BI、化 est、Swiss-p;rot、Unigene、Refseq、n;r-aa、PRF或PDBSTR。
【附圖說明】
[0038] 為了更完全地了解本發明，現結合附圖進行W下說明，其中：
[0039] 圖1是顯示THP-1細胞對CX化17的反應性的結果的圖。圖1A，在針對CX化17引導的 趨化現象的transwell檢驗中，在休眠或PGE2預處理條件下測試THP-1細胞;另外，在用百日 咳桿菌(Bordetella pedussis)毒素(PTX)預處理之后，W相同方式測試運些細胞。各條柱 顯示在化answe 11板的下部小室中回收的細胞(受趨化的細胞）的總數。圖1B，當用1 OOnM的 CX化17刺激時，在休眠或PGE2處理條件下THP-1細胞(負載化敏感性染料)的代表性巧流動 反應。η = 2Χ，對于THP-1細胞表達的CX化17受體的去敏化，在指定時間點替代性添加 l(K)nM 的CX化17或(XL2W誘導細胞巧流動反應。顯示了代表性曲線，n = 3。
[0040]圖2是表示典型趨化因子受體特征的示意性圖式。圖2A，在人染色體2長臂的遠端 區域中GPR35基因的位置;如所描繪的，有可能在近側觀察到鄰近的CXCR7基因。圖2B，有關 已知趨化因子受體的蛋白質序列的系統發生分析，顯示出與GPR35最密切相關的成員是 CXCR7。圖2C，在休眠單核細胞中含量最豐富的趨化因子受體的蛋白質序列相應地與BIGE (0：尺1(沈9 10側.3)、(：0?2(569 10側.1)、(：0?5(569 10側.2)及〔乂0?4(569 10側.4))加 CXCR7(SEQ ID N0.5)和GPR35(SEQ ID ^.6)的比對。保守水平在每個氨基酸背景中^深灰 色陰影顯示。示出了屯個跨膜(TM)結構域。框形指示DRY盒和Τ邱基序;箭頭描繪了在第二個 ΤΜ區域處的保守天冬氨酸。還示出了共同序列（SEQ ID NO.7)。
[0041 ] 圖3是顯示在THP-1細胞中GPR35表達的結果的圖。圖3A，通過qRT-PCR測量的在休 眠或PGE2處理的THP-1細胞中GPR35的相對表達情況。數據用樣品中GAPDH的相對表達水平 標準化。代表性實驗，n = 2。圖3B，通過流式細胞術測量的GPR35蛋白的表達情況，比較了在 休眠 THP-1細胞(呈陽性)和Ba/F3細胞(呈陰性）中GPR35的表達情況與同型對照物(兔IgG)。
[0042] 圖4是顯示CX化17通過GPR35誘導細胞巧調動的結果的圖。圖4A，添加 CX化17 [lOOnM]后，在負載化"敏感性染料的模擬轉染或GPR35短暫轉染的Ba/F3細胞中的巧流動反 應。示出了進行的3個實驗的代表性曲線。圖4B，添加不同量的CX化17后，在GPR35轉染的Ba/ F3細胞中所觀察到的劑量-反應關系。
[0043] 圖5是顯示在來自BIGE數據庫的人體的不同細胞或組織中GPR35的相對表達情況 的表(表1)。數據表示微陣列分析并且平均強度是指對應于GPR35的探針集與對應于運些組 織/細胞中的每一個的mRNA雜交的能力。
[0044] 圖6是顯示皿K293細胞中GPR35的表達使其對CX化17起反應的曲線。用含有人 GPR35編碼序列的表達載體轉染皿K293細胞，并在轉染后72小時用材料與方法部分中所描 述的Ca"調動方法進行分析。在標記的時間點，添加10化g的CX化17刺激細胞。
[0045] 圖7是顯示粘膜趨化因子CX化14或CCL28不誘導GPR35信號傳導的曲線。利用在指 定時間點獨立添加的人CX化17、CX化14及(XL28(濃度是lOOnM)測試GPR35/CXCR8轉染的Ba/ F3細胞的化"調動情況。
[0046] 圖8是顯示人單核細胞表達的GPCR的表(表2)。圖8A和8B分別包括該表的一部分。
[0047] 圖9是顯示針對若干趨化因子受體的放射性配體置換研究的結果的表(表3)(n.d. 表示無法檢測）。
[0048] 圖10是顯示趨化因子誘導的β-抑制蛋白（arrestin)募集的結果的表(表4)。
[0049] 圖11是顯示在感染沙口氏菌的小鼠中巧CR8和巧化17的表達情況的一系列圖。
[0050] 圖12是顯示巧CR8在小鼠潰瘍性結腸炎模型中升高的圖。
[0化1]圖13是顯示CXCR8:CX化17介導的趨化作用與CCR2(-種重要的巨隧細胞趨化蛋 白）相當的圖。
[0化2] 圖14是來自各種動物的CXCR8的序列比對。比對是使用化USTAL Omega多序列比對 工具進行（Sievers和Hi邑邑ins ,Clustal Omega accurate alignment of very large numbers of sequences.Methods Mol Biol.2014;1079:105-16)。在該圖中，顯示了共同殘 基，其中（*)指示在特定殘基處具有完全序列相似性，而（.）和（：）指示在特定殘基處具有部 分序列相似性。沒有符號指示在該特定殘基處不具有顯著序列相似性。顯示了來自貓(SEQ 10顯.8)、牛（569 10^.9)、智人（569 10顯.10)、黑猩猩（569 10顯.11)、雜猴(569 10 ^.12)、大鼠（569 10^.13)及小鼠（569 10^.14)的〔乂〇?8序列。圖144和148分別包括該 比對的一部分。
[0化3] 圖15是來自各種動物的CX化17的序列比對。比對是使用化USTAL Omega多序列比 對工具進行的。在該圖中，顯示了共同殘基，其中（*)指示在特定殘基處具有完全序列相似 性，而（.）和（：）指示在特定殘基處具有部分序列相似性。沒有符號指示在該特定殘基處不 具有顯著序列相似性。顯示了來自小鼠 （SEQ ID NO.15)、大鼠 （SEQ ID NO.16)、牛（SEQ ID NO. 17)、貓(SEQ ID NO. 18)、雜猴（SEQ ID NO. 19)、智人(SEQ ID NO. 20)及黑猩猩(SEQ ID NO. 21)的CX化17序列。
[0054] 圖16是顯示在膜蛋白適度交聯后對巧化17的趨化反應的圖。
【具體實施方式】
[0055] W下申請通過引用并入本文中：2013年9月30日提交的美國臨時專利申請號61/ 884,576。
[0056] 已知趨化因子和趨化因子受體可用于控制體內細胞的遷移，而且還可W改變表達 針對給定配體的適當受體的應答細胞的內環境穩定（1，15)。本發明的實施方案部分基于鑒 別出趨化因子CXCL17的同源受體，WG蛋白偶聯受體GPR35表示。作為該鑒別的結果，現依據 趨化因子受體命名法確立的指導原則將GPR35重新命名為CXCR8( 1)。
[0057] 巧化17趨化因子(包括物種對應物）
[005引趨化因子CX化17存在于人類（基因座標簽UNQ473/PR0842)(Q6UXB2(UniParc)) (NP_940879.1)、小鼠（NCBI基因 ID: 284340) (NP_705804.2)、黑猩猩(XP_001154726.1)及包 括狗、象和大猩猩在內的其它哺乳動物中。CXCL17可能存在于許多物種中并且可W利用 BLAST捜索如Swiss-Prot或NR-AA等綜合數據庫來鑒別（參見例如，World Wide Web的 genome . jp/tools/blast/)。在許多情形中，天然序列可W被其變體取代，包括在某些實施 方案中具有至少約80 %同一性、約85%，或約90%或更高百分比同一性，包括具有至少約 95%或100%同一性的變體。舉例來說，比較的區段可W是氨基酸長度的約95 %，或氨基酸 長度的約90%、85%或80%^供比較。比較的長度可^是至少約20、30、40、50、55、60、65、70 或75個氨基酸。運些變體可W保留主要天然序列的特定物理化學或功能特征，而其它變體 可W具有結構和功能特征的修飾組合。在一些實施方案中，變體不包括與天然存在的人 CX化17或CXCR8序列，或其它動物的天然存在的CX化17或CXCR8序列同一的序列。提供了展 現所描述的功能的截短的形式，或與其它區段的融合物。本發明的實施方案能夠評價對應 于結構變化的功能。
[0059] 巧CR8趨化因子受體(包括物種對應物）
[0060] 描述了 CXCR8趨化因子受體(包括物種對應物）。本文提供了所述序列的具有適當 功能的變體。具體說來，變體典型地與天然序列保持至少約80 %、85 %、90 %及95 %或更高 百分比的序列同一性。在其它實施方案中，變體將具有同一性不同的區域，并且可W包括各 種長度的區段，例如與參考序列具有特定同一性，例如100%、約95%、90%、85%、80%或更 低百分比同一性的約20、30、40、50、70、100或更多個氨基酸。^上描述了優選人類序列，并 且包括登錄號:NP_001182310;QOTC97;BC095500。
[0061] CXCL17趨化因子與CXCR8趨化因子受體配對(配體-受體配對）
[0062] 本發明的實施方案描述了 CXCL17趨化因子受體的鑒別。該受體是G蛋白偶合受體 GPR35,現可W重新命名為CXCR8。運一發現的重要性在于，二者都是在粘膜部位表達的蛋白 質，其中運些蛋白質募集免疫系統的各種細胞，包括巨隧細胞、單核細胞及樹突狀細胞W維 持內環境穩定并調控運些組織中的炎性反應，及其它功能。在運些組織中存在引起人類疾 病的許多炎性情況，并因此調控CX化17/CXCR8軸對于實現治療益處極為重要。
[0063] 配對功能(配體產生、受體結合、信號傳導、效應子功能）
[0064] 由于在人類基因組中存在大量A類GPCR(超過273種），故很難鑒別新的趨化因子受 體。少數趨化因子的受體尚未得到鑒別（另一個是CX化14)(1)。本發明人認為，CXCR8的鑒別 很難并且不是顯而易見的，因為它首先設及到應答細胞所表達的所有GPCR的鑒別，接著是 每一 GPCR的測試，直到發現CX化17信號傳導所利用的正確受體。CXCR8的鑒別使得我們能夠 預測，其將進行信號傳導并介導CX化17的效應子功能。CX化17和CXCR8在發炎情況下都過度 表達，并且運是參與炎性反應的其它趨化因子/受體軸的共有特征（16)。在最初趨化因子與 其受體結合引起初始巧流動之后，存在多個憐酸化步驟，運些步驟使細胞的細胞骨架發生 變化并為其遷移反應作準備(16)。
[0065] 配體類似物結構、激動劑及括抗劑
[0066] 可W預測，CXCL17與CXCR8的結合可W通過在蛋白質相互作用區段或運些蛋白質 的結合位點中引入突變來消除。CXCR8的配體結合位點應包括面向細胞外部的GPCR環N此末 端約1-25和暴露位點，運些位點可W包括登錄號是NP_005292的序列的殘基約73到約105及 約150到約175。圖2C顯示了 CXCR8(GPR35)與若干其它人類趨化因子受體分子之間的序列同 源性。示出了所有受體之間的共同序列及相對保守程度。指示了 GPCR家族共有的結構域，如 屯個跨膜結構域(TM)、TxP基序及DRY盒。圖14是來自各種動物的CXCR8的序列比對。
[0067] 類似地，可W通過在趨化因子的核屯、中介于趨化因子特有的2個二硫橋之間的區 域進行突變來構建CX化17突變體。CX化17展現出一些原始結構，運部分地解釋了其成為最 近所發現的趨化因子的原因（2)，因此有可能在其它區域，例如在登錄號是NP_940879的序 列的殘基約23到約49及約104到約119處進行突變可W使其無法結合CXCR8。圖15是來自各 種動物的CX化17的序列比對。不過誘變法和分析是本領域技術人員所熟悉的常用技術，因 此，憑經驗應當易于鑒別出CX化17和CCR8蛋白質中的結構變化如何影響功能。
[0068] CX化17突變體由于其可溶性而特別適合用作括抗劑(在其結合但不進行信號傳導 的情況下），或作為替代方案，一些突變體可能顯示出增強的結合和信號傳導并可能在特定 應答細胞募集中具有其它用途。
[0069] 針對配體、針對受體的抗體結構；片段、適體;非膚結構（例如非膚鍵聯;修飾的多 膚）；影響受體/配體相互作用的RNAi、CRISPR、TALEN化合物;受體結合的篩選(使用配體作 為陽性對照物）；及化合物文庫都是本發明的實施方案。
[0070] 針對CXCR8或CX化17的括抗劑包括針對運些蛋白質的某些抗體，w及突變體 CX化17蛋白。也可能使用小分子括抗劑，運些括抗劑可W通過使用經CXCR8轉染的BA/F3細 胞，用于基于巧流動的篩選檢驗，如基于化WR技術的那些檢驗來鑒別（17) "FLIPR(巧光成 像板讀取器)檢驗使用了晶體管激光對多孔細胞培養板進行照明，并檢測由前述發射的光。 典型地，細胞負載有化指示劑巧光團（如Fluo3)并且發出的巧光指示在被照明的細胞內的 相對Ca2+水平。測試化合物可W從含有預先測量的化合物的多孔板直接添加到含有細胞的 檢驗板中。運一配置能夠在添加測試化合物之前和之后連續測量細胞化水平并且允許測 量化合物針對測試細胞的信號傳導能力的活性。可W使用運些方法，包括如MercKLilly、 Pfizer等公司使用的方法來篩選各種化合物。參見例如（World Wide Web的 enzolifesciences.com/welcome/compound-libraries/)。
[0071] 特別重要的是，此處提供的配對充當篩選檢驗的陽性對照物。該配對可W定量使 用，例如W評價天然相互作用的特異性活性和藥理信號傳導。變體形式的特異性活性可W 被評價為部分激動劑或部分括抗劑。不同形式可W在各種治療劑亞群中所發現的不同受體 變體間具有不同活性譜。因此，不同變體可能在對異源祀群的反應性(例如表達不同受體同 型)方面具有較高或較低的變化。
[0072] 可W影響結合或其它藥理學的其它特征包括糖基化、甲基化、乙酷基化或其它修 飾。在某些實施方案中，膚序列的非膚鍵聯可W實現相同功能W連接兩個膚。運些包括結合 到特定祀分子的適體，運些適體是寡聚核酸或膚分子。其它可能針對CX化17/CXCR8相互作 用的抑制劑包括RNAi(干擾性RNA，用于抑制基因表達）（參見例如，Cheng，K.和Mahato R. I .Advanced delivery and therapeutic applications of RNAi ,Wiley ,2012)。弓|入細 胞中的RNAi分子將通過正常細胞路徑破壞細胞RNA并由此防止DM序列和所得mRNA編碼的 蛋白質的表達。RNAi分子常常在生物研究中被用于減少或消除祀分子的表達。在治療情形 中，可W使用mRNA來減少或消除CXCR8或CX化17蛋白的表達，由此減少CX化17和CXCR8的信 號傳導和生物作用。還可W使用CRISPR、TALEN化合物及影響受體配體相互作用的類似物 (參見World Wide Web的sciencemag.org/content/341/6148/833.化 11) XRISPR和TALEN 分子技術使用了DNA結合蛋白（TALEN)或RNA分子(CRISPR)將締合的核酸酶分子導引到基因 組中的特定DNA序列。核酸酶引入雙鏈DNA缺口。在引入的基因座特異性同源臂的存在下，可 W在祀位點處引入突變、缺失及插入。此類技術可W用于研究或臨床環境中W減少或增加 通常由CXCR17與CXCR8相互作用所驅動的信號傳導。
[0073] 配對的診斷應用;標記其中一個，檢驗另一個，功能靈敏度等
[0074] 選擇性相互作用將允許使用配對之一檢測配偶體。標記其中之一將允許鑒別該配 偶體。該標記可W包括放射性標記、同位素標記、巧光標記等。還可W使用抗體來檢測和評 價身體、器官及組織分布。運些分布模式可W用作例如針對所描述的臨床適應癥的診斷評 價。
[0075] 診斷方法(例如基于趨化因子/受體的患者情形）
[0076] CX化17和CXCR8還可W用作特定診斷應用的生物標記物。運些包括定量患者血液 中CXCR8+細胞或亞型的能力，所述細胞的數量或類型在各種病理病癥中可能改變;或定量 體液中CX化17的濃度的能力，運可W由ELI SA或類似方法測量。參見例如，Pagana和化gana， Mosby's Μ曰nu曰1 of Di曰gnostic 曰nd L曰bor曰tory Tests,第四片反,Mosby Elsevier 2013。 CX化17和/或CXCR8還可w用作亞臨床間質性肺病(亞臨床ILD)的生物標記物。
[0077] 使用趨化因子或受體的治療方法(臨床適應癥）
[0078] 預期CX化17/CXCR8相互作用的激動劑或括抗劑基于運些蛋白質的表達模式，包括 呼吸系統、胃腸系統及雌性生殖系統的粘膜部位，將可用于各種治療適應癥。運些蛋白質將 設及包括成膠質細胞瘤或其它腦癌在內的若干癌癥，W及多發性硬化的發病機理，并且其 還可能設及到血壓的控制。
[0079] 受試者可W是例如哺乳動物、靈長類動物、人類、農場動物、伴侶動物、人類、家禽 類、牛、馬、山羊、貓、綿羊、曬齒動物、狗、豬、雞、鴨、火雞、鶴譜或碟。還可W治療展示或展覽 動物，例如動物園或表演動物，包括罐足類動物、嫁、海豚、獅子、老虎及其它獸類受試者。
[0080] 組合療法(與另一治療組合）
[0081 ]本發明實施方案的一個優選應用是控制炎癥。此處，CXCL17/CXCR8相互作用的激 動劑或括抗劑可W與其它確定的消炎劑一起使用，包括非類固醇消炎劑、阿司匹林或抗TNF α藥劑，如化mira、Remicade或Enbrel。具體說來，提供了與治療性抗體的組合。其它適應癥 可W用經典方法治療，運些方法的功效可W與本文所提供的方法起協同作用。
[0082] 制備趨化因子、類似物(重組、化學鍵聯、糖基化等）；制備受體類似物;編碼類似物 的核酸，包括表達構建體、質粒;細胞、包含核酸的動物(真核生物、原核生物）。
[0083] 可W應用用于產生并制備配體、受體及變體的標準方法。可W開發標準重組方法， 包括設計重組核酸編碼構建體。參見例如，Thompson D.A.Cell and Molecular Biology Manual 2011。可W設計出例如用啟動子可操作地連接到編碼區的表達載體。提供了包含所 述載體的細胞，包括原核細胞和真核細胞。還可W開發相容的表達方法。
[0084] 典型地，使編碼細胞壁降解多膚的多聚核巧酸處于在所希望的宿主細胞中起作用 的啟動子的控制下。眾所周知眾多啟動子，并且取決于具體應用，可W將運些啟動子用于本 發明實施方案的表達載體中。通常，所選啟動子取決于啟動子在其中將具有活性的細胞。其 它表達控制序列，如核糖體結合位點、轉錄終止位點等也任選包括在內。包括運些控制序列 中的一個或多個的構建體稱為"表達盒"。因此，本發明的實施方案提供了表達盒，在運些表 達盒中并入了編碼相關功能多膚的核酸W便在所希望的宿主細胞中進行高水平表達(參見 例如，Ream W和Field K.G.Mole州lar Biology Techniques.Academic Press.2012)。
[0085] 優選具有至少約70%、75%、80%、85%、90%同源性的基本上純的組合物，并且最 優選具有92%、95%、98%到99%或更高同源性的基本上純的組合物。也可W使用純化的多 膚，例如用于產生抗體的免疫原，運些抗體可W用于免疫選擇純化方法中