R2、
[0091 ]包含序列編號67所示的氨基酸序列的重鏈⑶R3、
[0092]包含序列編號68所示的氨基酸序列的輕鏈⑶R1、
[0093]包含序列編號69所示的氨基酸序列的輕鏈⑶R2、以及 [0094]包含序列編號70所示的氨基酸序列的輕鏈⑶R3;
[0095] (B8)具有包含序列編號75所示的氨基酸序列的重鏈⑶R1、
[0096]包含序列編號76所示的氨基酸序列的重鏈⑶R2、
[0097]包含序列編號77所示的氨基酸序列的重鏈⑶R3、
[0098]包含序列編號78所示的氨基酸序列的輕鏈⑶R1、
[0099] 包含序列編號79所示的氨基酸序列的輕鏈⑶R2、以及
[0100] 包含序列編號80所示的氨基酸序列的輕鏈⑶R3。
[0101] 用于解決同樣的問題的本發明的另一種方式為一種抗人CCR7抗體，其為與人CCR7 的細胞外結構域特異性結合的抗人CCR7抗體，其重鏈可變區和輕鏈可變區的氨基酸序列滿 足下述(C1)~(C8)中的任意一種：
[0102] (C1)具有包含序列編號2所示的氨基酸序列的重鏈可變區以及包含序列編號4所 示的氨基酸序列的輕鏈可變區；
[0103] (C2)具有包含序列編號12所示的氨基酸序列的重鏈可變區以及包含序列編號14 所示的氨基酸序列的輕鏈可變區；
[0104] (C3)具有包含序列編號22所示的氨基酸序列的重鏈可變區以及包含序列編號24 所示的氨基酸序列的輕鏈可變區；
[0105] (C4)具有包含序列編號32所示的氨基酸序列的重鏈可變區以及包含序列編號34 所示的氨基酸序列的輕鏈可變區；
[0106] (C5)具有包含序列編號42所示的氨基酸序列的重鏈可變區以及包含序列編號44 所示的氨基酸序列的輕鏈可變區；
[0107] (C6)具有包含序列編號52所示的氨基酸序列的重鏈可變區以及包含序列編號54 所示的氨基酸序列的輕鏈可變區；
[0108] (C7)具有包含序列編號62所示的氨基酸序列的重鏈可變區以及包含序列編號64 所示的氨基酸序列的輕鏈可變區；
[0109] (C8)具有包含序列編號72所示的氨基酸序列的重鏈可變區以及包含序列編號74 所示的氨基酸序列的輕鏈可變區。
[0110]優選具有阻斷通過刺激CCR7配體而產生的CCR7依賴性細胞內信號傳導機制的活 性。
[0111] 優選為人源化抗體或嵌合抗體。
[0112] 優選為抗體片段、單鏈抗體或雙抗體。
[0113] 本發明的另一種方式為一種抗人CCR7抗體，其為與人CCR7的細胞外結構域特異性 結合的抗人 CCR7 抗體，?Κ7-01(ΡΕΚΜΒΡ-11369)、Κ7-02(ΡΕΚΜΒΡ-11404)、Κ7-05(ΡΕΚΜΒΡ-11371)、R7-09(FERM BP-11372)、R7-11(FERM BP-11373)、R7-18(FERM BP-11374)、R7-25 (FERM BP-11375)或R7-47(FERM BP-11376)產生。
[0114] 本發明的另一種方式為一種抗人CCR7抗體，其與上述抗人CCR7抗體結合同一的表 位。
[0115] 本發明的又一種方式為一種雜交瘤，其為R7-01(FERM BP-11369)、R7-02(FERM BP-11404)、R7-05(FERMBP-11371)、R7-09(FERMBP-11372)、R7-11(FERMBP-11373)、R7-18(FERM BP-11374)、R7-25(FERM BP-11375)或R7-47(FERM BP-11376)。
[0116] 本發明的又一種方式為一種核酸，其編碼本發明的抗人CCR7抗體的重鏈可變區或 輕鏈可變區。
[0117] 優選具有序列編號1、序列編號3、序列編號11、序列編號13、序列編號21、序列編號 23、序列編號31、序列編號33、序列編號41、序列編號43、序列編號51、序列編號53、序列編號 61、序列編號63、序列編號71或序列編號73所示的堿基序列。
[0118] 本發明的又一種方式為包含上述核酸的載體。
[0119] 本發明的又一種方式為導入有上述載體的細胞。
[0120] 本發明的又一種方式為一種醫藥組合物，包括:上述本發明的抗人CCR7抗體，以及 藥學上可接受的擔載體。
[0121] 優選為阻斷通過CCR7配體的CCR7依賴性細胞內信號傳導機制的醫藥組合物。
[0122] 優選用于治療組織的纖維化。
[0123] 優選上述組織的纖維化為選自肝纖維癥、腎纖維癥、肺纖維癥、皮膚纖維癥、心血 管纖維癥、消化管纖維癥以及其他纖維性疾病中的纖維癥。
[0124] 優選上述肝纖維癥為選自肝硬化、缺血再灌注、肝移植后損傷、壞死性肝炎、乙型 肝炎、丙型肝炎、原發性膽汁性肝硬化以及原發性硬化性膽管炎。
[0125] 優選上述肝硬化是選自由酒精誘發、由藥物誘發以及化學誘發中的至少一種造成 的肝硬化。
[0126] 優選上述腎纖維癥選自增生性腎小球腎炎、硬化性腎小球腎炎、腎源性纖維化性 皮膚病、糖尿病性腎病、腎小管間質性纖維癥以及局灶節段性腎小球硬化癥。
[0127] 優選上述肺纖維癥選自肺間質性纖維癥、藥物誘發結節病、肺纖維癥、特發性肺纖 維癥、哮喘、慢性阻塞性肺病、彌漫性肺泡損傷疾病、肺高血壓癥以及新生兒支氣管肺發育 不良。
[0128] 優選上述皮膚纖維癥選自硬皮病、瘢瘤性疤痕、銀肩病、增生性疤痕以及假性硬皮 病。
[0129] 優選上述心血管纖維癥選自動脈粥樣硬化、冠狀動脈再狹窄、充血性心肌病、心臟 衰竭、心臟移植以及心肌纖維癥。
[0130]優選上述消化管纖維癥選自膠原性結腸炎、絨毛萎縮、隱窩增生、息肉形成、克羅 恩病的纖維癥、胃潰瘍愈合以及腹腔粘連術后瘢痕。
[0131] 優選上述纖維癥具有從與骨關聯的纖維化性疾病產生的狀態，為類風濕性血管翳 形成。
[0132] 優選用于治療癌的轉移。
[0133] 優選上述癌選自咽癌、軟骨肉瘤、大腸癌、胰腺癌、白血病、乳腺癌。
[0134] 本發明的又一種方式是通過將上述的本發明的抗人CCR7抗體固定于擔載體而形 成的抗體固定化擔載體。
[0135] 優選用于與含有CCR7表達細胞的血液接觸，從而從上述體液中除去CCR7表達細 胞。
[0136] 發明的效果
[0137] 根據本發明的抗人CCR7抗體，能夠提供對于難以治療的纖維癥或淋巴性癌轉移等 的新型醫藥品。
[0138] 關于本發明的雜交瘤也同樣，能夠制造作為對于難以治療的纖維癥或淋巴性癌轉 移等的新型醫藥品的有效成分的抗人CCR7抗體。
[0139] 根據本發明的核酸，能夠利用重組技術生產本發明的抗體。另外，也能夠應用于 基因治療。
[0140] 關于本發明的載體也同樣，能夠利用重組技術生產本發明的抗體。另外，也能夠應 用于基因治療。
[0141] 關于本發明的細胞也同樣，能夠利用重組技術生產本發明的抗體。
[0142] 根據本發明的醫藥組合物，能夠提供對于難以治療的纖維癥或淋巴性癌轉移等的 新型醫藥品。
[0143] 根據本發明的抗體固定化擔載體，能夠從患有纖維癥或癌等的患者的血液中，選 擇性地除去CCR7表達細胞。
【附圖說明】
[0144] 圖1是表示R7-01的可變區的氨基酸序列和⑶R1~3的位置的說明圖，（a)表示重鏈 可變區，（b)表示輕鏈可變區。
[0145] 圖2是表示R7-02的可變區的氨基酸序列和⑶R1~3的位置的說明圖，（a)表示重鏈 可變區，（b)表示輕鏈可變區。
[0146] 圖3是表示R7-05的可變區的氨基酸序列和⑶R1~3的位置的說明圖，（a)表示重鏈 可變區，（b)表示輕鏈可變區。
[0147] 圖4是表示R7-09的可變區的氨基酸序列和⑶R1~3的位置的說明圖，（a)表示重鏈 可變區，（b)表示輕鏈可變區。
[0148] 圖5是表示R7-11的可變區的氨基酸序列和⑶R1~3的位置的說明圖，（a)表示重鏈 可變區，（b)表示輕鏈可變區。
[0149] 圖6是表示R7-18的可變區的氨基酸序列和⑶R1~3的位置的說明圖，（a)表示重鏈 可變區，（b)表示輕鏈可變區。
[0150] 圖7是表示R7-25的可變區的氨基酸序列和⑶R1~3的位置的說明圖，（a)表示重鏈 可變區，（b)表示輕鏈可變區。
[0151] 圖8是表示R7-47的可變區的氨基酸序列和⑶R1~3的位置的說明圖，（a)表示重鏈 可變區，（b)表示輕鏈可變區。
[0152] 圖9是表示導入了人CCR7基因的細胞與小鼠對照I gG的相互作用的解析結果的柱 狀圖。
[0153] 圖10是表示導入了人CCR7基因的細胞與抗人CCR7抗體R7-47的相互作用的解析結 果的柱狀圖。
[0154] 圖11是表示細胞內Ca2+濃度和各添加物的濃度的關系的曲線圖。
[0155] 圖12(a)是表示由同種型對照抗體和FITC標記抗小鼠 IgG抗體染色的結果的柱狀 圖；（b)是表示由R7-47和FITC標記抗小鼠 IgG抗體染色的結果的柱狀圖。
[0156] 圖13是表示對誘發了肺纖維癥的小鼠給藥抗人CCR7抗體R7-11、R7-18或R7-47的 實驗的結果的曲線圖。
[0157] 圖14(a)是表示CH0-K1細胞與來自雜交瘤R7-02的重組型抗人CCR7抗體的相互作 用的解析結果的二維點陣圖和柱狀圖；（b)是表示導入了人CCR7基因的細胞與來自雜交瘤 R7-02的重組型抗人CCR7抗體的相互作用的解析結果的二維點陣圖和柱狀圖。
[0158] 圖15(a)是表示CH0-K1細胞與來自雜交瘤R7-11的重組型抗人CCR7抗體的相互作 用的解析結果的二維點陣圖和柱狀圖；（b)是表示導入了人CCR7基因的細胞與來自雜交瘤 R7-11的重組型抗人CCR7抗體的相互作用的解析結果的二維點陣圖和柱狀圖。
[0159] 圖16(a)是表示CH0-K1細胞與來自雜交瘤R7-18的重組型抗人CCR7抗體的相互作 用的解析結果的二維點陣圖和柱狀圖；（b)是表示導入了人CCR7基因的細胞與來自雜交瘤 R7-18的重組型抗人CCR7抗體的相互作用的解析結果的二維點陣圖和柱狀圖。
【具體實施方式】
[0160] 首先，對于本發明的抗體所特異性地識別的人CCR7,以其結構為中心進行說明。如 上所述，CCR7為G蛋白偶聯受體(GPCR)的一種，貫穿細胞膜7次，其N末端存在于細胞外，C末 端向著細胞內存在。編碼人CCR7的基因（cDNA)已經被分離，人CCR7的氨基酸序列也已經已 知。該序列信息，例如能夠從GenBank等的數據庫中獲取(例如，GenBank: EAW60669.1)。作為 其一例，序列編號81中表不了人CCR7基因的喊基序列和與該喊基序列對應的氣基酸序列， 在序列編號82中僅表示氨基酸序列。
[0161] 人CCR7的各結構域可以認為相當于序列編號82所示的氨基酸序列中的以下的部 分。左側為氨基酸編號，右側為各結構域。其中，關于各結構域間的邊界，多少會產生偏差。
[0162] 1~24:膜易位信號肽序列(表達后被切斷、除去）
[0163] 25~59: N末端結構域
[0164] 87~95:細胞內第1環結構域
[0165] 117~130:細胞外第1環結構域
[0166] 153~170:細胞內第2環結構域
[0167] 192~219:細胞外第2環結構域
[0168] 248~263:細胞內第3環結構域
[0169] 290~313:細胞外第3環結構域
[0170] 332~378: C末端結構域
[0171]人CCR7除序列編號82所示的以外還已知氨基酸置換體等的各種變體。本發明的 "人CCR7"中，只要具有細胞外結構域且具有作為CCR7的功能，就包含上述變體。
[0172] 本發明的抗人CCR7抗體（以下，有時簡稱為"本發明的抗體"。）為與人CCR7的細胞 外結構域特異性地結合的抗體。在1種方式(第一方式）中，本發明的抗體具有包含序列編號 7、序列編號17、序列編號27、序列編號37、序列編號47、序列編號57、序列編號67或序列編號 77所示的氨基酸序列的重鏈互補決定區3(重鏈CDR3)。
[0173] 另外，在其他方式（第二方式）中，就本發明的抗體而言，關于其互補決定區1~3 (⑶R1~3)的氨基酸序列，滿足下述(A1)~(A8)中的任意一種。
[0174] (A1)具有包含序列編號5所示的氨基酸序列的重鏈⑶R1、
[0175] 包含序列編號6所示的氨基酸序列的重鏈⑶R2、以及
[0176] 包含序列編號7所示的氨基酸序列的重鏈⑶R3;
[0177] (A2)具有包含序列編號15所示的氨基酸序列的重鏈⑶R1、
[0178] 包含序列編號16所示的氨基酸序列的重鏈⑶R2、以及
[0179] 包含序列編號17所示的氨基酸序列的重鏈⑶R3;
[0180] (A3)具有包含序列編號25所示的氨基酸序列的重鏈⑶R1、
[0181] 包含序列編號26所示的氨基酸序列的重鏈⑶R2、以及
[0182] 包含序列編號27所示的氨基酸序列的重鏈⑶R3;
[0183] (A4)具有包含序列編號35所示的氨基酸序列的重鏈⑶R1、
[0184] 包含序列編號36所示的氨基酸序列的重鏈⑶R2、以及
[0185] 包含序列編號37所示的氨基酸序列的重鏈⑶R3;
[0186] (A5)具有包含序列編號45所示的氨基酸序列的重鏈⑶R1、
[0187] 包含序列編號46所示的氨基酸序列的重鏈⑶R2、以及
[0188] 包含序列編號47所示的氨基酸序列的重鏈⑶R3;
[0189] (A6)具有包含序列編號55所示的氨基酸序列的重鏈⑶R1、
[0190] 包含序列編號56所示的氨基酸序列的重鏈⑶R2、以及
[0191] 包含序列編號57所示的氨基酸序列的重鏈⑶R3;
[0192] (A7)具有包含序列編號65所示的氨基酸序列的重鏈⑶R1、
[0193] 包含序列編號66所示的氨基酸序列的重鏈⑶R2、以及
[0194] 包含序列編號67所示的氨基酸序列的重鏈⑶R3;
[0195] (A8)具有包含序列編號75所示的氨基酸序列的重鏈⑶Rl、
[0196] 包含序列編號76所示的氨基酸序列的重鏈⑶R2、以及
[0197] 包含序列編號77所示的氨基酸序列的重鏈⑶R3。
[0198] 另外，在其他方式（第三方式）中，就本發明的抗體而言，關于其互補決定區1~3 (⑶R1~3)的氨基酸序列，滿足下述(B1)~(B8)中的任意一種。
[0199] (B1)具有包含序列編號5所示的氨基酸序列的重鏈⑶R1、
[0200] 包含序列編號6所示的氨基酸序列的重鏈⑶R2、
[0201 ]包含序列編號7所示的氨基酸序列的重鏈⑶R3、
[0202] 包含序列編號8所示的氨基酸序列的輕鏈⑶R1、
[0203] 包含序列編號9所示的氨基酸序列的輕鏈⑶R2、以及
[0204] 包含序列編號10所示的氨基酸序列的輕鏈⑶R3;
[0205] (B2)具有包含序列編號15所示的氨基酸序列的重鏈⑶R1、
[0206] 包含序列編號16所示的氨基酸序列的重鏈⑶R2、
[0207] 包含序列編號17所示的氨基酸序列的重鏈⑶R3、
[0208] 包含序列編號18所示的氨基酸序列的輕鏈⑶R1、
[0209] 包含序列編號19所示的氨基酸序列的輕鏈⑶R2、以及
[0210] 包含序列編號20所示的氨基酸序列的輕鏈⑶R3;
[0211] (B3)具有包含序列編號25所示的氨基酸序列的重鏈⑶R1、
[0212] 包含序列編號26所示的氨基酸序列的重鏈⑶R2、
[0213] 包含序列編號27所示的氨基酸序列的重鏈⑶R3、
[0214]包含序列編號28所示的氨基酸序列的輕鏈⑶R1、
[0215] 包含序列編號29所示的氨基酸序列的輕鏈⑶R2、以及
[0216] 包含序列編號30所示的氨基酸序列的輕鏈⑶R3;
[0217] (B4)具有包含序列編號35所示的氨基酸序列的重鏈⑶R1、
[0218] 包含序列編號36所示的氨基酸序列的重鏈⑶R2、
[0219] 包含序列編號37所示的氨基酸序列的重鏈⑶R3、
[0220]包含序列編號38所示的氨基酸序列的輕鏈⑶R1、
[0221] 包含序列編號39所示的氨基酸序列的輕鏈⑶R2、以及
[0222] 包含序列編號40所示的氨基酸序列的輕鏈⑶R3;
[0223] (B5)具有包含序列編號45所示的氨基酸序列的重鏈⑶R1、
[0224] 包含序列編號46所示的氨基酸序列的重鏈⑶R2、
[0225] 包含序列編號47所示的氨基酸序列的重鏈⑶R3、
[0226]包含序列編號48所示的氨基酸序列的輕鏈⑶R1、
[0227] 包含序列編號49所示的氨基酸序列的輕鏈⑶R2、以及
[0228] 包含序列編號50所示的氨基酸序列的輕鏈⑶R3;
[0229] (B6)具有包含序列編號55所示的氨基酸序列的重鏈⑶R1、
[0230]包含序列編號56所示的氨基酸序列的重鏈⑶R2、
[0231 ]包含序列編號57所示的氨基酸序列的重鏈⑶R3、
[0232]包含序列編號58所示的氨基酸序列的輕鏈⑶R1、
[0233] 包含序列編號59所示的氨基酸序列的輕鏈⑶R2、以及
[0234] 包含序列編號60所示的氨基酸序列的輕鏈⑶R3;
[0235] (B7)具有包含序列編號65所示的氨基酸序列的重鏈⑶R1、
[0236] 包含序列編號66所示的氨基酸序列的重鏈⑶R2、
[0237] 包含序列編號67所示的氨基酸序列的重鏈⑶R3、
[0238] 包含序列編號68所示的氨基酸序列的輕鏈⑶R1、
[0239] 包含序列編號69所示的氨基酸序列的輕鏈⑶R2、以及 [0240]包含序列編號70所示的氨基酸序列的輕鏈⑶R3;
[0241] (B8)具有包含序列編號75所示的氨基酸序列的重鏈⑶R1、
[0242] 包含序列編號76所示的氨基酸序列的重鏈⑶R2、
[0243] 包含序列編號77所示的氨基酸序列的重鏈⑶R3、
[0244] 包含序列編號78所示的氨基酸序列的輕鏈⑶R1、
[0245] 包含序列編號79所示的氨基酸序列的輕鏈⑶R2、以及
[0246] 包含序列編號80所示的氨基酸序列的輕鏈⑶R3。
[0247] 另外，在其他方式(第四方式）中，本發明的抗體，其重鏈可變區（以下，有時簡單記 為"VH"。）和輕鏈可變區（以下，有時簡單記為"VL"。）的氨基酸序列滿足以下(C1)~(C8)中 的任意一種。
[0248] (C1)具有包含序列編號2所示的氨基酸序列的重鏈可變區以及包含序列編號4所 示的氨基酸序列的輕鏈可變區；
[0249] (C2)具有包含序列編號12所示的氨基酸序列的重鏈可變區以及包含序列編號14 所示的氨基酸序列的輕鏈可變區；
[0250] (C3)具有包含序列編號22所示的氨基酸序列的重鏈可變區以及包含序列編號24 所示的氨基酸序列的輕鏈可變區；
[0251] (C4)具有包含序列編號32所示的氨基酸序列的重鏈可變區以及包含序列編號34 所示的氨基酸序列的輕鏈可變區；
[0252] (C5)具有包含序列編號42所示的氨基酸序列的重鏈可變區以及包含序列編號44 所示的氨基酸序列的輕鏈可變區；
[0253] (C6)具有包含序列編號52所示的氨基酸序列的重鏈可變區以及包含序列編號54 所示的氨基酸序列的輕鏈可變區；
[0254] (C7)具有包含序列編號62所示的氨基酸序列的重鏈可變區以及包含序列編號64 所示的氨基酸序列的輕鏈可變區；
[0255] (C8)具有包含序列編號72所示的氨基酸序列的重鏈可變區以及包含序列編號74 所示的氨基酸序列的輕鏈可變區。
[0256] 序列編號5(重鏈⑶R1)、序列編號6(重鏈⑶R2)、序列編號7(重鏈⑶R3)分別相當于 序列編號2(VH)的氨基酸編號27~35、50~66、97~112的部分（圖1(a))。
[0257] 序列編號8(輕鏈⑶R1)、序列編號9(輕鏈⑶R2)、序列編號10(輕鏈⑶R3)分別相當 于序列編號4(VL)的氨基酸編號24~39、55~68、94~102的部分（圖1(b))。
[0258] 序列編號15(重鏈⑶R1)、序列編號16(重鏈⑶R2)、序列編號17(重鏈⑶R3)分別相 當于序列編號12(VH)的氨基酸編號43~51、66~82、113~124的部分（圖2( &))。
[0259] 序列編號18(輕鏈⑶R1)、序列編號19(輕鏈⑶R2)、序列編號20(輕鏈⑶R3)分別相 當于序列編號14(VL)的氨基酸編號24~37、53~59、87~99的部分（圖2(b))。
[0260] 序列編號25(重鏈⑶R1)、序列編號26(重鏈⑶R2)、序列編號27(重鏈⑶R3)分別相 當于序列編號22(VH)的氨基酸編號30~38、53~68、100~111的部分（圖3(a))。
[0261] 序列編號28(輕鏈⑶R1)、序列編號29(輕鏈⑶R2)、序列編號30(輕鏈⑶R3)分別相 當于序列編號24(VL)的氨基酸編號23~36、52~58、91~99的部分（圖3(b))。
[0262] 序列編號35(重鏈⑶R1)、序列編號36(重鏈⑶R2)、序列編號37(重鏈⑶R3)分別相 當于序列編號32(VH)的氨基酸編號28~36、51~67、98~109的部分（圖4(a))。
[0263] 序列編號38(輕鏈⑶R1)、序列編號39(輕鏈⑶R2)、序列編號40(輕鏈⑶R3)分別相 當于序列編號34(VL)的氨基酸編號23~36、52~58、91~99的部分（圖4(b))。
[0264] 序列編號45(重鏈⑶R1)、序列編號46(重鏈⑶R2)、序列編號47(重鏈⑶R3)分別相 當于序列編號42(VH)的氨基酸編號29~37、52~68、98~110的部分（圖5(a))。
[0265] 序列編號48(輕鏈⑶R1)、序列編號49(輕鏈⑶R2)、序列編號50(輕鏈⑶R3)分別相 當于序列編號44(VL)的氨基酸編號24~39、55~61、94~102的部分（圖5(b))。
[0266] 序列編號55(重鏈⑶R1)、序列編號56(重鏈⑶R2)、序列編號57(重鏈⑶R3)分別相 當于序列編號52(VH)的氨基酸編號30~37、53~69、99~111的部分（圖6(a))。
[0267] 序列編號58(輕鏈⑶R1)、序列編號59(輕鏈⑶R2)、序列編號60(輕鏈⑶R3)分別相 當于序列編號54(VL)的氨基酸編號24~39、55~61、94~102的部分（圖6(b))。
[0268] 序列編號65(重鏈CDR1)、序列編號66(重鏈CDR2)、序列編號67(重鏈CDR3)分別相 當于序列編號62(VH)的氨基酸編號30~41、54~69、100~111的部分（圖7( &))。
[0269] 序列編號68(輕鏈⑶R1)、序列編號69(輕鏈⑶R2)、序列編號70(輕鏈⑶R3)分別相 當于序列編號64(VL)的氨基酸編號24~39、56~62、95~102的部分（圖7(b))。
[0270] 序列編號75(重鏈⑶R1)、序列編號76(重鏈⑶R2)、序列編號77(重鏈⑶R3)分別相 當于序列編號72(VH)的氨基酸編號27~35、50~66、96~109的部分（圖8(a))。
[0271] 序列編號78(輕鏈⑶R1)、序列編號79(輕鏈⑶R2)、序列編號80(輕鏈⑶R3)分別相 當于序列編號74(VL)的氨基酸編號24~39、55~61、94~102的部分（圖8(b))。
[0272]本發明中"抗體"這一用語能夠與"免疫球蛋白"互換。
[0273] 本發明的抗體中包含其功能性片段。其中，"抗體的功能性片段"是指抗體（即免疫 球蛋白）的部分片段，且至少保持1種對于抗原的作用的片段。作為上述部分片段的例子，可 以列舉F (ab '）2、Fab、Fv、二硫鍵Fv、單鏈抗體(scFv、VH-VL)、VH和它們的聚合體、以及它們 與重鏈CH3區域的融合體。另外，可以列舉⑶Rl、CDR2、roR3等各⑶R和這些⑶R的連接體、以 及這些⑶R或⑶R連接體與重鏈CH3區域的融合體。即，本發明的抗體中，只要與人CCR7的細 胞外結構域特異性地結合，就包含上述那樣的抗體的部分片段。有時也將抗體的部分片段 稱為"抗體片段"。
[0274] 另外本發明的抗體也可以為多特異性抗體。作為例子，可以列舉作為雙特異性抗 體的一種的雙抗體(Diabody)(國際公開第93/11161號小冊子等）。
[0275] 在本發明的抗體為功能性片段的情況下，例如，具有以下的效果。即，在將本發明 的抗人CCR7抗體應用于后述那樣的醫藥品時，若使用IgG型等的全長的抗體，則除了抑制靶 標受體的信號，還會對靶標組織引起障礙，這有時會導致副作用。在這樣的情況下，當采用 僅使用可變區的"抗體的功能性片段"時，就容易避免上述那樣的副作用。
[0276] 對于本發明的抗體的類型（同種型）沒有特別限定。例如可以為IgG、IgM、IgA、IgD、 IgE等的任意類型。另外，對于本發明的抗體的亞型也沒有特別限定，例如，只要為IgG，可以 為IgGl、IgG2、IgG3等的任意亞型。
[0277] 在優選實施方式中，具有阻斷通過CCR7配體刺激的CCR7依賴性細胞內信號傳導機 制的活性。
[0278] 本發明的抗體的又一種方式(第五方式)為由R7-01(FERM BP-11369)、R7-02(FERM BP-11404)、R7-05(FERMBP-11371)、R7-09(FERMBP-11372)、R7-11(FERMBP-11373)、R7-18(FERM BP-11374)、R7-25(FERM BP-11375)或R7-47(FERM BP-11376)產生的抗人CCR7抗 體。這8種雜交瘤產生的抗體為與人CCR7的細胞外結構域特異性地結合的抗體。
[0279] 如后述的實施例中詳細說明的那樣，由這些雜交瘤產生的8種抗體分別具有包括 上述的特定的氨基酸序列的重鏈可變區（VH)、輕鏈可變區（VL)以及各CDR。表1中匯總了 VH、VL、各CDR的氨基酸序列的序列編號和對應的克隆的關系。
[0280] 表 1
[0282] 產生本發明的抗體的上述8種雜交瘤，保藏于獨立行政法人產業技術綜合研究所 專利生物保藏中心（IP0D，地址：日本國茨城縣筑波市東1 丁目1番地1中央第6)。保藏的詳 細內容如下。
[0283] 分類命名：雜交瘤R7-01
[0284] 保藏編號：FERM BP-11369
[0285] 保藏日：2010年7月28日（平成22年7月28日）
[0286] (從2010年7月28日所保藏的FERM-21988移管）
[0287] 分類命名：雜交瘤R7-02
[0288] 保藏編號:FERM BP-11404
[0289] 保藏日：2010年7月28日（平成22年7月28日）
[0290] (從2010年7月28日所保藏的FERM-21989移管）
[0291] 分類命名:雜交瘤R7-05
[0292] 保藏編號:FERM BP-11371
[0293] 保藏日：2010年7月28日（平成22年7月28日）
[0294] (從2010年7月28日所保藏的FERM-21990移管）
[0295] 分類命名：雜交瘤R7-09
[0296] 保藏編號:FERM BP-11372
[0297] 保藏日：2010年7月28日（平成22年7月28日）
[0298] (從2010年7月28日所保藏的FERM-21991移管）
[0299] 分類命名：雜交瘤R7-11
[0300] 保藏編號:FERM BP-11373
[0301] 保藏日：2010年7月28日（平成22年7月28日）
[0302](從2010年7月28日所保藏的FERM-21992移管）
[0303] 分類命名：雜交瘤R7-18
[0304] 保藏編號:FERM BP-11374
[0305] 保藏日：2010年7月28日（平成22年7月28日）
[0306](從2010年7月28日所保藏的FERM-21993移管）
[0307] 分類命名：雜交瘤R7-25
[0308] 保藏編號：FERM BP-11375
[0309] 保藏日：2010年7月28日（平成22年7月28日）
[0310](從2〇10年7月28日所保藏的FERM- 21"4移管）
[0311] 分類命名：雜交瘤R7-47
[0312] 保藏編號:FERM BP-11376
[0313] 保藏日：2010年7月28日（平成22年7月28日）
[0314](從2〇10年7月28日所保藏的FERM- 21"5移管）
[0315]本發明的抗體特異性地結合的人CCR7的細胞外結構域可以為N末端結構域、細胞 外第1環結構域、細胞外第2環結構域、細胞外第3環結構域中的任意結構域。另外本發明的 抗體可以僅與這些細胞外結構域中的任意一種，也可以與2種以上結合。
[0316]本發明的抗體中還包括與上述的第一至第五方式所涉及的抗人CCR7抗體結合同 一的表位的抗人CCR7抗體。換而言之，還包括具有與上述的第一至第五方式所涉及的抗人 CCR7抗體的CDR "功能性同等"的CDR的抗人CCR7抗體。例如，利用了使用人CCR7的部分肽等 的表位作圖法解析后述的實施例中具體所示的8種抗人CCR7抗體的表位。并且，使用包含所 鑒定的表位的合成肽作為抗原，能夠得到與上述8種抗人CCR7抗體結合同一的表位的抗人 CCR7抗體。另外，能夠確定所得到的抗人CCR7抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區的氨基酸序 列，決定重鏈⑶R1~3和輕鏈⑶R1~3的氨基酸序列。
[0317]此外，作為該抗人CCR7抗體中的"功能性同等"的CDR的氨基酸序列的例子，可以列 舉在原始的氨基酸序列（序列編號5~10、15~20、25~30、35~40、45~50、55~60、65~70、 75~80)中缺失、取代或添加有1或數個、優選1~5個、更優選1~3個、更加優選1個氨基酸且 具有作為CDR的同等功能的氨基酸序列。作為另一個例子，可以列舉與上述原始的氨基酸序 列的同源性為80%以上、優選為90%以上、更優選為95%以上且具有作為⑶R的同等功能的 氨基酸序列。
[0318] 作為對于2個抗體調查表位是否相同的方法，可以列舉利用競爭性試驗的方法。例 如，作為第一抗體的上述8種抗人CCR7抗體與受體的結合在受到來自作為試驗對象的第二 抗體的競爭性抑制時，該第二抗體可以說是與上述第一抗體結合相同的表位的抗體。
[0319] 本發明的核酸是編碼本發明的抗體的重鏈可變區(VH)或輕鏈可變區(VL)的核酸。 即，編碼第一方式涉及的具有包含序列編號7、序列編號17、序列編號27、序列編號37、序列 編號47、序列編號57、序列編號67或序列編號77所示的氨基酸序列的重鏈CDR3的抗人CCR7 抗體的VH或VL的核酸包括在本發明的核酸中。另外，編碼第二方式涉及的滿足上述（A1)~ (A8)中的任意一種的VH或VL的核酸包括在本發明的核酸中。另外，編碼第三方式涉及的滿 足上述(B1)~(B8)中的任意一種的VH或VL的核酸包括在本發明的核酸中。另外，編碼第四 方式涉及的滿足上述(C1)~(C8)中的任意一種的VH或VL的核酸包括在本發明的核酸中。作 為這些核酸的具體例，可以列舉具有序列編號1、序列編號3、序列編號11、序列編號13、序列 編號21、序列編號23、序列編號31、序列編號33、序列編號41、序列編號43、序列編號51、序列 編號53、序列編號61、序列編號63、序列編號71或序列編號73所示的堿基序列的核酸。
[0320] 本發明的核酸也能夠使用PCR等從上述8種雜交瘤中取得。
[0321] 本發明的載體是包含本發明的核酸的載體。作為載體的種類沒有特別限定，根據 之后導入的宿主細胞的種類等適當選擇即可。另外，本發明的載體中包含基因治療用載體。 此時，可以將載體本身直接給藥至生物體內。
[0322] 本發明的細胞是導入有本發明的載體的細胞。作為細胞的種類，只要是所導入的 載體發揮功能的細胞就沒有特別限定。作為例子，可以列舉動物細胞（C0S細胞、CH0細胞 等）、酵母、細菌(大腸桿菌等）、植物細胞、昆蟲細胞等。
[0323] 本發明的抗體，例如能夠如下來制造。
[0324](利用雜交瘤的生產）
[0325] 能夠培養上述8種中的任意雜交瘤，從該培養物中生產本發明的抗體。作為培養的 方法，能夠直接適用作為雜交瘤的培養方法被通常所采用的方法。例如，能夠使用DMEM或 RPMI1640這樣的動物細胞用的培養基培養雜交瘤，從其培養上清中獲得本發明的抗體。在 動物的腹腔內培養雜交瘤時，能夠采取腹水，從該腹水中得到本發明的抗體。
[0326] (利用基因重組技術的生產）
[0327] 本發明的抗體也能夠使用基因重組的方法生產。特別在生產嵌合型抗體、人源化 抗體、抗體的功能性片段等的情況下，一般利用基因重組的方法生產。
[0328] 首先，關于生產第四方式所涉及的具有滿足上述(C1)~(C8)中的任意一種的重鏈 可變區和輕鏈可變區的抗體的方法，以嵌合型抗體的生產為例進行說明。其中"嵌合型抗 體"是指重鏈可變區（VH)和輕鏈可變區（VL)來自人以外的動物，且重鏈恒定區（CH)或輕鏈 恒定區(CL)等的其他區域來自人的抗體。
[0329]首先，制備編碼序列編號2、序列編號12、序列編號22、序列編號32、序列編號42、序 列編號52、序列編號62或序列編號72所示的氨基酸序列(VH)的DNA。同樣制備編碼序列編號 4、序列編號14、序列編號24、序列編號34、序列編號44、序列編號54、序列編號64或序列編號 74所示的氨基酸序列(VL)的DNA。作為這些DNA，例示了序列編號1、序列編號3、序列編號11、 序列編號13、序列編號21、序列編號23、序列編號31、序列編號33、序列編號41、序列編號43、 序列編號51、序列編號53、序列編號61、序列編號63、序列編號71或序列編號73所示的DNA， 但也可以為其他堿基序列。DNA的制備能夠使用PCR等公知的方法進行。也能夠利用化學合 成制備該DNA。
[0330]將編碼所得到的VH或VL的DNA分別插入具有編碼人抗體的CH或CL的序列的載體， 構建嵌合型抗體表達載體。其中，具有編碼人抗體的CH或CL的序列的載體能夠從市場獲得。 通過將構建的表達載體導入宿主細胞，得到表達嵌合型抗體的重組細胞。然后，培養該重組 細胞，從該培養物獲得所期望的嵌合型抗體。
[0331]作為上述宿主細胞，只要是表達載體能夠發揮功能的細胞就沒有特別限定。能夠 適當采用上述那樣的動物細胞(C0S細胞、CH0細胞等）、酵母、細菌(大腸桿菌等）、植物細胞、 昆蟲細胞等。
[0332]接著，對于生產第三方式涉及的具有滿足上述(B1)~(B8)中的任意一種的特定的 CDR的抗體的方法，以人源化抗體的生產為例進行說明。其中，人源化抗體是指CDR來自人以 外的動物且其他區域(框架區或恒定區等)來自人的抗體。
[0333] 首先，作為編碼重鏈⑶R1~3以及輕鏈⑶R1~3的DNA，制備編碼序列編號5~10、序 列編號15~20、序列編號25~30、序列編號35~40、序列編號45~50、序列編號55~60、序列 編號65~70或序列編號75~80所示的氨基酸序列的各DNA。作為該DNA，可以例示序列編號 1、序列編號3、序列編號11、序列編號13、序列編號21、序列編號23、序列編號31、序列編號 33、序列編號41、序列編號43、序列編號51、序列編號53、序列編號61、序列編號63、序列編號 71或序列編號73所示的堿基序列中相當于各CDR的部分的序列，但也可以為其他堿基序列。 DNA的制備能夠使用PCR等公知的方法進行。也能夠利用化學合成制備該DNA。
[0334] 接著，使用這些DNA，制作編碼在任意的人抗體的VH的框架區（FR)中移植有重鏈 CDR1~3的可變區的DNA。同樣制作編碼在任意的人抗體的VL的FR中移植有輕鏈CDR1~3的 可變區的DNA。將所制作的各DNA插入具有編碼人抗體的CH或CL的序列的載體，構建人源化 抗體表達載體。通過將構建的表達載體導入宿主細胞，得到表達人源化抗體的重組細胞。然 后，培養該重組細胞，從該培養物中取得所期望的人源化抗體。
[0335] 對于第二方式涉及的具有滿足上述(A1)~(A8)中的任意一種的特定的⑶R的抗 體，也能夠由同樣的程序生產。
[0336] 對于第一方式涉及的具有包含序列編號7、序列編號17、序列編號27、序列編號37、 序列編號47、序列編號57、序列編號67或序列編號77所示的氨基酸序列的重鏈CDR3的抗人 CCR7抗體，也能夠由同樣的程序生產。
[0337] 作為本發明的抗體的純化方法沒有特別限定，能夠采用公知的方法。例如，能夠回 收上述雜交瘤或上述重組細胞的培養上清，組合各種色譜、鹽析、透析、膜分離等公知的方 法，純化本發明的抗體。在抗體的同種型為IgG的情況下，也能夠利用使用了蛋白A的親和色 譜簡便地進行純化。
[0338] 其中，本發明的雜交瘤，如后述實施例中所詳述的那樣，為使用公知的雜交瘤制作 技術篩選并取得的細胞。其中，在對動物（例如小鼠）免疫抗原時，也能夠使用所純化的人 CCR7作為抗原，但也可以使用基因免疫的方法。特別有時通過使用使作為大腸桿菌分子伴 侶的GroEL的基因與CCR7基因連接得到的融合基因作為免疫原，能夠容易進行抗體制作。該 基因免疫方法的詳細內容記載于國際公開第2006/041157號小冊子中。
[0339] 本發明的抗體可用作醫藥組合物(治療劑）的有效成分。本發明的醫藥組合物的特 征在于包含本發明的抗人CCR7抗體和藥學上可接受的擔載體。優選阻斷通過CCR7配體的 CCR7依賴性細胞內信號傳導機制。
[0340]在優選實施方式中，本發明的醫藥組合物用于治療組織的纖維化。作為組織的纖 維化的例子，可以列舉選自肝纖維癥、腎纖維癥、肺纖維癥、皮膚纖維癥、心血管纖維癥、消 化管纖維癥以及其他纖維性疾病中的纖維癥。
[0341] 作為上述肝纖維癥的例子，可以列舉選自肝硬化、缺血再灌注、肝移植后損傷、壞 死性肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、原發性膽汁性肝硬化以及原發性硬化性膽管炎中的肝纖維 癥。關于肝硬化，可以列舉選自酒精誘發、藥物誘發以及化學誘發中的至少1種造成的肝硬 化。作為上述腎纖維癥的例子，可以列舉選自增生性腎小球腎炎、硬化性腎小球腎炎、腎源 性纖維化性皮膚病、糖尿病性腎病、腎小管間質性纖維癥以及局灶節段性腎小球硬化癥中 的腎纖維癥。作為上述肺纖維癥的例子，可以列舉選自肺間質性纖維癥、藥物誘發結節病、 肺纖維癥、特發性肺纖維癥、哮喘、慢性阻塞性肺病、彌漫性肺泡損傷疾病、肺高血壓癥以及 新生兒支氣管肺發育不良中的肺纖維癥。
[0342] 作為上述皮膚纖維癥的例子，可以列舉選自硬皮病、瘢瘤性疤痕、銀肩病、增生性 疤痕以及假性硬皮病中的皮膚纖維癥。作為上述心血管纖維癥的例子，可以列舉選自動脈 粥樣硬化、冠狀動脈再狹窄、充血性心肌病、心臟衰竭、心臟移植以及心肌纖維癥中的心血 管纖維癥。作為上述消化管纖維癥的例子，可以列舉選自膠原性結腸炎、絨毛萎縮、隱窩增 生、息肉形成、克羅恩病的纖維癥、胃潰瘍愈合以及腹腔粘連術后瘢痕中的消化管纖維癥。
[0343] 另外上述纖維癥具有從與骨關聯的纖維化性疾病產生的狀態，可以為類風濕性血 管翳形成。
[0344] 另外，本發明的醫藥組合物在用于治療癌的轉移中也能夠使用。作為上述癌的例 子，可以列舉選自咽癌、軟骨肉瘤、大腸癌、胰腺癌、白血病、乳腺癌中的癌。
[0345] 本發明的醫藥組合物能夠口服或者非口服地、全身或者局部地給藥。作為給藥的 形式，可以列舉注射劑型、經鼻給藥劑型、經肺給藥劑型、經皮給藥型等。注射劑型時，例如 能夠通過靜脈內注射、肌肉內注射、腹腔內注射、皮下注射等，全身或局部給藥。另外，也能 夠根據患者的年齡、癥狀，適當選擇給藥方法。作為本發明的抗體的給藥量，例如，能夠在一 次每lkg體重從0.000lmg至lOOOmg的范圍選擇。或者，例如，能夠在每位患者抗體0.001~ 100000mg/body的范圍選擇給藥量。然而，本發明的抗體的給藥量不限于這些范圍。
[0346]包含本發明的抗體的醫藥組合物能夠按照常規方法制劑化（例如、Remington ' s Pharmaceutical Science,最新版，Mark Publishing Company，Easton，U. S.A) 〇本發明的 醫藥組合物包含藥學上可接受的擔載體、添加物。作為上述擔載體或者上述添加物的例子， 能夠列舉表面活性劑(PEG、Tween等）、賦形劑、抗氧化劑(抗壞血酸等）、著色料、著香料、保 存料、穩定劑、緩沖劑(磷酸、檸檬酸、其他有機酸等）、螯合劑(EDTA等）、懸浮劑、等滲劑、結 合劑、崩解劑、潤滑劑、流動性促進劑、矯味劑等，但不限于這些，也能夠適當使用其他常用 的擔載體等。具體而言，能夠列舉輕質無水硅酸、乳糖、結晶纖維素、甘露糖醇、淀粉、羧甲基 纖維素鈣、羧甲基纖維素鈉、羥丙基甲基纖維素、聚乙烯醇縮乙醛二乙基氨基乙酸酯、聚乙 烯基吡咯烷酮、明膠、中鏈脂肪酸甘油三酯、聚氧乙烯氫化蓖麻油60、白糖、羧甲基纖維素、 玉米淀粉、無機鹽類等。另外，也可以包含其他其他低分子量的多肽、血清白蛋白、明膠或免 疫球蛋白等蛋白質、甘氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、精氨酸以及賴氨酸等氨基酸。
[0347]在形成為注射用的水溶液時，可以列舉例如生理食鹽水、含有葡萄糖或其他輔助 藥的等滲液、例如，也可以列舉D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露糖醇、氯化鈉，可以與適當的 助溶劑、例如酒精（乙醇等）、多元醇(丙二醇、PEG等）、非離子性表面活性劑(聚山梨醇酯80、 HC0-50)等組合使用。另外，也能夠根據需要將本發明的抗體封入微膠囊(羥甲基纖維素、明 膠、聚[甲基丙烯酸甲酯]等的微膠囊）中，或者制成膠體藥物傳遞系統（脂質體、白蛋白微 球、微乳液、納米顆粒以及納米膠囊等）（參照〃Remingto's Pharmaceutical Science 16th edition"，0slo Ed·(1980)等）。
[0348]此外，已知有使藥劑緩釋的技術，也能夠應用于本發明的醫藥組合物(Langer et al·，J.Biomed.Master.Res·15:167-277(1981);Langer，Chem.Tech·12:98-105(1982);美 國專利第3,773,919號；歐州專利申請公開第58,481號；Sidman et al.，Biopolymers 22: 547-556( 1983);歐州專利申請公開第133，988號）。
[0349] 此外，使其他藥劑(抗纖維化作用劑、低分子抗癌劑、細胞因子等)與抗體直接融合 來提高治療效果的技術，能夠應用于本發明的醫藥組合物。
[0350] 另外，也可以考慮將編碼本發明的抗體的基因組入基因治療用載體，制成基因治 療藥。作為該基因治療藥(重組載體)的給藥方法除利用裸(naked)質粒的直接給藥以外，還 可以列舉在脂質體等中包裝進行給藥的方法、組入逆轉錄病毒載體、腺病毒載體、痘苗病毒 載體、痘病毒載體、腺伴隨病毒載體、HVJ載體等各種病毒載體進行給藥的方法(參照Adolph 《病毒基因組法》，CRC PreSS，Fl〇rid(1996))、包覆膠體金顆粒等珠子擔載體（國際公開第 93/17706號小冊子等)進行給藥的方法等。即，只要是上述基因治療藥能夠在生物體內表達 本發明的抗體并發揮其作用，就可以通過任何方法給藥。優選通過適當的非口服路徑(經由 靜脈內、腹腔內、皮下、皮內、脂肪組織內、乳腺組織內、吸入或肌肉內的路徑進行注射、注 入，或氣體誘導性顆粒轟擊法(利用電子槍等）、滴鼻藥等經由粘膜路徑的方法等)將充分的 量進行給藥。此外，上述基因治療藥也可以通過離體利用脂質體轉染、粒子轟擊法(美國專 利第4,945,050號）、或病毒感染向細胞給藥，將該細胞再導入動物進行給藥。
[0351] 此外，在本發明中，也包括與患有因 CCR7信號的異常亢進而發病的疾病或疾患的 哺乳動物的該疾病相關的治療方法和治療藥。
[0352] 其中"治療"以如下含義使用：以在可能患有疾病或者已經患有疾病的哺乳動物 中，阻止或緩解該疾病的疾病狀態的發展以及惡化，由此以阻止或緩解該疾病的各種癥狀 等的發展以及惡化為目的的治療措施。
[0353]另外，"疾病"的意思是指因 CCR7信號的異常亢進而發病的所有疾病，沒有特別限 定，例如是包括肝纖維癥、腎纖維癥、肺纖維癥、皮膚纖維癥、心血管纖維癥、消化管纖維癥 以及其他纖維性疾病的概念。另外，也為包括以咽癌、軟骨肉瘤、大腸癌、胰腺癌、白血病、乳 腺癌為原發的癌轉移的概念。作為治療的對象"哺乳動物"的意思是分類為哺乳類的任意的 動物，沒有特別限定，例如，除人以外，為狗、貓、兔子等寵物動物、牛、豬、羊、馬等家畜動物 等。特別優選的"哺乳動物"為人。
[0354] 本發明的抗體固定化擔載體是將本發明的抗人CCR7抗體固定于擔載體而形成的。 在優選實施方式中，使本發明的抗體固定化擔載體與包含CCR7表達細胞的血液接觸，用于 從上述體液中除去CCR7表達細胞。固定于擔載體的抗人CCR7抗體可以僅為1種也可以為2種 以上。
[0355] 作為本發明的抗體固定化擔載體的具體的形態，例如，可以列舉將本發明的抗體 固定于水不溶性擔載體并填充于容器的形態。其中，作為水不溶性擔載體可以使用任意材 質，但若在成型性、滅菌性和細胞毒性低的方面列舉優選的材質，則可以列舉聚乙烯、聚丙 烯、聚苯乙烯、丙烯酸類樹脂、尼龍、聚酯、聚碳酸酯、聚丙烯酰胺、聚氨酯等合成高分子、瓊 脂糖、纖維素、醋酸纖維素、幾丁質、殼聚糖、海藻酸鈉等天然高分子、羥基磷灰石、玻璃、氧 化鋁、氧化鈦等無機材料、不銹鋼、鈦等金屬材料。
[0356] 作為擔載體的形狀，可以列舉粒狀、棉狀、紡織布、無紡布、海綿狀多孔質體、平板 狀等，但在每體積的表面積大的方面優選粒狀、棉狀、紡織布、無紡布、海綿狀多孔質體。例 如，使末梢血通過預先在容器中填充有固定了抗體的水不溶性擔載體的多孔質體過濾器， 能夠高效地除去與疾病相關的CCR7表達細胞。
[0357] 組合本發明的抗體固定化擔載體和其他構成要素，能夠制作CCR7表達細胞除去用 試劑盒。作為該其他構成要素，可以列舉抗凝固劑、體外循環回路等。
[0358] 本發明包含下述(1)~(5)的抗人CCR7抗體。
[0359] (1)抗人CCR7抗體，其為與人CCR7的細胞外結構域特異性結合的抗人CCR7抗體，其 特征在于，具有包含序列編號7、序列編號17、序列編號27、序列編號37、序列編號47、序列編 號57、序列編號67或序列編號77所示的氨基酸序列的重鏈互補決定區3(重鏈⑶R3)。
[0360] (2)上述（1)中記載的抗人CCR7抗體，其特征在于，其互補決定區1~3(CDR1~3)的 氨基酸序列，滿足下述(A1)~(A8)中的任意一種。
[0361] (A1)具有包含序列編號5所示的氨基酸序列的重鏈⑶R1、
[0362] 包含序列編號6所示的氨基酸序列的重鏈⑶R2、以及
[0363] 包含序列編號7所示的氨基酸序列的重鏈⑶R3;
[0364] (A2)具有包含序列編號15所示的氨基酸序列的重鏈⑶R1、
[0365] 包含序列編號16所示的氨基酸序列的重鏈⑶R2、以及
[0366] 包含序列編號17所示的氨基酸序列的重鏈⑶R3;
[0367] (A3)具有包含序列編號25所示的氨基酸序列的重鏈⑶R1、
[0368] 包含序列編號26所示的氨基酸序列的重鏈⑶R2、以及
[0369] 包含序列編號27所示的氨基酸序列的重鏈⑶R3;
[0370] (A4)具有包含序列編號35所示的氨基酸序列的重鏈⑶R1、
[0371] 包含序列編號36所示的氨基酸序列的重鏈⑶R2、以及
[0372] 包含序列編號37所示的氨基酸序列的重鏈⑶R3;
[0373] (A5)具有包含序列編號45所示的氨基酸序列的重鏈⑶R1、
[0374] 包含序列編號46所示的氨基酸序列的重鏈⑶R2、以及
[0375] 包含序列編號47所示的氨基酸序列的重鏈⑶R3;
[0376] (A6)具有包含序列編號55所示的氨基酸序列的重鏈⑶Rl、
[0377] 包含序列編號56所示的氨基酸序列的重鏈⑶R2、以及
[0378] 包含序列編號57所示的氨基酸序列的重鏈⑶R3;
[0379] (A7)具有包含序列編號65所示的氨基酸序列的重鏈⑶R1、
[0380]包含序列編號66所示的氨基酸序列的重鏈⑶R2、以及 [0381]包含序列編號67所示的氨基酸序列的重鏈⑶R3;
[0382] (A8)具有包含序列編號75所示的氨基酸序列的重鏈⑶R1、
[0383] 包含序列編號76所示的氨基酸序列的重鏈⑶R2、以及
[0384] 包含序列編號77所示的氨基酸序列的重鏈⑶R3。
[0385] (3)上述（1)或（2)中記載的抗人CCR7抗體，其特征在于，其互補決定區1~3(CDR1 ~3)的氨基酸序列滿足下述(B1)~(B8)中的任意一種。
[0386] (B1)具有包含序列編號5所示的氨基酸序列的重鏈⑶R1、
[0387] 包含序列編號6所示的氨基酸序列的重鏈⑶R2、
[0388] 包含序列編號7所示的氨基酸序列的重鏈⑶R3、
[0389]包含序列編號8所示的氨基酸序列的輕鏈⑶R1、
[0390] 包含序列編號9所示的氨基酸序列的輕鏈⑶R2、以及
[0391] 包含序列編號10所示的氨基酸序列的輕鏈⑶R3;
[0392] (B2)具有包含序列編號15所示的氨基酸序列的重鏈⑶R1、
[0393] 包含序列編號16所示的氨基酸序列的重鏈⑶R2、
[0394] 包含序列編號17所示的氨基酸序列的重鏈⑶R3、
[0395] 包含序列編號18所示的氨基酸序列的輕鏈⑶R1、
[0396] 包含序列編號19所示的氨基酸序列的輕鏈⑶R2、以及
[0397] 包含序列編號20所示的氨基酸序列的輕鏈⑶R3;
[0398] (B3)具有包含序列編號25所示的氨基酸序列的重鏈⑶R1、
[0399] 包含序列編號26所示的氨基酸序列的重鏈⑶R2、
[0400] 包含序列編號27所示的氨基酸序列的重鏈⑶R3、
[0401]包含序列編號28所示的氨基酸序列的輕鏈⑶R1、
[0402]包含序列編號29所示的氨基酸序列的輕鏈⑶R2、以及 [0403]包含序列編號30所示的氨基酸序列的輕鏈⑶R3;
[0404] (B4)具有包含序列編號35所示的氨基酸序列的重鏈CDR1、
[0405] 包含序列編號36所示的氨基酸序列的重鏈⑶R2、
[0406] 包含序列編號37所示的氨基酸序列的重鏈⑶R3、
[0407]包含序列編號38所示的氨基酸序列的輕鏈⑶R1、
[0408]包含序列編號39所示的氨基酸序列的輕鏈⑶R2、以及 [0409]包含序列編號40所示的氨基酸序列的輕鏈⑶R3;
[0410] (B5)具有包含序列編號45所示的氨基酸序列的重鏈⑶R1、
[0411] 包含序列編號46所示的氨基酸序列的重鏈⑶R2、
[0412] 包含序列編號47所示的氨基酸序列的重鏈⑶R3、
[0413]包含序列編號48所示的氨基酸序列的輕鏈⑶R1、
[0414] 包含序列編號49所示的氨基酸序列的輕鏈⑶R2、以及
[0415] 包含序列編號50所示的氨基酸序列的輕鏈⑶R3;
[0416] (B6)具有包含序列編號55所示的氨基酸序列的重鏈⑶R1、
[0417] 包含序列編號56所示的氨基酸序列的重鏈⑶R2、
[0418] 包含序列編號57所示的氨基酸序列的重鏈⑶R3、
[0419]包含序列編號58所示的氨基酸序列的輕鏈⑶R1、
[0420] 包含序列編號59所示的氨基酸序列的輕鏈⑶R2、以及
[0421] 包含序列編號60所示的氨基酸序列的輕鏈⑶R3;
[0422] (B7)具有包含序列編號65所示的氨基酸序列的重鏈⑶R1、
[0423] 包含序列編號66所示的氨基酸序列的重鏈⑶R2、
[0424] 包含序列編號67所示的氨基酸序列的重鏈⑶R3、
[0425] 包含序列編號68所示的氨基酸序列的輕鏈⑶R1、
[0426] 包含序列編號69所示的氨基酸序列的輕鏈⑶R2、以及
[0427] 包含序列編號70所示的氨基酸序列的輕鏈⑶R3;
[0428] (B8)具有包含序列編號75所示的氨基酸序列的重鏈⑶R1、
[0429] 包含序列編號76所示的氨基酸序列的重鏈⑶R2、
[0430] 包含序列編號77所示的氨基酸序列的重鏈⑶R3、
[0431] 包含序列編號78所示的氨基酸序列的輕鏈⑶R1、
[0432] 包含序列編號79所示的氨基酸序列的輕鏈⑶R2、以及
[0433] 包含序列編號80所示的氨基酸序列的輕鏈⑶R3。
[0434] (4)上述(1)~(3)中任一項中記載的抗人CCR7抗體，其特征在于，其重鏈可變區和 輕鏈可變區的氨基酸序列滿足下述(C1)~(C8)中的任意一種。
[0435] (C1)具有包含序列編號2所示的氨基酸序列的重鏈可變區以及包含序列編號4所 示的氨基酸序列的輕鏈可變區；
[0436] (C2)具有包含序列編號12所示的氨基酸序列的重鏈可變區以及包含序列編號14 所示的氨基酸序列的輕鏈可變區；
[0437] (C3)具有包含序列編號22所示的氨基酸序列的重鏈可變區以及包含序列編號24 所示的氨基酸序列的輕鏈可變區；
[0438] (C4)具有包含序列編號32所示的氨基酸序列的重鏈可變區以及包含序列編號34 所示的氨基酸序列的輕鏈可變區；
[0439] (C5)具有包含序列編號42所示的氨基酸序列的重鏈可變區以及包含序列編號44 所示的氨基酸序列的輕鏈可變區；
[0440] (C6)具有包含序列編號52所示的氨基酸序列的重鏈可變區以及包含序列編號54 所示的氨基酸序列的輕鏈可變區；
[0441] (C7)具有包含序列編號62所示的氨基酸序列的重鏈可變區以及包含序列編號64 所示的氨基酸序列的輕鏈可變區；
[0442] (C8)具有包含序列編號72所示的氨基酸序列的重鏈可變區以及包含序列編號74 所示的氨基酸序列的輕鏈可變區。
[0443] (5)上述（1)~（4)中任一項中記載的抗人CCR7抗體，其特征在于，由R7-01(FERM BP-11369)、R7-02(FERMBP-11404)、R7-05(FERMBP-11371)、R7-09(FERMBP-11372)、R7-11(FERM BP-11373)、R7-18(FERM BP-11374)、R7-25(FERM BP-11375)或R7-47(FERM BP-11376) 產生。
[0444] 本發明包含給藥有效量的上述抗人CCR7抗體的組織的纖維化或癌的轉移的治療 方法。組織的纖維化和癌的具體例如上所述。
[0445] 本發明包含用于治療組織的纖維化或癌的轉移的治療劑制造的上述抗人CCR7抗 體的使用。本發明還包含組織的纖維化或癌的轉移的治療用的上述抗人CCR7抗體。組織的 纖維化和癌的具體例如上所述。
[0446] 實施例
[0447] 以下，使用實施例進一步具體地說明本發明，但本發明不限于這些實施例。
[0448] (1)人 CCR7(hCCR7)基因的制備
[0449] 利用DNA合成裝置制作在Genebank注冊完畢的人CCR7基因序列(NM_001838、序列 編號81)的5 '末端添加有GCTAGC序列、在3 '末端添加有GTCGACTAGGAATTC序列（序列編號83) 的人工合成基因。然后，將該基因導入PUC57克隆載體，制備人CCR7基因克隆。以下，將所得 到的載體在NheI和Sa 11位點切斷而制備的基因片段稱為"DNA片段A"，將在NheI和EcoRI位 點切斷而制備的基因片段稱為"DNA片段B"。
[0450] (2)GroEL亞單位基因的分離
[0451 ] 從大腸桿菌HMS174 (DE3)株(Novagen公司）提取、純化基因組DNA。接著，以純化后 的基因組DNA作為模板，以具有序列編號84以及85所示的堿基序列的寡核苷酸作為引物對 進行PCR，擴增具有序列編號86所示的堿基序列的含有GroEL亞單位基因的DNA片段（以下， 稱為"DNA片段C"。）。在DNA片段C中，在5 '末端導入來自引物的Sal I位點，在3 '末端導入來自 弓丨物的編碼2個終止密碼子(TAATAG)的序列以及Notl位點。
[0452] (3)表達人CCR7和GroEL亞單位的融合蛋白的基因免疫用載體的構建
[0453] 用制限酶Nhel和Sail消化哺乳動物表達載體pCI Mammalian Expression Vector (Promega公司），用來自細菌的堿性磷酸酶(BAP)對末端進行脫磷酸化處理后，插入在上述 (1)中制備的DNA片段A。再將該表達載體用Sail和Notl消化，用BAP對末端進行脫磷酸化處 理后，插入在上述（2)中制備的DNA片段C，構建載體pCI-hCCR7 · GroEL。即，載體pCI-hCCR7 · GroEL具有編碼人CCR7的基因和編碼GroEL亞單位的基因的融合基因。
[0454] (4)制作導入了人CCR7基因的穩定表達細胞
[0455] 將在上述（1)中制備的DNA片段B導入pCIneo(Promega公司）的Nhel-EcoRI位點，構 建pCIneo_hCCR7〇
[0456] 混合 POFECTAMINE(Lipofectamin)溶液 37.5yL、0PTI-MEMI 培養基625yL、和含有 20 yg pCIne〇-hCCR7的0ΡΤΙ-ΜΕΜΙ培養基625yL。使用該混合液，將pCIne〇-hCCR7導入2X105個 CH0-K1細胞(大日本制藥株式會社）。作為對照，僅將pCIneo導入CH0-K1細胞。用Ham' SF12K+ 10%FBS培養基（ICN公司）培養30小時導入有基因的各CH0-K1細胞。然后剝離、懸浮各細胞， 在100mm培養皿中接種5 X 105個，用以0.8mg/mL的濃度含有抗生素 G418(Promega公司）的 Ham'sF12K+10%FBS培養基進行2周藥劑處理。藥劑處理后，利用極限稀釋法，克隆G418耐性 細胞。另外，為了增大Ca信號應答，在克隆后的細胞中基因導入pCEP-Gal6(M 〇leCular Devices公司），在抗生素潮霉素0.2mg/mL的濃度下，同樣地進行藥劑處理，然后，進一步進 行潮霉素耐性細胞的克隆。通過以上的操作，制作導入了人CCR7基因的穩定表達細胞。接 著，為了確認該細胞上的CCR7功能活性，進行了以下的評價。對于細胞，以2 X 104個/lOOyL 的初始細胞濃度，使用96孔微量滴定板培養一晝夜，培養結束后，利用10-6~10-12Μ的濃度范 圍內的CCL21 (R&D systems公司）刺激各細胞，結果細胞內的Ca2+濃度瞬間上升。Ca2+濃度使 用Ca 2 +信號解析裝置（FLIPR; Molecular Devices公司）以及細胞內Ca2 +染色試劑盒 (Ca3kit;Molecular Devices公司）測定。由此可知活性型人CCR7在CH0-K1細胞膜上正常穩 定地表達。
[0457] (5)基因免疫
[0458] 在生理食鹽水中溶解載體pCI-hCCR7 · GroEL使其達到250yg/mL的濃度，制備免疫 用組合物。將該免疫用組合物在8周齡的小鼠 BALB/c(雌）的兩大腿肌肉中各進行0.12mL的 注射，進行免疫(第0日）。由此，在兩腿各給藥30yg pCI-hCCR7 · GroEL，即，每一只一次給藥 60yg。然后，在第7日、第21日、以及第28日也同樣重復免疫。然后，在第0、7、14、21、28、35、42 日進行采血，制備血清。作為對照，使用單獨表達hCCR7的載體pCI-hCCR7對小鼠進行免疫。
[0459] (6)利用流式細胞儀評價對于活性型人CCR7的血清中抗體結合性
[0460] 將確認了pCIne〇-hCCR7被導入并穩定表達的CH0-K1細胞（以下，稱為"hCCR7基因 導入細胞"。）以及導入了pCIneo的CH0-K1細胞(對照細胞）用PBS清洗。將免疫后第56日的血 清稀釋500倍，與各細胞一起培育。再用PBS清洗各細胞，作為2次抗體添加藻紅蛋白標記抗 小鼠 IgG抗體(Beckman Coulter公司）后，使用流式細胞儀FACScalibur(Becton Dickinson 公司），解析各細胞與血清中的抗人CCR7抗體的相互作用。
[0461] 其結果，在使用了導入了人CCR7基因的細胞時，在基因免疫前的血清中幾乎沒有 檢測出藻紅蛋白，但在基因免疫后的血清中檢測出。這表示免疫后的血清中的抗人CCR7抗 體與導入了人CCR7基因的細胞結合。另一方面，在使用對照細胞時，在基因免疫后的血清中 也沒有檢測出藻紅蛋白。這表示免疫后的血清中的抗人CCR7抗體未與對照細胞結合。
[0462] 從以上可知，通過由載體pCI_hCCR7 · GroEL的基因免疫，小鼠血清中誘導出了特 異性識別活性型人CCR7的細胞外結構域的抗體的產生。
[0463] (7)抗人CCR7單克隆抗體的制作
[0464] 對于用與上述(5)同樣的程序進行了基因免疫的小鼠6只進行追加免疫。追加免疫 的3日后摘出脾臟，制備脾細胞。利用PEG法，將1 X 108個脾細胞、和1 X 107個來自BALB/C小鼠 的HAT選擇性的骨髓瘤SP2/0細胞融合(細胞融合）。將融合的細胞（雜交瘤）的集團懸浮于 RPMI培養基中，接種于14枚96孔微孔板的各孔中。在該階段，得到了約990種雜交瘤。
[0465] 從細胞融合的第二日開始2周，以每3日一次的頻率，將上述微孔板內的培養基置 換為添加了HAT Media Supplement(50X)(Sigma公司、型號：H0262)的RPMI培養基。
[0466] 利用與上述(6)同樣的流式細胞儀進行抗體結合評價，研究導入了人CCR7基因的 細胞和各孔的雜交瘤培養上清中的抗體的結合性。其結果，在8個孔中確認到了與抗體的結 合性。
[0467] 對于確認了與抗體的結合性的8種雜交瘤，進行利用極限稀釋法的克隆。即，對于8 種雜交瘤在96孔微孔板中以細胞1個以下/孔的方式接種并培養。2周后，進行同樣的流式細 胞儀檢測，確認了所克隆的培養上清中的抗體(抗人CCR7單克隆抗體)的結合性。其結果，產 生抗人CCR7單克隆抗體的8種雜交瘤得到克隆。
[0468] 對于各雜交瘤在RPMI培養基lOOmL內進行2周燒瓶培養。將各培養上清供給蛋白質 G柱(Amersham 13;[08(^61106 8公司）進行純化、濃縮，各得到約2011^的純化的8種抗人(]〇?7單 克隆抗體。
[0469] 將各雜交瘤保藏于IPOD。各雜交瘤的表示和保藏編號如上所述。
[0470] 對于各個抗人CCR7單克隆抗體（以下，簡單稱為"抗人CCR7抗體"。）進行以下所示 的試驗。在以下的記載中，也將雜交瘤的表示作為抗體名稱使用。
[0471 ] (8)利用流式細胞儀評價對于導入了人CCR7基因的細胞的結合性
[0472] 制備1 Oyg/mL濃度的抗人CCR7單克隆抗體以及小鼠對照I gG (Thermo、陰性對照）的 PBS溶液（以下，稱為"抗體溶液"。）。另一方面，用PBS清洗導入了人CCR7基因的細胞之后，抗 體溶液與細胞一起溫育。此外，用PBS清洗細胞，作為2次抗體添加了藻紅蛋白標記抗小鼠 IgG抗體(Beckman Coulter公司），然后使用流式細胞儀FACScalibur(Becton Dickinson公 司），解析細胞與抗人CCR7抗體以及小鼠對照I gG的相互作用。結果示于圖9、10以及表2。圖9 是表示導入了人CCR7基因的細胞和小鼠對照IgG的相互作用的解析結果的柱狀圖。圖10是 表示導入了人CCR7基因的細胞與抗人CCR7抗體R7-47的相互作用的解析結果的柱狀圖。表2 表示由導入了人CCR7基因的細胞與各抗人CCR7抗體的相互作用的解析結果算出的特異的 結合細胞的比例。在圖9、10中，縱軸表示細胞數，橫軸表示來自藻紅蛋白（PE)的熒光強度。 另外，在2個區域(area) (Ml、M2)中，屬于M2(右區域）的細胞表示與抗體結合的細胞。在表2 中，特異性結合的細胞的比例由M2/(M1+M2)表示。
[0473]其結果，使用導入了人CCR7基因的細胞的情況，在M2的區域檢測出大量細胞（圖 10、表2)。這表示各抗人CCR7抗體與導入了人CCR7基因的細胞結合。另一方面，使用了小鼠 對照IgG的情況（圖9)，在M2的區域幾乎沒有檢測出細胞。這表示小鼠對照IgG未與導入了人 CCR7基因的細胞結合。從以上表明，所得到的抗人CCR7抗體均為特異性識別活性型人CCR7 的細胞外結構域的抗體。
[0474]表 2
[0476] (9)評價細胞內Ca2+信號傳導抑制活性
[0477] 將導入了人CCR7基因的細胞以2X 104個/100yL的初始細胞濃度，使用96孔微量滴 定板培養一晝夜。培養結束后，在各孔中添加10- 6~10-ηΜ濃度范圍內的抗人CCR7抗體。另 外，作為對照，也制備將小鼠對照IgG(Thermo公司、陰性對照）同樣地以10- 6~10-ηΜ濃度范 圍內添加得到的樣品。1小時后，測定利用1 X 1 〇-7Μ的CCL21 (R&D systems公司）刺激各細胞 時的細胞內Ca2+濃度的瞬時上升的依賴于抗體濃度的減少度。Ca 2+濃度的測定使用Ca2+信號 解析裝置(FLIPR;Molecular Devices公司）以及細胞內Ca染色試劑盒(Ca3kit;Molecular Devices公司）進行。添加了抗人CCR7抗體R7-47的結果示于圖11。圖11是表示細胞內Ca 2+濃 度和各添加物的濃度的關系的曲線圖。如圖11所示，觀察到了細胞內Ca2+濃度依賴于R7-47 的濃度地下降。這表明R7-47競爭性抑制CCL21與人CCR7的結合的結果，使得向細胞內的信 號傳導受到抑制。算出50%抑制濃度（IC50)，利用R7-47為7.4nM。表3表示R7-47以外的抗人 CCR7抗體的IC50。
[0478] 從以上表明所得到的抗人CCR7抗體均能夠阻斷通過人CCR7配體的CCR7依賴性細 胞內信號傳導機制。
[0479] 表 3

[0481] (10)同種型解析
[0482] 使用小鼠單克隆抗體同種型鑒定試劑盒(GE HEALTHCARE公司），確定抗人CCR7抗 體的同種型。檢測是通過使用了辣根過氧化物酶標記小鼠 IgG抗體的三明治ELISA得到的。 結果示于表4。
[0483] 表 4
[0485] (11)抗體可變區的cDNA克隆以及互補決定區（CDR)的確定
[0486] 利用上述8種雜交瘤，克隆編碼各抗體的L鏈以及Η鏈的可變區的DNA，確定其堿基 序列。克隆如下進行。首先使用RNeasyMini Kit(QIAGEN公司）從雜交瘤中分離RNA。然后，使 用"SMARTer-RACE cDNA Amplification Kit"（Takara Bio株式會社），按照制造商說明書 進行利用5' -RACE法的cDNA合成，并得到PCR產物。作為PCR的3 '側引物，γ鏈時，使用序列編 號87的序列，κ鏈時使用序列編號88~90的序列，λ鏈時使用序列編號91的序列。
[0487] 利用DNA Ligation kit ver.2(Takara Bio株式會社）將所得到的DNA片段插入 pT7Blue T Vector(Novagen公司）。用該載體轉化XL10Gold(Stratagene公司），接種于含有 X-gal、氨芐青霉素、IPTG的平板后，挑取白色菌落。利用各5種含有正常尺寸的插入序列的 克隆制備質粒后，使用ABI PRISM 3130型自動測序儀確定DNA序列。所確定的序列除了一部 分被認為是由PCR誤差造成的變異以外，3個克隆都顯示相同序列，因此，將該序列作為目的 DNA序列。將所得到的堿基序列和對應的氨基酸序列表示為序列編號1(R7-01的VH)、序列編 號3(R7-01的VL)、序列編號ll(R7-02的VH)、序列編號13(R7-02的VL)、序列編號21(R7-05的 VH)、序列編號23(R7-05的VL)、序列編號31 (R7-09的VH)、序列編號33(R7-09的VL)、序列編 號41(R7-11 的VH)和43(R7-11 的VL)、序列編號51(R7-18的VH)、序列編號 53(R7-18的VL)、 序列編號61(R7-25的VH)、序列編號63(R7-25的VL)、序列編號71(R7-47的VH)、序列編號73 (R7-47的VL)。
[0488] 僅將與各堿基序列對應的氨基酸序列表示為序列編號2(R7_01的VH)、序列編號4 (R7-01的VL)、序列編號12(R7-02的VH)、序列編號14(R7-02的VL)、序列編號22(R7-05的 VH)、序列編號24(R7-05的VL)、序列編號32(R7-09的VH)、序列編號34(R7-09的VL)、序列編 號 42(R7-11 的 VH)和 44(R7-11 的 VL)、序列編號 52(R7-18 的 VH)、序列編號 54(R7-18 的 VL)、序 列編號62(R7-25的VH)、序列編號64(R7-25的VL)、序列編號72(R7-47的VH)、序列編號74 (R7-47的VL)。
[0489] 對于各VH和VL，鑒定CDR1~3(序列編號5~10、15~20、25~30、35~40、45~50、55 ~60、65~70、75~80)。參照圖1~9和表1。
[0490] (12)確認使用了人初代培養細胞的抗人CCR7抗體的結合
[0491 ]從健康人的末梢血中按照常規方法使用Lymphoprep(Axis_Shield公司）分離單核 球細胞（PBMC)。將所分離的PBMC懸浮于含有lmg/mL的人γ球蛋白（Jackson Immuno Research Laboratories公司）的Phosphate Buffered Saline(磷酸鹽緩沖液，PBS)溶液 中，通過在室溫溫育30分鐘進行封閉。將封閉后的PBMC(3 X 105個細胞)與各抗人CCR7抗體 (0.5yg)或同種型對照抗體(0.5yg) -起在4 °C溫育1小時。然后，將PBMC用清洗緩沖液(含有 0.1 %胎牛血清的PBS溶液)清洗3次。接著，作為2次抗體，添加異硫氰酸熒光素(FITC)標記 抗小鼠 IgG抗體(Beckman Coulter公司），在4°C溫育1小時。將該PBMC再次用清洗緩沖液清 洗3次之后，使用流式細胞儀(Beckman Coulter公司制)分析。
[0492] 使用了R7-47時的流式細胞儀的結果示于圖12。圖12(a)表示用同種型對照抗體和 FITC標記抗小鼠 IgG抗體染色的結果，圖12(b)表示用R7-47和FITC標記抗小鼠 IgG抗體染色 的結果。圖12(a)，（b)的兩個箭頭所示的部分分別顯示同種型對照抗體和R7-47特異性結合 的細胞集團。另外圖中的數字表示將分析得到的PBMC的細胞數設為100 %時的該細胞集團 的比例。
[0493] 在PBMC中各抗人CCR7抗體特異性結合的細胞的比例示于表5。
[0494] 表 5
[0496] 這些結果表明該抗人CCR7抗體識別人天然型CCR7,能夠與人天然型CCR7結合。
[0497] (13)確認使用了人初代培養細胞的抗人CCR7抗體的功能性
[0498] 將PBMC(1.6X105細胞)接種于24孔細胞培養插管(Becton · Dickinson公司）的插 管中。再添加各抗人CCR7抗體或同種型對照IgG抗體10yg/mL，在室溫使其反應5分鐘。在細 胞培養插管的各孔中添加人重組體CCL21(150ng/mL)。將插管設置在平板上后，在37°C使其 反應1.5小時。反應后，除去插管，測定在各孔中游走的細胞數。在表6和表7中表示由該抗體 實現的對于依賴于CCL21的細胞游走的功能抑制的結果。
[0499] 表 6
[0504](平均值土標準偏差）
[0505] 首先，未添加 CCL21和添加 CCL21的比較表明TOMC的一部分細胞進行CCL21依賴性 地細胞游走。而且，即使添加同種型對照（IgGl或者IgG2)抗體，對于CCL21依賴性的細胞游 走也沒有影響。另一方面，在添加該抗體時，8種抗體全部顯著抑制CCL21依賴性的細胞游 走。這些結果表明該抗人CCR7抗體的任何一種都抑制人天然型CCR7的功能。
[0506] (14)確認抗人CCR7抗體的肺纖維癥模型的組織纖維化形成的抑制作用
[0507] 表達人PBMC中的CCR7的⑶14陽性細胞對于肺纖維的纖維化形成是重要的細胞 (Abe R,Donnelly SC,Peng T,Bucala R,Metz CN,"Peripheralblood fibrocytes: differentiation pathway and migration to wound sites·''JImmunol · 2001 Jun 15； 166 (12):7556_62;Curnow SJ，Fairclough M，Schmutz C， Kissane S，Denniston AK，Nash K， Buckley CD,Lord JM,Salmon M,^Distinct types of fibrocyte can differentiate from mononuclear cells in the presence and absence of serum,PLoS One.20lOMar 18; 5(3): e9730)。抗人CCR7抗體在肺纖維癥中的有效性，能夠通過對免疫不全小鼠（例如 SCID小鼠）將誘發肺纖維癥的刺激物質（例如博萊霉素，Bleomycin)進行給藥后，通過調查 將表達來自人的CCR7的CD 14陽性細胞植入時的該細胞向肺組織的轉移來表示。
[0508]按照常規方法從健康人的末梢血中分離PBMC。使分離的PBMC再與人⑶14標記磁珠 (Miltenyi Biotec公司）接觸，分離CD14陽性細胞，用于向小鼠的細胞植入。對T細胞和B細 胞缺失的SCID小鼠，將在生理食鹽水中溶解的博萊霉素（日本化藥株式會社、商品名:BLE0) 經氣道給藥使其達到5mg/kg，按照常規方法誘發肺纖維癥。將博萊霉素給藥日作為第0日， 在博萊霉素給藥4日前和從給藥后第1、4、8、11日，將溶解于生理食鹽水的抗人CCR7抗體R7-1UR7-18或R7-47分別以20mg/kg的用量進行腹腔給藥。作為對照，將同種型對照IgG以同樣 的時間安排進行給藥。在博萊霉素給藥后第4日，用上述的方法分離包含表達CCR7的細胞的 人CD14陽性細胞，用PKH26PCL紅色熒光細胞接頭（linker)試劑盒(Sigma公司）進行熒光標 記。從尾靜脈對每一只小鼠植入IX 1〇6個熒光標記細胞。從博萊霉素給藥開始第15日后將 小鼠解剖檢查，按照常規方法將肺組織用中性福爾馬林固定，制作病理切片。用熒光顯微鏡 觀察病理組織，在右肺全部視野中對來自被熒光標記的人細胞的細胞數計數。其結果，與給 藥了同種型對照IgG的小鼠相比，在給藥了抗人CCR7抗體的小鼠中，任何一個在肺中熒光標 記細胞數均減少。
[0509]另外，從通過解剖檢查所得到的左肺中，利用TRIzol試劑（Invitrogen公司）提取 組織的全部RNA，利用Nano Drop 1000(Thermo Fisher Scientific公司）對提取的RNA量進 行定量。對于從各小鼠肺得到的RNA樣品2yg，使用High Capacity cDNA Reverse transcription kit(Applied Biosystems公司）進行逆轉錄反應，利用實時PCR法對所得到 的cDNA樣品進行肺組織中的人CCR7的mRNA量的測定。利用實時PCR的解析通過TaqMan Gene Expression Assays系統（Applied Biosystems公司）進行。作為內部標準使用TaqMan Ribosomal RNA Control Reagents(Applied Biosystems公司），在人CCR7的檢測中使用了 Hs01013469_ml的引物對(Applied Biosystems公司）。所得到的數據通過Δ ACt法進行解 析，通過以給藥了同種型對照的組為基準的相對表達量的形式進行評價。其結果，與給藥了 同種型對照I gG的小鼠相比，在給藥了抗人CCR7抗體R7-11、R7-18或R7-47的小鼠中的任何 一個中，人CCR7的mRNA量均減少（圖13)。該結果反映了該抗人CCR7抗體在肺纖維癥中，抑制 對于纖維化重要的細胞向肺組織的浸潤。這些結果表明該抗CCR7抗體對于肺纖維化治療有 用。
[0510] (15)利用基因重組技術制造抗人CCR7抗體
[0511] 對含有序列編號11所示的DNA的小鼠抗體重鏈全長的基因進行克隆，并導入至分 泌表達用載體pSecTag2( Invitrogen公司）。將該載體命名為pSecTag2_R702HC。同樣地對含 有序列編號41所示的DNA的小鼠抗體重鏈全長的基因進行克隆，并導入至分泌表達用載體 pSecTag2。將該載體命名為pSecTag2-R711HC。同樣地對含有序列編號51所示的DNA的小鼠 抗體重鏈全長的基因進行克隆，并導入分泌至表達用載體pSecTag2。將該載體命名為 pSecTag2-R718HC〇
[0512] 對含有序列編號13所示的DNA的小鼠抗體輕鏈全長的基因進行克隆，并導入至分 泌表達用載體pSecTag2。將該載體命名為pSecTag2-R702LC。同樣地對含有序列編號43所示 的DNA的小鼠抗體輕鏈全長的基因進行克隆，并導入至分泌表達用載體pSecTag2。將該載體 命名為pSecTag2-R711LC。同樣地對含有序列編號53所示的DNA的小鼠抗體輕鏈全長的基因 進行克隆，并導入至分泌表達用載體pSecTag2。將該載體命名為pSecTag2-R718LC。
[0513] 使用LIPOFECTAMINE 2000(Invitrogen公司）將pSecTag2-R702HC以及pSecTag2-R702LC導入到HEK293細胞中。將該細胞培養2天。將培養上清供給至Protein-G柱，制備來自 雜交瘤R7-02的重組型抗人CCR7抗體。同樣地使用LIPOFECTAMINE 2000,將pSecTag2-R711HC以及pSecTag2-R711LC導入至HEK293細胞。將該細胞培養2天。將培養上清供給至 Protein-G柱，制備來自雜交瘤R7-11的重組型抗人CCR7抗體。同樣地使用LIPOFECTAMINE 2000,將pSecTag2-R718HC以及pSecTag2-R718LC導入至HEK293細胞。培養該細胞2天。將培 養上清供給至Protein-G柱，制備來自雜交瘤R7-18的重組型抗人CCR7抗體。
[0514] 與上述(6)同樣操作，對于導入了人CCR7基因的細胞以及CH0-K1細胞（陰性對照）， 使用流式細胞儀確認l〇yg/mL的各重組型抗人CCR7抗體是否結合。作為熒光2次抗體使用 藻紅蛋白標記抗小鼠 IgG抗體(Beckman Coulter公司），作為流式細胞儀使用FACScalibur (Becton Dickinson公司），對各細胞和各重組型抗人CCR7抗體的相互作用進行解析。結果 示于圖14~16。圖14表示使用了來自雜交瘤R7-02的重組型抗人CCR7抗體的結果。圖15表示 使用了來自雜交瘤R7-11的重組型抗人CCR7抗體的結果。圖16表示使用了來自雜交瘤R7-18 的重組型抗人CCR7抗體的結果。在圖14~16中，（a)為使用了CH0-K1細胞時的二維點陣圖 (左）和柱狀圖（右），（b)為使用導入了人CCR7基因的細胞時的二維點陣圖（左）和柱狀圖 (右）。在各二維點陣圖中，縱軸表示來自藻紅蛋白（PE)的熒光強度，橫軸表示來自異硫氰酸 熒光素(FITC)的熒光強度。即，表明任何一種重組型抗人CCR7抗體均與導入了人CCR7基因 的細胞結合，但不與CH0-K1細胞結合。這些結果表明，使用基因重組的方法，能夠以小鼠型 抗體、嵌合型抗體、人源化抗體、抗體的功能性片段等的形式生產本發明的抗體。
【主權項】
1. 第一抗人CCR7抗體，其是與人CCR7的細胞外結構域特異性結合的第一抗人CCR7抗 體，且所述第一抗人CCR7抗體具有阻斷活性，所述阻斷活性不通過補體依賴性細胞溶解作 用或者抗體依賴性細胞介導性細胞毒性作用，而通過刺激CCR7配體來阻斷依賴CCR7的細胞 內信息傳導機制， 所述第一抗人CCR7抗體競爭抑制第二抗人CCR7抗體與受體的結合， 所述第二抗人CCR7抗體是與人CCR7的細胞外結構域特異性結合的抗人CCR7抗體，其互 補決定區1~3(CDR1~3)的氨基酸序列滿足下述(B5)、（B6)、（B8)中的任意一項，且所述第 二抗人CCR7抗體具有阻斷活性，所述阻斷活性不通過補體依賴性細胞溶解作用或者抗體依 賴性細胞介導性細胞毒性作用，而通過刺激CCR7配體來阻斷依賴CCR7的細胞內信息傳導機 制： (B5)具有 序列編號45所示的氨基酸序列的重鏈CDR1、 序列編號46所示的氨基酸序列的重鏈CDR2、 序列編號47所示的氨基酸序列的重鏈CDR3、 序列編號48所示的氨基酸序列的輕鏈CDR1、 序列編號49所示的氨基酸序列的輕鏈CDR2、以及 序列編號50所示的氨基酸序列的輕鏈CDR3; (B6)具有 序列編號55所示的氨基酸序列的重鏈CDR1、 序列編號56所示的氨基酸序列的重鏈CDR2、 序列編號57所示的氨基酸序列的重鏈CDR3、 序列編號58所示的氨基酸序列的輕鏈CDR1、 序列編號59所示的氨基酸序列的輕鏈CDR2、以及 序列編號60所示的氨基酸序列的輕鏈CDR3; (B8)具有 序列編號75所示的氨基酸序列的重鏈CDR1、 序列編號76所示的氨基酸序列的重鏈CDR2、 序列編號77所示的氨基酸序列的重鏈CDR3、 序列編號78所示的氨基酸序列的輕鏈CDR1、 序列編號79所示的氨基酸序列的輕鏈CDR2、以及 序列編號80所示的氨基酸序列的輕鏈CDR3。2. 根據權利要求1所述的第一抗人CCR7抗體，其中，所述第二抗人CCR7抗體滿足下述 (C5)、（C6)、（C8)中的任意一項： (C5)具有序列編號42所示的氨基酸序列的重鏈可變區以及序列編號44所示的氨基酸 序列的輕鏈可變區； (C6)具有序列編號52所示的氨基酸序列的重鏈可變區以及序列編號54所示的氨基酸 序列的輕鏈可變區； (C8)具有序列編號72所示的氨基酸序列的重鏈可變區以及序列編號74所示的氨基酸 序列的輕鏈可變區。3. 第一抗人CCR7抗體，其是與人CCR7的細胞外結構域特異性結合的第一抗人CCR7抗 體，且所述第一抗人CCR7抗體具有阻斷活性，所述阻斷活性不通過補體依賴性細胞溶解作 用或者抗體依賴性細胞介導性細胞毒性作用，而通過刺激CCR7配體來阻斷依賴CCR7的細胞 內信息傳導機制， 所述第一抗人CCR7抗體競爭抑制第二抗人CCR7抗體與受體的結合， 所述第二抗人CCR7抗體是與人CCR7的細胞外結構域特異性結合的抗人CCR7抗體，由以 R7-11(FERM BP-11373)、R7-18(FERM BP-11374)或R7-47(FERM BP-11376)為特征的雜交瘤 產生，且所述第二抗人CCR7抗體具有阻斷活性，所述阻斷活性不通過補體依賴性細胞溶解 作用或者抗體依賴性細胞介導性細胞毒性作用，而通過刺激CCR7配體來阻斷依賴CCR7的細 胞內信息傳導機制。4. 一種核酸，其編碼權利要求1~3中任一項所述的第一抗人CCR7抗體的重鏈可變區或 輕鏈可變區。5. -種載體，其包含權利要求4所述的核酸。6. -種細胞，其導入有權利要求5所述的載體。7. -種抗人CCR7抗體，其是與人CCR7的細胞外結構域特異性結合的抗人CCR7抗體，其 互補決定區1~3(CDR1~3)的氨基酸序列滿足下述01)、（82)、03)、（84)、以及(87)中的任 意一項，且所述抗人CCR7抗體具有阻斷活性，所述阻斷活性不通過補體依賴性細胞溶解作 用或者抗體依賴性細胞介導性細胞毒性作用，而通過刺激CCR7配體來阻斷依賴CCR7的細胞 內信息傳導機制： (BI)具有 序列編號5所示的氨基酸序列的重鏈CDR1、 序列編號6所示的氨基酸序列的重鏈CDR2、 序列編號7所示的氨基酸序列的重鏈CDR3、 序列編號8所示的氨基酸序列的輕鏈CDR1、 序列編號9所示的氨基酸序列的輕鏈CDR2、以及 序列編號10所示的氨基酸序列的輕鏈CDR3; (B2)具有 序列編號15所示的氨基酸序列的重鏈CDR1、 序列編號16所示的氨基酸序列的重鏈CDR2、 序列編號17所示的氨基酸序列的重鏈CDR3、 序列編號18所示的氨基酸序列的輕鏈CDR1、 序列編號19所示的氨基酸序列的輕鏈CDR2、以及 序列編號20所示的氨基酸序列的輕鏈CDR3; (B3)具有 序列編號25所示的氨基酸序列的重鏈CDR1、 序列編號26所示的氨基酸序列的重鏈CDR2、 序列編號27所示的氨基酸序列的重鏈CDR3、 序列編號28所示的氨基酸序列的輕鏈CDR1、 序列編號29所示的氨基酸序列的輕鏈CDR2、以及 序列編號30所示的氨基酸序列的輕鏈CDR3; (B4)具有 序列編號35所示的氨基酸序列的重鏈CDR1、 序列編號36所示的氨基酸序列的重鏈CDR2、 序列編號37所示的氨基酸序列的重鏈CDR3、 序列編號38所示的氨基酸序列的輕鏈CDR1、 序列編號39所示的氨基酸序列的輕鏈CDR2、以及 序列編號40所示的氨基酸序列的輕鏈CDR3; (B7)具有 序列編號65所示的氨基酸序列的重鏈CDR1、 序列編號66所示的氨基酸序列的重鏈CDR2、 序列編號67所示的氨基酸序列的重鏈CDR3、 序列編號68所示的氨基酸序列的輕鏈CDR1、 序列編號69所示的氨基酸序列的輕鏈CDR2、以及 序列編號70所示的氨基酸序列的輕鏈CDR3。8. 根據權利要求7所述的抗人CCR7抗體，其滿足下述(Cl)、（ C2)、（ C3)、（ C4)、以及(C7) 中的任意一項： (Cl)具有序列編號2所示的氨基酸序列的重鏈可變區以及序列編號4所示的氨基酸序 列的輕鏈可變區； (C2)具有序列編號12所示的氨基酸序列的重鏈可變區以及序列編號14所示的氨基酸 序列的輕鏈可變區； (C3)具有序列編號22所示的氨基酸序列的重鏈可變區以及序列編號24所示的氨基酸 序列的輕鏈可變區； (C4)具有序列編號32所示的氨基酸序列的重鏈可變區以及序列編號34所示的氨基酸 序列的輕鏈可變區； (C7)具有序列編號62所示的氨基酸序列的重鏈可變區以及序列編號64所示的氨基酸 序列的輕鏈可變區。9. 根據權利要求7或8所述的抗人CCR7抗體，其為人源化抗體或嵌合抗體。10. 根據權利要求7~9中任一項所述的抗人CCR7抗體，其為抗體片段、單鏈抗體或雙抗 體。11. 一種抗人CCR7抗體，其是與人CCR7的細胞外結構域特異性結合的抗人CCR7抗體， 所述抗人CCR7抗體由以R7-01 (FERM BP-11369)、R7-02(FERM BP-11404)、R7-05(FERM BP-11371)、R7-09(FERM BP-11372)或R7-25(FERM BP-11375)為特征的雜交瘤產生，且所述 抗人CCR7抗體具有阻斷活性，所述阻斷活性不通過補體依賴性細胞溶解作用或者抗體依賴 性細胞介導性細胞毒性作用，而通過刺激CCR7配體來阻斷依賴CCR7的細胞內信息傳導機 制。12. -種抗人CCR7抗體，其競爭抑制權利要求7~11中任一項所述抗人CCR7抗體與受體 的結合，且所述抗人CCR7抗體具有阻斷活性，所述阻斷活性不通過補體依賴性細胞溶解作 用或者抗體依賴性細胞介導性細胞毒性作用，而通過刺激CCR7配體來阻斷依賴CCR7的細胞 內信息傳導機制。13. -種核酸，其編碼權利要求7~12中任一項所述的抗人CCR7抗體的重鏈可變區或輕 鏈可變區。14. 根據權利要求13所述的核酸，其由序列編號1、序列編號3、序列編號11、序列編號 13、序列編號21、序列編號23、序列編號31、序列編號33、序列編號61、或序列編號63所示的 堿基序列構成。15. -種載體，其包含權利要求13或14所述的核酸。16. -種細胞，其導入有權利要求15所述的載體。17. -種醫藥組合物，其包括： 權利要求1~3、7~12中任一項所述的抗人CCR7抗體，以及， 藥學上可接受的載體。18. 根據權利要求17所述的醫藥組合物，其用于治療組織的纖維化。19. 根據權利要求18所述的醫藥組合物，其中，所述組織的纖維化為選自肝纖維癥、腎 纖維癥、肺纖維癥、皮膚纖維癥、心血管纖維癥、消化管纖維癥以及其他纖維性疾患中的纖 維癥。20. 根據權利要求19所述的醫藥組合物，其中，所述肝纖維癥選自肝硬化、缺血再灌注、 肝移植后損傷、壞死性肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、原發性膽汁性肝硬化以及原發性硬化性 膽管炎。21. 根據權利要求20所述的醫藥組合物，其中，所述肝硬化是選自由酒精誘發、由藥物 誘發以及化學誘發中的至少一種造成的肝硬化。22. 根據權利要求19所述的醫藥組合物，其中，所述腎纖維癥選自增生性腎小球腎炎、 硬化性腎小球腎炎、腎源性纖維化性皮膚病、糖尿病性腎病、腎小管間質性纖維癥以及局灶 節段性腎小球硬化癥。23. 根據權利要求19所述的醫藥組合物，其中，所述肺纖維癥選自肺間質性纖維癥、藥 物誘發結節病、肺纖維癥、特發性肺纖維癥、哮喘、慢性阻塞性肺病、彌漫性肺泡損傷疾病、 肺高血壓癥以及新生兒支氣管肺發育不良。24. 根據權利要求19所述的醫藥組合物，其中，所述皮膚纖維癥選自硬皮病、瘢瘤性疤 痕、銀肩病、增生性疤痕以及假性硬皮病。25. 根據權利要求19所述的醫藥組合物，其中，所述心血管纖維癥選自動脈粥樣硬化、 冠狀動脈再狹窄、充血性心肌病、心臟衰竭、心臟移植以及心肌纖維癥。26. 根據權利要求19所述的醫藥組合物，其中，所述消化管纖維癥選自膠原性結腸炎、 絨毛萎縮、隱窩增生、息肉形成、克羅恩病的纖維癥、胃潰瘍愈合以及腹腔粘連術后瘢痕。27. 根據權利要求19所述的醫藥組合物，其中，所述纖維癥具有從與骨關聯的纖維化性 疾病產生的狀態，為類風濕性血管翳形成。28. -種抗體固定化擔載體，其是通過將權利要求1~3、7~12所述的抗人CCR7抗體固 定于擔載體而形成的。29. 根據權利要求28所述的抗體固定化擔載體，其用于與含有CCR7表達細胞的血液接 觸從而從所述體液中除去CCR7表達細胞。
【文檔編號】A61P9/10GK105884895SQ201610098810
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2011年9月27日
【發明人】西口直樹, 平山明義, 古谷昌弘, 清水達丈, 高山喜好, 清水朋子, 鈴木矢, 鈴木一矢
【申請人】積水化學工業株式會社, 株式會社Nb健康研究所