專利名稱：新受體的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種基本純的形式的新受體，該受體的可溶形式及其作為治療劑的應用，篩選用于通過與受體相互作用而治療疾病的化合物的方法，以及通過實施這種篩選方法發現的新化合物；涉及重組受體及其在這種篩選方法中的應用；涉及結合于該受體的單克隆和多克隆抗體的制備；涉及這種抗體作為治療劑的應用以及確定結合于該受體的治療劑有效性的方法。
WO 92\22293(Smithkline Beechamplc)描述了一族化合物，它們通過行為模型顯示具有某些CNS活性，特別是在癲癇的治療和/或預防中。描述了上述專利申請的這種化合物的一個實例為反式-(+)-6-乙酰-4S-(4-氟苯并氨基-3，4-二氫-2，2-二甲基-2H-1-苯并吡喃-3R-醇。(下文中稱為化合物A)。
WO\94\13656，WO\94\13657，WO\94\13292，WO\94\13297，PCT\EP\95\02076，PCT\EP\95\02249和PCT\EP\95\02246都描述了具有某些中樞神經系統(CNS)活性的其它化合物，特別是PCT\EP\95\02076中描述了本申請實施例4中的“冷卻”化合物，即化合物B。
上述專利中描述的化合物不結合任何已知受體，并且現在已鑒定出一種這種化合物結合的新受體。
相應地，本發明提供了一種獲自大鼠前腦組織的基本純的受體，其特征在于a)對于大鼠前腦組織，化合物A以Kd 40nM與其結合，b)對于大鼠前腦組織，化合物A以Bmax220pmol/g蛋白與其結合，c)對于大鼠前腦組織，化合物B以Kd 2nM與其結合，d)對于大鼠前腦組織，化合物B以Bmax220pmol/g蛋白與其結合，和與大鼠前腦組織享有至少85％同源性的來自其它來源的同源受體。
其它已知的抗驚厥化合物包括安定，苯妥英，戊巴比通，丙戊酸鈉，氨甲酰苯，Vigabotvin lamotrigine，乙琥胺和gabapeutin不與新受體結合。
另外，新受體可在人類和嚙齒動物成神經細胞瘤和神經膠質瘤細胞培養物中發現。它們可不經制備直接使用或通過與大腦組織相同的方法制備。在人類成神經細胞瘤細胞系如SHSYSY或IMR 32中，化合物B可以Kd為2nM和Bmnax為150pmol/g蛋白結合于新受體。
新受體通過常規技術以基本純的形式分離。例如，含新受體(如上面所述的)的組織的等分試樣(如含1至10mg蛋白/ml)與放射標記的(如125I)光親合標記化合物(如實施例6的化合物C)混合。優選光親合標記化合物在混合物中的終濃度是0.1至1000pM。該混合物適宜在室溫下溫育1小時。然后將該混合物暴露于紫外線(如來自6W燈的366nm)30分鐘。隨后通過離心活組織以去除未結合的光親合標記化合物。光親合標記的受體可通過凝膠滲透色譜法(例如使用Superose 6)在非還原條件下從其它蛋白初步分離。然后按照Bensadoun和Weinstein(Bensadoun A，和Weinstein D(1976)分析生物化學70，241-250)的方法將含受體的級分通過三氯乙酸沉淀。此蛋白級分通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進一步分離，在還原條件下，6％(w/v)棒凝膠覆蓋以5％(w/v)積層凝膠，或垂直10％(w/v)，或4-20％(w/v)梯度，板凝膠可被使用，基于Laemmli(見Lacmmli英國(1970)自然，227，680-685)的方法。受體的進一步提純可通過在固定pH梯度聚丙烯酰胺凝膠中對通過制備性SDS-PAGE制備的材料進行等電點聚焦(IEF)而獲得。
受體的分子量當通過凝膠電泳(SDS-PAGE)分析時是在130KD范圍內。
本發明的第二方面提供了上述受體的可溶形式。
所述受體的可溶形式可按照常規技術制備。
所述受體的這種可溶形式據信具有治療學用途，因而本發明延伸至使用所述受體的可溶形式作為一種治療學制劑。
本發明還延伸至所述受體的可溶形式在藥物制造中的應用，這種藥物用于治療和/或預防焦慮、躁狂，抑郁、與蛛網膜下出血或神經性休克相關的疾病，與濫用物質如可卡因、尼古丁，酒精和苯二氮類的撤藥相關的效應，用抗痙厥藥物可治療和/或預防的疾病如癲癇，帕金森氏病，精神病，偏頭痛和/或大腦缺血。
本發明還延伸至治療和/或預防焦慮、躁狂，抑郁、與蛛網膜下出血或神經性休克相關的疾病，與濫用物質如可卡因、尼古丁，酒精和苯二氮類的撤藥相關的效應，用抗痙厥藥物可治療和/或預防的疾病如癲癇，帕金森氏病，精神病，偏頭痛和/或大腦缺血的方法，該方法包含向需要此種治療的患者施用有效量或預防量的可溶性受體。
本發明還延伸至一種藥物組合物，該藥物組合物包含與藥物學上可接受的載體混合的可溶性受體。這種藥物組合物可用于治療和/或預防焦慮、躁狂，抑郁、與蛛網膜下出血或神經性休克相關的疾病，與濫用物質如可卡因、尼古丁，酒精和苯二氮類的撤藥相關的效應，用抗痙厥藥物可治療和/或預防的疾病如癲癇，帕金森氏病，精神病，偏頭痛和/或大腦缺血。
這種藥物組合物和載體在本領域中是公知的，并可通過常規技術制備。
在本發明的第三方面提供了一種篩選具有與結合所述受體相關的治療活性的化合物的方法，它包含將待測化合物與含有新受體的物質接觸并測定結合的程度。
含有新受體的物質包含但不限于來自大鼠、人類、狨、狗、貓和小鼠的腦組織。這種腦組織適合在緩沖的水性介質如5至50mM HEPES，pH 7.4 Tris/HCl緩沖液中被勻漿。被勻漿的組織可通過離心和重懸被洗滌。從這些組織制備的亞細胞級分可被使用。
被測化合物與含有新受體的物質能接觸可通過將含新受體(如上所述)的組織的等分試樣(如含1至10mg蛋白/ml)與放射標記的(如用3H或125I)待測化合物混合而進行。優選待測化合物在混合物中的終濃度為0.1至1000nM，更優選1至50nM。
該混合物適合在環境溫度溫育1小時。未結合的被測化合物隨后通過濾過從結合的被測化合物分離。這可使用Whatman玻璃纖維濾膜優選GF/B或GF/C型進行。該濾膜適合用冰冷的緩沖介質(優選在組織制備中使用的類型)洗滌。
在濾器上捕獲的結合于組織的放射性量可通過向濾膜加入液體閃爍劑后在液體閃爍計數儀中計數(用于3H)或通過在γ計數儀中直接對濾器計數(用于125I)而測定。
另外，當使用粘附于培養板的完整細胞時，未結合的被測化合物與結合的被測化合物的分離可通過用冰冷的緩沖介質洗滌細胞，隨后在氫氧化鈉溶液中溶解細胞并在液體閃爍計數儀或γ計數儀中計數，如上所述。
被測化合物的放射標記使用常規技術進行。
另外，使用常規技術，可通過測定已知結合于受體如化合物(A)和(B)的其它前述專利或申請提及或包含的化合物的放射標記化合物的置換量來確定非放射標記的測定化合物的結合親合力。
應認識到，結合于受體并可使用這種篩選方法置換的放射標記化合物是新的并且構成本發明和另一方面。
篩選方法中使用重組受體是有用的，這種重組受體可通過常規技術制備。
例如，分離新的人類受體編碼核酸的一種方法是使用本領域公認的方法(參見“分子生物學流行方法”Ausubel.F.M等(編).Creene出版社和John Wiley Interscieuce，紐約，1989，1992)用自然的或人工設計的探針探查人類基因組或cDNA文庫。所獲得的分離核酸分子可用于獲得來自人類，哺乳類或其它動物來源的基因組DNA，cDNA或RNA的互補拷貝；或用于篩查這些來源以尋找相關序列，包括上述轉錄調節和控制元件以及來自相對于編碼序列的5′和/或3′區的其它穩定，加工，翻譯和組織特異性決定區。
本發明的蛋白優選通過重組基因工程技術制造。分離的核酸特別是DNA可通過可操作地連接DNA至基團表達所需表達控制區(如，調節區)而導入表達載體。該載體可通過本領域公知的方法(Ausubel等，上文)導入適當的宿主細胞如原核(例如細菌)，或真核(例如，酵母，昆蟲或哺乳類)細胞中。已經制備或分離的所需蛋白的編碼序列，可克隆入適當的載體或復制子。許多克隆載體是本領域技術人員公知的，適當克隆載體的選取只是一個選擇的問題。用于克隆的重組DNA載體和它們可轉化的宿主細胞的實例包括噬菌體λ(大腸桿菌)，pBR322(大腸桿菌)，pACYC177(大腸桿菌)，pKT230(革蘭氏陰性細胞)，pGV1106(革蘭氏陰性細胞)，pLAFR1(革蘭氏陰性細菌)，pME290(非大腸桿菌的革蘭氏陰性細胞)，pHV14(大腸桿菌和枯草桿菌)，pBD9(桿菌)，pIJ61(鏈霉菌)，pUC6(鏈霉菌)，YIp5(酵母菌)，一種桿狀病毒昆蟲細胞系統，YCp19(酵母菌)。見“DNA”克隆卷I和II，Glover等編。IRL出版社，牛津(1985)(1987)和；J.Maniatis等(“分子克隆”冷泉港實驗室(1982))。
該基因可被置于啟動子，核糖體結合位點(用于細菌表達)和任選一種操縱基因(在本文中合稱為“控制”元件)的控制下，以便編碼所需蛋白的DNA序列被轉錄為經含有這種表達構建物的載體轉化的宿主細胞中的RNA。該編碼序列可含或可不含信號肽或前導序列。本發明的亞單位抗原可使用如大腸桿菌tac啟動子或蛋白A基因(spa)啟動子和信號序列而被表達。前導序列可在翻譯后加工中被細菌宿主去除。參見，如美國專利第4431739；4425437；4338397號。
除控制序列外，可能還希望增加調節序列以供調節宿主細胞生長相關蛋白序列表達。調節序列為本領域技術人員公知，實例包括在化學或物理刺激(包括調節化合物的存在)下引起基因的表達開啟或關閉的物質。調節元件的其它類型也可存在于載體中，例如，增強子序列。
構建表達載體以使特定編碼序列位于帶有適當調節序列的載體中，編碼序列相對于控制序列的位置和取向應使編碼序列在控制序列的“控制”下轉錄(即，在控制序列處結合于DNA分子的RNA多聚酶轉錄該編碼序列)。為達到這一點，可能需要改變編碼所研究的特定抗原的序列。例如，在一些情況下，可能需要改變該序列以便它可以適當取向連接于控制序列；即，保持閱讀框，控制序列和其它調節序列可在插入一種載體，如上述克隆載體，之前連接于編碼序列。另外，編碼序列可直接被克隆入已含有控制序列和適當限制性位點的表達載體。
在一些情況下，可能希望增加引起多肽從宿主有機體分泌的序列，隨后再剪切分泌信號。也可能希望產生所研究受體的突變型或類似物。突變型或類似物可通過編碼蛋白的序列的一部分的缺失，通過在序列中插入一段序列，和/或通過取代一或多個核苷酸而制備。改變核苷酸序列的技術，如定點突變發生，為本領域技術人員所公知。見，如，T.Maniatis等，上文；DNA克隆，卷I和II，上文；核酸雜交，上文。
許多原核表達載體在本領域中是公知的。見，美國專利第4578355；4440859；4436815；4431740；4431739；4428941；4425437；4418149；4411994；4366246；4342832號。亦見英國專利申請GB2121054；GB2008123；GB2007675；和歐洲專利申請103395。酵母表達載體在本領域中也是公知的。見，如，美國專利第4446235；4443539；4430428號，亦見歐洲專利申請103409；100561；964491。使用SV40晚啟動子以驅動哺乳動物細胞中的表達的pSV2neo(如J.Mol.Appl.Genet(分子應用遺傳學雜志)1；327-341中所述)或使用CMV啟動子以驅動表達的pCDNA1neo，一種使用CMV啟動子以驅動表達的衍生自pCDNA1載體(分子細胞生物學74125-29)。這后兩種載體可被用于在哺乳動物細胞中瞬時或穩定(使用G418抗性)表達。昆蟲表達系統，如，果蠅，也有用，參見，PCT申請美國89/05155和美國91/06838以及歐洲申請88/304093.3。
根據所選擇的表達系統和宿主，本發明的蛋白通過在所研究蛋白能被表達的條件下培養用上述表達載體轉化的宿主細胞而產生。隨后將蛋白從宿主細胞分離并提純。如果表達系統將蛋白分泌入培養基，則可直接從培養基提純蛋白。如果蛋白不被分泌，則它可從細胞溶胞產物分離或從細胞膜級分回收。在這種情況下，如果蛋白位于細胞表面，則完整細胞或分離的膜可用作所希望基因產物的可分析來源。適當培養條件和回收方法的選擇是本領域中公知的。
鑒定本發明的蛋白的另一種方法是通過構建基因文庫，使用產生的克隆去轉化大腸桿菌并使用針對所希望受體的多克隆血清或單克隆抗體收集和篩選單個克隆。
本發明的蛋白也可通過化學合成如固相肽合成生產，使用已知氨基酸序列或衍生自所研究基因DNA序列的氨基酸序例。這些方法對于本領域技術人員是公知的。肽類的化學合成不特別優選。
本發明的蛋白或它們的片段包含至少一個表位可用于產生抗體，多克隆和單克隆抗體。如果期望得到多克隆抗體，則將一種被選擇的哺乳動物(如小鼠，兔，山羊，馬等)用本發明的受體或其片段，或一種突變的受體免疫接種。經免疫接種的動物的血清被收集并按照已知方法處理。如果使用含多克隆抗體的血清，則多克隆抗體可通過免疫親合層析或其它已知方法提純。
針對本發明的蛋白及其片段的單克隆抗體也易于由本領域技術人員生產。通過使用雜交瘤技術制造單克隆抗體的常規方法是公知的。可通過細胞融合，以及其它技術如用致瘤的DNA直接轉化B淋巴細胞，或用EB病毒轉染產生永生的抗體產生細胞系。參見，M.Schreier等，雜交瘤技術“(1980)；Hammeiling等，”單克隆抗體和T-細胞雜交瘤“(1981)；kennetl等，”單克隆抗體“(1980)；也參見美國專利4341761；4399121；4427783；4444887；4452570；446917；4472500；4491632；和4493890號。針對所研究抗原產生的單克隆抗體清單，可被篩查多種特性，即，同種型，表位，親合性等。通過使用免疫親合技術，單克隆抗體在它們所針對的個別抗原的提純中有用。另外，編碼所研究單克隆抗體的基因可通過本領域公知的PCR技術從雜交技術，單克隆抗體在它們所針對的個別抗原的提純中有用。另外，編碼所研究單克隆抗體的基因可通過本領域已知的PCR技術從雜交瘤分離并在適當載體中克隆和表達。本發明的這些抗體，不管是多克隆的還是單克隆的都有其它用途，因為，它們還可用作免疫測定，RIA，ELISA等中的試劑。
在另一項實施方案中，包含受體的細胞膜級分或游離或固定于固體支持物上的分離的受體可用于測定被測的結合。當重組體細胞用于表達受體時，優選使用具有很小或無內源性受體活性的細胞，以使結合(如果有結合的話)是由于被表達的所研究受體的存在。優選細胞包括人胚腎細胞，猴腎(HEK-293細胞)，成纖維(COS)細胞，中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，果蠅或鼠L-細胞。還優選采用具有受體反應第二信使系統的宿主細胞。公知的第二信使系統包括但不限于響應結合于細胞外受體結構域，磷酸肌醇水解，腺苷酸環化酶，鳥苷酸環化酶，離子通道活性的升高或降低。在另一項實施方案中，一種特殊設計的受體結合標記可被構建。例如可通過將本發明的受體與對受體結合敏感的蛋白區融合制造一種融合蛋白。在此稱為指示域的結構域本身或與輔助分子一起能夠產生一種分析上可檢測信號，該信號指示受體配體結合。
另外，來自轉染的或轉化的細胞的細胞膜制備物可被使用。在這種情況下，分析上可測的配體的結合被測定。放射和非放射標記配體的使用在本發明中得到考慮。上述技術在配體鑒定中有用，而且在藥物篩選和藥物開發方法中也有用。
第四方面提供了在上述篩選方法中鑒定的新化合物(下文中稱為通式(X)的化合物)和可藥用的鹽，水合物或溶劑化物。
可藥用的鹽，水合物和溶劑化物可按常規方法制備。
本發明還延伸至使用通式(X)的化合物或其可藥用的鹽，水合物或溶劑化物作為治療劑。
本發明還延伸至一種治療或防止疾病的方法，它包含向需要此種治療或防止的患者施用有效量和/或預防量的通式(X)的化合物或其可藥用的鹽，水合物或溶劑化物。
本發明還延伸至在藥物制造中通式(X)的化合物的用途。這種藥物用于治療或預防焦慮，躁狂，抑郁，與蛛網膜下出血或神經性休克相關的疾病，與濫用物質如可卡因，尼古丁，酒精和苯二氮類的撤藥相關的效應，用抗痙厥藥物可治療和/或預防的疾病，如癲癇，帕金森氏病，精神病，偏頭痛和/或大腦缺血。
本發明也延伸至用于治療或防止下述疾病的藥物組合物。這些疾病包括焦慮，躁狂，抑郁，與蛛網膜下出血或神經性休克相關的疾病，與濫用物質如可卡因，尼古丁，酒精和苯二氮類的撤藥相關的效應，用抗痙厥藥物可治療和/或預防的疾病，如癲癇，帕金森氏病，精神病，偏頭痛和/或大腦缺血。該方面包含將通式(X)的化合物與可藥用的載體混合。
用所述篩選方法鑒定的這種新化合物可使用有機化學領域公知技術制備。
本發明第五方面提供了一種結合于新受體的單克隆或多克隆抗體。
這種單克隆和多克隆抗體可通過常規技術識別和制備。
本發明因此也提供了結合于新受體的單克隆或多克隆抗體作為治療劑的應用。
本發明還提供了結合于新受體的單克隆或多克隆抗體在藥物制造中的應用。這種藥物用于治療和/或預防焦慮，躁狂，抑郁，與蛛網膜下出血或神經性休克相關的疾病，與濫用物質如可卡因，尼古丁，酒精和苯二氮類的撤藥相關的效應，用抗痙厥藥物可治療和/或預防的疾病，如癲癇，帕金森氏病，精神病，偏頭痛和/或大腦缺血。
本發明還提供了一種方法，用于治療和/或預防焦慮，躁狂，抑郁，與蛛網膜下出血或神經性休克相關的疾病，與濫用物質如可卡因，尼古丁，酒精和苯二氮類的撤藥相關的效應，用抗痙厥藥物可治療和/或預防的疾病，如癲癇，帕金森氏病，精神病，偏頭痛和/或大腦缺血。該方法包含施用有效量和/或預防量的結合于新受體的單克隆或多克隆抗體。
本發明還延伸至用于治療和/或預防焦慮，躁狂，抑郁，與蛛網膜下出血或神經性休克相關的疾病，與濫用物質如可卡因，尼古丁，酒精和苯二氮類的撤藥相關的效應，用抗痙厥藥物可治療和/或預防的疾病，如癲癇，帕金森氏病，精神病，偏頭痛和/或大腦缺血的藥物組合物，它包含將單克隆或多克隆抗體與一種可藥用的載體混合。
本發明的第六方面提供了一種結合于新受體的放射標記化合物。這種放射標記化合物可通過常規技術制備。這種化合物的具體實例在實施例中描述。本發明因此也提供了結合于新受體的放射標記化合物作為診斷工具在檢測新受體中的改變或異常中的應用。這些改變可能存在于本發明中提及的與受體結合相關的疾病中。這種放射標記受體也可用作用于研究新受體性質的研究工具。優選的放射活性化合物包括實施例2至5中所給出的。
下列實施例闡明本發明。實施例1成年Wistar大鼠被處死并解剖取腦。解剖出全部前腦組織并在緩沖水性介質中均漿。均漿組織通過離心和再懸溶于相同緩沖液洗滌。離心后再懸溶的組織或新鮮使用，或在使用前冰凍保存3個月或更長時間。
濃度為1-10mg蛋白/ml的如上制備的組織的等分試樣與溶解于緩沖介質(50mM HEPES，pH7.4)中的〔3H〕化合物A的等分試樣混合。〔3H〕化合物在混合物各的終濃度在20-50mM范圍內。該混合物在室溫溫育約1小時。然后通過濾過將結合于組織的〔3H〕化合物A從未結合的〔3H〕化合物A分離。濾過是通過Whatman玻璃纖維濾膜(GF/B或GF/C)。該濾膜隨后用冰冷卻的緩沖介質(50mM HEPES，pH 7.4)快速洗滌。在濾膜加入液體閃爍劑后在液體閃爍儀中計數而測定。
為確定〔3H〕-化合物A“特異”結合量(即，對新位點特異的結合)，按照上述進行平行測定，但是在存在高濃度(1-10μM)未標記化合物情況下將〔3H〕化合物A與組織共同溫育，該未標記化合物也結合于新位點從而防止〔3H〕化合物A對此位點結合。可使用未標記的化合物A本身，但也可使用結合于新位點的其它化合物。在此未標記化合物存在下保留的〔3H〕-化合物A結合量定義為“非特異”結合。將此量從〔3H〕-化合物A結合總量(即，在無未標記化合物存在下的量)中減去以獲得〔3H〕化合物A對新位點的“特異”結合。
組織中新受體的密度和其對〔3H〕化合物A親合性的估算通過將組織與一系列濃度的〔3H〕化合物A溫育而獲得。在〔3H〕化合物A的不同濃度的特異結合(如上所定義)水平隨后被用計算〔3H〕-化合物A對新位點的解離常數(KD)和組織中此位點的密度(Bmax)。
結果化合物A的計算值為對于大鼠前腦組織Kd為40nm和Bmax為220pmol/g蛋白。
使用上述類似方法，但化合物B的濃度約為1/10；則化合物B的計算值為對于大鼠前腦組織KD為2nM和Bmax為220pmol/g。實施例2〔羧基-14C〕化合物A的合成和〔羰基-14C〕化合物1.〔羧基-14C〕4-氟苯甲酸向攪拌的無水二甲基甲酰胺中的〔14C〕氰化鉀(100 mCi，60mCi/mmol-1)懸液中加入碘化銅(I)(158mg，0.83mmol)和4-氟-碘代苯(433mg，1.95mmol)。該混合物在氮氣下回流加熱22小時。該溶液通過加入5N氫氧化鈉(2ml)堿化并用水(2ml)稀釋。該混合物用乙醚徹底提取，合并的提取物依次用飽和鹽水(2×30ml)，水(2×30ml)洗滌，在硫酸鎂上干燥，濾過并蒸發除醚。殘留物溶于乙醇(15ml)，加入氫氧化鉀(1.34g)水(8ml)溶液，產生的溶液回流加熱15小時。冷卻的反應混合物用水(20ml)稀釋，用1N鹽酸調節pH值至1-2并用乙酸乙酯徹底提取混合物。合并的提取物用水(1×50ml)洗滌，在硫酸鎂上干燥，濾過并蒸發至干，提供〔羧基-14C〕4-氟苯甲酸(196mg，1.38mmol，68.4mCi，68.4％)。2.〔羧基-14C〕化合物A將〔羧基-14C〕4-氟苯甲酸(196mg，68.3mCi，1.38mmol)，1-羥基-苯并三唑水化物(191.4mg，1.42mmol)和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(265mg，1.38mmol)溶于無水二氯甲烷(6ml)。向其中加入二氯甲烷(2.0ml)中的(3R，4S)-4-氨基-3，4-二氫-2，2-二甲基-2H-苯并[b]吡喃-3-醇(258mg，1.38mmol，含95w/w甲醇)和三乙胺(0.190ml)溶液。該混合物在環境溫度攪拌19.5小時并將溶劑在真空中蒸發。殘留物用乙酸乙酯提取(25ml)依次用稀鹽酸(2×25ml)，水(25ml)，飽和碳酸氫鈉水溶液(25ml)，水(25ml)洗滌，在硫酸鎂上干燥，濾過并蒸發至干。粗〔羧基-14C〕化合物A通過柱層析提純(硅膠40g，用乙酸乙酯/己烷1∶3v/v洗脫以去除非極性雜質并用100％乙酸乙酯洗脫〔14C〕化合物A)產生〔14C〕化合物A(179.7mg，0.50mmol)。此物質的一部分(130mg)通過半制備性HPLC(Spherisorb 5W硅膠22.5×250mm柱，用氯仿/甲醇95∶5v/v)以1010ml/min洗脫)以提供〔14C〕化合物A(107mg)。此批在水中平衡6小時，隨后在真空中徹底干燥。該產物放射化學純度為99.7％，光學純度＞99％，化學純度為95.5％(“如是”)，比活為59.6Ci.mmol-1。1H NMR譜與結構一致，并且與WO 92/22293中制備的未標記化合物相同。分析系統在下面描述。圖解式1〔14C〕化合物A的合成
〔14C〕化合物A*指碳-14放射標記實施例3〔羧基-14C〕的合成，(3S，4S)-6-乙酰基-3，4-二氫-2，2-二甲基-4-(3-氯-4-氟-苯基〔14C〕羰基氨基)-2H-苯并〔b〕吡喃-3-醇的合成3-氯-4-氟苯并〔14C〕腈將3-氯-4-氟碘代苯(472.8mg，184mmol)。〔14C〕氰化鉀(比活為60mCi.mmol-1時100mCi，1.67mmol，108.8mg)和碘化銅(I)(173.9mg，0.91mmol)懸溶于N-甲基吡咯烷酮(4.5ml)中。
該混合物隨后在氮氣下加熱至150℃，同時攪拌，總共19.25小時，并放置于室溫49小時。通過TLC(硅膠，用乙酸乙酯/正-己烷1∶5v/v洗脫)檢測顯示反應進行至約73％轉化。該反應混合物隨后在水(100mL)和乙酸乙酯(100mL)間分開。有機層依次用2％w/v氯化鐵溶液(100mL)，水(100mL)，2％w/v偏二硫化鈉溶液(100mL)，水(100mL)和鹽水(100mL)洗滌。然后將有機層在硫酸鎂上干燥，濾過以去除干燥劑，在減壓下蒸發干燥并將殘留物在硅膠(MerckArt.9385)上進行柱層析，用1∶8乙酸乙酯/正己烷洗脫。收集相關級分并合并以提供合約72.7mCi(相當于1.21mmol，188mg，72.7％收率)3-氯-4-氟苯并〔14C〕腈的溶液。
3-氯-4-氟苯并〔14C〕羧酸的合成3-氯-4-氟苯并〔14C〕腈(在60mCi.mmol-1的比活下36mCi；0.6mmol，94.5mg)的乙酸乙酯/正己烷1∶8v/v(85mL)溶液被還原后在減壓下干燥。殘留物被懸溶于濃鹽酸(8.0mL)并加熱至100℃，同時攪拌，在氮氣下，6小時。約每間隔1小時攪拌混合物以使升華的物質洗滌入混合物中。該混合物冷卻并在室溫下過夜。該混合物隨后水(30mL)乙酸乙酯(40ml)間分層。水層用乙酸乙酯(40mL)再次提取；合并有機層提取入2M氫氧化鈉溶液(40mL)。將有機層再提取兩次入2M氫氧化鈉溶液(2×20ml)。合并的堿性水溶液通過加入濃鹽酸小心地酸化至pH1。將水溶液隨后提取兩次入乙酸乙酯(2×80mL)合并層，在硫酸鎂上干燥并濾過以去除干燥劑。用小量乙酸乙酯(總量50mL)洗滌沉淀數次并將洗滌物與濾過物合并。所有溶劑隨后在減壓下蒸發以提供固體(75mg，0.43mmol，71.7％收率)3-氯-4-氟苯并〔14C〕羧酸。
(3S，4S)-6-乙酰基-3，4-二氫-2，2-二甲基-4-(3-氯-4-氟-苯基〔14C〕羰基氨基)-2H-苯并〔b〕吡喃-3-醇的合成3-氯-4-氟苯并〔14C〕羧酸(75mg，0.43mmol)被溶于DMF(2.5mL)。向此溶液加入羥基苯并三唑(82.6mg，0.61mmol，1.42eq)〔在真空下在室溫干燥24小時〕和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(113.8mg，0.59mmol，1.37eq)〔在真空下在室溫干燥24小時〕并將混合物在室溫攪拌30分鐘。加入(3S，4S)-6-乙酰-3，4-二氫-2，2-二甲基-4-氨基-2H-苯并〔b〕吡喃-3-醇(150mg，0.64mmol，1.49eq)的DMF(2.5mL)溶液并將混合物在室溫攪拌過夜。將混合物在水(50mL)和乙酸乙酯間分配；水層再次提取入乙酸乙酯(80mL)。合并有機層，用水(50mL)洗滌，在硫酸鎂上干燥并濾過以去除干燥劑。干燥劑在濾器上用乙酸乙酯洗滌(50mL)；合并濾過液和洗滌并在減壓下蒸發至干燥，殘留物在硅膠進行柱層析，用乙酸乙酯/正-己烷1∶1v/v洗脫。合并相關柱級分，在減壓下蒸發至干燥，如此獲得的泡沫狀殘留物從丙酮/正-己烷再結晶以提供一種白色固體產物，它在真空干燥以得到123.5mg，0.31mmol，72％收率的(3S，4S)-6-乙酰基-3，4-二氫-2，2-二甲基-4-(3-氯-4-氟苯基〔14C〕羧基氨基)-2H-苯并〔b〕吡喃-3-醇。該產物具有98.7％的放射化學純度。99.4％的化學純度(“如是”)，99.9％的手性純度和59.4mCi.mmol-1的比活。1H NMR譜與結構一致并且與按照前述專利中所描述制備的未標記化合物相同。實施例4〔125I〕化合物B未標記化合物B與二(三丁基錫)的鈀(II)催化偶聯產生三丁基錫烷衍生物。隨后在3％乙酸的醇溶液中在存在1.0-2.0μg氯胺-T作為氧化劑時，通過用5.0mCi碘-〔125I〕化鈉對100μg部分的丁基錫烷衍生物進行放射性碘脫錫烷化而獲得且目標碘-125標記化合物，即化合物B-〔125I〕。此方法產生3.4-3.9mCi(68-78％放射化學收率)的〔125I〕化合物B，在HPLC(Baher硅膠柱，4.6mm ID×25cm，98∶2己烷/異丙醇，以1.0ml/分洗脫，在230nm處用紫外線監測)純化后放射化學純度至少為99％，比活(來自對質量和放射活性濃度的測定)測定為1775-1800 Ci/mmol。
實施例5〔3H〕化合物A將化合物D(1.0-1.2mg，1.9-2.4μmol)溶于1.0ml 9∶1(v/v)DMF(Baker)/三乙胺(Aldrich)。向此溶液中加入1.0-1.2mg(100重量％)的10％披鈀碳(Aldrich)。此反應混合物在環境溫度中在3.6-4.9Ci氚氣環境下攪拌。
通過加入甲醇(3×2ml)繼以真空轉移去除揮發性成分。留下108-146mCi的粗產物。放射HPLC分析顯示此物質含61-60％〔3H〕化合物A。此物質以4至次注射通過反相HPLC提純(Beckman Octyl，4.6×250mm柱，乙腈/水/三氟乙酸(40∶60∶0.1)，在220-240nm處紫外線檢測，1ml/分流速)。對應于產物的洗脫液被冷凍干燥隨后溶于乙醇以提供24-25mCi〔3H〕化合物A。分析得到21.5-29Ci/mmol的特異活性(通過化學電離作用-質譜測定的同位素豐度，NH3試劑氣體)和至少99％的放射化學純度(Ultrasphere ODS 5μm，4.6×250mm柱，乙腈/水/三氟乙酸線性梯度從34∶66∶0.1至90∶10∶0.1大于10分鐘，速度為1.0ml/分，在230nm處紫外線檢測。并通過在線放射活性流式閃爍監測儀檢測放射活性活性)。
化合物D3H化合物A實施例6化合物C
通過在標準條件下ipso取代導入放射標記{Na[125I]I(不加載體)/氯胺-T}8-三丁基錫烷制備光親合標記〔125I〕6-乙基-3，4-二氫-2，2-二甲基-8-〔125I〕碘-4S-〔3-{三氟甲基-3H-diazirin-3基}苯甲酰基〕-2H-苯并[b]吡喃-3R-醇，并將粗〔125I〕6-乙酰基-3，4-二氫-2，2-二甲基-8-〔125I〕碘-4S-〔3-{三氟甲基-3H-diazirin-3基}-苯甲酰氨基〕-2H-苯并[b]吡喃-3R-醇，通過HPLC{Novapak C18用0.1％TFA水溶液/乙腈(1∶1v/v)}〔125I〕SB-224172提純，通過將6-乙酰基-3，4-二氫-2，2-二甲基-8-碘-4S-氨基-2H-苯并[b]吡喃-3R-醇與六丁基錫和二溴鈀二(三苯膦)反應并隨后與3-〔3-(三氟甲基)-3H-diazirin-3-基〕苯甲酸縮合而制備錫烷。流程圖
實施例7a)3-(1，1-Diazirino-2-三氟乙基)苯甲酸向二噁烷(10ml)和0.2MKOH(63ml)溶液中的按照M.Ceruso和G.D.Prestwich，Bioorg和Med Cgem Letts，1994，4-2179-2184制備的2.7g 3-(1，1，diazirino-2-三氟乙基)芐醇攪拌溶液中分批在2.5h內加入KMNO4(2.45g)。該混合物隨后通過硅藻土墊濾過以去除過剩的MnO2并將濾過液用醚提取。水性層用1M H2SO4(25ml)酸化用醚提取。有機層用水，鹽水洗滌并在無水Na2SO4上干燥。濾過并在真空中蒸發以得到淺黃色固體的化合物(2.45g)。b)反式-6-乙酰-4S-(3-(1，1-diazirino-2-三氟乙基)-苯甲酰氨基)-3，4-二氫-2，2-二甲基-8-碘-2H-1-苯并吡喃-3-醇(化合物C)向干燥DMF(2ml)中的上述diazirinyl苯甲酸(0.124g)溶液加入乙基二甲基氨基丙基碳化二亞胺鹽酸鹽(0.095g)和1-羥基苯并三唑(0.067g)。此溶液在室溫攪拌10分鐘。將反式6-乙酰基-4R-氨基-3，4-二氫-2，2-二甲基-8-ido-2H-1-苯并吡喃-3S-醇(0.015g，按照PCT/EP/95/02249)的描述1和實施例8制備)加入此溶液中并繼續攪拌3小時。將混合物倒入水中并用乙酸乙酯提取。有機層用稀鹽酸，水，飽和NaHCO3溶液和鹽水洗滌并在無水Na2SO4上干燥。濾過并在真空中蒸發以得到粗固體(0.37g)并將它從乙酸乙酯正己烷重結晶以產生作為晶體的實施例7的化合物。熔點109-100℃[α]D25+55.3°(MeOH，c＝1.1)
權利要求
1.一種獲自大鼠前腦組織的基本純的受體，其特征在于a)對于大鼠前腦組織，化合物A以Kd 40nM與其結合，b)對于大鼠前腦組織，化合物A以Bmax220pmol/g蛋白與其結合，c)對于大鼠前腦組織，化合物B以Kd 2nM與其結合，d)對于大鼠前腦組織，化合物B以Bmax220pmol/g蛋白與其結合，以及與大鼠前腦組織有至少85％同源性的來自其它來源的同源受體。
2.按權利要求1所定義的受體的可溶形式。
3.按權利要求1所定義的受體，其分子量經凝膠電泳(SDS-PAGE)分析在130K道爾頓左右。
4.按權利要求2所定義的受體可溶形式作為治療劑的應用。
5.按權利要求2所定義的受體可溶形式在藥物制備中的應用，這些藥物用于治療和/或預防焦慮、躁狂、抑郁、與蛛網膜下出血或神經性休克相關的疾病，與濫用物質如可卡因、尼古丁，酒精和苯二氮類的撤藥相關的效應。用抗痙厥藥物可治療和/或預防的疾病，如癲癇，帕金森氏病，精神病，偏頭痛和/或大腦缺血。
6.一種方法，用于治療和/或預防焦慮，躁狂，抑郁、與蛛網膜下出血或神經性休克相關的疾病，與濫用物質如可卡因、尼古丁，酒精和苯二氮類的撤藥相關的效應。用抗痙厥藥物可治療和/或預防的疾病，如癲癇，帕金森氏病，精神病，偏頭痛和/或大腦缺血，該方法包含向需要的患者施用有效量或預防量的按權利要求2的定義的可溶性受體。
7.一種藥物組合物，用于治療或預防焦慮、躁狂，抑郁、與蛛網膜下出血或神經性休克相關的疾病，與濫用物質如可卡因、尼古丁，酒精和苯二氮類的撤藥相關的效應。用抗痙厥藥物可治療和/或預防的疾病如癲癇，帕金森氏病，精神病，偏頭痛和/或大腦缺血，它包含與藥學上可接受載體混合的按權利要求2所定義的可溶性受體。
8.一種方法，用于篩選具有與結合于按權利要求1所定義受體相關的治療活性的化合物；它包含使被測化合物與存在新受體的物質相接觸并測定結合度。
9.一種放射標記化合物，它結合于按權利要求1所定義的受體并可使用按權利要求8中所定義的篩選方法被取代。
10.一種新化合物及其可藥用的鹽，水合物或溶劑化物，它在按權利要求8所定義的篩選方法中被鑒定。
11.權利要求10的化合物或其可藥用的鹽，水合物或溶劑化物作為治療劑的應用。
12.一種治療或預防疾病的方法，它包含向需要的患者施用有效和/或預防量的按權利要求10所定義的化合物或其可藥用的鹽，水合物或溶劑化物。
13.按權利要求10所定義的化合物在藥物制造中的應用，這些藥物用于治療或預防焦慮、躁狂，抑郁、與蛛網膜下出血或神經性休克相關的疾病，與濫用物質如可卡因、尼古丁，酒精和苯二氮類的撤藥相關的效應。用抗痙厥藥物可治療和/或預防的疾病如癲癇，帕金森氏病，精神病，偏頭痛和/或大腦缺血。
14.一種藥物組合物，用于治療或預防焦慮、躁狂，抑郁、與蛛網膜下出血或神經性休克相關的疾病，與濫用物質如可卡因、尼古丁，酒精和苯二氮類的撤藥相關的效應。用抗痙厥藥物可治療和/或預防的疾病如癲癇，帕金森氏病，精神病，偏頭痛和/或大腦缺血，它包含將按權利要求10所定義的化合物與一種可藥用的載體混合。
15.一種單克隆或多克隆抗體，它結合于按權利要求1所定義的受體。
16.按照權利要求15所定義的結合于新受體的單克隆或多克隆抗體作為治療劑的應用。
17.按權利要求15所定義的結合于新受體的單克隆或多克隆抗體在藥物制造中的應用，這些藥物用于治療或預防焦慮、躁狂，抑郁、與蛛網膜下出血或神經性休克相關的疾病，與濫用物質如可卡因、尼古丁，酒精和苯二氮類的撤藥相關的效應。用抗痙厥藥物可治療和/或預防的疾病如癲癇，帕金森氏病，精神病，偏頭痛和/或大腦缺血。
18.一種方法，用于治療或預防焦慮、躁狂，抑郁、與蛛網膜下出血或神經性休克相關的疾病，與濫用物質如可卡因、尼古丁，酒精和苯二氮類的撤藥相關的效應。用抗痙厥藥物可治療和/或預防的疾病如癲癇，帕金森氏病，精神病，偏頭痛和/或大腦缺血，它包含施用有效量和/或預防量的按權利要求15所定義的結合于新受體的單克隆或多克隆抗體。
19.一種藥物組合物，用于治療或預防焦慮、躁狂，抑郁、與蛛網膜下出血或神經性休克相關的疾病，與濫用物質如可卡因、尼古丁，酒精和苯二氮類的撤藥相關的效應。用抗痙厥藥物可治療和/或預防的疾病如癲癇，帕金森氏病，精神病，偏頭痛和/或大腦缺血，它包含將按權利要求15所定義的單克隆或多克隆抗體與可藥用的載體混合。
20.一種放射活性標記的化合物，它結合于按權利要求1定義新受體。
21.按權利要求20所定義的結合于新受體的放射標記化合物作為診斷工具的應用，用于檢測按權利要求1所定義的新受體的改變或異常。
全文摘要
一種獲自大鼠前腦組織的基本純的受體,其特征在于:a)對于大鼠前腦組織,化合物A以Kd40nM與其結合,b)對于大鼠前腦組織,化合物A以B
文檔編號C07D311/68GK1175262SQ95197647
公開日1998年3月4日 申請日期1995年12月11日 優先權日1994年12月17日
發明者H·J·赫登, J·C·杰曼, W·N·陳 申請人:史密絲克萊恩比徹姆有限公司