使用電穿孔的哺乳動物基因修飾方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及有效地修飾哺乳動物的任意祀基因的技術，該技術包括:將具有完整 透明帶的原核階段哺乳動物合子浸入含有某種RNA分子的溶液中，和通過在Ξ個步驟中施 加多個方波脈沖來執行電穿孔處理，其中在預定范圍內調節第一個電脈沖的總電能。
【背景技術】
[0002] 迄今，為了執行哺乳動物的基因修飾已經必須使用ES細胞，且因此除了一些可W 利用其ES細胞系的動物(諸如小鼠）W外已經非常難W建立遺傳修飾的個體。但是，近年來， 已經出現了設及利用例如鋒指核酸酶(ZFN)、TALEN或CRISPR的新基因修飾技術，W使哺乳 動物中的基因組編輯通過僅胚胎操作容易地執行，而不使用任何ES細胞(參見，例如，非專 利文獻1-4)。
[0003] 設及利用ZFN等的技術是一種突破性技術，其使用基因組上的特定序列作為祀標 且通過核酸酶的作用來實現特定基因的破壞或同源重組。另外，該技術使祀序列的基因修 飾(基因組編輯)能夠容易地執行，即使對于不存在確立的ES細胞系統的任何動物。
[0004] 但是，基于ZFN等的基因組編輯技術的利用需要將核酸轉移進合子中的操作。所述 核酸轉移操作通常通過需要特殊裝置(顯微操作器)的顯微注射方法(顯微注射)來執行。也 就是說，相關技術方法已經指出了基于ZFN等執行等的基因組編輯技術中的成本問題。
[0005] 另外，需要熟練技術人員來執行顯微注射方法，并且已經指出了依賴于實驗者的 低再現性問題。
[0006] 如上所述，基于ZFN等的基因組編輯技術用于哺乳動物的用途設及成本和技術問 題。因此，需要可W被任何人容易地采用且可W在哺乳動物中高效率地實現基因組編輯的 技術。
[0007] 引文列表 非專利文獻
[NPL 1] Tomoji Mashimo: New Gene Modification Technology "Zinc Finger Nuclease (ZFN)": KAGAKU TO SEIBUTSU, Japan Society for Bioscience, Biotechnology, and Agrochemistry編，第220-222頁（2011)
[NPL 2] Tomoji Mashimo和Tadao Serikawa: Zinc Finger Nuclease (ZFN): Cell Technology 第 31 (3)卷第 296-301 頁（2012)
[NPL 3] Genome Editing Revolution (監督人：Takashi Yamamoto和Sumihare Noji): Cell Technology第32 (5)卷（2013)
[NPL 4] Ryan Μ. Walsh和Konrad Hochedlinger, PNAS,第110卷，第39期，15514- 15515 (2013)。

【發明內容】

[000引技術問題 本發明的一個目的是開發一種技術，其能夠僅僅通過非常簡單的操作來利用可廣泛應 用于哺乳動物的技術，該技術不需要利用ES細胞，并且其包括通過祀向基因組上的特定序 列來修飾特定基因（基于ZFN等的基因組編輯技術）。
[0009] 本發明的另一個目的是W高效率和良好再現性建立遺傳修飾的哺乳動物個體，不 限于特定哺乳動物物種。
[0010] 問題的解決方案 本發明的發明人為了完成上述目的已經進行了廣泛研究，并由此已經發現，可W如下 有效地修飾充當祀標的期望的哺乳動物基因：將具有完整透明帶的原核階段哺乳動物合子 浸入含有某種RNA分子的溶液中；然后執行電穿孔處理，其包括，在使它的總電能落在預定 范圍內的條件下施加具有高電壓的方波電脈沖(第一電脈沖)短時間段，然后施加具有低電 壓的方波電脈沖(第二電脈沖)長時間段2次或更多次，然后施加具有低電壓的、具有與所述 第二電脈沖相反的極性的方波電脈沖(第Ξ電脈沖）長時間段2次或更多次(在Ξ個步驟中 的多個方波脈沖:參見圖1和圖2)。
[0011] 具體地，本發明的發明人已經發現，W下技術特征在那些條件下是特別重要的： "使用處于原核階段的哺乳動物合子作為合子"；"使用處于具有透明帶狀態的合子作為合 子"；"使用具有特定序列的RNA分子作為核酸分子物質"；和"在預定條件內的電脈沖條件下 在Ξ個步驟中施加多個方波脈沖作為電穿孔的電條件"。
[0012] 本發明的發明人還已經發現，該技術是可廣泛應用于一般哺乳動物的技術，不限 于特定哺乳動物物種。
[OOU]應當指出，在相關領域中，沒有報道運樣的例子:其中通過對'合子'進行'電穿孔' 來建立遺傳修飾的哺乳動物個體（已經通過基因轉移經歷基因組編輯的個體）。例如，在 Joanna B. Grabarek等人，Genesis 32第269-276頁（2002)和Hui Peng等人，化0S 0肥 vol. 7 (8) e43748第1-13頁（2012)中，報道了其中將DNA或dsRNA轉移進合子中的一個例 子。但是，那些文獻僅僅報道了轉移的核酸的'短暫'基因表達。
[0014] 前述內容的一個可能的原因是W下問題:相關技術電穿孔經常使用運樣的方法： 其設及從采用"衰減波系統（指數系統Γ的輸出裝置施加電脈沖一次（參見，例如， Siimogawara, K.等人，Genetics 148第 1821-1828頁（1998))，因此基因轉移效率非常 低。
[0015] 另外，在上述的Joanna B. Grabarek等人和Hui Peng等人中，用酸性臺氏液 (Tyrode's solution)處理W除去合子的透明帶（其造成基因轉移中的屏障），其目的是提 高通過電脈沖處理來轉移DNA等的效率。但是，當將除去了它的透明帶或使它的透明帶變薄 的合子移植進假妊娠雌性的輸卵管中時，存在運樣的問題:合子正常生長成后代的效率顯 著地下降。也就是說，存在運樣的問題:通過執行用于提高基因轉移效率的處理，相反地抑 制正常生長。
[0016] 另外，作為哺乳動物細胞(培養的細胞等)的電穿孔技術，已經公開了運樣的方法： 其包括施加兩類電脈沖W執行向哺乳動物細胞中的有效基因轉移(參見S址harev S.I.等 人，Biophys. J. 63第1320-1327頁（1992))。但是，也在該方法中，沒有減輕需要除去或薄 化透明帶W便實現合子的足夠轉移效率的問題。
[0017] 已經基于上述發現做出了本發明。
[0018] 也就是說，根據第一方面的發明設及一種哺乳動物基因修飾方法，其包括： 將如在W下項目（A)中定義的合子浸入含有如在W下項目（B)中定義的核酸分子的溶 液中； 將如在W下項目（C)中定義的方波電脈沖施加于所述溶液1次或2次或更多次，使得所 述方波電脈沖具有從0.2 J/100 yL至7.5 J/100 yL的總電能； 然后施加如在W下項目化)中定義的方波電脈沖2次或更多次;和 然后施加如在W下項目巧)中定義的方波電脈沖2次或更多次： (A) 具有完整透明帶的、除了人W外的哺乳動物的原核階段合子； (B) RNA，其起作用從而W序列特異性的方式表現出對基因組DNA的任意區域的內切核 酸酶活性； (C) 具有375 V/cm或更高的電壓/脈沖的方波電脈沖； (D) 具有250 V/cm或更低的電壓/脈沖和從0.01 J/100化至3.6 J/100化的電能/脈 沖的方波電脈沖;和 (E) 其極性與如在項目（D)中定義的電脈沖相反且具有250 V/cm或更低的電壓/脈沖和 從0.01 J/100 yL至3.6 J/100 yL的電能/脈沖的方波電脈沖。
[0019] 另外，根據第二方面的發明設及根據第一方面的方法，其中如在項目（B)中定義的 核酸分子包括如在W下項目（bl)中定義的核酸分子和如在W下項目（b2)中定義的核酸分 子： (bl)編碼蛋白的mRNA，所述蛋白具有序列特異性的DNA-結合結構域和當與如在W下項 目化2)中定義的限制性酶活性結構域形成二聚體時表現出限制性酶活性的結構域;和 (b2)編碼蛋白的mRNA，所述蛋白具有序列特異性的DNA-結合結構域和當與如在項目 (bl)中定義的限制性酶活性結構域形成二聚體時表現出限制性酶活性的結構域，所述DNA- 結合結構域是如在項目（bl)中定義的蛋白所結合的基因組DNA區域末端附近的區域且結合 其互補鏈。
[0020] 另外，根據第Ξ方面的發明設及根據第一方面的方法，其中如在項目（B)中定義的 核酸分子包括如在W下項目（b3)中定義的核酸分子和如在W下項目（b4)中定義的核酸分 子： 化3)指導RNA，其具有基因組DNA的任意堿基序列的互補序列和特異性地結合如在W下 項目化4)中定義的蛋白的序列;和 化4)編碼蛋白的mRNA，所述蛋白當特異性地結合如在項目（b3)中定義的指導RNA時表 現出內切核酸酶活性。
[0021] 另外，根據第四方面的發明設及根據第一至第Ξ方面中的任一個的方法，所述方 法還包括，在執行電穿孔W后，將得到的合子在培養基中培養成2-16細胞階段胚胎，然后將 所述胚胎移植進哺乳動物的相同物種或近似物種的雌性的輸卵管或子宮中W提供后代。
[0022] 另外，根據第五方面的發明設及根據第一至第四方面中的任一個的方法，其中所 述溶液還含有編碼外切核酸酶1化xol)的mRNA。
[0023] 另外，根據第六方面的發明設及根據第一至第五方面中的任一個的方法，其中所 述哺乳動物包括屬于曬齒目的物種。
[0024] 另外，根據第屯方面的發明設及根據第一至第六方面中的任一個的方法，其中將 如在項目（D)中定義的方波電脈沖的施加執行5次或更多次，和將如在項目化）中定義的方 波電脈沖的施加執行5次或更多次。
[0025] 另外，根據第八方面的發明設及根據第一至第屯方面中的任一個的方法，其中所 述基因修飾通過基因的破壞而造成功能的缺失或抑制。
[0026] 另外，根據第九方面的發明設及一種建立遺傳修飾的哺乳動物個體的方法，其包 括使用第一至第八方面中的任一個的方法。
[0027] 發明的有利效果 本發明能夠僅僅通過非常簡單的操作來利用可廣泛應用于哺乳動物的技術，該技術不 需要利用ES細胞，并且其包括通過祀向基因組上的特定序列來修飾特定基因（基于ZFN等的 基因組編輯技術）。
[0028] 本發明還能夠W高效率和良好再現性建立遺傳修飾的哺乳動物個體，不限于特定 哺乳動物物種。
[0029] 附圖簡述 圖1的概念圖用于解釋電穿孔處理，其包括在Ξ個步驟中施加多個方波脈沖。垂直軸代 表電壓(V)，且水平軸代表時間（毫秒）。在圖1中，"Pp"代表穿孔脈沖，且叮P"代表轉移脈沖。
[0030] 圖2的概念圖用于解釋通過電穿孔處理將mRNA轉移進合子中的機制，其包括在Ξ 個步驟中施加多個方波脈沖。在圖2中，"Pp"代表穿孔脈沖，且叮P"代表轉移脈沖。左圖的概 念圖用于解釋，穿孔脈沖在透明帶和細胞膜中形成微孔。中圖的概念圖用于解釋，轉移脈沖 1造成mRNA遷移進合子的細胞質中。右圖的概念圖用于解釋，轉移脈沖2 (極性發生變化的 脈沖)造成mRNA進一步遷移進合子的細胞質中。
[0031] 圖3是在實施例中使用的電脈沖產生裝置的拍攝照片圖像。圖3(A)是玻璃室的照 片圖像，所述玻璃室具有固定在其上面的培養皿銷板電極。圖3(B)是電脈沖產生裝置 肥PA21 (商標)的主體的照片圖像。
[0032] 圖4是合子的拍攝照片圖像，其已經在測試實施例1中在所述合子中轉移進四甲基 羅丹明標記的糊精。上行中的照片圖像是用顯微鏡在明視場中拍攝的照片圖像。下行中的 照片圖像是用巧光顯微鏡拍攝的照片圖像。
[0033] 圖5是在測試實施例5中通過轉移祀向II化g基因的ZFN mRNA而建立的敲除大鼠的 拍攝照片圖像。在左側顯示了II化g基因敲除的大鼠。在右側顯示了野生型大鼠（F344/Stm 品系）。
[0034] 圖6是測試實施例5中的ZFN的概念圖，所述ZFN被設計成祀向11化g基因的第二個 外顯子附近的特定區域。
[003引圖7是測試實施例6中的TALEN的概念圖，所述TALEN被設計成祀向I12rg基因的第 二個外顯子附近的特定區域。
[0036] 圖8是測試實施例7中的CRISPR-化s9系統的概念圖，所述CRISPR-Cas9系統被設計 成祀向化y基因的特定區域。
【具體實施方式】
[0037] 在下面詳細描述本發明的實施方案。
[0038] 本發明設及有效地修飾哺乳動物的任意祀基因的技術，該技術包括:將具有完整 透明帶的原核階段哺乳動物合子浸入含有某種RNA分子的溶液中，和通過在Ξ個步驟中施 加多個方波脈沖來執行電穿孔處理，其中在預定范圍內調節第一個電脈沖的總電能。
[0039] [要進行基因轉移的合子] 本發明的基因修飾技術是基本上使用"具有完整透明帶的原核階段哺乳動物合子"的 技術。
[0040] 原核階段 要進行基因轉移的合子需要處于"原核階段(原核階段胚胎的狀態Γ。本文中使用的術 語'原核階段'表示運樣的合子狀態:其中精子的核已經整合進卵的細胞質中，但是卵的核 和精子的核的融合尚未發生。通過顯微術可W確定合子是否處于原核階段。
[0041] 收集原核階段合子的方法例如如下所述。當允許經受超數排卵處理的雌性個體與 相同物種的雄性個體彼此交配時，可W在交配后的天收集原核階段合子。可選地，也可W通 過將沒有執行交配就收集的未受精卵進行精子卵漿內注射來人工得到原核階段合子。
[0042] 在本發明中，通過執行向原核階段的合子中的基因轉移，可W得到運樣的動物:其 中個體的所有細胞已經W均勻方式進行了遺傳修飾。
[0043] 相反，在對已經經過原核階段的合子進行基因轉移的情況下，產生嵌合個體(其中 存在進行了基因轉移的細胞和沒有進行基因轉移的細胞）的可能性顯著增加，因此運樣的 情況不是優選的。另外，在對未受精卵進行基因轉移的情況下，正常發育變得難W發生，運 不是優選的。
[0044] 透明帶 要進行基因轉移的合子需要處于"具有透明帶的狀態"。本文中使用的術語'透明帶' 表示糖蛋白的基質結構(ma化ix struc化re),其充當用于覆蓋和保護哺乳動物的卵母細胞 或合子的外層。
[0045] 在胎盤哺乳動物的早期發育中，受精后的早期胚胎需要在被運樣的結構物理上保 護的同時生長成胚泡。在運點上，將透明帶視作在哺乳動物的早期胚胎的正常生長中起重 要作用的結構。
[0046] 應當指出，生長成胚泡W后的胚胎會經歷透明帶破裂的解化過程和植入子宮壁中 W形成胎盤。