專利名稱：趨化素樣因子－1在器官炎性損傷中的用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種趨化因子在器官炎性損傷中的用途。具體地說，涉及趨化素樣因子-1在檢測樣品炎性損傷的病理狀態、制作器官炎性損傷的動物模型、制備具有治療器官炎性損傷的CKLF-1抗體和拮抗劑中的用途，尤其是在支氣管哮喘氣道損傷及重塑和肺纖維化中的用途。
背景技術：
支氣管哮喘是嚴重危害人類健康的慢性疾病，其發病率在全世界范圍內不斷上升。目前美國的發病人數已達1500萬，英國幾乎1/7的兒童患有哮喘，而我國約有數千萬患者。因此，對哮喘的研究與防治是一項緊迫而艱巨的任務。
在過去的十幾年間，哮喘研究的重點放在研究引發氣道粘膜炎性浸潤的機制上，如免疫活性細胞分泌的各種前炎因子引起的炎性細胞粘附、滾動、趨化、游走、局部浸潤、直至呼吸爆發并釋放組胺、脂質介質及活性氧等多種炎性介質所造成的炎性損傷。1995年WHO與美國心肺血液研究所在共同制定的綱領性文件“全球哮喘防治戰略”中將支氣管哮喘明確定義為“多種細胞特別是嗜酸性粒細胞、肥大細胞、淋巴細胞參與的慢性氣道炎癥，并由此導致氣道高反應性及氣道阻塞”。該文件還指出“這種氣道阻塞通過治療可部分逆轉或自行逆轉。”(Global strategy for asthmamanagement and prevention NHLBI/WHO workshop reportthe definitionof asthma in global，1995，6-7)。
但大量臨床資料表明某些哮喘病人的臨床表現無法用單純的氣道炎癥來解釋，一些病人即使經規范合理的抗炎治療，氣道阻塞仍不能逆轉。如今人們已明白，那些難治病例是因為氣道粘膜炎性損傷后的不全或過度修復，包括上皮細胞脫落、粘液細胞增生、粘膜下膠原纖維沉積，平滑肌增生肥大等病變而使得氣管管徑顯著縮小。當炎性分泌物增多、氣道平滑肌收縮、粘液腺分泌增加時，氣道阻塞加重，因而出現持續的呼吸困難等臨床癥狀，皮質激素亦不能使之逆轉。這種氣道結構的病理改變被稱為“氣道重塑”。
支氣管哮喘患者的支氣管粘膜活檢與死亡病例尸解亦證實，伴有顯著的氣道結構改變是支氣管哮喘的病理特征(Redinogton A.E.，et al.Thorax，1997；52310-312)。多年來人們一直試圖復制哮喘氣道結構變化的動物模型，但迄今為止各類模型多為支氣管粘膜的炎性病變。例如，變應性哮喘模型、感染性哮喘模型、職業性哮喘模型等，都只表現出明顯的炎性浸潤(如嗜酸性粒細胞、淋巴細胞、巨嗜細胞、嗜中性粒細胞等在支氣管周圍的聚集浸潤)，但缺少氣道上皮嚴重受損、上皮下膠原沉積、平滑肌增生等病變，因此不能夠真實地反映哮喘的病理特征。
一些研究還提示某些免疫活性細胞和細胞因子參與了哮喘的發病過程，因為在哮喘病變組織中檢測到多種細胞因子的表達。例如，從支氣管哮喘病人外周血單個核細胞、肺泡灌洗液及支氣管粘膜活檢中檢測到高水平表達的細胞因子及其受體(如EGF、TGF-β、GM-CSF、PDGF、ET-1、EGFR)。但由于受體內實驗的限制，細胞因子與氣道炎癥及修復的直接關系，尤其是某單一因子與肺支氣管病理變化關系的報道極少。而這些對闡明哮喘的發病機制無疑是非常重要的。
趨化素樣因子-1(Chemokine-like factor1，CKLF-1)是一個新發現的趨化因子，其GenBank登錄號為AF096895。CKLF-1具有C-C亞家族趨化因子的特點，即位于氨基酸序列N末端的第一和第二個半胱氨酸(Cys)緊密相連，呈Cys-Cys排列，即CC結構。已經發現，多種腫瘤細胞表達CKLF-1，該因子對嗜中性粒細胞、單核細胞、淋巴細胞有趨化作用，并能促進人低密度骨髓細胞增值及集落形成(參見PCT申請PCT/CN00/00026)。
發明概述本發明人根據多年積累的臨床資料和實驗數據，從眾多的細胞因子中選擇趨化素樣因子-1，進行支氣管哮喘病的研究。經過長期研究和大量實驗，發明人首次公開了CKLF-1對器官炎性損傷，尤其是對支氣管哮喘氣道炎性損傷及重塑和肺纖維化的重要作用，并成功地建立了氣道炎性損傷及重塑和肺纖維化的動物模型。
本發明一個方面公開了趨化素樣因子-1在器官炎性損傷，尤其是在支氣管哮喘氣道炎性損傷及重塑和肺纖維化中的用途。
本發明涉及通過檢測樣品中CKLF-1的過量表達，從而確定樣品為炎性損傷組織的體外檢測方法。
本發明另一個方面公開了利用趨化素樣因子-1制作器官炎性損傷的動物模型中的方法，尤其是制作支氣管哮喘氣道炎性損傷及重塑、肺纖維化動物模型的方法。
本發明再一個方面公開了趨化素樣因子-1在制備具有治療器官炎性損傷作用的抗體和拮抗劑中的用途。
根據本發明的一個方面，公開了趨化素樣因子-1對器官炎性損傷，尤其是對支氣管哮喘氣道炎性損傷及重塑和肺纖維化的作用。
在本發明的一個實施方案中，CKLF-1的導入直接介導了小鼠氣道損傷及重塑樣改變。例如，導入CKLF-1后2周，小鼠氣道上皮細胞明顯充血水腫，支氣管變形，管腔內可見脫落的上皮及滲出物。隨后上皮纖毛消失，杯狀細胞增生(支氣管哮喘氣道上皮表型改變的特征)。6周后小鼠氣道上皮結構排列嚴重紊亂，呈現明顯的粘膜皺折，大量上皮細胞脫入支氣管腔，基底膜增厚，上皮下膠原沉積，平滑肌增殖。
在實施方案中，CKLF-1的導入還引起小鼠體內的肺纖維化病變。例如引起肺小血管異常，肺泡壁增厚，肺泡上皮細胞、中性粒細胞、巨噬細胞、成纖維細胞聚集增生，肺間質膠原沉積。因此，CKLF-1廣泛地參與了支氣管肺的炎性損傷與修復過程，亦可能在慢性阻塞性肺疾病、急性呼吸衰竭的發病中發揮重要作用。
除肺部效應外，發明人還發現CKLF-1可引起肝、脾、腎、睪丸等組織的變性腫脹以及結構改變。故有理由推測CKLF-1對其它組織器官也會產生病理生理效應，即CKLF-1具有致器官炎性損傷的作用。
炎性損傷是指炎細胞積聚活化，釋放大量炎性介質所造成的組織細胞損傷，如毛細血管通透性增加，血漿滲出，細胞腫脹變性，功能受阻等等。炎性損傷發生在不同的組織器官既有炎癥的一般表現，也有不同的特性。
因此，本發明涉及一種體外檢測方法，包括相對于正常對照，通過檢測樣品中CKLF-1的過量表達而確定樣品炎性損傷狀態的方法。樣品可以是來自有機體的組織或細胞，如肺手術切除組織，肺支氣管粘膜組織，外周血單個核細胞等。檢測標的物可以是CKLF-1核酸編碼序列或CKLF-1蛋白。檢測來自宿主的樣品中CKLF-1改變水平的分析方法是本領域技術人員公知的。例如，在DNA水平上，可以從樣品細胞中獲得用于診斷的核酸，基因組DNA可以直接用于檢測，或者在分析前用與CKLF-1核酸序列互補的引物進行PCR擴增。在蛋白質水平上的分析方法包括放射免疫測定、競爭結合測定、Western印跡分析、ELASA測定等等。
在本發明的一個優選實施方案中，用CKLF-1特異性引物進行PCR擴增，檢測到哮喘患者PBMCs中CKLF-1的表達明顯高于非哮喘患者。
根據本發明的再一個方面，公開用CKLF-1制作炎性損傷的動物模型的方法，尤其是制作哮喘氣道損傷及重塑和肺纖維化動物模型的方法。
可以用各種已知的方法將CKLF-1導入動物體內，制作炎性損傷的病理模型。例如，可以采用鼻吸、口服、靜脈內、肌內、腹膜內、胸骨內、皮下、關節內注射和輸注等方法，建立支氣管哮喘氣道損傷的病理模型。優選注射和吸入途徑，更優選霧化吸入途徑。
霧化吸入是指借助霧化裝置將溶質吸入肺支氣管，使溶質直接在肺局部發揮作用。由于抗原的氣道吸入是大部分哮喘的始發途徑，因此霧化吸入途徑非常接近哮喘發生的真實狀況。
導入動物體內的CKLF-1可以與藥學上可接受的載體或賦形劑一起制成組合物，用于注射或輸注的組合物包括無菌水溶液或非水溶液、分散液、懸浮液或乳液，以及臨使用前在無菌可注射溶液或分散液中配制的粉末。用于適于吸入的組合物中，CKLF-1可以被壓縮或含于壓縮氣體如氮氣或液化氣體推進劑中。
用于制作病理模型的動物可以是除人類以外的哺乳動物，例如小鼠、大鼠、兔等。使用的動物符合國家規定的實驗動物標準。
在一個優選實施方案中，發明人采用電脈沖裸基因肌肉注射法，將真核表達質粒pcDI-CKLF1導入小鼠體內，成功地復制出類似于支氣管哮喘氣道損傷及重塑的小鼠動物模型，表現為大量氣道上皮脫落，杯狀細胞增生，基底膜增厚，上皮下膠原沉積，平滑肌增殖及肺小血管異常等病變。發明人用該方法同時建立了小鼠肺纖維化的病理模型。
根據本發明的又一個方面，公開了CKLF-1在制備具有治療器官炎性損傷作用的抗體和拮抗劑中的用途。
根據本發明，CKLF-1可以用于制備和篩選具有治療器官炎性損傷作用的抗體和拮抗劑。抗體可以是單克隆的或者是多克隆的。拮抗劑包括在一定條件下與CKLF-1結合的寡肽或化合物。拮抗劑可以與CKLF-1結合并在受體位點阻斷其活性，或者，可以與CKLF-1受體結合，從而阻止CKLF-1與受體的結合。可以用本領域已知的各種方法制備CKLF-1抗體和拮抗劑。例如，將CKLF-1蛋白注入動物體內，獲得CKLF-1抗血清。用人B細胞-雜交瘤技術、EB病毒-雜交瘤技術等制備CKLF-1單克隆抗體。
本發明的優點和特點概述如下首先，首次公開了CKLF-1對器官炎性損傷，尤其是對支氣管哮喘氣道炎性損傷及重塑和肺纖維化的重要作用。本發明不僅提供了一種新的器官炎性損傷的檢測方法，而且為這類疾病的深入研究提供了實驗基礎。
其次，利用本發明成功地建立了小鼠氣道炎性損傷及重塑樣模型。該模型克服了以往哮喘研究動物模型的缺陷，具有氣道上皮脫落等病變，能夠真實地反映哮喘的病理特征，因此為闡明哮喘發病機理，研究和防治哮喘提供了有益工具。
第三，本發明公開的實驗資料和結果，對哮喘及相關疾病的研究意義深遠。例如，本發明人發現(1)在基礎狀態下，人氣道上皮細胞和外周血單個核細胞(PBMCs)表達CKLF-1；(2)前炎因子TNF-α可以上調人氣道上皮細胞CKLF-1的表達；(3)嗜酸性粒細胞在哮喘氣道損傷及重塑中未必是不可缺少的因素；(4)嗜中性粒細胞的聚集活化在哮喘樣氣道損傷及重塑中具有重要意義。
附圖簡述

圖1顯示人氣道上皮16HBE細胞和外周血單個核胞CKLF-1的表達。
圖2顯示TNF-α對16HBE細胞CKLF-1表達的影響。
圖3A-6B顯示CKLF-1對小鼠氣道上皮的影響。其中，圖3A是導入pcDI空質粒2周后，小鼠(對照組)氣道上皮細胞的蘇木精-伊紅(HE)染色結果(20×)；圖3B是導入pcDI-CKLF1質粒2周后，小鼠(實驗組)氣道上皮細胞的HE染色結果(20×)；圖4是導入pcDI-CKLF1質粒3周后，小鼠(實驗組)氣道上皮細胞的HE染色結果(20×)，圖中顯示氣道上皮杯狀細胞增生；圖5A是導入pcDI-CKLF1質粒6周后，小鼠(實驗組)氣道上皮細胞的HE染色結果(20×)；圖5B是導入pcDI-CKLF1質粒6周后，小鼠(實驗組)氣道上皮細胞的HE染色結果(20×)，圖中可見明顯的氣道粘膜皺折；圖6A顯示導入pcDI空質粒8周后，小鼠(對照組)姬姆薩染色支氣管肺泡灌洗液(BALF)中的少量上皮細胞(20×)；圖6B顯示導入pcDI-CKLF1質粒8周后，小鼠(實驗組)姬姆薩染色支氣管肺泡灌洗液(BALF)中以集落形式脫落的上皮細胞(20×)；圖7顯示CKLF-1對小鼠氣道基底膜的影響(HE染色，20×)。
圖8顯示CKLF-1對小鼠氣道平滑肌的影響(20×)。
圖9A-10B顯示CKLF-1對小鼠肺組織的影響。其中，圖9A是導入pcDI空質粒2周后，小鼠(對照組)肺組織的HE染色結果(20×)；圖9B是導入pcDI-CKLF1質粒2周后，小鼠(實驗組)肺組織的HE染色結果(10×)；圖10A是導入pcDI空質粒4周后，小鼠(對照組)肺組織Mallory改良染色的結果(40×)；圖10B是導入pcDI-CKLF1質粒4周后，小鼠(實驗組)肺組織Mallory改良染色的結果(40×)，圖中顯示膠原纖維。
圖11A～11B顯示CKLF-1對小鼠肺組織血管的影響。其中，圖11A是導入pcDI空質粒4周后，小鼠(對照組)肺組織血管的HE染色結果(20×)；圖11B是導入pcDI-CKLF1質粒4周后，小鼠(實驗組)肺組織血管的HE染色結果(20×)。
圖12A-12B顯示CKLF-1對小鼠肺組織巨噬細胞的影響。其中，圖12A顯示苔盼蘭活體注射后對照組小鼠肺組織切片(20×)；圖12B顯示苔盼蘭活體注射后實驗組小鼠肺組織切片(20×)。
圖13A-13B顯示肺組織CKLF-1表達的免疫組化檢測。其中，圖13A是對照組小鼠肺組織CKLF-1表達的免疫組化檢測(40×)；圖13B是實驗組小鼠肺組織CKLF-1表達的免疫組化檢測(40×)。
圖14顯示正常對照組與哮喘組外周血單個核細胞的CKLF-1表達。
圖15A-15B顯示正常對照與哮喘患者支氣管粘膜CKLF-1蛋白表達的免疫組化檢測。其中，圖15A是正常對照支氣管粘膜CKLF-1蛋白表達的免疫組化檢測(蘇木素復染，40×)；圖15B是哮喘患者支氣管粘膜CKLF-1蛋白表達的免疫組化檢測，(蘇木素復染，40×)。
為了更清楚地理解本發明，現參照以下實施例對其進行說明。實施例對本發明的保護范圍沒有任何限制意義。優選實施例的描述實施例1.CKLF-1在人氣道上皮細胞和外周血單核細胞的表達以及TNFα對人氣道上皮細胞中CKLF-1表達的影響為探測CKLF-1是否參與支氣管哮喘的發生，須確定CKLF-1是否表達于炎性細胞和氣道結構細胞，以及在前炎因子刺激下CKLF-1表達是否發生變化。
本實施例(1)以正常人外周血單個核細胞為炎細胞代表，以正常人氣道上皮細胞16HBE為氣道結構細胞代表，檢測了CKLF-1的表達。(2)檢測了前炎因子TNF-α對氣道上皮細胞CKLF-1表達的影響。
1.正常人氣道上皮細胞株16HBE的培養取正常人氣道上皮細胞株16HBE(Southampton)凍存管1支，在37℃水浴迅速凍融，加入含10％胎牛血清、100u/ml青霉素、100u/ml鏈霉素的1640培養液。以1×105細胞/ml接種于25cm2培養瓶中，在37℃，5％二氧化碳孵箱內培養。每隔2天換液，待細胞長至基本匯合狀態時按照1∶3傳代。傳代時用0.125％的胰酶消化2分鐘，用含血清培養基吹懸細胞后離心。以1×105/ml接種于12孔培養板，用含10％胎牛血清的DMEM培養液繼續培養。當細胞80％匯合成片時，吸凈上清改用無血清培養基培養。12小時后用1000U/ml TNF-α刺激培養細胞。
2.外周血單個核細胞(PBMCs)的分離從健康受試者抽取外周靜脈血3-4毫升，肝素抗凝。用4℃預冷的生理鹽水將新鮮血稀釋1倍并混勻。將稀釋血液加于2毫升淋巴細胞分離液(比重1.077)之上，2000轉/分鐘，離心20分鐘。吸出中層單個核細胞，加入另一試管。加2毫升生理鹽水洗滌單個核細胞。4℃，1000轉/分鐘，離心10分鐘。棄上清，加1毫升生理鹽水重復洗滌。4℃，2000轉/分鐘，離心5分鐘。棄上清，沉淀即為PBMCs。
3.總RNA提取和cDNA合成按照《基因操作技術》(第一版)(王申五主編，北京醫科大學協和醫科大學聯合出版社出版.1991；46-48)和《分子克隆》(第二版)(J.薩姆布克等著，金冬雁等譯.科學出版社出版)中的方法分別提取16HBE、PBMCs總RNA，并在逆轉錄酶(Promega公司)的作用下合成cDNA，用于檢測正常氣道上皮細胞和外周血單個核細胞中CKLF-1的表達。
于TNF-α刺激16HBE細胞8、12、20小時后，分別提取細胞總RNA，進行RT-PCR，用于檢測TNF-α對氣道上皮細胞CKLF-1表達的影響。實驗對照組只加DMEM無血清培養液。
4.PCR擴增CKLF-1片段(1)引物CKLF-1擴增引物上游引物5’-ATG GAT AAC GTG CAG CCG AAA AT-3’下游引物5’-CCG CTC GAG TTA CAA AAC TTC TTT TTT TTC-3’β-actin擴增引物上游引物5-`ATG TGG CAC CAC ACC TTC TAC AAT GAG CTG CG-3`，下游引物5-`CGT CAT ACT CCT GCT TGC TGA TCC ACA TCT GC-3`。
(2)反應體系分別以16HBE細胞、外周血單個核細胞、TNF-α刺激16HBE細胞8、12、20小時后mRNA逆轉錄的cDNA為模板，進行PCR擴增。
反應體系含有10×PCR緩沖液2.5ul，1.25mM的dNTP 4ul，上游、下游引物各50pmol，模板2ul，Taq DNA聚合酶1U，加滅菌雙蒸水至25ul。
以β-actin擴增作為PCR反應的對照。以質粒pcDI-CKLF1(含CKLF-1開放讀碼框架，構建見下文)擴增出的片段作為CKLF-1的對照。
(3)反應參數預變性94℃變性8分鐘，加Taq酶0.8μl，94℃變性2分鐘；
循環94℃變性15秒，60℃退火15秒，72℃延伸30秒，35個循環；延伸72℃7分鐘。
5.PCR產物鑒定及定量分析反應結束后，將PCR反應管置4℃冰箱10分鐘。隨后取6μl反應終產物，于2％瓊脂糖凝膠(含溴乙錠0.5μg/ml)，6V/cm恒壓下電泳30分鐘。取凝膠在紫外線燈下觀察，并在UVP暗箱式紫外凝膠圖象分析儀上，對凝膠進行攝影記錄和熒光亮度測定，并進行相對定量分析。
結果1.CKLF-1在正常人氣道上皮細胞和外周血單個核細胞的表達如圖1所示，作為PCR對照的反應管擴增出838bp的β-actin片段。用CKLF-1特異性引物，從質粒pcDI-CKLF1中擴增出作為CKLF-1對照的300bp片段(條帶B)；同時從16HBE和PBMCs中亦擴增出300bp片段(條帶C、D、E)。由圖可見，CKLF-1在人氣道上皮細胞高表達，在人外周血單個核細胞亦有一定水平的表達。
由于氣道上皮細胞不僅具有防御保護和物理屏障的功能，而且具有介導炎癥反應的功能。例如在環境因素刺激下，氣道上皮細胞活化，分泌大量的粘附分子及細胞因子，這些物質又作用于氣道上皮，引發一系列特征性哮喘氣道炎癥反應。CKLF-1在氣道上皮細胞的表達提示該因子可能參與氣道的炎癥反應。
此外，已經證實哮喘的發生有炎性細胞的參與，炎性細胞分泌的生物活性物質可以介導炎癥的發生。CKLF-1表達于炎性細胞(如外周血單個核細胞)提示當哮喘發生、炎細胞聚集于氣道粘膜時，炎細胞可能表達并釋放CKLF-1，參與哮喘炎癥的發生。
2.前炎因子TNF-α對氣道上皮細胞CKLF-1表達的影響。
如圖2所示，前炎因子TNF-α刺激8小時、12小時后，人氣道上皮細胞CKLF-1表達無明顯變化；刺激20小時后，人氣道上皮細胞的CKLF-1表達水平顯著增高。
TNF-α的活化是哮喘發病的重要特征之一。由TNF-α活化而引發一系列前炎因子的分泌，構成作用復雜、效應廣泛的細胞因子網絡，最終導致哮喘炎癥損傷及重塑的特征性反應。本實驗發現氣道上皮細胞CKLF-1可以被TNF-α活化，則CKLF-1可能通過細胞因子網絡參與哮喘的氣道炎癥反應。發明人還發現前炎因子TNF-α刺激后，CKLF-1的表達并非即刻增強。說明CKLF-1表達的上調依賴于TNF-α的持續作用，或者其表達是受TNF-α刺激后上調的其它細胞因子作用而增強的，即CKLF-1對TNF-α的反應需要經歷一定的時段。
綜合上述結果，CKLF-1可能參與了哮喘氣道炎癥及重塑病變。
實施例2.CKLF-1介導的小鼠肺支氣管病變用電脈沖裸基因注射法，將CKLF-1導入小鼠體內。觀察注入CKLF-1后2至8周小鼠肺支氣管的病理變化，以檢測單一因子CKLF-1對肺支氣管的直接病理作用。
1.質粒(1)質粒構建質粒pcDI將pcDNA3(Invitrogen公司)的BglI-kpnI片段與PcI(Promega公司)的BglI-kpnI片段置換，得到pcDI真核表達質粒。
質粒pcDI-CKLF-1EcoRI酶切PGEM-T-Easy-CKLF-1質粒，釋放CKLF-1的ORF片段，連接至經EcoRI酶切并用CIP處理過的pcDI質粒中，再經酶切鑒定得到正向插入的CKLF-1的真核表達質粒pcDI-CKLF-1。
(2)質粒的大量提取與純化將陽性菌株劃板，37℃孵育過夜。挑取單克隆菌落置于3ml LB培養基和抗生素中37℃，200rpm搖8小時，將菌液轉移入2000ml含抗生素的LB培養基中，37℃，200rpm搖過夜。質粒提取純化及內毒素的處理方法和步驟嚴格按照EndoFree Plasmid Giga Kit(IAGEM-tip10000，Hilden，Germany)操作說明進行。
2.實驗動物4-6周齡BALB/c健康小鼠(購自北京大學基礎醫學院實驗動物所)共140只，雌雄各半，隨機分為5組(見表1)。每組一半為實驗鼠，一半為對照鼠。實驗鼠分別為導入pcDI-CKLF-1后2w，3w，4w，6w，8w及相應的對照鼠。本文簡稱為2w組，3w組，4w組，6w組，8w組及對照組。
表1.CKLF-1轉基因實驗小鼠分組(只)組別 pcDI-CKLF1 pcDI對照2w組 10 103w組 20 204w組 20 206w組 10 108w組 10 103.CKLF-1基因的體內轉移將經過無菌處理的質粒溶解到生理鹽水中，調節濃度至1μg/μl，利用微量注射器將100μl(100ug)質粒溶液注射到實驗鼠一側大腿的股四頭肌內，對照鼠于相同部位注射pcDI空質粒100ul(100ug)，注射后立即在注射部位插入兩根電極，電極由不銹鋼針制成，直徑0.08mm，長10mm，插入深度5mm，電極間距5mm，電極連接至湯氏基因治療儀(TS-A)，給予直流方波電脈沖刺激.參數為場強200v/cm，脈沖波寬40ms，刺激頻率1Hz，作用時間6秒。然后分期分批頸椎脫臼處死。每組10只小鼠中4-6只用于形態觀察，其余作支氣管肺泡灌洗。
4.導入CKLF-1后動物的生理指標檢測(1)動物的呼吸頻率、體重、肺系數的觀察記錄3，4W組實驗鼠與對照鼠的呼吸頻率，稱量體重后，摘取肺臟稱其總重量，再計算肺系數。肺系數為肺重g/體重g×100。
(2)臺盼藍活體注射稱取適量臺盼藍粉劑，溶于生理鹽水，配成終濃度為1％的臺盼藍水溶液、然后煮沸10分鐘滅菌。選取導入CKLF-1后3到4w的小鼠，以無菌手術操作方法，按2-5ml/kg之劑量將滅菌臺盼藍溶液注入小鼠腹腔，48小時后重復注射一次。再經歷24小時后處死小鼠，取肺組織，立即固定。
(3)病理光鏡標本制備將新鮮肺組織立即投入Bouin溶液中固定48小時以上，分別用70％、80％、90％、95％乙醇脫水12小時，每次脫水期間換液3次。再用無水乙醇脫水2小時，期間換液2次。隨后用二甲苯透明45-60分鐘，期間換液1次。65℃浸蠟一小時。浸蠟后的組織放入65℃石蠟包埋，4mm連續切片。用HE及改良Mallory染色，進行顯微鏡觀察。
(4)電鏡標本制備將新鮮肺組織立即固定于新近配制的4℃2.5％戊二醛溶液中，真空抽出肺內空氣，按電鏡常規制備標本。半薄切片定位后再行超薄切片。醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙染色，在日立H-600透射電鏡下觀察。
(5)支氣管肺泡灌洗按分組于第3、4、6、8周頸椎脫臼處死動物，氣管切開插管，1640培養液灌洗，每次0.8ml共3次。灌洗液回收率＞80％，行細胞記數。沉淀涂片作HE染色或姬姆薩染色。
(6)灌洗液細胞涂片的制作，細胞計數和分類離心獲得的BALF中細胞經沉淀，用1ml生理鹽水稀釋，取一部分進行計數，算出每毫升的細胞數，進而計算細胞總數；同時涂片，立即用電吹風筒的冷風檔迅速吹干玻片，待細胞干燥固定后作HE染色或姬姆薩染色。光學顯微鏡下進行細胞分類，數500個細胞，計算細胞的百分比，用細胞總數乘以百分比數即得細胞的絕對數。
結果由電脈沖裸基因肌肉注射法導入的CKLF-1，成功地在注射局部獲得表達產生相應的蛋白質，CKLF-1蛋白隨血液循環到達肺部，從而導致了肺支氣管的一系列病變(詳見下文)。免疫組化顯示的CKLF-1主要表達在氣道上皮細胞和上皮下部分間質細胞，亦證實了CKLF-1體內轉移的成功。
1.導入CKLF-1小鼠的呼吸頻率及體重變化如表2所示，導入CKLF-1 3，4周后的小鼠與對照相比，在籠內活動增多，呼吸頻率加快，體重降低。
表2.CKLF-1導入3、4周后小鼠呼吸頻率及體重的變化組別 呼吸頻率(b/min)n＝8體重(g)n＝32實驗組107.8±20.7※ 22.93±1.88※對照組81.7±15.8 26.09±1.57※與對照組相比P＜0.052.CKLF-1對小鼠肺組織重量的影響如表3所示，肉眼觀CKLF-1導入3、4周后小鼠與對照相比，肺體積膨大，有些肺組織表面明顯充血。肺系數比對照組增加39.2％。
表3.CKLF-1對小鼠肺組織重量的影響組別 例數 肺系數實驗組 n＝16 0.78±0.10※對照組 n＝16 0.56±0.07※與對照組相比P＜0.053.CKLF-1對小鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)中細胞的影響如表4所示，對照組小鼠BALF細胞總數雖比其它資料顯示為高，但實驗各組細胞總數比對照組顯著增高，各實驗組均比對照組高200％以上，細胞總數增高至少維持8周。
表4.CKLF-1導入小鼠后BALF細胞總數的變化(×106)組別 對照組實驗組3w 4.3±2.2 11.6±3.8※4w 4.5±2.9 10.7±3.5※6w 3.8±2.6 9.9±2.9※8w 3.3±1.7 9.5±3.2※與對照組相比P＜0.01，各實驗組間差異無統計學意義。
如表5所示，實驗組BALF中細胞的分類表明，大量細胞中以上皮細胞增加為著，為對照組的8.1倍。與對照組相比淋巴細胞及中性粒細胞亦明顯增加。但兩組均未見嗜酸性粒細胞(Eos)。
表5.CKLF-1導入3周后小鼠BALF細胞學變化(×106)組別 細胞總數 Eos 上皮細胞 L+N對照組4.3±2.2 0 0.8±0.200.7±0.2實驗組11.6±3.8※ 0 6.5±2.6※ 2.3±0.7※注L淋巴細胞 N中性粒細胞與對照組相比P＜0.014.對小鼠氣道上皮的影響(1)導入CKL-1后2周，小鼠氣道上皮細胞充血水腫、脫落如圖3A所示，對照組小鼠(注射pcDI空質粒)氣道上皮細胞排列較整齊、無脫落，周圍肺泡結構及肺血管無明顯異常。實驗組小鼠(注射pcDI-CKLF1)氣道上皮細胞充血水腫，支氣管變形，管腔內可見脫落的上皮及滲出物，周圍肺組織明顯充血水腫(圖3B)。
(2)導入CKLF-1后3周，小鼠氣道上皮杯狀細胞增生如圖4所示，小鼠氣道上皮杯狀細胞增生(支氣管哮喘氣道上皮表型改變的特征)，大量分泌物、滲出物充溢支氣管管腔，管腔明顯狹窄。在40×視野下放大增殖的杯狀細胞，可見杯狀細胞分泌的粘原顆粒。電鏡檢查可見上皮細胞纖毛幾乎脫光。
(3)導入CKLF-1后6周，氣道上皮嚴重受損，結構排列紊亂如圖5A所示，平行排列的3個支氣管已無正常形態，細胞排列紊亂、細胞連接破壞，大量上皮細胞與基底膜分離，脫落于管腔，幾乎堵塞管腔。如圖5B所示，平行排列的支氣管上皮細胞排列紊亂、脫落。可見明顯的氣道粘膜皺折(哮喘氣道病變的一個重要特征)。
(4)導入CKLF-1后2-8周，肺泡灌洗液中氣道上皮細胞脫落導入CKLF-1后2周，肺泡灌洗液中檢測到大量脫落的氣道上皮細胞。3周后脫落的細胞成片或以集落形式出現直至第8周，脫落細胞以柱狀上皮細胞為主。圖6A示導入pcDI(對照)8周后，BALF中少量的上皮細胞；圖6B示導入pcDI-CKLF1 8周后，BALF中以集落形式脫落的上皮細胞。
5.CKLF-1對小鼠氣道基底膜的影響正常情況下，小鼠氣道的光鏡觀察難以見到基底膜。而CKLF-1轉入6周后，可見小鼠氣道基底膜增厚。圖7示變形的支氣管，嚴重受損的上皮。緊貼上皮下的條狀粉紅色均一結構為基底膜。
6.CKLF-1對小鼠氣道平滑肌的影響光鏡下觀察，正常豚鼠的小支氣管周圍有明顯的平滑肌結構，圍繞支氣管呈環型排列，而正常小鼠很難見到平滑肌結構。而CKLF-1導入4周后，小鼠支氣管平滑肌細胞增殖。圖8示變形的支氣管，粗大的氣管粘膜皺折。粘膜下顯著增厚的組織為增殖的平滑肌細胞。
7.CKLF-1對小鼠肺組織的影響導入pcDI后2周，對照組小鼠肺泡結構無明顯異常(圖9A)；導入pcDI-CKLF1后2周，實驗組小鼠肺周邊肺泡正常結構消失，肺泡壁增厚，肺泡間隔細胞聚集增生，肺間質充血水腫(圖9B)。
導入CKLF-1后3周，小鼠肺泡壁明顯增厚，大量免疫活性細胞聚集增生，增多的細胞有肺泡上皮細胞，成纖維細胞，巨噬細胞及嗜中性粒細胞。
Mallory改良染色(可顯示膠原纖維)顯示與對照組相比(圖10A)，導入CKLF-1后4周，小鼠肺間質大量膠原纖維增生(圖10B)。
8.KLF1對小鼠肺組織血管的影響與對照組(圖11A)相比，導入CKLF-1后4周小鼠支氣管上皮受損，基底膜增厚。氣管旁肺小血管管壁明顯增厚，膠原蛋白沉積，透明樣變性(圖11B)。
9.CKLF-1對小鼠肺組織巨噬細胞的影響苔盼蘭活體注射一定時間后處死小鼠，取肺標本立即固定，常規切片，鏡下觀察。由圖12A和12B可見肺結構支架及巨噬細胞吞噬的蘭色顆粒。與對照相比(圖12A)，導入CKLF-1的小鼠肺中蘭色顆粒明顯增多，表明巨噬細胞增生聚集。小鼠肺內苔盼蘭顆粒不但數量多且體積大，表明肺組織巨噬細胞數量明顯增多且活性增強(圖12B)。
10.肺組織CKLF-1表達的免疫組化分析對照組小鼠無特異陽性反應，血管內的黃褐色顆粒為非特異性染色(圖13A)；實驗組小鼠氣道上皮細胞內的黃褐色顆粒為CKLF-1免疫反應強陽性，CKLF-1主要表達在氣道上皮細胞和上皮下部分間質細胞的胞質中，細胞核內無特異免疫反應，仍呈蘭色(圖13B)。
上述結果充分證明CKLF-1導入小鼠體內，直接介導了類似支氣管哮喘氣道粘膜活檢及尸解所見氣道損傷及重塑樣改變。發明人推測CKLF-1介導氣道損傷及重塑的機制在于(1)直接刺激氣道上皮細胞、平滑肌細胞等的增殖(直接作用)；(2)作為趨化因子趨化并活化免疫細胞，活化的免疫細胞分泌大量細胞因子，進而引起一系列病變(間接作用)。
除引起氣道損傷及重塑樣改變，CKLF-1導入小鼠體內尚引起肺泡充血水腫、肺泡壁增厚、肺間質細胞如成纖維細胞、巨噬細胞聚集活化，肺間質膠原沉積，形成纖維化樣改變。因此，CKLF-1還參與了肺間質纖維化的發生。
此外，發明人還發現(1)嗜酸性粒細胞(Eos)未必是哮喘氣道損傷及重塑中不可缺少的因素。已往的研究認為Eos浸潤是哮喘氣道炎癥的主要特征，本發明人將CKLF-1導入小鼠體內后的2至8周內，支氣管肺泡灌洗液始終未見脫落的Eos，支氣管肺組織病理切片亦未見粘膜Eos浸潤。這些結果提示Eos在氣道損傷及重塑中并非不可缺少的因素，僅針對Eos采取治療措施或許有失偏頗。(2)嗜中性粒細胞是哮喘發病中的重要因素。本發明人證實了CKLF-1的肺內嗜中性粒細胞趨化活性，結合CKLF-1所致肺支氣管病變，認為CKLF-1引起的嗜中性粒細胞聚集活化，在CKLF-1介導的哮喘樣氣道損傷及重塑中具有重要意義。
實施例3.哮喘患者外周血單個核細胞CKLF-1mRNA的表達及支氣管粘膜CKLF-1蛋白的檢測用RT-PCR方法觀察哮喘病人外周血單個核細胞CKLF-1mRNA的表達，用免疫組織化學方法探測哮喘病人支氣管粘膜CKLF-1蛋白水平的表達。以通過臨床研究驗證CKLF-1是否參與哮喘的發病。
1.哮喘病人外周血單個核細胞CKLF-1mRNA的表達(1)實驗對象支氣管哮喘組男12例，女9例。平均年齡30±7.2歲。入選標準1.符合1997年中華醫學會制定的哮喘診斷標準病情輕或中度。2.三周內未使用糖皮質激素或其它抗炎藥物。3.近期無呼吸道感染。4.皮膚過敏原測試，兩種以上過敏原陽性。5近期喘息發作。
正常對照組21例自愿受試者男11例，女9例，年齡29±8.2歲。無哮喘、過敏性鼻炎及其它過敏疾病，無腫瘤及慢性炎癥疾病。
(2)PCR檢測CKLF-1的表達從哮喘患者及健康受試者抽取外周靜脈血3-4毫升，肝素抗凝。外周血單個核細胞的分離方法如前所述。
提取PBMCs細胞總RNA，逆轉錄合成cDNA。
以PBMCs逆轉錄產物作為模板，進行PCR反應。擴增引物、反應體系及參數如前所述。
結果如圖14所示，哮喘患者PBMCs的CKLF-1表達水平明顯高于健康人。癥狀期哮喘組CKLF-1/β-actin比值顯著高于正常人，分別為0.815±0.103和0.561±0.0862(P＜0.05)(見表6)。
表6.哮喘與對照PBMC的CKLF-1/β-actin比值X±SD組別 例數 CKLF-1/β-actin哮喘組 21 0.815±0.103※對照組 21 0.561±0.0862與對照組相比P＜0.052.哮喘病人支氣管粘膜的病理觀察及CKLF-1的免疫組化分析(1)實驗對象哮喘組男4例，女4例，平均年齡30±7.2歲。入選標準1.符合1997年中華醫學會制定的哮喘診斷標準病情中或重度。2.三周內未使用糖皮質激素或其它抗炎藥物。3.近期無呼吸道感染排除其它慢性炎癥。4.支氣管鏡檢查的前一天進行肺通氣功能和組織胺激發實驗。
對照組男4例，女2例，年齡29±8.2歲。無哮喘過敏性鼻炎及其它過敏疾病，無肺部腫瘤及炎癥感染疾病。因肺內局部陰影需作支氣管纖維鏡檢查的非哮喘患者。
(2)纖維支氣管鏡檢查囑受試者早晨空腹，術前半小時口服安定2.5mg，阿托品0.3mg，術前30分鐘5％利多卡因2ml+0.5％舒喘寧0.5-1ml混合霧化吸入，2％利多卡因局部噴霧麻醉口咽喉部，術前用麻黃素和2％利多卡因處理鼻腔，受試者仰臥，吸入氧氣，監測其心率，操作按常規將支氣管纖維鏡經鼻咽腔插入氣管，然后分別在右上葉嵴，右中葉嵴鉗取粘膜組織2-3塊，放入1％多聚甲醛固定液中固定。
(3)病理觀察樣本制備將活檢肺組織即刻放入10％福爾馬林液中固定過夜。70％乙醇2小時→80％乙醇1小時→95％乙醇1小時→95％乙醇1小時→無水乙醇2小時→無水乙醇1.5小時→無水乙醇1.3小時，進行脫水處理。TO生物透明劑(廣西松香廠)依次處理30分鐘、1小時、30分鐘。50℃低溫浸蠟1小時。浸蠟后的組織放入60℃石蠟中包埋。4mm連續切片。HE染色，顯微鏡觀察并攝影。
(4)免疫組化取2張石蠟包埋組織切片，二甲苯脫蠟2次各5分鐘。90％，80％，70％乙醇水化各5分鐘。自來水沖洗2分鐘，蒸餾水漂洗2次。置檸檬酸鈉緩沖液中于微波爐92-98℃加溫1-2分鐘，室溫冷卻。置于3％H2O2漂洗10分鐘。加入50μl過氧化物酶阻斷劑室溫孵育10分鐘。PBS漂洗5分鐘各3次。加入50μl非免疫性動物血清。室溫孵育10分鐘，吸取多余液體。
2張玻片分別加入50μl PBS、CKLF-1單克隆抗體，室溫孵育60分鐘，PBS洗滌3次。加入50μl生物素標記二抗，室溫孵育10分鐘，PBS洗滌3次。加入50μl鏈霉素親和素-過氧化物酶，室溫孵育10分鐘，PBS洗滌3次。加入100μl新配制DAB液，顯微鏡下觀察染色情況，自來水沖洗5分鐘終止反應。蘇木素復染。自來水沖洗，自然干燥，用中性樹膠封片。
結果1.支氣管粘膜活檢的組織學觀察(1)對照組(健康受試者)正常氣道上皮由多種細胞組成，如假復層纖毛柱狀上皮細胞、杯狀細胞、基底細胞等。盡管上皮的多種細胞排列參差不齊，但所有細胞均緊貼于基底膜之上，仍為一單層細胞(假復層上皮)。靠近頂腔的上皮細胞緊密相連，形成上皮屏障。基底細胞靠近基底膜表面。杯狀細胞很少。
(2)實驗組(哮喘患者)
纖維支氣管鏡檢查發現，8例哮喘患者的氣道粘膜充血水腫，嚴重者粘膜發白，支氣管管徑狹窄。2例病人的支氣管肺泡灌洗液細胞涂片可見大量氣道上皮細胞呈片狀脫落。支氣管粘膜活檢顯示患者氣道粘膜主要以淋巴細胞、Eos浸潤為主，氣道上皮細胞破壞，細胞外基質明顯增多。其中1例患者氣道粘膜無明顯Eos浸潤，其氣道上皮層的纖毛細胞及杯狀細胞幾乎全部脫落，僅剩少量基底細胞附于基底膜之上；基底膜顯著增厚，透明樣變性；間質中膠原沉積、大量細胞聚集及平滑肌增生。這些充分表明支氣管哮喘是伴有顯著氣道結構改變的氣道炎癥。
2.支氣管粘膜CKLF-1蛋白表達的免疫組化分析(1)對照組(健康受試者)正常對照上皮纖毛排列整齊形成一完整屏障，未見基底膜結構。CKLF-1免疫反應呈陰性，無特異性顯色(圖15A)。
(2)實驗組(哮喘患者)蛋白免疫組化分析顯示CKLF-1mRNA在患者PBMCs(包括單個核細胞和淋巴細胞，以淋巴細胞為主)高表達。8例中的5例患者部分上皮細胞及上皮下間質細胞免疫反應呈陽性。其中1例重癥患者的陽性反應最為明顯(圖15B)。
根據上述結果，認為哮喘患者在細胞水平上至少有淋巴細胞、氣道上皮細胞、上皮下間質的成纖維細胞及巨噬細胞處于活化狀態，因而使CKLF-1表達水平增高。實驗結果顯示哮喘患者尤其重癥患者的氣道上皮及上皮下間質均有高水平CKLF-1蛋白表達，推測CKLF-1有加強間質及平滑肌增殖的作用。作為氣道門戶的上皮細胞最早接受環境因素的刺激，由此激活上皮下成纖維細胞，啟動逐級放大的瀑布樣炎癥鏈式反應及炎癥損傷后的修復反應。
權利要求
1.一種體外檢測方法，包括檢測來自宿主的樣品中趨化素樣因子-1的過量表達，確定樣品炎性損傷的病理狀態。
2.如權利要求1的方法，其中所述炎性損傷是支氣管哮喘氣道炎性損傷及重塑和肺纖維化。
3.如權利要求2的方法，其中所述來自宿主的樣品是人外周血細胞、肺手術切除組織、肺支氣管粘膜組織。
4.一種制作器官炎性損傷的動物模型的方法，包括將趨化素樣因子-1導入除人類之外的哺乳動物體內。
5.如權利要求4的方法，其中所述炎性損傷是支氣管哮喘氣道炎性損傷及重塑和肺纖維化。
6.如權利要求5的方法，其中采用注射的方法將趨化素樣因子-1導入動物體內。
7.如權利要求5的方法，其中采用霧化吸入的方法將趨化素樣因子-1導入動物體內。
8.如權利要求4-7任一項所述的方法，其中所述哺乳動物是小鼠。
9.趨化素樣因子-1在制備具有治療器官炎性損傷作用的抗體和拮抗劑中的用途。
10.如權利要求9的方法，其中所述炎性損傷是支氣管哮喘氣道炎性損傷及重塑和肺纖維化。
全文摘要
本發明公開了趨化素樣因子－1在檢測樣品炎性損傷的病理狀態、制作器官炎性損傷的動物模型、制備具有治療器官炎性損傷的CKLF－1抗體和拮抗劑中的用途，尤其是在支氣管哮喘氣道損傷及重塑和肺纖維化中的用途。
文檔編號G01N33/68GK1420358SQ0113996
公開日2003年5月28日 申請日期2001年11月21日 優先權日2001年11月21日
發明者鐘南山, 譚亞夏, 馬大龍, 韓文玲, 宋泉聲, 陳英玉 申請人:廣州呼吸疾病研究所, 北京大學醫學部