專利名稱：微生物來源的炎癥因子受體拮抗活性化合物及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及微生物來源的炎癥因子受體拮抗活性化合物，特別是腫瘤壞死因子受體(TNFR)和白細胞介素-6受體(IL-6R)的拮抗活性化合物或其藥學可接受的衍生物。本發明還涉及上述化合物用于制備治療與天然腫瘤壞死因子受體(TNFR)和白細胞介素-6受體(IL-6R)的配基過量相關的疾病的藥物的用途。此外，本發明還涉及含有所述化合物的藥物組合物。
背景技術：
炎癥是機體對各種損傷的反應，細胞因子在炎癥反應加重、修復和慢性化上均起重要作用。腫瘤壞死因子(TNF)和白細胞介素-6(IL-6)已知是炎癥反應的重要介質。
腫瘤壞死因子通過與細胞表面的受體結合，由信號傳導系統將信息傳入細胞內而發揮其生物學活性。腫瘤壞死因子有兩種受體，其基因已被分離純化，闡明了結構。已知這兩種受體蛋白質分子量分別為55Kd和75kD，分別稱為P55R(TNFR I)和P75R(TNFR II)。細胞表面的TNFR經蛋白酶水解下來的受體片段，存在于人的各種體液中，即可溶性TNF受體，與膜表面相對應，來源于TNFR I的稱為sTNFR I，來源于TNFR II的稱為sTNFR II。sTNFR對TNF有高親和力，一旦與TNF結合，阻斷TNF與TNFR的結合，從而間接抑制TNF的活性。sTNFR的作用有兩方面在高濃度時sTNFR可拮抗TNF作用；在低濃度時對TNF的結構具有穩定作用。
白細胞介素-6(IL-6)是一種多功能的細胞因子，參與免疫調節、造血、急性期反應等生物學過程，并在內分泌、神經系統中發揮一定作用。IL-6的表達失調與許多人類疾病有關，如感染、腫瘤、自身免疫病、關節炎及衰老過程等。IL-6通過兩個膜蛋白組成的雙鏈受體系統作用于靶細胞，即配基結合鏈IL-6R和作為信號轉導子的非配基結合鏈gp130。IL-6R由Ig樣區、配基結合區、跨膜區以及胞內區組成。其為跨膜糖蛋白，有兩種天然存在形式，即膜結合受體gp80和可溶性受體sIL-6R，二者在IL-6的信號傳遞過程中起重要作用。
鑒于細胞因子的受體參與機體的多種生理和/或病理過程，是藥物作用的重要靶點。近年來，隨著分子生物學在藥理學領域中的發展，尤其是人類基因組計劃的開展，針對細胞因子的新的受體和亞型不斷被發現，所述受體(亞型)的功能以及在疾病發展過程中的作用也逐漸被闡明。這驅使藥物研究工作者能夠從尋找相應的受體拮抗劑或激動劑出發，一方面通過所述受體的拮抗劑或激動劑研究這些信使物質的生物學功能，另一方面也能夠從特異性受體的拮抗劑或激動劑中獲得調節機體功能的新的藥物。
已知人源sTNFR和sIL-6R可以作為天然TNFR和IL-6R的拮抗劑，用于治療與其相應的配基過量有關的疾病，所述疾病包括類風濕關節炎、敗血癥休克、急慢性髓性敗血病、動脈粥樣硬化、自身免疫性疾病、移植排斥反應等。因此，不同來源的TNFR和IL-6R的拮抗劑日益引起人們的廣泛關注。
為克服現有技術中采用動物組織提取受體篩選藥物所存在的缺陷，例如受體在組織細胞上含量極少(每個細胞有10-1000個結合位點)；直接利用動物組織或組織勻漿進行受體拮抗劑或激動劑的篩選專一性不高等，本發明人分別通過利用相應的重組受體建立的TNFR和IL-6R拮抗劑篩選模型，對微生物來源的樣品進行篩選，獲得了本發明所述化合物。

發明內容
為獲得新的TNFR和IL-6R拮抗劑，本發明人通過利用相應的重組受體建立的TNFR和IL-6R拮抗劑篩選模型，對大量微生物來源的代謝產物進行篩選，通過進一步分離純化，獲得了新的微生物來源的炎癥因子受體拮抗活性化合物。
本發明一個方面，通過TNFR受體拮抗劑篩選模型，獲得了一種微生物來源的炎癥因子受體拮抗活性化合物，或其藥學可接受的衍生物，其具有式I所示的結構 所述化合物的名稱為N-(3-乙酰硫基-2-甲基-1-羰基丙基)-脯氨酸，以下也簡稱為1487B，其具有TNFR受體拮抗活性。
在本發明中，所述化合物的藥學可接受的衍生物包括上述化合物的鹽、酯或鹽的酯。
本發明又一方面，還涉及一種產生所述化合物1487B的微生物。具體的，為滿足專利審查要求，本發明人將所述真菌1487于2005年3月14日保藏于中國微生物菌株管理委員會普通微生物中心(CGMCC，北京，海淀區中關村北一條13號，100080)，保藏號CGMCC 1327。
本發明又一方面還涉及一種制備所述化合物1487B的方法，包括如下步驟在適合所述化合物1487B產生的條件下培養所述的微生物CGMCC1327，以及從培養液中回收化合物1487B。
本發明另一方面，通過IL-6R受體拮抗劑篩選模型，獲得了一種微生物來源的炎癥因子受體拮抗活性化合物，或其藥學可接受的衍生物，其具有式II所示的結構
所述化合物的名稱為2-(N-正庚基)亞氨基-3-氧代-4a-甲基-5-氧代-7-(2-羥乙基)-8-(E-異丙烯基)-2，3，-二氫萘并[2，3-b]1，4-二氧六環，以下也簡稱為2460A，具有IL-6R受體拮抗活性。
在本發明中，所述化合物的藥學可接受的衍生物包括上述化合物的鹽、酯或鹽的酯。
本發明又一方面，還涉及一種產生所述化合物2460A的微生物。具體的，為滿足專利審查要求，本發明人將所述真菌2460于2005年3月14日保藏于中國微生物菌株管理委員會普通微生物中心(CGMCC，北京，海淀區中關村北一條13號，100080)，保藏號CGMCC 1328。
本發明又一方面還涉及一種制備所述化合物2460A的方法，包括如下步驟在適合所述化合物2460A產生的條件下培養所述的微生物CGMCC1328，以及從培養液中回收化合物2460A。
本發明又一方面涉及一種藥物組合物，其含有上述式I和/或式II2所述化合物或其藥學可接受的衍生物，以及藥學可接受的載體。
本發明的再一方面，涉及上述式I和/或式II的化合物用于制備治療與天然腫瘤壞死因子受體(TNFR)和白細胞介素-6受體(IL-6R)的配基過量相關的疾病的藥物的用途。在本發明中，所述疾病包括但不限于類風濕關節炎、敗血癥休克、急慢性髓性敗血病、動脈粥樣硬化、自身免疫性疾病、移植排斥反應。


圖1圖1a-c分別為化合物2460A的H-譜結果。
圖2化合物2460A的C-譜結果。
圖3化合物2460A ESI質譜結果。
圖4化合物2460的紅外IR譜結果。
圖5化合物2460的高分辨FAB質譜結果。
圖6圖6a-d分別為化合物2460的HMBC核磁二維譜結果。
圖7圖7a-b分別為化合物2460的HSQC核磁二維譜結果。
圖8圖8a-c分別為化合物2460的H-H COSY核磁二維譜結果。
圖9圖9a-b分別為化合物2460的DEPT C-譜結果。
圖10圖10a-c分別為化合物2460的C-譜結果。
圖11化合物2460的紫外UV譜結果。
以下結合實施例，對本發明所述化合物及其用途進一步加以闡述。
實施例1微生物來源的拮抗活性化合物2460的制備和純化真菌2460接種后，于26℃搖床上培養96小時。將所得發酵液過濾，濾液過X-5大孔吸附樹脂，30％丙酮洗脫后，80％丙酮洗脫并收集，常溫揮干至固體。干品溶于50％甲醇，過Sephadex LH-20柱，50％甲醇洗脫，用本發明人建立的針對IL-6R拮抗劑篩選模型檢測，并收集活性組分，揮干。干品溶于80％甲醇，過ODS柱，50％甲醇洗脫，收集活性組分。
揮干后，將樣品溶于有機溶劑后冷凍干燥，得紅色固體，即本發明所述化合物2046A。經過對該化合物的UV，IR，NMR和MS分析，得到其理化性質如下分子量425溶解性難溶于水，易溶于甲醇，氯仿。
熔點84-87℃顏色固體為紅色，甲醇溶液為鮮紅。
pH值5.3(飽和水溶液中)。
穩定性酸堿均不穩定(pH約2或12)，溶液顏色均為黃色，可以提高其水溶解度。
UV最大值500nm。
實施例2微生物來源的拮抗活性化合物1487B的制備和純化真菌1487接種后，于26℃搖床上培養96小時。將所得發酵液過濾，濾液過X-5大孔吸附樹脂，30％丙酮洗脫后，80％丙酮洗脫并收集，常溫揮干至固體。干品溶于50％甲醇，過Sephadex LH-20柱，50％甲醇洗脫，用本發明人建立的針對TNFR拮抗劑篩選模型檢測，并收集活性組分，揮干。干品溶于80％甲醇，過ODS柱，50％甲醇洗脫，收集活性組分。
揮干后，將樣品溶于有機溶劑后冷凍干燥，得本發明所述化合物1487B。
實施例3通過Caco-2細胞建立的模型體外預測2460A的腸道吸收情況在Transwell corning板的半透膜上培養Caco-2細胞，3天后，細胞貼滿半透膜。在半透膜上部加2460A溶液(濃度為100μmol/l，含乙醇20％的HBSS緩沖液)0.5ml，半透膜下部加1.5ml含乙醇20％的HBSS緩沖液，在第0、30、60、90、120分鐘分別從下部取溶液200μl，每次取完后及時補充200μl含乙醇20％的HBSS緩沖液。
HPLC檢測取出液中含2460A的濃度，分別標記為A0、A30、A60、A90、A120，AT為殘留液濃度。
在半透膜下部加1.5ml 2460A溶液，在半透膜上部加0.5ml含乙醇20％的HBSS緩沖液，半透膜下部加1.5ml含乙醇20％的HBSS緩沖液，在第0、30、60、90、120分鐘分別從下部取溶液400μl，每次取完后及時補充400μl含乙醇20％的HBSS緩沖液。
HPLC檢測取出液中含2460A的濃度，分別標記為B0、B30、B60、B90、B120，BT為殘留液濃度。
檢測結果見表1
表1

由表1可知，在90分鐘后化合物2460A能夠從腔內(半透膜上部)透過到血液(半透膜下部)。30分鐘后，化合物2460A能從血液(半透膜下部)透過到腔內(半透膜上部)。并且，后者的透過能力強于前者。
實施例4化合物2460A體外對人骨髓瘤細胞RPMI8226的抑制作用采用人骨髓瘤RPMI8226細胞，在添加10％胎牛血清的RPMI1640培養基(Hyclone公司產品)中培養于37℃，5％CO2孵箱內，3-4天傳代一次，生長至對數期。
以少量100％乙醇溶解本發明所述化合物2460A，乙醇終濃度不超過0.1％。確保徹底溶解。分別以完全培養基稀釋所述藥物至如下濃度25、10、5、1、0.5、0.1、0.01*10-6Mol/L。
收集如上述培養至對數生長期的細胞，制成5.6*105/ml濃度的細胞懸液。取兩塊96孔細胞培養板，每孔分別加50μl細胞懸液。設不加藥物的對照組。加藥組按照不同濃度設平行6孔；分別培養48、72小時。培養結束前4小時，每孔加入MTT20μl；4小時后離心去除每孔液體，每孔加入二甲基亞砜200μl；30分鐘后用自動酶標儀測630nm各孔的OD值。實驗重復三次。
結果在24小時和72小時的情形中，化合物2460A對人骨髓瘤細胞RPMI8226在濃度大于1*10-6Mol/L時，有明顯的抑制作用，最高可達63％。
權利要求
1.一種微生物來源的炎癥因子受體拮抗活性化合物，或其藥學可接受的衍生物，其具有式I所示的結構 其為腫瘤壞死因子受體的拮抗活性化合物。
2.一種產生權利要求1所述化合物的微生物，其為CGMCC1327。
3.一種制備權利要求1所述化合物的方法，包括如下步驟在適合權利要求1所述化合物產生的條件下培養權利要求2所述的微生物，以及從培養液中回收權利要求1的化合物。
4.一種微生物來源的炎癥因子受體拮抗活性化合物，或其藥學可接受的衍生物，其具有式II所示的結構 其為白細胞介素-6受體的拮抗活性化合物。
5.一種產生權利要求4所述化合物的微生物，其為CGMCC1328。
6.一種制備權利要求4所述化合物的方法，包括如下步驟在適合權利要求4所述化合物產生的條件下培養權利要求5所述的微生物，以及從培養液中回收權利要求1的化合物。
7.一種藥物組合物，其含有權利要求1和/或2所述的化合物，以及藥學可接受的載體。
8.權利要求1或2的化合物用于制備治療與天然腫瘤壞死因子受體(TNFR)和白細胞介素-6受體(IL-6R)的配基過量相關的疾病的藥物的用途。
9.權利要求8的用途，其中所述疾病包括類風濕關節炎、敗血癥休克、急慢性髓性敗血病、動脈粥樣硬化、自身免疫性疾病、移植排斥反應。
全文摘要
本發明涉及微生物來源的炎癥因子受體拮抗活性化合物，特別是腫瘤壞死因子受體(TNFR)和白細胞介素－6受體(IL－6R)的拮抗活性化合物或其藥學可接受的衍生物。本發明還涉及上述化合物用于制備治療與天然腫瘤壞死因子受體(TNFR)和白細胞介素－6受體(IL－6R)的配基過量相關的疾病的藥物的用途。此外，本發明還涉及含有所述化合物的藥物組合物。
文檔編號C07D319/00GK1891687SQ20051008297
公開日2007年1月10日 申請日期2005年7月8日 優先權日2005年7月8日
發明者李元, 朱鳳昌, 吳劍波, 陳晶, 張洋, 郭連宏, 石蓮英, 姜蓉 申請人:中國醫學科學院醫藥生物技術研究所