高活性人細胞因子Eotaxin-2的制備方法及應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及基因工程和食品醫藥技術領域，特別涉及一種高活性人細胞因子 Eotaxin-2的快速、大量制備方法及用途。
【背景技術】
[0002] 高活性細胞趨化因子Eotaxin-2屬于β趨化因子或CC化學趨化因子家族的成員，是 一種分子量多為8-10kDa的一種蛋白質。以近Ν-端處有2個相鄰的半胱氨酸為特征。通過與 具有7個跨膜區的G蛋白偶聯受體即趨化因子受體結合，激活細胞內的信號轉導通路，在細 胞的迀移中發揮了重要作用。
[0003] 目前越來越多的研究表明Eotaxin-2的趨化因子受體CCR3在炎癥反應、過敏性哮 喘等疾病中發揮著關鍵作用，是重要的藥物靶點，通過阻斷CCR3的信號傳導途徑將有望大 大緩解或徹底治愈炎癥及過敏性哮喘等相關疾病。因此，Eotaxin-2作為趨化因子的重要的 組成部分，其研究受到了廣泛的關注。
[0004] 在1997年及1999年又分別發現了Eotaxin-2和Eotaxin-3,二者的基因都位于 7qll. 23,他們的生物學作用非常相似，Eotaxin-2的趨化活性與Eotaxin-Ι相似，但氨基酸 的同源序列只有39%，而Eotaxin-3與Eotaxin-Ι氨基酸的同源序列只有37 %，Eotaxin-3對 嗜酸性粒細胞的趨化活性是Eotaxin-2和Eotaxin-l的10%(李靜.趨化因子eotaxin及其受 體與支氣管哮喘[J].國際兒科學雜志，2006,33(3) :406-408)。
[0005] Eotaxin-2由78個氨基酸組成，其分子量為8.8X103，Eotaxin-2的結構包括一個 螺旋，隨后是3個反向平行的β片層和一個α螺旋。N-loop通過兩個保守的二硫鍵將N-末端/ N-loop區域與β片層連接在一起。與CCR3的N-末端區域相對的線性肽與Eotaxin-2結合，誘 導許多氨基酸殘基濃度依賴的化學位移改變或線性增加。這些氨基酸殘基的移動表明肽與 N-loop和β2_β3發卡結構之間的表面的擴展槽結合。受體肽也可能與趨化因子的N-端和α螺 旋的部分相互作用。Eo tax in-2的結構與趨化因子結構的不同之處，可能對其與受體結合的 特異性相關（Mayer K.L.，Stone M.J. .NMR solution structure and receptor peptide binding of the CC chemokine eotaxin-2[J].Biochemistry,2000,V39(29):8382-8395)。
[0006] 目前Eotaxin-2的獲得由兩種主要途徑:從活體中天然提取和用基因工程的方法 進行基因克隆到原核細胞中進行異源表達。第一種方法產量低，成本過高，不利于大規模生 產，第二種方法經常會產生過量表達，然而過量表達會產生不溶和無活性的多肽，不溶的聚 集物通常形成包涵體(劉華，李敏.基因重組蛋白的表達系統與分離純化研究進展[J].福建 師范大學報，2007,23(1): 100-104;Proudfoot A.E.I.，Borlat F. .Chemokine Protocols [M].Humana Press,New York,2002,7587)。
[0007] 重組蛋白被包裹在包涵體中是不具有生物活性的，必須重新增溶、變性和復性以 促進分子內正確二硫鍵和自然構象的形成，這個過程由于增加了許多色譜分離純化步驟而 比較費時且復性效果不好。因此，需要建立一個更加快速、高效的趨化因子表達系統，不僅 可溶性蛋白表達量高，而且分離純化步驟簡單。

【發明內容】

[0008] 本發明所要解決的技術問題在于:提供了一種簡便、快速、低成本、高產量、高純度 的細胞趨化因子Eotaxin-2的制備方法，并對其活性進行了驗證。
[0009] 為解決上述技術問題，本發明提供了一種高活性細胞因子的制備方法，包括如下 步驟：
[0010]步驟1:根據NCBI數據庫中Eotaxin-2的氨基酸序列，對其密碼子進行了優化，人工 合成目的基因；
[0011] 步驟2:通過設計引物在其N端引入一個或多個His標簽、TEV酶切位點，并在N端和C 端分別引入限制性酶切位點EcoR I和Hind III;
[0012] 步驟3:利用PCR技術將目的片段進行擴增，再將基因片段雙酶切后連接到用相同 酶切割后的載體上面，而后導入大腸桿菌中進行異源表達，生產Eotaxin-2蛋白。
[0013] 所述步驟1中，所得人工合成目的基因的核苷酸序列優選為：GTT GTT ATT CCG TCA CCG TGC TGT ATG TTT TTC GTT TCG AAA CGT ATT CCG GAA AAC CGC GTT GTT AGT TAT CAG CTG AGC TCT CGT TCC ACC TGC CTG AAA GGC GGC GTC ATC TTT ACC ACG AAA AAA GGC CAG CAA TTC TGT GGT GAT CCG AAA CAG GAA TGG GTG CAA CGT TAC ATG AAA AAT CTG GAC GCG AAA CAG AAA AAA GCG AGC CCG CGT GCA CGC GCA GTG GCA TAA。
[0014] 所述步驟2中，所得修飾后的人工合成目的基因的核苷酸序列優選為：
[0015] EcoR I site 6XHis TEV cleavage site Hindlllsite
[0016] 5-tatagtgaattc|G\GG\ 丁 GATGAGGAGGX^gaaaacctgtattttcagggt- Eotaxin-2-TAAAAGCTTACT-3。
[0017]所述高活性細胞因子的制備方法，可以進一步包括：
[0018] 步驟4:將誘導表達后的大腸桿菌收集、高壓破碎、離心、過濾、鎳柱親和層析、凝膠 過濾脫鹽、酶切除去His標簽后得到純度很高的蛋白。
[0019] 為解決上述技術問題，本發明還提供了一種人工合成目的基因，所述基因是根據 NCBI數據庫中Eotaxin-2的氨基酸序列，對其密碼子進行了優化，人工合成目的基因；
[0020] 所得人工合成目的基因的核苷酸序列為：GTT GTT ATT CCG TCA CCG TGC TGT ATG TTT TTC GTT TCG AAA CGT ATT CCG GAA AAC CGC GTT GTT AGT TAT CAG CTG AGC TCT CGT TCC ACC TGC CTG AAA GGC GGC GTC ATC TTT ACC ACG AAA AAA GGC CAG CAA TTC TGT GGT GAT CCG AAA CAG GAA TGG GTG CAA CGT TAC ATG AAA AAT CTG GAC GCG AAA CAG AAA AAA GCG AGC CCG CGT GCA CGC GCA GTG GCA TAA〇
[0021] 為解決上述技術問題，本發明另提供了一種人工合成目的基因，所述基因是根據 NCBI數據庫中Eotaxin-2的氨基酸序列，對其密碼子進行了優化，人工合成目的基因；并通 過設計引物在其N端引入一個或多個His標簽、TEV酶切位點，并在N端和C端分別引入限制性 酶切位點EcoR I和Hind III;
[0022] 所得修飾后的人工合成目的基因的核苷酸序列為：
[0023] EcoR I site 6XHis TEV cleavage site Hindlllsite
[0024] S-TATAGTGAATTcICACCATCATCACCACCAliGAAAACCTGTATTTTCAGGGT-Eotaxin-2-TAAAAGCTTACT-3。
[0025] 為解決上述技術問題，本發明又提供了一種如前述任一項所述高活性細胞因子的 制備方法在制備治療變應性鼻炎、哮喘、結直腸腫瘤、鼻息肉、艾滋病(HIV)、過敏性疾病、寄 生蟲感染、系統性疾病、和/或炎癥及免疫相關疾病的藥物中的應用。
[0026] 為解決上述技術問題，本發明再提供了一種如前述任一項所述人工合成基因在制 備治療變應性鼻炎、哮喘、結直腸腫瘤、鼻息肉、艾滋病(HIV)、過敏性疾病、寄生蟲感染、系 統性疾病、和/或炎癥及免疫相關疾病的藥物中的應用。
[0027] 為解決上述技術問題，本發明另提供了一種如前述任一項所述高活性細胞因子的 制備方法和/或所述人工合成基因，在治療變應性鼻炎、哮喘、結直腸腫瘤、鼻息肉、艾滋病 (HIV)、過敏性疾病、寄生蟲感染、系統性疾病、和/或炎癥及免疫相關疾病的藥物設計方面 的應用。
[0028] 所述的表達載體為普通大腸桿菌表達載體，優選質粒pET28a、pET32a、pMAL-p4X， 分別對應于大腸桿菌宿主菌BL21 (DE3)、0rigami、TB1。
[0029] 本發明還進一步對所用表達載體、誘導時機、誘導溫度和時間進行了優化，最終優 化的表達條件為:表達載體選用pET28a、0D 6(x) = 1.0~1.2、誘導時間為8h、誘導溫度為25°C。
[0030] 本發明方法還可以用SDS-PAGE、質譜方法對制備得到的蛋白的純度和分子量進行 了分析和驗證，用表面等離子共振技術(SPR)對制備得到的Eotaxin-2的生物活性進行了表 征。
[0031 ]本發明制備得到的Eotaxin-2純度很高且有生物活性，在相關疾病的治療和藥物 的設計方面顯示了很大的應用前景。
[0032]本發明有益的技術效果在于：
[0033] 1.本發明為運用基因工程技術，將Eotaxin-2基因進行了優化，并在其N端加入了 能與Ni柱特異性結合的His標簽以及后續可以去除標簽的TEV酶切位點，在N端和C端分別加 入限制性酶切位點EcoR I和Hind III，連接到表達載體上然后轉入相應的大腸桿菌表達體 系中，在菌體〇D6Q()= 1.0~1.2時加入IPTG誘導蛋白表達。這一生產過程生產周期為12個小 時，同時大腸桿菌易于實現高密度大規模培養，從而大大縮短了培養時間，降低生產成本。 [0034] 2.大腸桿菌細胞容易破碎，且含雜蛋白比較少，因為是誘導型表達，有利于目的蛋 白的富集和反應過程的調控，使得下游純化過程變得更加簡單，容易獲得低成本、高產量、 高純度的Eotaxin-2蛋白。
[0035] 3、本發明通過優化最終選擇表達菌株pET28a/BL21(DE3)，使Eotaxin-2水溶性表 達量高，包涵體形成較少，所得蛋白結構折疊正確，具有生物活性。培養1L大腸桿菌可以獲 得3.87mg左右的蛋白，和傳統提取方法相比產量提高很多倍。
[0036] 4、本發明Eotaxin-2的分離純化過程簡單，只經過鎳柱親和層析和凝膠層析兩步， 減少了過多的分離純化步驟對蛋白活性和產量的影響。
[0037] 5、在蛋白的純化過程中雜蛋白組氨基酸的含量比較少，在與目的蛋白進行競爭性 結合Ni柱時，由于結合力較弱非常容易就被少量的咪唑洗脫下來，而目的蛋白用500mM的咪 唑洗脫，從而得到純度很高的蛋白。
[0038] 6、本發明中通過Eotaxin-2表達體系的選擇、表達條件的優化和表達過程的調控， 進一步提高了蛋白的產量，并且獲得的蛋白中單體比較多，二聚體和寡聚體很少。
[0039] 7、本發明用表面等離子共振技術（SPR)對制備得到的Eotaxin-2的生物活性進行 了驗證，通過活性實驗可以看出本實驗室制備的Eotaxin-2比商業化的Eotaxin-2與CCR3的 結合親和力高10倍左右，因此在相關疾病的治療和藥物的設計方面顯示了更大的應用前 景。
【附圖說明】
[0040] 圖1為本發明細胞因子Eotaxin-2表達載體PET28a-Eotaxin-2基因的構建圖。<