專利名稱：新的受體核酸及多肽的制作方法
技術領域：
本發明提供了一種新的受體蛋白。本發明廣義上涉及一種核酸及多肽。本發明更具體地涉及編碼與BAFF受體相關的多肽的核酸，該受體是一種B細胞活化因子，屬于腫瘤壞死因子(TNF)家族，與B細胞及免疫球蛋白的表達相關。該受體可用于治療癌癥、淋巴瘤、自身免疫疾病或B細胞有關的遺傳性疾病。
背景技術：
本發明涉及一種屬于TNF家族的新的受體。該新的受體被稱作BAFF受體(″BAFF-R″)。
TNF家族由多對的配體及它們的特異性受體組成，分別稱為TNF家族配體和TNF家族受體(Bazzoni and Beutler(1996)N.Engl.J.Med.334(26)1717-1725)。該家族參與免疫系統可能還有其他非免疫系統的調控。所述調控通常處于“控制開關”水平，以致于TNF家族信號能夠引發大量以TNF為特征的繼發反應。TNF能啟動有機體針對外來入侵者的一般的保護性炎癥反應，這種反應包括改變參與細胞運輸的粘附分子的表達，產生趨化因子以驅動特異性細胞到特定腔室以及活化各種效應細胞。因此，調控這些途經具有臨床應用前景。
所述TNF家族細胞因子介導的各種細胞應答的誘導被認為是通過它們與特異性細胞受體的結合來啟動的。目前已經鑒定出了至少兩種不同的TNF受體，分子量約55kDa(TNFR1)和75kDa(TNFR2)(Hohman et al.(1989)J.Biol.Chem.26414927-14934；和Brockhaus et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 873127-3131)。廣泛的多態性與這兩種TNF受體基因有關。這兩種TNFR都具有細胞表面受體的典型結構，包括胞外區、跨膜區及胞內區。1型和2型TNFR的胞外部分都包含4個富半胱氨酸結構域(CDR)的重復氨基酸序列模式。類似的CDR重復模式也存在于其他數種細胞表面蛋白中，包括p75神經生長因子受體、B細胞抗原CD40等。
這些受體是闡釋生物途經的有力工具，因為它們易于轉化為免疫球蛋白融合蛋白。這些二聚的可溶性受體形式是那些分泌型或表面結合型配體介導的事件的良好抑制劑。通過與這些配體結合，它們便可阻止這些配體與細胞相連受體間的相互作用，而這種相互作用能夠釋放信號。
這些受體-Fc融合蛋白不僅具有試驗價值，而且就TNF-R-Fc而言，它們還可以在臨床上與OKT3聯合給藥用于治療炎性腸道疾病(inflammatorybowel disease)、類風濕性關節炎以及急性臨床綜合征(Eason etal.(1996)Transplantation 61(2)224-228；Feldmann et al.(1996)Int.Arch.AllergyImmunol.111(4)362-365；和van Dullemen et al.(1995)Gastroenterol.109(1)129-135)。可以設想，對所述TNF家族受體發送信號而介導的多種事件進行操縱可以廣泛地用于治療以免疫為基礎的疾病，另外還可用于治療多種因免疫系統參與而具有病理性后遺癥的人類疾病。一種近來發現的可溶型受體，osteoprotegerin，它能夠阻止骨質的流失，因此TNF家族受體信號調控的事件不一定僅限于對免疫系統的調控(Simonet et al.(1997)Cell 89(2)309-319)。所述受體的抗體能阻斷配體的結合，因而也具有臨床用途。這些抗體通常壽命很長，與那些血液半衰期較短的可溶性受體-Fc融合蛋白相比具有優勢。
盡管對所述受體介導途經的抑制具有最廣闊的治療應用開發前景，但是最初顯示出臨床作用的卻是TNF受體的活化(Aggarwal和Natarajan(1996)Eur Cytokine Netw.7(2)93-124)。由于TNF受體的活化能夠引發靶細胞的細胞死亡，因而將其用于治療腫瘤無論是過去還是現在都是引人注目的(Eggermont et al.(1996)Ann.Surg.224(6)756-765)。受體的活化可以通過給藥配體即天然途徑或者給藥抗體來實現，這些抗體能夠與受體交聯因而也是有效的激動劑。由于這些抗體與那些血液半衰期一般比較短的配體相比，它們在血液中長時間存在，因而在腫瘤學方面有優勢。由于這些受體中許多受體在腫瘤中的表達是受到較嚴格挑選的，或者它們只發出腫瘤的細胞死亡或分化信號，因此，激動劑抗體可能成為治療癌癥的有力武器。類似地，多數有利的免疫反應都是通過TNF家族的介導的，例如宿主炎癥反應、抗體的生成等，因此激動抗體在其他非腫瘤領域也有有益效果。
看似矛盾的是，對一途徑的抑制在腫瘤治療上也有有益的臨床效果。例如，Fas配體表達于一些腫瘤，而且這種表達能導致Fas陽性淋巴細胞的死亡，因此使得該腫瘤能夠逃避免疫系統。這種情況下，抑制Fas系統就能使得免疫系統通過其他途徑與腫瘤反應，因為此時免疫系統能夠接觸到腫瘤(Green和Ware(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94(12)5986-90)。
TNF家族配體BAFF，也稱為TALL-1，THANK，BLyS和zTNF4(Sclneider et al.(1999)J.Exp.Med.189(11)1747-1756；Shu et al.(1999)JLeukoc.Biol.65(5)680-683；Mukhopadhyay et al.(1999)J.Biol.Chem.274(23)15978-15981；Moore et al.(1999)Science 285(5425)260-263；Gross etal.(2000)Nature 404(6781)995-999)，有助于B細胞體外存活(Batten etal.(2000)J.Exp.Med.192(10)1453-1466)，已作為體內外周B細胞群的關鍵調控劑。過表達BAFF的小鼠表現出成熟B細胞增生以及系統性紅斑狼瘡(SLE)的癥狀(Mackay et al.(1999)J.Exp.Med.190(11)1697-1710)。另外，一些SLE患者血清中BAFF水平顯著增高(Zhang et al.(2001)JImmunol.166(1)6-10)。因此可以認為，該配體水平的異常升高通過提高自身反應性B細胞的存活率引發自身免疫疾病(Batten et al.(2000)J.Exp.Med.192(10)1453-1466)。
BAFF是一種II型膜蛋白，由骨髓來源的細胞產生(Schneider etal.(1999)J Exp.Med.189(11)1747-1756；Moore et al.(1999)Science 285(5425)260-263)，表達于細胞表面或以可溶形式表達(Schneider et al.(1999)J.Exp.Med.189(11)1747-1756)。此前證明，TNF受體家族的兩成員BCMA和TACI與BAFF相互作用(Gross et al.(2000)Nature 404995-999；Thompson etal.(2000)J.Exp.Med.192(1)129-135；Xia et al.(2000)J.Exp.Med.192137-143；Masters et al.(2000)Curr.Biol.10(13)785-788；Shu et al.(2000)J.Leukoc.Biol.65(5)680-683；Wu et al.(2000)J.Biol.Chem.27535478-35485)。
發明概述本發明部分基于BAFF受體蛋白“BAFF-R”、多核苷酸序列以及這些核酸序列編碼的BAFF-R多肽的發現。
一方面，本發明提供了分離的核酸，該核酸編碼BAFF-R多肽或者其片段或衍生物。該核酸可以包括，例如，編碼與包含圖2D(SEQ ID NO5)所示氨基酸序列的多肽之間具有至少50％或至少90％相同的多肽的核酸序列。
本發明還提供了基本上純的核酸分子，其中含有能在嚴謹條件下與雜交探針雜交的序列，所述雜交探針的核酸序列由圖2A所示編碼序列(SEQID NO3)、圖2C所示編碼序列(SEQ ID NO4)或者所述編碼序列的互補序列組成。
一些實施方案中，所述核酸序列編碼具有圖2D所示序列(SEQ ID NO5)并有至少一處保守氨基酸取代的多肽。
一些實施方案中，所述核酸序列編碼能結合BAFF的多肽。
所述核酸可包括，例如，包含圖1A(SEQ ID NO1)、圖1B(SEQ ID NO2)、圖2A(SEQ ID NO3)、圖2C(SEQ ID NO4)及圖3(SEQ ID NO6)所示核苷酸序列的核酸。
所述核酸可以是，例如一基因組DNA片段，或者也可以是一cDNA分子。
本發明還包括其中含有一個或多個本發明所述核酸的載體，以及含有本發明所述載體或核酸的細胞。
另一方面，本發明提供了基本純的核酸分子，該核酸分子編碼融合蛋白，所述融合蛋白含有至少兩個區段，其中一個區段含有本發明上述實施方案列出的氨基酸序列中所述的多肽或其片段。本發明還提供了融合蛋白，該融合蛋白包含至少兩個或三個區段，其中第一區段包含異源信號肽，第二區段包含本發明上述實施方案列出的BAFF-R氨基酸序列中所述的多肽或其片段，第三區段包含免疫球蛋白多肽。替代地，所述第一區段包含含有信號序列的免疫球蛋白多肽片段，第二區段包含BAFF-R多肽片段。
其他方面，本發明提供了基本純的結合試劑，該試劑能特異性地結合本發明上述實施方案所述的多肽。
本發明還涉及用重組表達載體轉化后的宿主細胞，該載體包含任何上述核酸分子。
另一方面，本發明包括藥用組合物，該組合物包括BAFF-R多肽和藥學上可接受的載體或稀釋劑。
另一方面，本發明包括基本純化的BAFF-R多肽，例如，任何由BAFF-R核酸編碼的多肽。
本發明還包括藥用組合物，該組合物包括BAFF-R多肽和藥物學上可接受的載體或稀釋劑。
另一方面，本發明提供了能夠特異性結合BAFF-R多肽的抗體。所述抗體可以是，例如單克隆或多克隆抗體。本發明還包括藥用組合物，該組合物包括BAFF-R抗體和藥物學上可接受的載體或稀釋劑。本發明還涉及分離的抗體，所述抗體能夠與任一本發明所述核酸分子編碼的多肽上的表位結合。
本發明進一步還涉及試劑盒，該試劑盒包括能夠與任一上述核酸分子編碼的多肽結合的抗體和陰性對照抗體。
本發明提供了用于制備BAFF-R多肽的方法。該方法包括提供包含BAFF-R核酸，例如含BAFF-R核酸的載體的細胞，以及在足以使所述核酸編碼的BAFF-R多肽能夠表達的條件下培養該細胞。然后從該細胞中回收表達的BAFF-R多肽。優選地，該細胞產生微量或不產生內源BAFF-R多肽。該細胞可以是，例如原核細胞或真核細胞。
本發明提供了一種方法，該方法通過向哺乳動物給藥足以誘導免疫應答的量的由上述任一核酸分子編碼的多肽，從而在該哺乳動物體內誘導出抗所述多肽的免疫應答。
本發明還涉及鑒定能夠結合BAFF-R多肽的化合物的方法，該方法是使BAFF-R多肽與化合物接觸，然后測定該化合物是否與BAFF-R多肽結合。
本發明還涉及鑒定能夠與編碼BAFF-R多肽的核酸結合的化合物的方法，該方法是使BAFF-R核酸與化合物接觸，然后測定該化合物是否與所述核酸分子結合。
本發明進一步還提供了鑒定能夠調控BAFF-R多肽活性的化合物的方法，該方法是使BAFF-R多肽與化合物接觸，然后測定BAFF-R多肽的活性是否被改變。
本發明還涉及能夠調控BAFF-R多肽活性的化合物，該化合物通過下述方法鑒定使BAFF-R多肽與該化合物接觸，然后測定該化合物是否調控了BAFF-R多肽的活性，是否與BAFF-R多肽結合，或者是否與編碼BAFF-R多肽的核酸分子結合。
另一方面，本發明提供了診斷受試者B-細胞介導的疾病的方法，例如自身免疫紊亂或癌癥。該方法包括提供來自受試者的蛋白樣品并測量樣品中BAFF-R多肽的量。然后將受試者樣品中BAFF-R的量與對照蛋白樣品中BAFF-R多肽的量進行比較。受試者蛋白樣品中BAFF-R多肽量相對于對照蛋白樣品中BAFF-R多肽的量發生變化，表明該受試者患有B-細胞介導的疾病。優選地，對照樣品取自匹配的個體，即年齡、性別或其他一般狀況類似但是能排除其患有該疾病的個體。替代地，所述對照樣品可在該受試者未被懷疑患該疾病的時候獲取。一些實施方案中，使用BAFF-抗體檢測所述BAFF-R多肽。
另一方面，本發明包括診斷受試者B-細胞介導的疾病的方法，例如，自身免疫紊亂。該方法包括提供來自受試者的核酸樣品，例如RNA或DNA，或者二者兼有，測量受試者核酸樣品中BAFF-R核酸的量。然后將受試者核酸樣品中BAFF-R核酸的量與對照樣品中BAFF-R核酸的量進行對比。樣品中BAFF-R核酸的量相對于對照樣品中BAFF-R核酸的量發生變化，表明受試者患有自身免疫疾病。
另一方面，本發明包括診斷受試者是否患有腫瘤發生(famorigenic)疾病或自身免疫疾病的方法。該方法包括提供來自受試者的核酸樣品，并對受試者核酸樣品中BAFF-R核酸的核苷酸序列中至少一部分進行鑒定。然后將受試者樣品的BAFF-R核苷酸序列與對照樣品的BAFF-R核苷酸序列進行比較。樣品中BAFF-R核苷酸序列相對于對照樣品BAFF-R核苷酸序列發生變化，就表明受試者患有這樣的疾病。
另一方面，本發明提供了治療或預防或延緩B-細胞介導的疾病的方法。該方法包括向期望該種治療或防止或延緩的受試者給藥足以治療或防止或延緩受試者致瘤性疾病或自身免疫疾病的量的BAFF-R核酸、BAFF-R多肽、或抗-BAFF-R抗體。
可用上述BAFF-R核酸分子、多肽或抗體診斷、治療、預防或延緩的疾病可以是癌癥或免疫調節性疾病。這些疾病包括本質上是自身免疫的疾病，例如系統性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎、重癥肌無力，自身免疫性溶血性貧血、自發性血小板減少性紫癜、抗-磷脂綜合征、恰加斯氏病(Chagas′disease)、格雷夫斯氏病(Grave′s disease)、韋格內氏肉芽腫病(Wegener′s granulomatosis)、結節性多動脈炎(poly-arteritis nodosa)以及急進性腎小球腎炎。所述治療劑還可用于漿細胞疾病，例如多發性骨髓瘤、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血癥(Waldenstrom′s macroglobulinemia)、重鏈疾病(heavy-chain disease)、原發性或免疫細胞相關性淀粉樣變以及不明意義的單克隆球蛋白病(monoclonal gammopathy of undetermined significance(MGUS))。腫瘤學治療目標包括B細胞癌、白血病及淋巴瘤。
使用本發明所述核酸、多肽和抗體的組合物及治療方法可用于任一與不希望的細胞增生有關的疾病。具體而言，本發明可以用于治療表達有BAFF和/或BAFF-R的腫瘤細胞。
本發明含有BAFF-R激動劑(如能結合BAFF-R的抗體及模擬的BAFF)的組合物還可用于治療以B細胞減少為特征的免疫缺陷病。所述疾病例如由輻射和/或化療引起。
本發明另一方面，提供了一種用于減少重組表達蛋白聚集的方法。該方法包括對蛋白或其融合蛋白的多個同系物進行比較，從而測定出保守結構域及保守區域中不相同的氨基酸。通常，至少有1個非-極性氨基酸變化為不帶電荷的極性氨基酸或脯氨酸、丙氨酸或絲氨酸。
除另有說明，本發明使用的所有科技術語都與本發明所屬領域普通技術人員通常理解的含義相同。盡管與本發明所述方法及材料類似或等同的方法和材料都可以用于實施或測試本發明，但是下文描述了適合的方法和材料。本發明提到的所有出版物、專利申請、專利以及本文所涉及的其他文獻在此完整引入作為參考。當出現沖突時，以本說明書為準，包括定義。此外，所述材料、方法及實施例都只是旨在說明而并非用來限制本發明。
本發明其他特征及優點顯而易見于下列發明詳述及權利要求書。


圖1A給出克隆于pJST576的BJAB cDNA的DNA序列(SEQ ID NO1)。
圖1B顯示IMAGE克隆2000271(EST AI250289)的cDNA的完整DNA序列(SEQ ID NO2)。
圖2A給出除去用GENESCAN程序推測的內含子后的JST576核苷酸序列(SEQ ID NO3)。
圖2B給出PCR產物的1％瓊脂糖凝膠電泳結果，該PCR產物是用從BJAB或IM-9 RNA制備到的第一鏈cDNA或者用JST576 cDNA擴增BAFF-R得到的PCR產物。泳道1.λDNA HindIII消化產物。泳道2.BJAB寡聚dT BAF-225/BAF-191引物。泳道3.BJAB寡聚dT BAF-226/BAF-191引物。泳道4.BJAB隨機BAF-225/BAF-191引物。泳道5.BJAB隨機BAF-226/BAF-191引物。泳道6.IM-9寡聚dT BAF225/BAF-191引物。泳道7.IM-9寡聚dT BAF-226/BAF-191引物。泳道8.IM-9隨機BAF-225/BAF-191引物。泳道9.IM-9隨機BAF-226/BAF-191引物。泳道10.JST576cDNA BAF-225/BAF-191。泳道11.JST576cDNABAF-226/BAF-191。泳道12.無模板BAF-225/BAF-191。泳道13.無模板BAF-226/BAF-191。
圖2C給出通過對擴增自BJAB第一鏈cDNA中推測內含子側翼的主要(bulk)PCR產物進行測序得到的成熟的JST576(BAFF-R)序列(SEQ ID NO4)(GenBank登記號AF373846)。
圖2D給出BAFF-R(JST576)的氨基酸序列(SEQ ID NO5)。粗體字表示的A(Ala)殘基表示使用替代剪接受體位點得到的序列。方框框起來的部分為推定的跨膜結構域，下劃線的部分為推定的終止轉移信號。
圖3給出JST576的剪接型(SEQ ID NO6)，其中包含從人脾第一鏈cDNA通過RT-PCR擴增到的5′UTR序列，以及推導出的氨基酸序列(SEQ IDNO7)。該序列包含框內上游終止密碼子，所述閱讀框帶有ATG。
圖4A給出小鼠BAFF-R cDNA序列(SEQ ID NO8)(另外GenBank登記號為AF373847)。
圖4B給出小鼠BAFF-R的氨基酸序列(SEQ ID NO9)。Cys殘基用粗體表示并加有下劃線，方框框起來的部分為推定的跨膜區。
圖4C顯示了人(SEQ ID NO10)與小鼠(SEQ ID NO9)BAFF-R蛋白序列之間的同源性。
圖5給出人BAFF與JST576轉染細胞之間的結合情況。293EBNA細胞是用pJST576或CA336(huTACI)與GFP受體構建體一起共轉染的。用1μg/ml生物素標記的myc-huBAFF，之后用SAV-PE來分析細胞結合BAFF的情況。
圖6顯示了人和小鼠BAFF與JST576轉染細胞間的結合情況。293EBNA細胞是用pJST576與GFP受體構建體一起共轉染的。與BAFF結合后24小時，用5ug/ml標簽-huBAFF或標簽-muBAFF以及接著再用抗-標簽單克隆抗體M2和驢抗-小鼠IgG-PE來分析細胞結合BAFF的情況。
圖7顯示APRIL不結合經JST576轉染后的細胞。293EBNA細胞是用pJST576或CA336(huTACI)與GFP受體構建體一起共轉染的。用1μg/mlmyc-muAPRIL，之后用抗-muAPRIL大鼠IgG2b、生物素標記的抗-大鼠FcG2b，以及SAV-PE來分析細胞結合APRIL的情況。
圖8顯示BAFF可沉淀來自JST576轉染細胞的蛋白質。293EBNA細胞是用BAFF-R(pJST576)、空載體(CH269)或huTACI(CA336)共轉染的，之后用35S半胱氨酸和蛋氨酸脈沖標記。提取物用標簽-huBAFF免疫沉淀，然后在還原性SDS-PAGE凝膠上電泳。左側顯示分子量標準參照物。
圖9給出編碼人BAFF-R:Fc的基因的核酸序列(SEQ ID NO11)及從其推導出的氨基酸序列(SEQ ID NO12)其中核酸殘基1-63編碼小鼠IgG-κ信號序列；核酸殘基64-66用來導入限制酶位點；核酸殘基67-276編碼部分BAFF-R胞外結構域；核酸殘基277-279用于導入限制酶位點；以及核酸殘基280-960編碼人IgG1的Fc區。
圖10給出用JST576的EcoNI片段作探針進行Northern印跡分析的結果。所有曝光時間均為4天。10AClontech人免疫II印跡；10BClontech人12泳道多-組織印跡；10CClontech人多-組織II印跡。
圖11顯示對20μg分離自各種細胞系的總RNA進行Northern印跡分析的結果。用JST576的EcoNI限制性片段作探針檢測印跡，曝光4天。經FACS測定的細胞系與BAFF結合的能力標示于泳道下方。
圖12顯示使用BAFF-R:Fc免疫沉淀的結果。人BAFF被BAFF-R:Fc或BCMA:Fc免疫沉淀，但是未被Fnl4-Fc免疫沉淀。對照用BAFF蛋白顯示于泳道1。
圖13顯示了人BAFF-R:Fc能夠阻斷人BAFF與BJAB細胞間的結合。FACS分析結果見圖13A。曲線E代表在無BAFF-R:Fc存在時生物素標記的BAFF與BJAB細胞的結合情況。曲線B-D分別代表在有5μg/ml、1μg/ml或0.2μg/ml BAFF-R:Fc存在時，BAFF結合BJAB細胞的能力。曲線A是僅作第二步得到的曲線。圖13B顯示，與TACI:Fc(三角形)或非特異性融合蛋白LTR:Fc(圓形)相比，各種濃度的BAFF-R:Fc(方形)阻斷BAFF與表達受體的BJAB細胞的結合的能力。
圖14顯示BAFF-R:Fc阻斷BAFF-誘導的對脾B細胞的共刺激的能力。該圖顯示[3H]胸苷摻入量(cpm)隨hBAFF量(ng/ml)而變化的曲線圖。
圖15顯示BAFF-R:Fc1處理導致正常小鼠外周B細胞損失。
圖16顯示用人和小鼠BAFF-R:Fc處理導致脾B220+B細胞數目減少。
圖17顯示向小鼠給藥BAFF-R:Fc導致淋巴結中B220+B細胞的百分比下降。
圖18顯示向小鼠給藥BAFF-R:Fc導致外周血B220+B細胞減少。
圖19A顯示，從4個能產生可結合BAFF-R的抗體的克隆取上清液進行FACS分析的數據。另外還給出了不含可結合BAFF-R抗體的對照上清液的FACS分析數據。
圖19B給出的柱形圖表明2個克隆能阻斷BAFF與BAFF-R間的結合。(a)顯示無BAFF的對照；(b)顯示了來自克隆2的抗體的阻斷能力；(c)顯示了來自克隆9的抗體的阻斷能力；以及(d)為不能結合BAFF-R的對照抗體的曲線。
圖20給出了人BAFF-R:Fc(hBAFF-R)和小鼠BAFF-R:Fc(mBAFF-R)胞外結構域氨基酸序列的比對結果，以及表達含有指示序列的Fc融合蛋白時所觀察到的凝集百分比。編號的JST克隆代表的是在親本序列中出現突變(下劃線標出)的氨基酸序列，以及導致的表達蛋白的凝集。另外還給出了人(SEQ ID NO13)和(SEQ ID NO14)BAFF-R的部分序列；以及下列克隆相對應的部分JST659(SEQ ID NO15)，JST660(SEQ ID NO16)，JST661(SEQ IDNO17)，JST662(SEQ ID NO18)，JST663(SEQ ID NO19)，JST673(SEQ IDNO20)，JST674(SEQ ID NO21)，JST675(SEQ ID NO22)，JST672(SEQ IDNO23)，JST676(SEQ ID NO24)，JST671(SEQ ID NO25)，JST677(SEQ IDNO26)，JST678(SEQ ID NO27)，JST664(SEQ ID NO28)，JST668(SEQ IDNO29)，JST665(SEQ ID NO30)，JST666(SEQ ID NO31)，和JST667(SEQID NO32)。
圖21顯示用制備自BAFF-R-i.c.d.(BAFF-R胞內結構域)(泳道1)或對照載體(泳道2)轉染的細胞的裂解物免疫沉淀的蛋白質的放射自顯影圖。用編碼BAFFR-i.c.d的構建體或模擬質粒轉染約6×106個293E細胞。48小時后，用35S代謝法標記細胞24小時，用裂解緩沖液裂解細胞，預先澄清裂解物，然后用抗myc的mAb，9E10免疫沉淀。在還原條件下通過10-20％SDSPAGE電泳分離免疫沉淀物。
發明詳述本發明中提到的參考著作、專利、專利申請及科學文獻，包括GenBank數據庫序列的登記號，構成本領域技術人員已有知識，作為整體在此引入作為參考，與這些文獻專門單個引入作為參考時的范圍相同。本申請所引文獻與本說明書特定含義之間如有任何抵觸都應該以后者為準。另外，本領域對詞匯和短語定義的已有理解與本說明書中對該詞匯或短語專門解釋而下的定義之間如有任何抵觸都以后者為準。
本領域技術人員已知的有關重組DNA技術普通原理的標準參考著作包括Ausubel et al.CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley & Sons，New York(1998)；Sambrook et al.MOLECULARCLONINGA LABORATORY MANUAL，2D ED.，Cold Spring HarborLaboratory Press，Plainview，New York(1989)；Kaufman et al.，Eds.，HANDBOOK OF MOLECULAR AND CELLULAR METHODS IN BIOLOGYAND MEDICINE，CRC Press，Boca Raton(1995)；McPherson，Ed.，DIRECTEDMUTAGENESISA PRACTICAL APPROACH，IRL Press，Oxford(1991)。
本發明公開了BAFF-R核酸、編碼BAFF-R多肽的分離的核酸或其部分、BAFF-R多肽、含所述核酸的載體、BAFF-R核酸轉化的宿主細胞、抗-BAFF-R抗體、以及藥用組合物。另外本發明還公開了制備BAFF-R多肽的方法，以及用上述化合物篩查、診斷、治療疾病的方法，以及篩選能調節BAFF-R多肽活性的化合物的方法。
本發明所述的BAFF-R核酸和多肽、BAFF-R抗體以及藥用組合物尤其可用于治療癌癥和/或免疫調節疾病。這些疾病包括，例如，本質上是自身免疫的B細胞-介導疾病，如系統性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎、重癥肌無力，自身免疫溶血性貧血、自發性血小板減少性紫癜、抗-磷脂綜合征、恰加斯氏病、格雷夫斯氏病、韋格內氏肉芽腫病、結節性多動脈炎以及急進性腎小球腎炎。所述治療劑還可用于漿細胞疾病，例如多發性骨髓瘤、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血癥、重鏈疾病、原發性或免疫細胞相關性淀粉樣變以及不明意義的單克隆球蛋白病。腫瘤學治療目標包括B細胞癌、白血病及淋巴瘤。
BAFF-R核酸本發明一方面提供的是編碼BAFF-R蛋白或其生物活性部分的分離的核酸分子。另外還包括那些足可用作探針鑒定BAFF-R編碼核酸(例如，BAFF-R mRNA)的核酸片段，以及可用作聚合酶鏈反應(PCR)的引物的片段以擴增或突變BAFF-R核酸分子。本發明使用的術語″核酸分子″包括DNA分子(例如，cDNA或基因組DNA)，RNA分子(例如，mRNA)，用核苷酸類似物制備而成的DNA或RNA的類似物，及其衍生物、片段和同系物。所述核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，但優選是雙鏈DNA。
“探針”是指用于不同用途的不同長度的核酸序列，優選，其長度至少約10個核苷酸(nt)，或者多至約，例如6,000nt。探針可用于檢測相同的、類似的或互補的核酸序列。較長的探針通常從天然或重組來源獲得，與寡聚物相比具有高特異性和雜交較慢的特點。探針可以是單鏈或雙鏈的，被設計為在PCR、膜基礎上的雜交技術或ELISA類技術中呈現特異性。
“分離的”核酸分子是指該分子從在天然狀態下與其共存的其他核酸分子中分離了出來。分離的核酸分子的實例包括，但不限于，包含在載體中的重組DNA分子、存留于異源宿主細胞中的重組DNA分子、部分或基本上純化的核酸分子以及合成的DNA或RNA分子。優選地，“分離的”核酸是指它從其所來源生物體基因組中天然狀態下位于該核酸側翼的序列(即位于該核酸5’和3’末端的序列)中脫離了出來。例如，在不同的實施方案中，所述的分離的BAFF-R核酸分子可包含小于約50kb、25kb、5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列，天然狀態下這一核苷酸序列在所述核酸來源細胞的基因組DNA中位于所述核酸的側翼。而且，“分離的”核酸分子，例如cDNA分子，在用重組技術制備時能夠基本上與其他細胞物質或培養基分離開來，或者當化學合成時能夠與化學前體或其他化合物分離開來。
本發明的核酸分子，例如具有圖1A(SEQ ID NO1)、圖1B(SEQ ID NO2)、圖2A(SEQ ID NO3)、圖2C(SEQ ID NO4)和圖3(SEQ ID NO6)所示核苷酸序列或這些核苷酸序列任一互補序列的核酸分子，能夠通過常規分子生物學技術和本發明提供的序列信息分離出來。使用圖1A、B、2A、C和3所示核酸序列的全長或部分作為雜交探針，用常規的雜交和克隆技術(例如，描述見Sambrook et al.，Eds.，MOLECULAR CLONINGALABORATORY MANUAL 2ND ED.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989；和Ausubel，et al.，Eds.，CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley & Sons，New York，NY，1993)能夠分離出BAFF-R核酸序列。
使用cDNA，mRNA或替代地使用基因組DNA作為模板以及合適的寡核苷酸引物，按照常規PCR擴增技術就能擴增出本發明的核酸。可以將這樣擴增到的核酸克隆入合適的載體并通過DNA序列分析來鑒定。另外，對應于BAFF-R核苷酸序列的寡核苷酸可以用常規的合成技術來制備，例如使用自動DNA合成儀。
本發明中使用的“寡核苷酸”一詞是指一連串連接在一起的核苷酸殘基，該寡核苷酸應具有足夠數目的核苷酸堿基以用于PCR反應。一短的寡核苷酸序列可以以基因組或cDNA序列為基礎或者從中設計出來，用于擴增、確定特定細胞或組織中相同的、類似的或互補DNA或RNA或檢測它們是否存在。
寡核苷酸包含核酸序列的一部分，具有至少約10nt，多至50nt，優選約15nt-30nt。他們可以化學合成并且可以用作探針。
另一個實施方案中，本發明所述的分離的核酸分子包含一互補于圖1A(SEQ ID NO1)、圖1B(SEQ ID NO2)、圖2A(SEQ ID NO3)，圖2C(SEQ ID NO4)和圖3(SEQ ID NO6)所示核苷酸序列的核酸分子。互補于圖1A(SEQ ID NO1)、圖1B(SEQ ID NO2)、圖2A(SEQ ID NO3)、圖2C(SEQ ID NO4)和圖3(SEQ ID NO6)所示核苷酸序列的核酸分子是指該分子與圖1A(SEQ ID NO1)、圖1B(SEQ ID NO2)、圖2A(SEQ ID NO3)、圖2C(SEQ ID NO4)和圖3(SEQ ID NO6)所示核苷酸序列之間是充分互補的，以至其與圖1A(SEQ ID NO1)、圖1B(SEQ ID NO2)、圖2A(SEQ ID NO3)、圖2C(SEQ ID NO4)和圖3(SEQ ID NO6)所示核苷酸序列之間極少或沒有錯配的氫鍵生成從而生成一穩定的二聚體。
本發明中“互補”一詞是指在核酸分子的核苷酸單位之間形成Watson-Crick或Hoogsteen堿基配對，“結合”一詞是指兩個多肽或化合物或者相關多肽或化合物或其結合之間的物理或化學作用。結合包括離子、非離子、范德華力和疏水相互作用等。物理相互作用可以是直接的或間接的。間接相互作用可以是通過或借助于另外一多肽或化合物來實現。直接結合是指那種不需通過或借助另外一種多肽或化合物的作用就可發生的相互作用，或者沒有其他實質性的化學中間物。
另外，本發明所述核酸分子可以僅包括圖1A(SEQ ID NO1)、圖1B(SEQ ID NO2)、圖2A(SEQ ID NO3)、圖2C(SEQ ID NO4)和圖3(SEQID NO6)所示核酸序列的一部分，例如，可用作探針或引物的片段或編碼BAFF-R生物活性部分的片段。
本發明提供的片段是指至少6個(連續的)核苷酸或至少4個(連續的)氨基酸的序列，對于核酸來說這個長度足以允許特異性雜交的發生或對氨基酸來說這個長度足以完成表位的特異性識別，而所述的片段至多是一小于全長序列的部分。這些片段可以來自所選核酸或氨基酸序列的任一連續部分。
衍生物是指從原初的化合物直接或通過修飾或部分取代而形成的核酸序列或氨基酸序列。類似物是指除在某些組分或側鏈上不同于原初的化合物外，與原初化合物結構類似但不相同的核酸序列或氨基酸序列。類似物可以是合成的或者出自不同的進化來源，并且與野生型相比具有類似或相反的代謝活性。
如果衍生物或類似物含有修飾的核酸或氨基酸，如下所述，那么該衍生物和類似物可以是全長的，也可以是非全長的。本發明所述核酸或蛋白的衍生物或類似物可包括，但不限于，含有與本發明所述核酸或蛋白質基本同源的區域的分子，在不同實施方案中，所述基本同源是指該區域與同樣大小的核酸或氨基酸序列相比或者與經過本領域已知的電腦同源性程序比對后的所比對序列相比同一性至少約45％、50％、70％、80％、95％、98％或甚至99％(優選同一性為80-99％)，或者其編碼核酸能夠與編碼上述蛋白質的序列的互補序列在嚴謹、中等嚴謹或者低嚴謹條件下雜交。參見例如，Ausubel，et al.，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，JohnWiley & Sons，New York，NY，1993，以及下列文獻。一代表性的程序是使用設定缺省值的Gap程序(Wisconsin Sequence Analysis Package，Version 8用于UNIX，Genetics Computer Group，University Research Park，Madison，WI)，其中使用Smith和Waterman算法(1981)Adv.Appl.Math.2482-489，在此引入作為參考)。
“同源核酸序列”或“同源氨基酸序列”，或者其變體，是指在核苷酸水平或氨基酸水平上達到上述同源性程度的序列。同源核苷酸序列是編碼BAFF-R多肽同種型的序列。由于例如RNA的不同剪接，同種型可以表達在同一生物體的不同組織中。替代地，同種型可以由不同的基因編碼。在本發明中，同源核苷酸序列包括編碼除人之外物種BAFF-R多肽的核苷酸序列，所述物種包括，但不限于，哺乳動物，因而可以包括，例如小鼠、大鼠、兔、狗、貓、牛、馬及其他生物體。同源核苷酸序列可以包括，但不限于，天然生成的等位變體以及本發明列出的核苷酸序列變體。但是，同源核苷酸序列不包括編碼人BAFF-R蛋白的核苷酸序列。同源核酸序列包括那些編碼圖2D(SEQ ID NO5)中的保守性氨基酸取代(參見下文)的核酸序列，以及編碼具有BAFF-R活性的多肽的核酸序列。同源氨基酸序列不是指人BAFF-R多肽的氨基酸序列。
從人BAFF-R基因克隆中測定的核苷酸序列可以用來制備探針和引物，設計這些探針和引物用于鑒定和/或克隆例如來自其他組織的其他細胞類型中的BAFF-R同系物，以及來自其他哺乳動物的BAFF-R同系物。通常，所述探針/引物包括一基本上純化的寡核苷酸。所述寡核苷酸一般包括這樣的一段核苷酸序列，該核苷酸序列能夠在嚴謹條件下與下述序列雜交圖1A(SEQ ID NO1)、圖1B(SEQ ID NO2)、圖2A(SEQ ID NO3)、圖2C(SEQID NO4)以及圖3(SEQ ID NO6)任一所示序列中至少約12，25，50，100，150，200，250，300，350或400個連續正義鏈核苷酸的序列，或者圖1A(SEQ ID NO1)、圖1B(SEQ ID NO2)、圖2A(SEQ ID NO3)、圖2C(SEQ ID NO4)以及圖3(SEQ ID NO6)任一所示序列的反義鏈核苷酸序列，或者圖1A(SEQ ID NO1)、圖1B(SEQ ID NO2)、圖2A(SEQ ID NO3)、圖2C(SEQ ID NO4)以及圖3(SEQ ID NO6)任一所示序列的天然突變體。
基于人BAFF-R核苷酸序列的探針可以用于檢測編碼相同或者同源蛋白的轉錄本或基因組序列。在不同的實施方案中，所述探針還包括一連接于其上的標記基團，例如所述標記基團可以是同位素、熒光化合物、酶或酶的輔因子。這類探針可以作為診斷試劑盒的一部分用于檢測錯誤表達了BAFF-R蛋白的細胞或組織，這可以通過例如如下方法來實現檢測取自受試者的樣本細胞中編碼BAFF-R的核酸的水平，例如檢測BAFF-R mRNA水平或者測定基因組BAFF-R基因是否已發生突變或缺失。
“具有BAFF-R生物活性部分的多肽”是指表現出與本發明所述多肽類似但不必相同活性的多肽，包括成熟形式，所述活性是在一具體的生物學試驗中檢測到的，具有或不具有劑量依賴性。編碼“BAFF-R生物活性部分”的核酸片段可以用下述方法來制備從圖1A(SEQ ID NO1)、圖1B(SEQID NO2)、圖2A(SEQ ID NO3)、圖2C(SEQ ID NO4)和圖3(SEQ ID NO6)所示的任一序列中分離出編碼具有BAFF-R生物活性(BAFF-R蛋白的生物活性見下文描述)的多肽的序列部分，然后表達BAFF-R蛋白的編碼部分(例如，通過體外重組表達)，之后再評定BAFF-R的編碼部分的活性。例如，編碼BAFF-R生物活性部分的核酸片段可以任選包括BAFF結合結構域。在另一實施方案中，編碼BAFF-R生物活性部分的核酸片段包括1個或多個區域。
BAFF-R變體本發明進一步還包括因遺傳密碼的簡并性而不同于圖1A(SEQ ID NO1)、圖1B(SEQ ID NO2)、圖2A(SEQ ID NO3)、圖2C(SEQ ID NO4)、和3(SEQ ID NO6)所示的核苷酸序列的核酸分子。這些核酸與1A(SEQ ID NO1)、圖1B(SEQ ID NO2)、圖2A(SEQ ID NO3)、圖2C(SEQ ID NO4)、和3(SEQ ID NO6)所示的核苷酸序列編碼同樣的BAFF-R蛋白。另一實施方案中，本發明的分離的核酸分子具有這樣的核苷酸序列，該核苷酸序列編碼的蛋白具有圖2D(SEQ ID NO5)所示的氨基酸序列。
除圖1A(SEQ ID NO1)，圖1B(SEQ ID NO2)，圖2A(SEQ ID NO3)，圖2C(SEQ ID NO4)和圖3(SEQ ID NO6)中任一所示的BAFF-R核苷酸序列外，本領域技術人員能夠理解DNA序列多態性可存在于群體(例如，人群)中，這種多態性可導致BAFF-R氨基酸序列的變化。所述的BAFF-R基因的基因多態性由于天然的等位基因變化存在于群體內個體之間。本發明中使用的“基因”和“重組基因”是指包含編碼BAFF-R蛋白的開放閱讀框架的核酸分子，所述BAFF-R蛋白優選哺乳動物BAFF-R蛋白。這類天然等位基因變異一般導致BAFF-R基因的核苷酸序列1-5％的變化。任一及所有這類核苷酸變化和由此產生的BAFF-R的氨基酸多態性都是天然等位基因變異的結果，因而不改變BAFF-R的功能活性，所有這些都屬于本發明的范圍。
此外，編碼來自其他物種的BAFF-R蛋白的核酸分子，其核苷酸序列也會因此不同于圖1A(SEQ ID NO1)，圖1B(SEQ ID NO2)，圖2A(SEQ IDNO3)，圖2C(SEQ ID NO4)和圖3(SEQ ID NO6)所示的人源序列，這也在本發明的范圍之內。對應于天然等位基因變體的核酸分子以及本發明所述BAFF-R cDNA的同系物，根據它們與本發明公開的人BAFF-R核酸之間的同源性，用人cDNA或其部分作為雜交探針按照常規雜交技術在嚴謹條件下能夠得到分離。例如，可溶性人BAFF-R cDNA可以根據其與人源膜-結合型BAFF-R之間的同源性得以分離。類似地，也可以根據其與可溶性人源BAFF-R之間的同源性，分離獲得膜結合型人源BAFF-R cDNA。
因此，在另一實施方案中，本發明所述的分離的核酸分子為至少6個核苷酸的長度，并且能夠在嚴謹的條件下與下述的核酸分子雜交即包含圖1A(SEQ ID NO1)、圖1B(SEQ ID NO2)、圖2A(SEQ ID NO3)、圖2C(SEQ ID NO4)和圖3(SEQ ID NO6)任一所示核苷酸序列的核酸分子。另一實施方案中，所述核酸的長度為至少10，25，50，100，250或500個核苷酸。另一實施方案中，本發明所述的分離的核酸分子與編碼區域雜交。本發明中使用的″在嚴謹條件下雜交″是用來描述符合這樣標準的雜交和洗滌條件，在此條件下彼此之間至少60％同源的核苷酸序列通常才能相互間保持雜交。
同系物(即，編碼來自除人之外物種的BAFF-R蛋白的核酸)或其它相關序列(例如，平行進化同源物(paralogs))可以通過低度、中度、高度嚴謹條件下與作為探針的全長或部分特定人源序列雜交來獲得，所用方法是本領域所熟知的核酸雜交及克隆方法。
本發明使用的“嚴謹雜交條件”是指這樣的條件，在該條件下探針、引物或寡核苷酸與其目標序列雜交而不與其他序列雜交。嚴謹條件是序列依賴性的并且隨環境不同而不同。較長序列的特異性雜交溫度高于較短的序列。通常，嚴謹條件選擇比特異性序列在特定離子強度及pH下的解鏈溫度(Tm)低約5℃。Tm是(特定離子強度、pH及核酸濃度下)互補于目標序列的探針約50％與該目標序列雜交達到平衡時的溫度。通常由于所述目標序列過量存在，在Tm時，50％的探針被占據達到平衡。通常，嚴謹條件是指鹽濃度低于約1.0M鈉離子，通常為pH7.0～8.3時約0.01～1.0M鈉離子(或其他鹽類)，對于短的探針、引物或寡核苷酸(例如，10nt～50nt)溫度為至少約30℃，而對于較長的探針、引物及寡核苷酸溫度為至少約60℃。嚴謹條件還可以通過添加去穩定劑來實現，例如甲酰胺。
嚴謹條件為本領域技術人員已知并可以參見于CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6。
優選地，所述嚴謹條件是指在這樣的條件下，彼此間的同源性至少約65％，70％，75％，85％，90％，95％，98％，或99％的序列通常才能相互雜交。
嚴謹雜交條件的一個非限制性實例是65℃時在含有下列成分的高鹽緩沖液中進行雜交6X SSC、50mM Tris-HCl(pH7.5)、1mM EDTA、0.02％PVP、0.02％Ficoll、0.02％BSA和500mg/ml的變性的鮭精DNA。雜交后用0.2X SSC，0.01％BSA在50℃洗滌1次或多次。本發明所述的可在嚴謹條件下與SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQID NO6雜交的分離的核酸分子對應于天然生成的核酸分子。本發明中的“天然生成的”核酸分子是指核苷酸序列天然生成的RNA或DNA分子(例如，編碼天然蛋白質)。
第二個實施方案中，提供了可與含有圖1A(SEQ ID NO1)，圖1B(SEQID NO2)，圖2A(SEQ ID NO3)，圖2C(SEQ ID NO4)和圖3(SEQ ID NO6)中任一所示核苷酸序列的核酸分子或其片段、類似物或衍生物在中度嚴謹條件下雜交的核酸序列。中度嚴謹雜交條件的一個非限制性實例是在6XSSC，5X Denhardt′s溶液，0.5％SDS和100mg/ml變性的鮭精DNA，在55℃雜交，然后用1X SSC，0.1％SDS，在37℃洗滌1次或多次。其他可以使用的中度嚴謹條件也已為本領域技術人員所熟知。參見，例如Ausubel et al.，Eds.，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley &Sons，NY，1993；和Kriegler，GENE TRANSFER AND EXPRESSION，ALABORATORY MANUAL，Stockton Press，NY，1990。
第三個實施方案中，提供了可與含有圖1A(SEQ ID NO1)，圖1B(SEQID NO2)，圖2A(SEQ ID NO3)，圖2C(SEQ ID NO4)和圖3(SEQ ID NO6)中任一所示核苷酸序列的核酸分子或其片段、類似物或衍生物在低度嚴謹條件下雜交的核酸序列。低度嚴謹雜交條件的一個非限制性實例是在35％甲酰胺，5X SSC，50mM Tris-HCl(pH7.5)，5mM EDTA，0.02％PVP，0.02％Ficoll，0.2％BSA，100mg/ml變性的鮭精DNA，10％(wt/vol)硫酸葡聚糖中，在40℃雜交，然后用2X SSC，25mM Tris-HCl(pH7.4)，5mM EDTA，和0.1％SDS，在50℃洗滌1次或多次。其他可以使用的低度嚴謹條件也已為本領域技術人員所熟知。參見，例如Ausubel et al.，Eds.，CURRENT PROTOCOLSIN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley & Sons，NY，1993；和Kriegler，GENE TRANSFER AND EXPRESSION，A LABORATORY MANUAL，Stockton Press，NY，1990；Shilo and Weinberg(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA786789-6792。
保守性突變除存在于群體中的天然生成的BAFF-R序列等位變體外，本領域技術人員還能理解的是可以通過突變將變化引入圖2A(SEQ ID NO3)、圖2C(SEQ ID NO4)，圖3(SEQ ID NO6)所示的核苷酸序列中，從而使得所編碼的BAFF-R蛋白的氨基酸序列發生變化，同時并不改變BAFF-R蛋白的功能。例如，可以在圖2A(SEQ ID NO3)、圖2C(SEQ ID NO4)和圖3(SEQID NO6)任一所示序列中引入能導致“非-必需”氨基酸殘基處出現氨基酸取代的核苷酸取代。“非-必需”氨基酸殘基是指這樣的殘基，即當野生型BAFF-R中這樣殘基發生變化時，其生物活性并不改變，而“必需”氨基酸殘基對于生物活性來說必需的。例如，本發明所述BAFF-R蛋白中的保守氨基酸殘基被認為是特別不能被改變的。
此外，在本發明所述BAFF-R蛋白家族成員中保守的氨基酸殘基也被認為是尤其不能改變的。例如，本發明所述的BAFF-R蛋白可以包括至少1個通常為TNF家族成員的保守區域的結構域。因此，這些保守結構域是不可能用來突變的。但是，其他氨基酸殘基(例如BAFF-R蛋白成員中的非保守或僅為半保守的殘基)對于活性而言并非必需，因而可以被改變。
本發明另一方面提供了編碼BAFF-R蛋白的核酸分子，該蛋白中的非活性必需氨基酸殘基發生了變化。這些蛋白雖然在氨基酸序列上不同于圖2D(SEQ ID NO5)，但是仍保留了生物活性。一個實施方案中，分離的核酸分子包含了編碼蛋白的核苷酸序列，其中所述的蛋白包括與圖2D(SEQ IDNO5)所示氨基酸序列至少約45％同源的氨基酸序列。優選地，所述核酸分子編碼的所述蛋白與圖2D(SEQ ID NO5)至少約60％同源，更優選至少約70％，80％，90％，95％，98％，最優選至少約99％同源。
編碼與圖2D所示蛋白同源的BAFF-R蛋白的分離的核酸分子可以通過下述方法來制備向圖2A(SEQ ID NO3)，圖2C(SEQ ID NO4)，和圖3(SEQ ID NO6)所示核苷酸序列中引入1處或多處核苷酸取代、添加或缺失，從而在所編碼的蛋白中導入1處或多處氨基酸取代、添加或缺失。
向圖2A(SEQ ID NO3)、圖2C(SEQ ID NO4)或圖3(SEQ ID NO6)中導入突變也可以通過，例如常規技術來實現，如定點誘變和PCR-介導的突變。優選地，在1個或多個被推測為非必需氨基酸殘基上進行保守氨基酸取代。“保守性氨基酸取代”是指用一具有類似側鏈的氨基酸殘基來代替原來的氨基酸殘基。具有類似側鏈的氨基酸殘基的家族已在本領域得到定義。這些家族包括帶有堿性側鏈的氨基酸(例如，賴氨酸，精氨酸，組氨酸)，帶有酸性側鏈的氨基酸(例如，天冬氨酸，谷氨酸)，不帶電的極性側鏈的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，非極性側鏈氨基酸(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)，β-分枝側鏈的氨基酸(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)以及帶有芳香側鏈的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。因此，用來自同一側鏈家族的另一種氨基酸殘基取代BAFF-R中被推測為非必需的氨基酸殘基。替代地，另一技術方案中，通過例如飽和誘變沿BAFF-R編碼序列的全長或一部分隨機引入突變，對所產生的突變體進行BAFF-R生物活性篩選以鑒定出保留活性的突變體。圖2A(SEQ IDNO3)、圖2C(SEQ ID NO4)和圖3(SEQ ID NO6)任一所示序列突變后，可用任一本領域已知的重組技術表達所編碼的蛋白，然后檢測該蛋白的活性。
一個實施方案中，對突變的BAFF-R蛋白進行了下列測試(1)與其他BAFF-R蛋白、其他細胞-表面蛋白或其生物活性部分形成蛋白:蛋白相互作用的能力；(2)突變的BAFF-R蛋白與BAFF-R配體復合物的形成；(3)突變的BAFF-R蛋白結合胞內目標蛋白或其生物活性部分的能力；(例如，抗生物素蛋白)；(4)結合BAFF的能力；或(5)特異性結合BAFF-R蛋白抗體的能力。
本發明提供了編碼BAFF-R:Fc多肽的特異性突變體，設計該多肽以減弱表達的蛋白的凝聚而同時又保持BAFF的結合活性。這類突變體，包括，例如，編碼JST661(SEQ ID NO17)，JST662(SEQ ID NO18)，JST663(SEQ ID NO19)，JST673(SEQ ID NO20)，JST674(SEQ ID NO21)，JST675(SEQ ID NO22)，JST672(SEQ ID NO23)，JST676(SEQ ID NO24)，JST671(SEQ ID NO25)，JST677(SEQ ID NO26)，和JST678(SEQ ID NO27)的氨基酸序列的克隆。其他實施方案包括編碼BAFF-R或BAFF-R:Fc多肽的突變體，該BAFF-R或BAFF-R:Fc多肽具有與天然人源BAFF-R或BAFF-R:Fc多肽類似的凝聚特性，但仍可結合BAFF，包括，例如，包含JST659(SEQ ID NO15)，JST660(SEQ ID NO16)，JST664(SEQ ID NO28)，JST668(SEQ ID NO29)，JST665(SEQ ID NO30)，JST666(SEQ ID NO31)，及JST667(SEQ ID NO32)的氨基酸序列的序列。其他實施方案包括編碼BAFF-R或BAFF-R:Fc多肽的突變體，其中人源和小鼠源BAFF-R間的保守氨基酸殘基變化為其他保守氨基酸，其中BAFF-R或BAFF-R:Fc多肽結合BAFF的活性仍被保留。其他實施方案中，突變體編碼BAFF-R或BAFF-R:Fc多肽，該BAFF-R或BAFF-R:Fc多肽具有在人源和小鼠源BAFF-R間非保守性的氨基酸，并且這些氨基酸已改變為其他氨基酸。優選地，至少1個非極性氨基酸變為脯氨酸殘基或不帶電的極性氨基酸。
反義本發明另一方面提供了一種分離的反義核酸分子，該反義核酸分子能雜交或互補于包含圖2A，C，3所示核苷酸序列或者其片段或類似物或衍生物的核酸分子。“反義”核酸包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與編碼蛋白的“正義”核酸互補，例如互補于雙鏈cDNA分子的編碼鏈，或互補于mRNA序列。在具體方面，提供的反義核酸分子包含的序列與BAFF-R編碼鏈中至少約10，25，50，100，250或500個核苷酸或其全長互補，或僅互補于其一部分。此外還提供了編碼圖2A(SEQ ID NO3)，圖2C(SEQ ID NO4)，圖3(SEQ ID NO6)任一所示的BAFF-R蛋白的片段、同系物、衍生物及類似物的核酸分子，或者與圖2A(SEQ ID NO3)，圖2C(SEQ ID NO4)，圖3(SEQ ID NO6)任一所示的BAFF-R核酸序列互補的反義核酸。
一個實施方案中，反義核酸分子與編碼BAFF-R的核苷酸序列的編碼鏈中的“編碼區”反義。“編碼區”一詞是指核苷酸序列中含有能被翻譯為氨基酸殘基的密碼子的區域(例如，人源BAFF-R的蛋白編碼區對應于圖2A(SEQ ID NO3)中的第13～568位核苷酸，或圖2C(SEQ ID NO4)中的第13～565位核苷酸，或圖3(SEQ ID NO6)中的第298～849位核苷酸)。另一實施方案中，所述的反義核酸分子與編碼BAFF-R的核苷酸序列的編碼鏈中的“非編碼區”反義。“非編碼區”一詞是指位于編碼區5′和3′兩側的序列，該序列不被翻譯為氨基酸(即，也稱為5′和3′非翻譯區)。
如果本發明公開了編碼BAFF-R的編碼鏈序列，那么就可以根據Watson和Crick或者Hoogsteen堿基配對規則設計出本發明所述的反義核酸分子。所述反義核酸分子可與BAFF-R mRNA的整個編碼區互補，但是更優選為僅與BAFF-R mRNA編碼區或非編碼區的一部分反義的寡核苷酸。例如，反義寡核苷酸可以是與BAFF-R mRNA翻譯起始位點周圍區域互補的。反義寡核苷酸的長度可為，例如約5，10，15，20，25，30，35，40，45或50個核苷酸。本發明中的反義核酸可用本領域已知方法通過化學合成或酶連接反應來構建。例如，反義核酸(例如，反義寡核苷酸)可用天然生成的核苷酸或設計用來增強分子的生物學穩定性的或者增加反義及正義核酸間形成的二聚體的物理穩定性的各種修飾核苷酸來化學合成，例如可以使用硫代磷酸衍生物及吖啶取代的核苷酸。
可用于制備反義核酸的修飾核苷酸的實例包括5-氟尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，5-碘尿嘧啶，次黃嘌呤，黃嘌呤，4-乙酰胞嘧啶(acetylcytosine)，5-(羧羥甲基)尿嘧啶，5-羧甲基氨甲基-2-硫尿嘧啶，5-羧甲基氨甲基尿嘧啶，二氫尿嘧啶，β-D-半乳糖基queosine，肌苷，N6-異戊烯腺嘌呤，1-甲基鳥嘌呤，1-甲基肌苷，2，2-二甲基鳥嘌呤，2-甲基腺嘌呤，2-甲基鳥嘌呤，3-甲基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，N6-腺嘌呤，7-甲基鳥嘌呤，5-甲基氨甲基尿嘧啶，5-甲氧氨甲基-2-硫尿嘧啶，β-D-甘露糖基queosine，5′-甲氧羧甲基尿嘧啶，5-甲氧尿嘧啶，2-甲硫-N6-異戊烯腺嘌呤，尿嘧啶-5-羥基乙酸(v)，wybutoxosine，假尿嘧啶，queosine，2-硫胞嘧啶，5-甲基-2-硫尿嘧啶，2-硫尿嘧啶，4-硫尿嘧啶，5-甲基尿嘧啶，尿嘧啶-5-羥基乙酸甲酯，尿嘧啶-5-羥基乙酸(v)，5-甲基-2-硫尿嘧啶，3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶，(acp3)w，和2，6-二氨基嘌呤。替代地，可通過將核酸按反義方向亞克隆入表達載體的生物學方法來制備反義核酸(即，從所插入核酸轉錄出的RNA相對于感興趣的目標核酸來說是反義方向的，下面部分做進一步的描述)。
通常將反義核酸給藥給受試者或在原位生成以便它們能與編碼BAFF-R蛋白的細胞mRNA和/或基因組DNA雜交或結合從而抑制該蛋白的表達，例如，通過抑制轉錄和/或翻譯來抑制該蛋白的表達。所述的雜交可以是常規的核苷酸互補形成穩定的雙螺旋，或者，例如反義核酸分子通過與雙螺旋大溝的特異性相互作用而結合DNA雙螺旋。本發明反義核酸分子給藥途徑的實例包括在組織位點處直接注射。替代地，可修飾反義核酸分子以使其靶向選擇的細胞，然后系統給藥。例如，就系統給藥而言，可對反義核酸分子修飾以便它們可與被選擇細胞表面上的受體或抗原特異性結合，例如將反義核酸分子連接到可與細胞表面受體或抗原結合的肽或抗體上。也可用本發明所述的載體將反義核酸分子遞送給細胞。為了使細胞內反義分子的濃度達到充足，優選這樣的載體構建體，其中反義核酸分子置于polII或polIII強啟動子的控制之下。
另一實施方案中，本發明的反義核酸分子是α-端基異構核酸分子。a-端基異構核酸分子與互補的RNA形成特異的雙鏈雜合體，與通常的b-單元不同，在這樣的雜合體中各鏈是相互之間是平行的(Gaultier et al.(1987)Nucl.Acids Res.156625-6641)。反義核酸分子還可以包含2′-O-甲基核糖核苷酸(Inoue et al.(1987)Nucl.Acids Res.156131-6148)或嵌合RNA-DNA類似物(Inoue et al.(1987)FEBS Lett.215327-330)。
核酶和PNA單元另一個實施方案中，本發明的反義核酸為核酶。核酶有催化活性的RNA分子，該分子具有核糖核酸酶活性，能切斷具有與該分子互補區域的單鏈核酸，如mRNA。因此，可用核酶(例如，錘頭狀核酶(描述見Haselhoff andGerlach(1988)Nature 334585-591))催化切割BAFF-R mRNA轉錄本從而抑制BAFF-R mRNA的翻譯。可以根據本發明公開的BAFF-RDNA的核苷酸序列(即，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO6)，設計出對BAFF-R-編碼核酸具有特異性的核酶。例如，可以構建出這樣的四膜蟲L-19 IVS RNA的衍生物，其中活性位點的核苷酸序列與BAFF-R編碼mRNA中的要切割的核苷酸序列互補。參見，例如，Cech et al.美國專利號4,987,071；和Cechet al.美國專利號5,116,742。替代地，可以用BAFF-R mRNA從RNA分子庫中篩選出具有特異性核糖核酸酶活性的催化性RNA。參見，例如，Bartel etal.，(1993)Science 2611411-1418。
替代地，可以通過將核苷酸序列靶向與其互補的BAFF-R的調控區(例如，BAFF-R啟動子和/或增強子)以形成三螺旋結構，阻止目標細胞中BAFF-R基因的轉錄，從而抑制BAFF-R基因的表達。參見，Helene(1991)Anticancer Drug Des.6569-84；Helene et al.(1992)Ann.N.Y.Acad.Sci.66027-36；和Maher(1992)Bioassays 14807-15。
不同的實施方案中，可以在堿基、糖基、或磷酸骨架上修飾BAFF-R的核酸，以提高，例如，該分子的穩定、雜交或溶解性。例如，可修飾核酸的脫氧核糖磷酸骨架制備出肽核酸(參見Hyrup et al.(1996)Bioorg.Med.Chem.45-23)。本發明中的“肽核酸”或“PNA”是指核酸模擬物，例如DNA模擬物，其中的脫氧核糖磷酸骨架被假肽骨架取代，僅保留了四種天然的核堿基。現已證明PNA的中性骨架可以實現與DNA和RNA在低離子強度的條件下特異性雜交。PNA寡聚體的合成可以采用標準的固相肽合成方法，參見Hyrup et al.(1996)Bioorg.Med.Chem.45-23；Perry-O′Keefe et al.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9314670-675。
BAFF-R的PNA可用于治療和診斷的用途。例如，PNA可作為反義或反基因(antigene)劑，通過例如誘導轉錄或翻譯停滯或者抑制復制來對基因表達進行序列特異性的調控。BAFF-R的PNA還可用于，例如，通過例如PNA指導的PCR夾(clamping)，分析基因中的單堿基對突變；與其他酶，如S1核酸酶聯用時，作為人工限制性酶(Hyrup B.(1996)Bioorg.Med.Chem.45-23)；或者作為探針或引物用于DNA測序及雜交(Hyrup et al.(1996)，Bioorg Med.Chem.45-23；Perry-O′Keefe(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9314670-675)。
另一實施方案中，可以通過將親脂性或其他輔助基團結合到PNA上，通過生成PNA-DNA嵌合體，或者通過使用本領域已知的脂質體或其他藥物遞送技術，對BAFF-R的PNA進行修飾，增強其穩定性或細胞攝入量。例如，可以制備BAFF-R的PNA-DNA嵌合體，該嵌合體結合了PNA和DNA的有益特性。所述嵌合體使得DNA識別酶，如RNase H和DNA聚合酶能與其中的DNA部分相互作用，而PNA部分則提供了高度的結合親合力和特異性。可周長度合適的連接物來連接PNA-DNA嵌合體，長度的選擇要依據堿基堆積、核堿基間形成鍵的數目以及方向而定(Hyrup(1996)Bioorg.Med.Chem.45-23)。PNA-DNA嵌合體合成方法的描述見Hyrup(1996)Bioorg.Med.Chem.45-23；和Finn et al.(1996)Nucl.Acids Res.243357-63。例如，用標準的亞磷酰胺(phosphoramidite)偶聯化學在固相支持物上合成DNA鏈，在PNA和DNA的5′末端間可以使用例如5′-(4-甲氧三苯甲基)氨基-5′-脫氧-胸苷亞磷酰胺(Mag et al.(1989)Nucl.Acids Res.17.5973-88)等修飾的核苷酸類似物。然后逐步連接PNA單體生成帶有5′PNA段和3′DNA段的嵌合分子(Finn et al.(1996)同上)。替代地，可以用5′DNA段和3′PNA段合成嵌合分子。參見，Petersen et al.(1975)Bioorg.Med.Chem.Lett.51119-11124。
其他實施方案中，所述的寡核苷酸可包括其他附加基團如肽(例如，用于體內靶向宿主細胞受體)，或跨越細胞膜轉運的促進劑(參見，例如，Letsinger et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 866553-6556；Lemaitre etal.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84648-652；PCT公開號WO 88/09810)或跨越血腦屏障轉運的促進劑(參見，例如，PCT公開號WO 89/10134)。此外，寡核苷酸的修飾還可使用雜交激發的切割劑(hybridization triggered cleavageagents)(參見，例如，Krol et al.，(1988)BioTechniques 6958-976)或嵌入劑(參見，例如，Zon，(1988)pharm.Res.5539-549)。最后，可將寡核苷酸偶聯于另一分子，例如，肽、雜交激發的交聯劑、轉運劑、雜交激發的切割劑等。
BAFF-R多肽本發明的一個方面涉及分離的BAFF-R蛋白及其生物活性部分或者其衍生物、片段、類似物或同系物。另外還提供了用作免疫原制備抗-BAFF-R抗體的多肽片段。一個實施方案中，可用標準的蛋白純化技術通過合適的純化方法，從細胞或組織來源分離出天然BAFF-R蛋白。另一方案中，用DNA重組技術制備BAFF-R蛋白。替代重組表達，可用標準的肽合成技術來化學合成BAFF-R蛋白或多肽。
“分離的”或“純化的”蛋白或其生物活性片段是指，當BAFF-R蛋白是源自細胞或組織時，其中基本上不含有來自該細胞或組織的細胞物質或其他污染蛋白，或者當化學合成時，其中基本上不含化學前體或其他化學制品。“基本上不含細胞物質”這句話包括，在BAFF-R蛋白制品中，BAFF-R蛋白與分離或重組制備該蛋白時所使用細胞的細胞成分已經被分離開來。一個技術方案中，“基本上不含細胞物質”這句話包括，BAFF-R蛋白制品中非-BAFF-R蛋白(本文中又稱污染蛋白)的含量低于約30％(干重)，優選低于約20％非-BAFF-R蛋白，還優選低于約10％非-BAFF-R蛋白，以及最優選低于約5％非-BAFF-R蛋白。當BAFF-R蛋白或其生物活性部分是重組制備時，還優選基本上不含細胞培養基，即細胞培養基在蛋白制品中所占的體積小于約20％，更優選小于約10％，以及最優選小于約5％。
“基本不含化學前體或其它化學制品”這句話包括，在BAFF-R蛋白制品中，BAFF-R蛋白與蛋白合成過程使用的化學前體或其他化學制品已經被分離開來。一個技術方案中，“基本不含化學前體或其它化學制品”這句話包括，BAFF-R蛋白制品中，化學前體或非-BAFF-R化學制品的含量低于約30％(干重)，優選低于約20％的化學前體或非-BAFF-R化學制品，還優選低于約10％的化學前體或非-BAFF-R化學制品，以及最優選低于約5％的化學前體或非-BAFF-R化學制品。
BAFF-R蛋白的生物活性部分包括含有與BAFF-R蛋白氨基酸序列足夠同源的氨基酸序列的肽，或者其氨基酸序列來源于BAFF-R蛋白氨基酸序列的肽，例如SEQ ID NO5所示的氨基酸序列，該序列比全長BAFF-R蛋白少數個氨基酸，并且表現出至少一種BAFF-R蛋白的活性。通常，生物活性部分包含具有至少1種BAFF-R蛋白活性的結構域或基序。BAFF-R蛋白的生物活性部分可以是一種長度為例如10、25、50、100或更多個氨基酸的多肽。
本發明所述的BAFF-R蛋白的生物活性部分可包含至少1個上述鑒定出的BAFF-R蛋白間保守的結構域。另外，BAFF-R蛋白的生物活性部分也可以包含至少2個上述鑒定出的結構域。另外，BAFF-R蛋白的生物活性部分也可以包含至少3個上述鑒定出的結構域。再者，BAFF-R的生物活性部分也可以含有至少4個上述鑒定出的結構域。
更進一步地，可以用重組技術制備出所述蛋白的其他區域被從中缺失的其他生物活性部分，然后評估天然BAFF-R蛋白的一種或多種功能活性。
一個實施方案中，所述BAFF-R蛋白具有圖2D所示的氨基酸序列(SEQID NO5)。其他實施方案中，所述的BAFF-R蛋白基本同源于圖2D(SEQ IDNO5)，并且保留了圖2D(SEQ ID NO5)所示蛋白的功能活性，然而，由于天然的等位變異或突變而導致氨基酸序列有所不同，具體描述見下文。因此，在另一實施方案中，BAFF-R蛋白是一種包含與圖2D所示氨基酸序列(SEQ ID NO5)至少約45％同源的氨基酸序列的蛋白質，并且保留了圖2D所示(SEQ ID NO5)BAFF-R蛋白的功能活性。
一些實施方案中，本發明包括BAFF-R:Fc多肽的特異突變體，對其進行設計是為了減弱所表達蛋白的凝聚但同時保留結合BAFF的活性。所述突變體，包括，例如編碼JST661(SEQ ID NO17)，JST662(SEQ ID NO18)，JST663(SEQ ID NO19)，JST673(SEQ ID NO20)，JST674(SEQ ID NO21)，JST675(SEQ ID NO22)，JST672(SEQ ID NO23)，JST676(SEQ ID NO24)，JST671(SEQ ID NO25)，JST677(SEQ ID NO26)，及JST678(SEQ ID NO27)所示氨基酸序列的克隆。其他實施方案包括編碼BAFF-R或BAFF-R:Fc多肽的突變體，其中所述的BAFF-R或BAFF-R:Fc多肽具有與天然的人源BAFF-R或BAFF-R:Fc多肽類似的凝聚特性，但是仍可結合BAFF，包括，例如，包含JST659(SEQ ID NO15)，JST660(SEQ ID NO16)，JST664(SEQ IDNO28)，JST668(SEQ ID NO29)，JST665(SEQ ID NO30)，JST666(SEQ IDNO31)和JST667(SEQ ID NO32)所示氨基酸序列的序列。其他實施方案包括編碼BAFF-R或BAFF-R:Fc多肽的突變體，其中那些在人源BAFF-R和小鼠源BAFF-R間保守的氨基酸已改變為其他保守的氨基酸，其中所述的BAFF-R或BAFF-R:Fc多肽保留了結合BAFF的活性。其他實施方案中，所述突變體編碼的BAFF-R或BAFF-R:Fc多肽具有在人源和小鼠BAFF-R間是非保守的氨基酸，這些氨基酸已經改變為其他氨基酸。優選地，非極性氨基酸突變為脯氨酸或不帶電荷的極性氨基酸。
確定兩個或多個序列間的同源性為了確定兩個氨基酸序列或兩個核苷酸序列之間的同源百分比，將這些序列對齊以達到最佳比較目的(例如，為了使第一氨基酸或核酸序列能與第二氨基酸或核酸序列最佳程度地對齊而向第一序列中導入空隙(gap))。然后，在相應氨基酸或核苷酸位置上進行氨基酸殘基或核苷酸的對比。當第一序列中某一位置被與第二序列相應位置處相同的氨基酸殘基或核苷酸占據，那么這些分子在該位置上就是同源的(即，本發明中出現的氨基酸或核酸的“同源性”等同于氨基酸或核酸的“同一性”)。
核酸序列同源性可以確定為兩序列間的同一性程度。可以使用本領域已知的電腦程序來測算同源性，如GCG程序軟件包中提供的GAP軟件。參見Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48443-453。使用GCG GAP軟件，同時用如下的核酸序列比較的設定值GAP產生罰分(GAP creationpenalty)為5.0，GAP延伸罰分(GAP extension penalty)為0.3，類似核酸序列的編碼區是指上述與圖2A(SEQ ID NO3)、圖2C(SEQ ID NO4)，圖3(SEQID NO6)所示DNA序列的CDS(編碼)部分之間具有優選至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性程度的序列。
“序列同一性”是指兩個多核苷酸或多肽序列在所比較的具體區域逐個殘基比較基礎上得到的相同程度。“序列同一性百分比”通過下述方法計算而來對在比較區域上最佳程度對齊的兩個序列進行比較，測算在這兩序列中都出現相同核酸堿基(例如，A，T，C，G，U，或I，就核酸而言)的位置的數目，從而得出匹配位置的數目，上述匹配位置的數目除以所比較區域中的位置總數(即，窗口大小)，得到的結果乘以100即為序列同一性百分比。術語“基本同一”是指多核苷酸序列的一個特征，其中，所述多核苷酸包含的序列與參照序列之間在所比較區域上具有至少80％的序列同一性，優選至少85％的序列同一性，通常為90～95％的序列同一性，更經常為至少99％的序列同一性。
嵌合蛋白及融合蛋白本發明還提供了BAFF-R嵌合或融合蛋白。在本發明中，BAFF-R“嵌合蛋白”或“融合蛋白”包含可操作地連接到非-BAFF-R多肽上的BAFF-R多肽。“BAFF-R多肽”是指具有對應于BAFF-R的氨基酸序列的多肽，而“非-BAFF-R多肽”是指具有對應于與BAFF-R基本上不同源的蛋白的氨基酸序列的多肽。例如，來自相同或不同生物體但不同于BAFF-R蛋白的蛋白。在BAFF-R融合蛋白中BAFF-R多肽可以為整個或部分的BAFF-R蛋白。一個技術方案中，BAFF-R融合蛋白包含至少1個BAFF-R蛋白的生物活性部分。另一實施方案中，BAFF-R融合蛋白包含至少2個BAFF-R蛋白的生物活性部分。另一實施方案中，BAFF-R融合蛋白包含至少3個BAFF-R蛋白的生物活性部分。在融合蛋白中，“可操作地連接”是指BAFF-R多肽和非-BAFF-R多肽彼此融合在同一個閱讀框內。非-BAFF-R多肽可以融合到BAFF-R多肽的N-末端或C-末端。非-BAFF-R多肽可以是，例如，抗體的Fc部分。它可以可操作地連接到BAFF-R多肽的N-末端或C-末端。Fc-目標蛋白融合體的描述已公開于Lo et al.(1998)Protein Enginering 11495-500，和美國專利5,541,087和5,726,044.這些文獻公開的內容在此引入作為參考。
例如，在一個實施方案中，BAFF-R融合蛋白包含可操作地連接于第二蛋白胞外結構域上的BAFF-R結構域。這類融合蛋白還可以用于篩選試驗篩選能調節BAFF-R活性的化合物(這類實驗的詳述見下文)。
另一實施方案中，所述融合蛋白為GST-BAFF-R融合蛋白，其中BAFF-R序列被融合到GST(即，谷胱甘肽S-轉移酶)序列的C-末端。這類融合蛋白可有助于重組BAFF-R的純化。
另一實施方案中，所述融合蛋白為在其N-端含有異源信號序列的BAFF-R蛋白。例如，由于BAFF-R不含有它自己的信號序列，所以必須在BAFF-R編碼序列的5’端融合一異源信號序列以使BAFF-R融合蛋白能有效地分泌。可以用不同的異源信號序列來增加BAFF-R的表達和/或分泌。
另一實施方案中，所述融合蛋白為BAFF-R-免疫球蛋白融合蛋白，其中BAFF-R序列包含融合到來自免疫球蛋白家族成員的序列上的1個或多個結構域。本發明所述的BAFF-R-免疫球蛋白融合蛋白可納入到藥物組合物中，給藥給受試者以抑制BAFF-R配體和細胞表面BAFF-R蛋白間的相互作用，從而抑制體內BAFF-R-介導的信號轉導。所述BAFF-R-免疫球蛋白融合蛋白可用于影響BAFF-R相應配體的生物利用率。對BAFF-R配體/BAFF-R相互作用的抑制可用于治療增殖和分化性疾病以及調控(例如，促進或抑制)細胞存活。進一步地，本發明的BAFF-R-免疫球蛋白融合蛋白可用作免疫原在受試者體內制備抗-BAFF-R抗體，用來純化BAFF-R配體，以及在篩選試驗中用來鑒定能抑制BAFF-R與BAFF-R配體間相互作用的分子。
本發明中的嵌合或融合蛋白可以用標準的重組DNA技術來制備。例如，用常規技術將編碼不同多肽序列的DNA片段一起連接到閱讀框內，例如通過使用平端或粘端連接，限制酶消化提供合適的末端，需要時粘性末端補平，堿性磷酸酶處理避免不需要的連接，以及酶連接。另一個技術方案中，可用常規技術合成融合基因，包括自動DNA合成儀。替代地，可用錨定引物進行基因片段的PCR擴增，這樣就可以使兩個連續的基因片段間伸出互補性的突出端，然后退火，再擴增生成嵌合基因序列(參見，例如，Ausubel et al.Eds.CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley & Sons，1992)。另外，可以購得多種編碼融合元件(例如，GST多肽)的表達載體。可將編碼BAFF-R的核酸克隆入這類表達載體中，從而可使融合元件在閱讀框內與BAFF-R蛋白連接。
在一個優選的實施方案中，通過圖9所示核酸序列(SEQ ID NO11)及氨基酸序列(SEQ ID NO12)提供了BAFF-R融合體。
BAFF-R激動劑及拮抗劑本發明還提供了BAFF-R蛋白的變體，這些變體可作為BAFF-R激動劑(模擬物)或BAFF-R拮抗劑。可通過誘變制備BAFF-R蛋白的變體，例如，離散性點突變(discrefe point mufation)或BAFF-R蛋白的截短。BAFF-R蛋白的激動劑保留了與天然形式的BAFF-R蛋白基本相同的生物活性，或其中的一部分的生物活性。BAFF-R蛋白的拮抗劑能抑制天然形式BAFF-R蛋白的一種或多種活性，例如，通過競爭性結合其中包括BAFF-R蛋白的細胞信號級聯反應中的下游或上游成員。因此，可以通過用具有限制功能的變體的處理來引發特定的生物學效應。一個實施方案中，用具有天然形式蛋白的部分生物活性的變體處理受試者，與用天然形式的BAFF-R蛋白處理受試者相比，產生的副作用要小得多。
可用作BAFF-R激動劑(模擬物)或BAFF-R拮抗劑的BAFF-R蛋白變體可以通過下述方法鑒定根據BAFF-R的激動劑或拮抗劑活性，對BAFF-R蛋白變體如截短變體的組合文庫進行篩選，選出具有激動或拮抗活性的BAFF-R蛋白。一個實施方案中，可通過核酸水平上的組合誘變制備出BAFF-R變體的花斑文庫(variegated library)，該文庫由一花斑基因文庫編碼。BAFF-R變體的花斑文庫例如可用下述方法制備將合成的寡核苷酸的混合物酶促連接入基因序列，因此，一組簡并的潛在BAFF-R序列可被表達為多個單獨的多肽，或表達為一組較大的融合蛋白(例如，用于噬菌體展示)，該融合蛋白中含有該組BAFF-R序列。許多方法都能從簡并的寡核苷酸序列制得潛在BAFF-R變體的文庫。簡并的基因序列的化學合成可以在自動DNA合成儀上進行，然后將合成的基因連接入適當的表達載體。使用一組簡并基因可在一混合物中得到編碼所期望的那組潛在BAFF-R序列的全部序列。合成簡并寡核苷酸的方法已為本領域已知(參見，例如，Narang(1983)Tetrahedron 393；Itakura et al.(1984)Ann.Rev.Biochem.53323；Itakura et al.(1977)Science 1981056-1063；Ike et al.(1983)Nucl.Acids Res.11477-488。
多肽文庫此外，可以用BAFF-R蛋白編碼序列的片段的文庫來制備BAFF-R片段的花斑群(vaviegated population)，用于BAFF-R蛋白變體的篩選及隨后的選擇。一個實施方案中，編碼序列片段的文庫可通過下述方法來制備在每個分子僅發生約1次切割的條件下用核酸酶處理BAFF-R編碼序列的雙鏈PCR片段，變性該雙鏈DNA，然后再復性該DNA形成其中含有來自不同切割產物的正義/反義對的雙鏈DNA，通過用S1核酸酶處理從重新形成的雙螺旋中除去單鏈部分，將得到的片段文庫連接入表達載體。用該方法可以得到編碼BAFF-R蛋白不同大小的N-末端片段及中間片段的表達文庫。
幾種本領域已知的技術可用于對通過點突變或截短方法制得的組合文庫的基因產物進行篩選，以及用于從cDNA文庫中篩選具有選擇特性的基因產物。可使這項技術適應于對通過組合誘變BAFF-R蛋白制得的基因文庫進行快速篩選。可對上述那些使用最廣泛的技術進行修改以用于高通量分析，篩選大基因文庫，這樣的技術通常包括將基因文庫克隆入可復制表達載體中，用得到的載體文庫轉化合適的細胞，然后在下述條件下表達上述組合基因，即在這樣的條件下對目的活性的檢測能使編碼所檢測產物基因的載體得到分離。Recrusive ensemble mutagenesis(REM)是一種新的技術，該項技術能夠提高文庫中功能突變體的出現的頻率，該技術可與篩選試驗聯合使用鑒定BAFF-R變體(Arkin and Yourvan(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 897811-7815；Delgrave et aL(1993)Protein Engineering 6327-331)。
抗-BAFF-R抗體可用分離的BAFF-R蛋白或其部分或片段作為免疫原，按照標準的多克隆及單克隆制備技術，制備能結合BAFF-R的抗體。可以使用全長的BAFF-R蛋白，替代地，本發明提供了可用作免疫原的BAFF-R的抗原性肽片段。BAFF-R抗原性肽片段包含圖2D所示序列(SEQ ID NO5)中的至少8個氨基酸殘基，并且還包含BAFF-R的表位以使抗該肽的抗體能夠與BAFF-R形成特異性的免疫復合物。優選地，抗原性肽包含至少10個氨基酸殘基，更優選至少15個氨基酸殘基，甚至更優選至少20個氨基酸殘基，以及最優選至少30個氨基酸殘基。優選的抗原性肽所包含的表位為位于BAFF-R蛋白表面的區域，例如親水區域。
如本發明所述，圖2D(SEQ ID NO5)所示的BAFF-R蛋白序列或者其衍生物、片段、類似物或同系物都可以用作免疫原制備能免疫特異性結合這些蛋白組分的抗體。本發明中的“抗體”是指免疫球蛋白分子以及免疫球蛋白分子的免疫學活性部分，所述分子即其中含有能特異性結合(發生免疫反應)抗原如BAFF-R的抗原結合位點的分子。所述抗體包括，但不限于，多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、Fab和F(ab′)2片段，以及Fab表達文庫。在一個特定的實施方案中，公開了抗人BAFF-R蛋白的抗體。各種本領域已知的方法都可用于制備抗圖2D(SEQ ID NO5)所示BAFF-R蛋白序列或者其衍生物、片段、類似物或同系物的多克隆或單克隆抗體。下文對這些蛋白中的一些進行討論。
為了制備多克隆抗體，可通過用天然蛋白或其合成變體或它們的衍生物注射各種合適的宿主動物(例如，兔、山羊、小鼠或其他哺乳動物)來免疫。合適的免疫原制劑包括，例如，重組表達的BAFF-R蛋白或者化學合成的BAFF-R多肽。該制劑可進一步包括佐劑。各種用來增強免疫應答的佐劑包括，但不限于，弗氏(完全和不完全)佐劑、礦物凝膠(例如，氫氧化鋁)、表面活性劑(例如，溶血卵磷脂，普盧蘭尼克多元醇(pluronic polyols)，聚陰離子，肽，油性乳劑，二硝基酚等)，人用佐劑如卡介菌(BCG)和小棒狀桿菌，或類似的免疫刺激劑。如果需要，可從哺乳動物(例如，從血液)分離抗BAFF-R抗體，并用熟知的技術進行純化，如蛋白A層析獲得IgG級分。
本發明中的“單克隆抗體”或“單克隆抗體組合物”是指其中僅含有一種能與BAFF-R特定表位免疫反應的抗原結合位點的抗體分子群。因此，單克隆抗體組合物通常表現針對與其免疫反應的特定BAFF-R蛋白的單一的結合親和力。為了制備針對一特定BAFF-R蛋白或者其衍生物、片段、類似物或同系物的單克隆抗體，任一種通過連續細胞系培養制備抗體分子的方法都可使用。這類技術包括，但不限于，雜交瘤技術(參見Kohler &Milstein，(1975)Nature 256495-497)；trioma技術；人B-細胞雜交瘤技術(參見Kozbor et al.(1983)Immunol.Today 472)以及制備人單克隆抗體的EBV雜交瘤技術(見，Cole，et al.MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCERTHERAPY，Alan R.Liss，Inc.，1985，pp.77-96)。人單克隆抗體可用于實施本發明，并可用人雜交瘤技術(見Cote et al.(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 802026-2030)或用EB病毒體外轉化人B-細胞(參見Cole et al.MONOCLONALANTIBODIES AND CANCER THERAPY，Alan R.Liss，Inc.，1985 pp.77-96)來制備。
根據本發明，可調整上述技術以用于制備特異性針對BAFF-R蛋白的單鏈抗體(參見，例如，美國專利4,946,778)。此外，上述方法可調整用于構建Fab表達文庫(參見，例如，Huse et al.(1989)Science 2461275-1281)使得可以快速有效地鑒定出期望的特異性針對BAFF-R蛋白或者其衍生物、片段、類似物或同系物的單克隆Fab片段。可用本領域眾所周知的技術使非-人抗體“人源化”。參見，例如，美國專利5,225,539。含有針對BAFF-R蛋白獨特型的抗體片段可用本領域已知技術來制備，這些技術包括，但不限于(i)用胃蛋白酶消化抗體分子得到F(ab′)2片段；(ii)還原F(ab′)2片段的二硫鍵得到Fab片段；(iii)用木瓜蛋白酶和還原劑處理抗體分子得到Fab片段，以及(iv)Fv片段。
此外，重組抗-BAFF-R抗體，如嵌合及人源化單克隆抗體，其中包含人源和非人源部分，可以用常規的重組DNA技術來制備，它們也在本發明的范圍之內。這些嵌合及人源化單克隆抗體可用本領域已知重組DNA技術來制備，例如用下列文獻描述的方法PCT國際申請PCT/US86/02269；歐洲專利申請184,187；歐洲專利申請171,496；歐洲專利申請173,494；PCT國際公開號為WO 86/01533的專利；美國專利4,816,567；歐洲專利申請125,023；Better et al.(1988)Science 2401041-1043；Liu et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 843439-3443；Liu et al.(1987)J.Immunol.1393521-3526；Sun et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84214-218；Nishimura etal.(1987)Cancer Res.47999-1005；Wood et al.(1985)Nature 314446-449；Shaw et al.(1988)J.Natl.Cancer Inst.801553-1559)；Morrison(1985)Science2291202-1207；Oi et al.(1986)BioTechniques 4214；美國專利5,225,539；Jones et al.(1986)Nature 321552-525；Verhoeyan et al.(1988)Science 2391534；和Beidler et al.(1988)J.Immunol.1414053-4060。
一個實施方案中，用于篩選具有目的特異性抗體的方法包括，但不限于，，酶聯免疫吸附試驗(ELISA)以及本領域已知的其他免疫學-介導的技術。在特定的實施方案中，特異于BAFF-R蛋白一具體結構域的抗體的選擇通過制備能與具有所述結構域的BAFF-R蛋白的片段結合的雜交瘤來實現。本發明還提供了特異于BAFF-R蛋白內一個或多個結構域的抗體(例如跨越上述鑒定到的BAFF-R家族蛋白保守區域的結構域的抗體)，或者其衍生物、片段、類似物或同系物。
抗-BAFF-R抗體可用于本領域已知的涉及BAFF-R蛋白定位和/或定量的方法中(例如，用于檢測合適的生理樣品中BAFF-R蛋白的水平，用于診斷方法，用于蛋白成像，等)。在一個給定的實施方案中，抗BAFF-R蛋白的抗體或者其衍生物、片段、類似物或同系物(含有源自所述抗體的結合結構域)，可用作藥學上的活性化合物(下文稱為“治療劑”)。
抗-BAFF-R抗體(例如，單克隆抗體)可用于常規技術分離BAFF-R，所述技術例如親和層析或免疫沉淀。抗-BAFF-R抗體可用于純化細胞中的天然BAFF-R以及表達在宿主細胞中重組制備的BAFF-R。另外，抗-BAFF-R抗體可用來檢測BAFF-R蛋白(例如，細胞裂解物或細胞上清液中的BAFF-R蛋白)以評定BAFF-R蛋白表達的豐度及模式。抗-BAFF-R抗體可在診斷方面應用以監測組織中的蛋白水平，這已成為臨床檢測方法的一部分，例如，用于測定特定治療方案的效力。檢測可通過將抗體連接(即，物理性連接)到一可檢測物質上來而變得更容易進行。可檢測物質的實例包括各種酶、輔基、熒光材料、發光材料、生物發光材料以及放射性物質。合適的酶的實例包括辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶；合適的輔基復合物的實例包括，鏈霉親和素/生物素以及親和素/生物素；合適的熒光材料的實例包括傘形酮，熒光素，異硫氰酸熒光素，若丹明，二氯三嗪基胺(dichlorotriazinylamine)，熒光素，丹磺酰氯或藻紅蛋白；發光材料的實例包括魯米諾(luminol)；生物發光材料的實例包括熒光素酶，熒光素及發光蛋白質(aeguorin)；以及合適的放射性物質的實例包括125I，131I，35S或3H。
BAFF-R重組表達載體及宿主細胞本發明的另一方面涉及載體，優選表達載體，其中含有編碼BAFF-R蛋白或者其衍生物、片段、類似物或同系物的核酸。本發明中的“載體”是指能夠運輸已連接于其上的另一核酸的核酸分子。一種類型的載體是“質粒”，是一種環形雙鏈DNA環，外加的DNA片段可以連接于其中。另一類型的載體為病毒載體，其中外加的DNA片段可連接于病毒基因組中。一些載體在它們被導入的宿主細胞中能夠自行復制(例如，具有細菌復制起始位點的細菌載體以及附加型哺乳動物載體)。其他載體(例如，非-附加型哺乳動物載體)當導入宿主細胞時，被整合入宿主細胞基因組中，因而隨基因組一起復制。
另外，某些載體能夠指導被可操作地連接于其上的基因的表達。這類載體本發明稱之為“表達載體”。通常，重組DNA技術中用到的表達載體往往是質粒的形式。由于質粒是最常用的載體形式，因而本說明書中，“質粒”和“載體”可交互使用。但是，本發明還包括所述其他形式的表達載體，如病毒載體(例如，復制缺陷型反轉錄病毒，腺病毒以及腺相關病毒)，它們發揮著同樣的功能。
本發明所述的重組表達載體包含本發明所述的核酸，該核酸以適于其在宿主細胞中表達的形式存在，這就意味著該重組表達載體包含一個或多個根據表達所用的宿主細胞而選擇的調控序列，這些調控序列可可操作地連接于要表達的核酸序列。在重組表達載體中，“可操作地連接”是指將目的核苷酸序列以能允許其表達的方式連接于調控序列(例如，在體外轉錄/翻譯系統中或者當該載體被導入宿主細胞時在宿主細胞內)。術語“調控序列”包括啟動子、增強子及其他表達控制元件(例如，聚腺苷酸化信號)。這類調控序列的描述見，例如，Goeddel″Gene Expression Technology″METHODS INENZYMOLOGY 185，Academic Press，San Diego，Calif.，1990。調控序列包括那些指導在多種類型宿主細胞中核苷酸序列組成型表達的序列以及那些指導核苷酸序列僅在一些宿主細胞中表達的序列(例如，組織-特異性調控序列)。本領域技術人員可以理解的是，表達載體的設計要取決于被轉化宿主細胞的選擇、所期望的蛋白表達水平等因素。本發明中的表達載體被導入宿主細胞從而制備出由本發明所述核酸編碼的蛋白質或肽，包括融合蛋白或肽(例如，BAFF-R蛋白，突變形式的BAFF-R，融合蛋白等)。
本發明中的重組表達載體可被設計用于在原核或真核細胞中表達BAFF-R。例如，BAFF-R可表達于細菌細胞，如大腸桿菌、昆蟲細胞(用桿狀病毒表達載體)、酵母細胞或哺乳動物細胞。合適的宿主細胞的討論另見于Goeddel，″Gene Expression Technology″METHODS IN ENZYMOLOGY185，Academic Press，San Diego，Calif.，1990。替代地，重組表達載體可在體外轉錄及翻譯，例如，用T7啟動子調控序列及T7聚合酶。
蛋白質的原核細胞表達最常在含載體的大腸桿菌中進行，所述載體包含指導融合或非融合蛋白質表達的組成型或可誘導型啟動子。融合載體向所編碼的蛋白添加許多個氨基酸，通常添加到重組蛋白的氨基末端。這類融合載體通常要達到三個目的(1)增加重組蛋白的表達；(2)增加重組蛋白的溶解性；以及(3)通過作為親和純化中的配體幫助重組蛋白的純化。通常，在融合表達載體中，在融合單元與重組蛋白的結合處引入蛋白水解酶的切割位點，這樣確保在融合蛋白純化后可將重組蛋白同融合單元分離開來。所述酶及它們的相應識別序列，包括因子Xa，凝血酶及腸激酶。常用的融合表達載體包括pGEX(Pharmacia Biotech Inc；Smith and Johnson(1988)Gene6731-40)，pMAL(New England Biolabs，Beverly，Mass.)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，N.J.)，這些載體分別將谷胱甘肽S-轉移酶(GST)、麥芽糖E結合蛋白或蛋白A融合于目標重組蛋白。
合適的可誘導的非融合大腸桿菌載體的實例包括pTrc(Amrann etal.，(1988)Gene 69301-315)和pETlld(Studier et al.，″Gene ExpressionTechnology″METHODS IN ENZYMOLOGY 185，Academic Press，San Diego，Calif.，1990，pp.60-89)。
使大腸桿菌中重組蛋白表達最大化的一個策略是在蛋白酶切割重組蛋白能力被減弱的宿主細菌中表達蛋白質。見，Gottesman，″Gene ExpressionTechnology″METHODS IN ENZYMOLOGY185，Academic Press，San Diego，Calif.，1990，pp.119-128.另一個策略是改變要插入表達載體的核酸的核酸序列以使得每一氨基酸的單個密碼子都是大腸桿菌優先使用的密碼子(Wada et al.，(1992)Nucleic Acids Res.202111-2118)。本發明所述這種核酸序列變化可以用常規的DNA合成技術來實施。
另一個實施方案中，BAFF-R表達載體是酵母表達載體。用于酵母(例如，釀酒酵母)中表達的載體的實例包括pYepSecl(Baldari，et al.，(1987)EMBOJ.6229-234)、pMFa(Kurjan and Herskowitz，(1982)Cell 30933-943)、pJRY88(Schultz et al.(1987)Gene 54113-123)、pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，Calif.)，用于巴斯德畢赤氏酵母(P.Pastoris)表達的載體的實例包括pPIC載體家族(Invitrogen Corp，San Diego，Calif.)。
替代地，BAFF-R可用桿狀病毒表達載體在昆蟲細胞中表達。現有的可用于在培養的昆蟲細胞(例如，SF9細胞)中表達蛋白的桿狀病毒載體包括pAc系列(Smith et al.(1983)Mol.Cell.Biol.32156-2165)和pVL系列(Lucklow and Summers(1989)Virology 17031-39)。
另一個實施方案中，本發明所述的核酸用哺乳動物表達載體表達在哺乳動物細胞中。哺乳動物表達載體的實例包括pCDM8(Seed(1987)Nature 329840-842)和pMT2PC(Kaufman et al.(1987)EMBO J.6187-195)。當用于哺乳動物細胞時，所述表達載體的調控功能通常是由病毒調控元件來提供的。例如，常常使用來自多瘤病毒、腺病毒2、巨細胞病毒和猴病毒40(SV40)的啟動子。其他對于原核細胞及真核細胞均適合的表達系統參見，例如Sambrook et al.，MOLECULAR CLONINGA LABORATORY MANUAL.2NDED.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.，1989.的第16和17章。
另一實施方案中，重組哺乳動物表達載體能夠指導核酸在特定細胞類型中優先表達(例如，用組織特異性調控元件來表達核酸)。組織特異性調控元件已為本領域已知。合適的組織特異性啟動子的非限制性實例包括白蛋白啟動子(肝特異性；Pinkert et al.(1987)Genes Dev.1268-277)、淋巴-特異性啟動子(Calame和Eaton(1988)Adv.Immunol.43235-275)，具體有T細胞受體啟動子(Winoto和Baltimore(1989)EMBO J.8729-733)和免疫球蛋白啟動子(Banerji et al.(1983)Cell 33729-740；Queen和Baltimore(1983)Cell33741-748)、神經元-特異性啟動子(例如，神經絲啟動子；Byrne和Ruddle(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 865473-5477)，胰腺-特異性啟動子(Edlund et al.(1985)Science 230912-916)、以及乳腺-特異性啟動子(例如，乳清啟動子；美國專利4,873,316和公開號為264,166的歐洲申請)。還包括發育-調控啟動子，例如小鼠hox啟動子(Kessel和Gruss(1990)Science 249374-379)和a-胎蛋白啟動子(Campes和Tilghman(1989)Genes Dev.3537-546)。
本發明進一步還提供了重組表達載體，其中含有以反義方向克隆入該表達載體中的本發明所述DNA分子。也就是說，該DNA分子被可操作地連接于調控序列，連接方式可使與BAFF-RmRNA反義的RNA分子能夠被表達(通過DNA分子的轉錄)。可以選擇能指導反義RNA分子在多種類型細胞中連續表達的調控序列，將其可操作地連接于以反義方向克隆的核酸，例如可以選擇病毒啟動子和/或增強子，或調控序列，以使它們能指導反義RNA組成性、組織特異性或細胞類型特異性的表達。反義表達載體可以是重組質粒、噬菌粒或減毒的病毒，在這些載體中反義核酸在高效調控區域的控制下生成，其活性可以通過該載體導入的細胞類型來測定。有關用反義基因來調控基因的表達的討論見Weintraub et al.(1986)″Antisense RNA asa molecular tool for genetic analysis，″Reviews--Trends in Genetics，1(1)。
本發明另一方面涉及已導入了本發明所述重組表達載體的宿主細胞。術語“宿主細胞”和“重組宿主細胞”在本發明中可交互使用。應該理解的是這類術語不僅指具體受試細胞而且也指該細胞的后代或可能的后代。雖然在連續傳代過程中由于突變或環境影響可能會發生一些修飾，而使所述后代實際上可能已經不同于親代細胞，但是它們仍包括在本發明使用術語包括的范圍之內。
宿主細胞可以是任一原核或真核細胞。例如，BAFF-R蛋白可以表達于細菌細胞如大腸桿菌、昆蟲細胞、酵母或哺乳動物細胞(如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)或COS細胞)。其他合適的宿主細胞已為本領域技術人員已知。
可通過常規的轉化或轉染技術，將載體DNA導入原核或真核細胞。本發明使用的″轉化″和″轉染″是指多種本領域認可的將外源核酸(例如，DNA)導入宿主細胞的技術，包括磷酸鈣或氯化鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖-介導的轉染、脂質轉染法或電穿孔。用于轉化或轉染宿主細胞的合適方法可見于Sambrook et al.MOLECULAR CLONINGA LABORATORY MANUAL 2NDED.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.，1989)，以及其他實驗手冊。
就穩定轉染哺乳動物細胞而言，本領域已知，根據所使用的表達載體及轉染技術，只有一小部分細胞可將外源DNA整合入其基因組。為了鑒定和選擇這些整合子，通常將編碼可選擇標記(對抗生素的抗性)的基因與目的基因一起導入宿主細胞。各種可選擇標記物包括那些賦予藥物抗性的標記物，如對G418、潮霉素及甲氨蝶呤的抗性的標記物。可將編碼可選擇標記物的核酸與編碼BAFF-R的核酸置于同一載體導入宿主細胞，或者各自置于不同載體。被導入核酸穩定轉染的細胞可通過藥物篩選來鑒定(例如，已引入可選擇標記物的細胞將存活，而其他細胞會死亡)。
本發明的宿主細胞，如培養物中的原核細胞或真核宿主細胞，可用來制備(即，表達)BAFF-R蛋白。因此，本發明進一步提供了用本發明所述宿主細胞制備BAFF-R蛋白的方法。在一個實施方案中，該方法包括將本發明所述宿主細胞(其中已經導入了編碼BAFF-R的重組表達載體)培養在合適的培養基中從而生成BAFF-R蛋白。另一實施方案中，該方法進一步還包括從培養基或宿主細胞中分離BAFF-R。
轉基因動物本發明的宿主細胞還可以用于制備非人轉基因動物。例如，在一個實施方案中，本發明的宿主細胞為其中導入了BAFF-R-編碼序列的受精的卵母細胞或胚胎干細胞。然后將這種宿主細胞用于生產非人轉基因動物，在該動物中外源BAFF-R序列已被導入其基因組中，或者將這種宿主細胞用于生產同源重組動物，其中內源BAFF-R序列已被改變。上述這些動物可用于研究BAFF-R的功能和/或活性，以及用于鑒定和/或評估BAFF-R活性的調節劑。本發明中的“轉基因動物”是非人動物，優選為哺乳動物，更優選為嚙齒類動物如大鼠或小鼠，其中該動物的一個或多個細胞包含轉基因。轉基因動物的其他實例包括非人靈長類動物、綿羊、狗、牛、山羊、雞、兩棲類動物，等。轉基因是外源DNA，其被整合入細胞的基因組中，轉基因動物從該細胞發育而來，并且該外源DNA仍保留在成熟動物的基因組中，從而指導所編碼的基因產物在轉基因動物的一種或多種類型細胞或組織中表達。本發明中的″同源重組動物″為非-人動物，優選為哺乳動物，更優選為小鼠，其中內源性BAFF-R基因由于該內源基因與導入該動物細胞(例如，動物發育之前的動物胚胎細胞)的外源DNA分子間的同源重組而被改變。
本發明的轉基因動物可以通過將編碼BAFF-R的核酸導入受精卵母細胞的雄前核(male pronuclei)制得，例如通過微注射、反轉錄病毒感染以及讓卵母細胞在假孕雌性養育動物體內發育。圖2A(SEQ ID NO3)，圖2C(SEQID NO4)，圖3(SEQ ID NO6)所示的人源BAFF-R DNA序列可作為轉基因被導入非-人動物的基因組。
替代地，人源BAFF-R基因的非人源同系物，如小鼠BAFF-R基因(圖4A)(SEQ ID NO8)，可通過與人源BAFF-R cDNA(上文有進一步的描述)的雜交而分離得到，并用做轉基因。內含子序列及聚腺苷酸化信號也可被包含在轉基因中用以提高轉基因的表達效率。組織-特異性調控序列可以被可操作地連接于BAFF-R轉基因用來指導BAFF-R蛋白在特定細胞中的表達。用于通過胚胎操作和微注射制備轉基因動物的方法，具體為小鼠等動物，已經成為本領域的常規技術，其描述見，例如美國專利4,736,866；4,870,009；和4,873,191；以及Hogan所著MANIPULATING THE MOUSEEMBRYO，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986。類似方法可用于其他轉基因動物的制備。轉基因建立動物(transgenic founder animal)可根據其基因組中有無BAFF-R轉基因存在和/或該動物組織或細胞中有無BAFF-R mRNA的表達來鑒定。然后將轉基因建立動物用于再繁殖帶有該轉基因的動物。另外，帶有編碼BAFF-R轉基因的轉基因動物還可繁殖其他帶有別的轉基因的轉基因動物。
為了創建同源重組動物，制備其中含有至少一部分BAFF-R基因的載體，這部分基因中導入了缺失、添加或取代從而改變了(例如功能性地破壞)BAFF-R基因。BAFF-R基因可以為人基因(例如，圖2A(SEQ ID NO3)，圖2C(SEQ ID NO4)，圖3(SEQ ID NO6))，但更優選為人BAFF-R基因的非-人同系物。例如，圖2A(SEQ ID NO3)、圖2C(SEQ ID NO4)、圖3(SEQID NO6)所示人BAFF-R基因的小鼠同系物(圖4a)可用于構建適于改變小鼠基因組中內源BAFF-R基因的同源重組載體。在一個實施方案中，設計載體使得，當進行同源重組時，內源性BAFF-R基因被功能性地破壞(即，不再編碼功能蛋白；該載體也稱為“敲除”載體)。
替代地，載體可被設計成這樣，當進行同源重組時，內源性BAFF-R基因突變或被改變但是仍能編碼功能蛋白(例如，上游調控區域被改變從而改變了內源BAFF-R蛋白的表達)。在同源重組載體中，BAFF-R基因的被改變部分的5′和3′端連接有BAFF-R基因的其他核酸從而可使該載體所攜帶的外源BAFF-R基因與胚胎干細胞中的內源BAFF-R基因之間能夠發生同源重組。為了能與內源基因間成功進行同源重組，上述側翼連接的BAFF-R基因的其它核酸要有足夠的長度。通常，載體中包含幾個Kb長的側翼DNA(5′和3′端均如此)。參見，例如，Thomas et al.(1987)Cell 51503中的同源重組載體的描述。該載體被導入胚胎干細胞系(例如，通過電穿孔)。選取在其中已經發生了被導入BAFF-R基因與內源BAFF-R基因間的同源重組的細胞(參見，例如，Li et al.(1992)Cell 69915)。
然后將被選取的細胞注射入動物(例如，小鼠)的胚泡形成聚集嵌合體(aggregation chimera)。參見，例如，Bradley，TERATOCARCINOMAS ANDEMBRYONIC STEM CELLSA PRACTICAL APPROACH，Robertson，Ed.IRL，Oxford，1987，pp.113-152。然后，將嵌合胚胎植入合適的假孕雌性養育動物，使胚胎發育至足月。在其生殖細胞中帶有同源重組的DNA的后代可用來繁殖動物，在繁殖得到的動物中由于轉基因的生殖系傳遞而使得該后代動物的所有細胞中都含有所述同源重組的DNA。用于構建同源重組載體和同源重組動物的方法還可參見Bradley(1991)Curr.Opin.Biotechnol.2823-829；PCT國際公開號WO 90/11354；WO 91/01140；WO 92/0968；和WO 93/04169。
另一實施方案中，制備的轉基因非-人動物中含有可保證轉基因調控表達的選擇系統。所述系統的一個實例為噬菌體P1的cre/loxP重組酶系統。cre/loxP重組酶系統的描述，參見，例如，Lakso et al.(1992)Proc.Natl.AcadSci.USA 896232-6236。重組酶系統的另一實例為釀酒酵母的FLP重組酶系統(O′Gorman et al.(1991)Science 2511351-1355。如果用cre/loxP重組酶系統來調控轉基因的表達，那么就需要動物中含有編碼Cre重組酶和被選擇蛋白的轉基因。這類動物可以通過構建“雙”轉基因動物來得到，例如通過讓兩個轉基因動物交配，其中的一個含有編碼選擇蛋白的轉基因，而另一個含有編碼重組酶的轉基因。
本發明所述的非-人轉基因動物的克隆還可用下列文獻中描述的方法來制備Wilmut et al.(1997)Nature 385810-813。簡而言之，可將來自轉基因動物的細胞，例如體細胞，分離出來，并誘導其脫離生長周期進入G0期。然后，將該靜止期細胞通過電脈沖融合入被摘除細胞核的卵母細胞，該卵母細胞與所述靜止細胞分離自同一種動物。然后，培養重新構建的卵母細胞從而使其發育成桑椹胚或胚細胞，然后將其轉移到假孕雌性養育動物。該雌性養育動物所繁殖的后代就是可從中分離細胞，例如體細胞的動物克隆。
藥物組合物BAFF-R核酸分子、BAFF-R蛋白以及抗-BAFF-R抗體(本發明中又稱為“活性化合物”)，及其衍生物、片段、類似物和同系物，都可以摻入適于給藥的藥物組合物中。這類組合物通常包括核酸分子、蛋白質或抗體以及藥物學上可接受載體。本發明使用的“藥物學上可接受載體”是指與藥物給藥相適宜的任一及所有溶劑、分散介質、包被物、抗細菌及抗真菌劑、等滲及吸收延遲劑等。合適載體的描述見最新版的Remington′sPharmaceutical Sciences，本領域一標準教科書，在此引入作為參考。這類載體或稀釋劑的優選實例包括，但不限于，水、鹽水、finger′s溶液、葡萄糖溶液以及5％人血清白蛋白。也可使用脂質體及無水載體如不揮發性油。這類用于藥物活性物質的介質及試劑的使用為本領域技術人員所熟知。除非任一常規介質或試劑與活性化合物不相容，否則其在組合物中的用途都是可預期的。另外，還可在組合物中摻入輔助性活性化合物。
本發明藥物組合物配制成與其給藥途徑相容的形式。所述給藥途徑的實例包括腸胃外給藥，例如，靜脈內、皮內、皮下、經口(例如，吸入)、經皮(局部)、經粘膜及直腸給藥。用于腸胃外、皮內或皮下使用的溶液或懸液可以包括下列組分用于注射的無菌溶劑如注射用水、鹽溶液、不揮發的油、聚乙二醇、甘氨酸、丙二醇或其他合成溶劑；抗細菌試劑如苯甲醇或甲基對羥基苯甲酸酯；抗氧化劑如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑如乙二胺四乙酸(EDTA)；緩沖液如醋酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽的緩沖液，以及用于調節張力的溶劑如氯化鈉或葡萄糖。PH可用酸或堿來調節，如鹽酸或氫氧化鈉。腸胃外給藥制劑可以封裝入安瓿、一次性注射器或玻璃或塑料制的多劑小瓶中。
適于注射使用的藥物組合物包括無菌水溶液(當可溶于水時)或分散液(dispersion)以及用于即時配制無菌注射溶液或分散液的無菌粉末。就靜脈給藥而言，合適載體包括生理鹽水、抑菌水、Cremophor EL(BASF，Parsippany，N.J.)或磷酸鹽緩沖液(PBS)。所有情況下，所述組合物都必須無菌而且均應當為流動性達到易于注射的程度。它必須在制造和儲存條件下是穩定的，還必須防止微生物如細菌和真菌的污染。所述載體可以是一種溶劑或分散介質含有，例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇及液態聚乙二醇等)，及其合適的混合物。保持適當的流動性可以通過，例如，使用卵磷脂等包被，在分散液情況下保持所需顆粒大小，以及使用表面活性劑來實現。防止微生物污染可以通過各種抗細菌及抗真菌的試劑來實現，例如，對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚，抗壞血酸，乙基汞硫代水楊酸鈉等。在許多情況下，優選在組合物中包含等滲試劑，例如糖，多元醇如甘露糖醇、山梨醇，氯化鈉。注射組合物的緩慢吸收可以通過在該組合物中包含一延遲吸收的試劑來實現，例如一硬脂酸鋁和明膠。
無菌注射液可以通過向合適溶劑中引入需要量的活性化合物(例如，BAFF-R蛋白或抗-BAFF-R抗體)以及一種或多種上述列舉成分(如需要)，然后過濾滅菌制備而成。通常，分散液的制備方法為將活性化合物引入一種含有基本分散介質以及上述列舉的所需其他成分的無菌載體中。就用于制備無菌注射溶液的無菌粉末而言，制備方法為真空干燥和冷凍干燥，所產生的活性成分的粉末中再加入由預先無菌過濾的溶液制得的其它的所需成分。
口服組合物通常包括一惰性溶劑或可食用載體。它們可以被包裹在明膠膠囊中或被壓縮成片劑。當口服治療給藥時，可將所述活性化合物和賦形劑組合在一起，以片劑、錠劑或膠囊的形式使用。口服組合物還可用流體載體制備成漱口劑來使用，其中流體載體中的化合物可在口腔中敷涂，漱口后吐出或咽下。藥物相容的粘合劑，和/或佐劑材料也可以摻入作為組合物的部分。所述片劑、丸劑、膠囊、錠劑等可含有下列成分中的任一種，或類似性質的化合物粘合劑如微晶纖維素、黃蓍膠或明膠；賦形劑如淀粉或乳糖；崩解劑如褐藻酸(alginicacid)、Primogel或玉米淀粉；潤滑劑如硬脂酸鎂或Sterotes；助流劑(glidant)如膠狀二氧化硅；甜味劑如蔗糖或糖精；或調味劑如薄荷油、甲基水楊酸鹽或桔味矯味劑。
就吸入給藥而言，所述化合物以氣溶膠噴射方式從受壓容器或配送器中釋放出來，所述容器中含有適當的拋射劑，例如氣體(如二氧化碳)，或所述化合物也可以從噴霧器中釋放出來。
另外還可以通過經粘膜或經皮的方式來系統給藥。就經粘膜或經皮給藥而言，在制劑中使用了適合于要通透屏障的滲透劑。這類滲透劑通常為本領域所已知，包括，例如，經粘膜給藥時，清潔劑、膽汁酸鹽和梭鏈孢酸衍生物。經粘膜給藥可通過鼻腔噴霧或栓劑來實現。就經皮給藥而言，所述的活性化合物被配制成本領域通常已知的油膏、軟膏、凝膠劑、霜劑。
該化合物還可以配制成栓劑(例如，用常規的栓劑基質如可可油以及其他甘油酯)或用于直腸給藥的滯留灌腸劑。
一個實施方案中，活性化合物用能夠保護該化合物不被機體迅速排除的載體來配制，例如一種緩釋制劑，包括輸注及微膠囊釋放系統。可以使用可生物降解、生物相容性聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯，聚酐，聚乙醇酸(polyglycolic acid)，膠原，聚原酸酯(polyorthoester)和聚乳酸。用于制備這類制劑的方法對于本領域技術人員而言是顯而易見的。所用材料還可以從Alza Corporation and Nova Pharmaceuticals，Inc.購得。脂質體懸液(包括用抗病毒抗原的單克隆抗體靶向感染細胞的脂質體)也可以用作藥物學上可接受的載體。這些制劑可以按照本領域技術人員已知的方法來配制，例如美國專利US4,522,811中所述的方法。
按劑量單位的形式配制成口服或非腸道用組合物因易于給藥并能保證劑量的均一性而特別有益。本發明中使用的劑量單位是指合適用作被治療患者單次劑量的物理分割單位；每一單位中包含預先計算出能與所需藥物載體共同作用產生預期治療效果的量的活性化合物。本發明所述的劑量單位形式的規定受制于或直接取決于活性化合物的獨特的特性以及要達到的具體療效。
本發明所述的核酸分子可以被插入載體并被用作基因治療載體。基因治療載體可以通過多種途徑中的任一種遞送給患者，例如，靜脈注射、局部給藥(見美國專利No.5,328,470)或定向注射(stereotactic injection)(參見，例如，Chen et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.913054-3057)。所述基因載體的藥物制劑可以包括可接受的稀釋液中的基因治療載體，或者可以含有一緩釋基質，基因遞送載體埋于其中。替代地，所述的完整基因遞送載體可以由重組細胞完整地制備而成，例如逆轉錄病毒載體，所述藥物制劑可以包括一種或多種能產生基因遞送系統的細胞。
可將藥物組合物與使用說明書一起裝入容器、包裝或配送器中。
本發明的用途和方法本發明所述的核酸分子、蛋白質、蛋白同系物及抗體可以用于下列的一種或多種方法(a)篩選試驗；(b)檢測試驗(例如，染色體作圖、組織分型、法律生物學)，(c)預測醫學(例如，診斷試驗，預測試驗，監測性臨床試驗以及藥物基因組學)；以及(d)治療方法(例如，治療和預防方法)。如本發明所述，在一個實施方案中，本發明所述的BAFF-R蛋白能與BAFF結合。
本發明所述的分離的核酸分子可以用于表達BAFF-R蛋白(例如，通過基因治療應用中宿主細胞內的重組表達載體)，用于檢測BAFF-R mRNA(例如，生物樣品中)或BAFF-R基因中的基因損傷，以及用于調控BAFF和/或BAFF-R活性，見本發明下文所述。此外，BAFF-R蛋白還可用于篩選能調控BAFF-R活性或表達的藥物或化合物以及用于治療以BAFF和/或BAFF-R蛋白生成不足或過量為特征的病癥，或相對于野生型BAFF-R蛋白其活性減弱或異常的BAFF-R蛋白形式的生成為特征的病癥。此外，本發明所述的抗-BAFF-R抗體可用于檢測及分離BAFF-R蛋白以及調節BAFF和/或BAFF-R活性。
本發明進一步還提供了通過上述篩選試驗鑒定出的新型藥物及其用在本發明所述治療中的用途。
篩選試驗本發明提供了一種用于鑒定調控劑的方法(本發明又稱篩選試驗)，所述調控劑即能結合BAFF-R蛋白或對例如BAFF-R表達或BAFF-R活性具有刺激或抑制功效的侯選或待測化合物或試劑(例如，肽、肽模擬物，小分子或其他藥物)。
一個實施方案中，本發明提供了用于篩選能夠結合BAFF-R蛋白或多肽或其生物活性部分或調控BAFF-R蛋白或多肽或其生物活性部分活性的侯選物或待測化合物的試驗。本發明所述的待測化合物可以使用本領域已知的大量組合文庫方法(combinatorial library method)中任一種制得，所述組合文庫方法包括生物文庫；空間可定位的平行固相或液相文庫(spatiallyaddressable parallel solid phase or solution phase libraries)；需去旋(deconvolution)的合成文庫法；″一微粒一化合物″文庫方法；以及使用親和層析選擇的合成文庫法。上述生物文庫方法僅限于肽文庫，而其他四種方法可用于肽、非-肽寡聚體或小分子化合物文庫(Lam(1997)Anticancer DrugDes.12145-167)。
用于合成分子文庫的方法的實例可見于現有技術中，例如見DeWittet al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906909-6013；Erb et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9111422-11426；Zuckermann et al.(1994)J.Med.Chem.372678-2685；Cho et al.(1993)Science 2611303；Carrell et al.(1994)AngewChem.Int.Ed.Engl.332059；Carell et al.(1994)Angew Chem.Int.Ed.Engl.332061；以及Gallop et al.(1994)J.Med.Chem.371233-1251.
化合物文庫可以以如下形式呈現溶液中(例如，Houghten(1992)Biotechniques 13412-421)，或微粒上(Lam(1991)Nature 35482-84)，芯片上(Fodor(1993)Nature 364555-556)，細菌(Ladner美國專利5,223,409)，孢子(Ladner U.S.Patent 5,223,409)，質粒(Cull et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 891865-1869)或噬菌體上(Scott和Smith(1990)Science249386-390；Devlin(1990)Science 249404-406；Cwirla et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 876378-6382；Felici(1991)J MOL Biol.222301-310；LadnerU.S.Patent5,223,409)。
一個實施方案中，試驗是以細胞為基礎的試驗，其中細胞表面上表達有膜結合型BAFF-R蛋白或其生物活性部分，讓該細胞與待測化合物接觸，測定待測化合物與BAFF-R蛋白間的結合能力。所述細胞，例如，可源自哺乳動物或為酵母細胞。待測化合物結合BAFF-R蛋白能力的測定可以通過，例如，將待測化合物與放射性同位素或酶標記物偶聯從而使得待測化合物與BAFF-R蛋白或其生物活性部分的結合的測定可以通過檢測復合物中的被標記化合物來實現。例如，待測化合物可以用125I，35S，14C或3H直接或間接標記，通過放射量(radioemission)直接計量或者通過閃爍計量檢測放射性同位素。替代地，待測化合物可以用酶標記，例如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶或熒光素酶，通過測定合適底物轉化成產物的情況來檢測酶標記物。一個實施方案中，所述試驗包括讓細胞表面上表達有膜結合型BAFF-R蛋白或其生物活性部分的細胞與能結合BAFF-R的已知化合物接觸形成試驗混合物，讓試驗混合物與待測化合物接觸，測定待測化合物與BAFF-R蛋白間相互作用的能力，其中所述的測定待測化合物與BAFF-R蛋白間相互作用的能力包括測定待測化合物相對于已知化合物優先結合BAFF-R或其生物活性部分的能力。
另一實施方案中，試驗是以細胞為基礎的試驗，其中包括讓表面上表達有膜結合型BAFF-R蛋白或其生物活性部分的細胞與待測化合物接觸，測定待測化合物調節(例如，刺激或抑制)BAFF-R蛋白或其生物活性部分活性的能力。對待測化合物調節BAFF-R蛋白或其生物活性部分活性的能力的測定可以通過，例如，測定BAFF-R蛋白與BAFF-R目標分子結合或相互作用的能力來實現。本發明中的“目標分子”是指BAFF-R蛋白能夠與其實質性結合或相互作用的分子，例如，表達BAFF-R蛋白的細胞表面的分子，第二種細胞(second cell)表面上的分子，胞內環境中的分子，細胞膜內表面相連的分子或者胞質分子(cytoplasmic molecule)。BAFF-R目標分子可以是非-BAFF-R分子或者是本發明所述的BAFF-R蛋白或多肽。一個實施方案中，BAFF-R目標分子是信號傳導途徑的一個組分，該組分可有助于胞外信號(例如，因化合物與膜結合型BAFF-R分子結合而產生的信號)通過細胞膜并進入胞內傳導。該目標分子可以是，例如，一種具有催化活性的第二種胞內蛋白(second intercellular protein)，或者是一種能夠促進下游信號分子與BAFF-R結合的蛋白。
對BAFF-R蛋白與BAFF-R目標分子間結合或相互作用能力的測定可以通過上述用于測定直接結合的方法中的一種來完成。一個實施方案中，對BAFF-R蛋白與BAFF-R目標分子間結合或相互作用能力的測定可以通過測定目標分子的活性來實現。例如，目標分子的活性可以通過下列方法來測定對細胞的第二信使靶(即，胞內Ca2+，甘油二脂，IP3，等)的誘導進行檢測，對該靶對于合適底物的催化/酶活性進行檢測，對報告基因(含有一個可操作地連接于編碼可檢測標記物的核酸分子上的BAFF-R-應答調控元件，例如，螢光素酶)的誘導進行檢測，或者對細胞應答反應，例如，細胞存活、細胞分化或細胞增生，進行檢測。
在另一個實施方案中，本發明的試驗是一個無細胞試驗，其中包括讓BAFF-R蛋白或其生物活性部分與待測化合物接觸，測定該待測化合物結合BAFF-R蛋白或其生物活性部分的能力。待測化合物與BAFF-R蛋白的結合可以通過上述方法直接或間接測定。一個實施方案中，所述試驗包括讓BAFF-R蛋白或其生物活性部分與一已知能結合BAFF-R的化合物接觸形成試驗混合物，讓該試驗混合物與待測化合物接觸，測定待測化合物與BAFF-R蛋白間相互作用的能力，其中所述的測定待測化合物與BAFF-R蛋白間相互作用的能力包括測定待測化合物相對于已知化合物優先結合BAFF-R或其生物活性部分的能力。
在另一個實施方案中，本發明的試驗是一個無細胞試驗，其中包括讓BAFF-R蛋白或其生物活性部分與待測化合物接觸，測定待測化合物調節(例如，刺激或抑制)BAFF-R蛋白或其生物活性部分活性的能力。對待測化合物調節BAFF-R蛋白或其生物活性部分活性的能力的測定可以例如用上述一種用于測定直接結合的方法通過測定BAFF-R蛋白結合BAFF-R目標分子的能力來實現。在另一個替代方案中，對待測化合物調節BAFF-R活性的能力的測定可以通過測定BAFF-R蛋白進一步調節BAFF-R目標分子的能力來實現。例如，如上所述，測定目標分子對合適底物的催化/酶促活性。
另一個實施方案中，所述的無細胞試驗包括讓BAFF-R蛋白或其生物活性部分與一已知能結合BAFF-R的化合物接觸形成試驗混合物，讓該試驗混合物與待測化合物接觸，測定待測化合物與BAFF-R蛋白間相互作用的能力，其中所述的測定待測化合物與BAFF-R蛋白間相互作用的能力包括測定待測化合物優先結合BAFF-R目標分子或優先調節其活性的能力。
在本發明所述的無細胞試驗中BAFF-R的可溶性或膜結合兩種形式均可使用。就包括膜結合型BAFF-R的無細胞試驗而言，需要使用一種溶解劑(solubilizing agent)以使膜結合型BAFF-R能停留在溶液中。所述溶解劑的實例包括非離子性去污劑如n-辛基葡糖苷，n-十二烷基葡糖苷，n-十二烷基麥芽糖苷，辛酰-N-甲基葡糖酰胺，十二酰-N-甲基葡糖酰胺，TritoneX-100，TritonX-114，Thesit，Isotridecypoly(乙烯乙二醇酯)n，3-(3-膽酰胺丙基)二乙銨-1-丙磺酸(CHAPS)，3-(3-膽酰胺丙基)二乙銨-2-羥基-1-丙磺酸(CHAPSO)，或N-十二烷基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙磺酸。
在本發明上述試驗方法的不止一個的實施方案中，都需要將BAFF-R或其目標分子固定，從而使得復合形式的蛋白質能與兩種蛋白中的一種或二者的非復合形式分離開來，并能適應該試驗的自動化。待測化合物與BAFF-R的結合，或者有無侯選化合物存在情況下BAFF-R與目標分子的相互作用，都可以在任一適于容納該反應物的器皿中進行。所述器皿的實例包括微量滴定板、試管以及微量離心管。在一個實施方案中，提供了一種融合蛋白，該融合蛋白上添加了一能使兩蛋白中的一種或二者均能結合于基質上的結構域。例如，可將GST-BAFF-R融合蛋白或GST-目標融合蛋白吸附于谷胱甘肽瓊脂糖凝膠微粒(Sigma Chemical，St.Louis，MO)或者谷胱甘肽衍生的微量滴定板上，然后讓其與待測化合物或者待測化合物與非吸附的目標蛋白或BAFF-R蛋白結合，在有助于復合物形成的條件下(例如，生理鹽濃度和pH)孵育上述混合物。孵育后，洗滌微粒或微量滴定板的孔以去除任一未結合的成分，使用微粒時被固定的基質，對復合物進行直接或間接測定，例如用上述方法進行測定。替代地，可將上述復合物從基質上解離下來，用常規技術測定BAFF-R的結合或活性水平。
用于將蛋白固定在基質上的其他技術也可以用于本發明所述的篩選試驗。例如，可以利用生物素與鏈霉親和素的結合來固定BAFF-R或其目標分子。用本領域熟知的技術(例如，生物素化試劑盒，Pierce Chemicals，Rockford，III.)由生物素-NHS(N-羥基琥珀酰亞胺)制備生物素化的BAFF-R或目標分子，將其固定于鏈霉親和素包被的96孔板(Pierce Chemical)上。替代地，可以使用能與BAFF-R或目標分子反應但不干擾BAFF-R蛋白與其目標分子結合的抗體來處理滴定板的孔，通過抗體偶聯將未結合的目標蛋白或BAFF-R俘獲在孔中。除上述用于GST-固定復合物的方法外，檢測所述復合物的方法還包括用能與BAFF-R或目標分子反應的抗體以及依賴于檢測與BAFF-R或目標分子連接的酶的活性的酶聯試驗對復合物進行免疫檢測。
另一實施方案中，可在如下方法中鑒定BAFF-R表達的調節物讓細胞與侯選化合物接觸，測定細胞中BAFF-R mRNA或蛋白的表達。將侯選化合物存在下BAFF-R mRNA或蛋白的表達水平與無侯選化合物存在時BAFF-R mRNA或蛋白的表達的水平進行比較。然后根據該對比結果就可將該侯選化合物鑒定為BAFF-R表達的調節物。例如，當在有侯選化合物存在時BAFF-R mRNA或蛋白的表達水平高于(統計學上顯著高于)無侯選化合物存在時，就可將該侯選化合物認定為BAFF-R mRNA或蛋白表達的激動劑。相反，當在有侯選化合物存在時BAFF-R mRNA或蛋白的表達水平低于(統計學上顯著低于)無侯選化合物存在時，就可將該侯選化合物認定為BAFF-R mRNA或蛋白表達的抑制劑。細胞內BAFF-R mRNA或蛋白的表達水平可以使用本發明所述用于檢測BAFF-R mRNA或蛋白的方法來測定。
本發明的另一方面，BAFF-R蛋白可用作雙雜交試驗或三雜交試驗中的″誘餌(bait)蛋白″(參見，例如，美國專利5,283,317；Zervos et al.(1993)Cell 72223-232；Madura et al.(1993)J.Biol.Chem.26812046-12054；Bartel etal.(1993)Biotechniques 14920-924；Iwabuchi et al.(1993)Oncogene 81693-1696；和Brent WO 94/10300)，以鑒定能與BAFF-R結合或相互作用的其他蛋白(″BAFF-R-結合蛋白″或″BAFF-R-bp″)以及能調節BAFF-R活性的其他蛋白。所述BAFF-R-結合蛋白還可能參與以BAFF-R蛋白例如作為BAFF-R途徑的上游或下游元件的信號傳播。
雙雜交系統是基于多個轉錄因子的調節特性建立的，所述轉錄因子由可分離的DNA-結合及活化結構域組成。簡而言之，該試驗使用兩種不同的DNA構建體。一個構建體中，編碼BAFF-R的基因被融合到編碼一已知轉錄因子(例如，GAL-4)的DNA結合結構域的基因上。另一個構建體中，將來自DNA序列文庫編碼未鑒定蛋白(″獵物″或″樣品″)的DNA序列融合到編碼上述已知轉錄因子活化結構域的基因上。如果，所述″誘餌″及所述″獵物″蛋白能在體內相互作用形成BAFF-R-依賴性復合物，那么就可使所述轉錄因子的DNA-結合結構域與活化結構域十分靠近，這種靠近使得報告基因(例如，LacZ)能夠轉錄，該報告基因可操作地連接于響應該轉錄因子的轉錄調控位點。可對所述報告基因的表達進行檢測，并且分離含有功能轉錄因子的細胞克隆，用其來獲得編碼可與BAFF-R相互作用的蛋白的克隆的基因。
本發明進一步還提供了用上述篩選試驗鑒定到的新的物質，及其用于本發明所述治療的用途。
檢測試驗本發明中鑒定出的cDNA序列的部分或片段(以及相應的全長基因序列)可作為多聚核苷酸反應物用于多種用途。例如，這些序列可用于(i)將其各自基因在染色體上作圖；從而將與遺傳性疾病相關的基因區域定位；(ii)從微小的生物樣本鑒定出個體(確定組織型別(tissue typing))；以及(iii)輔助生物樣本的法醫學鑒定。這些用途的描述見下列章節。
染色體作圖基因的序列(或該序列的一部分)一旦被分離，那么就可以用該序列繪出該基因在染色體上的位置圖。這種方法稱為染色體作圖。因此，本發明所述的BAFF-R，序列的片段或部分，可以用來繪出BAFF-R基因在染色體上各自的位置。BAFF-R序列的染色體作圖是在這些序列和與疾病相關基因間建立相關關系的重要的第一步。
簡單地說，可通過從BAFF-R序列制備PCR引物(優選長度為15-25bp)將BAFF-R基因圖示于染色體。電腦分析BAFF-R，序列可用于快速篩選出跨度不超過基因組DNA中1個外顯子的引物，因而使擴增過程復制化。然后將這些引物用于含特定物種個體染色體的體細胞雜合體的PCR篩選。只有那些其中含有相應于BAFF-R序列的種-特異性基因的雜合體才能產生擴增的片段。
體細胞雜合體的PCR作圖是一種將特定序列排布在特定染色體上的快速方法。用單個熱循環儀每天可排布3個或多個序列。用BAFF-R序列設計寡核苷酸引物時，用來自特定染色體的多組片段可實現亞定位。
DNA序列與中期染色體展布(metaphase chromosomal spread)的熒光原位雜交(FISH)還可以進一步用于在一步之內完成準確的染色體定位。可以用這樣的細胞制備染色體展布，即該細胞的分裂已被能夠破壞有絲分裂紡錘體的化學制劑如秋水仙酰胺在中期阻斷。可用胰蛋白酶簡單地處理染色體，然后用吉姆薩染色。每一染色體上都出現明暗條帶的模式，因而染色體能夠被單個鑒定。FISH技術可使用短至500或600個堿基的DNA序列。但是，大于1000個堿基的克隆與獨特的染色體座位結合的可能性更大，信號強度足以滿足簡單檢測。優選1,000個堿基，更優選2,000個堿基，能夠在一段合理時間得到好的結果。該技術的綜述見，Verma et al.HUMANCHROMOSOMESA MANUAL OF BASIC TECHNIQUES，Pergamon Press，N.Y.，1988。
用于染色體作圖的反應物可單獨用于標記單個染色體或該染色體上的單個位點，或者用多組的反應物標記多個位點和/或多個染色體。實際上，優選用對應于基因非編碼區的反應物進行作圖。編碼序列在基因家族中保守的可能性較大，因此提高了染色體作圖過程中交叉雜交的機會。
序列一旦被繪圖至到一確切的染色體座位，那么就可在該序列在染色體上的物理位置與基因圖譜數據之間建立相關關系。這類數據可見于，例如，McKusick，MENDELIAN INHERITANCE IN MAN，可從Johns HopkinsUniversity Welch Medical Library在線獲得)。然后可以通過連鎖分析(自然鄰接基因的共遺傳)在繪圖至同一染色體區域的基因和疾病間建立聯系，描述見，例如，Egeland et al.(1987)Nature，325783-787。
此外，可對受BAFF-R基因相關疾病影響的個體與未受影響的個體之間在DNA序列上的差異進行測定。如果部分或全部受影響個體中出現了突變，而非受影響個體無一出現，那么該突變就可能是特定疾病的致病因子。受影響個體與未受影響個體間的比較通常涉及首先尋找染色體中的結構的改變，如缺失或轉位，這些改變可從染色體展布中觀察到或者可用以該DNA序列為基礎的PCR來檢測。最后，對來自數個個體的基因完整測序以確定突變的存在并從多態性中辨別出突變。
確定組織型別本發明所述的BAFF-R序列還可用于從微小的生物樣本鑒定個體。該技術中，用1種或多種限制性酶消化個體的基因組DNA，并在Southern印跡進行探針檢測產生用于鑒定的獨特性條帶。本發明的序列可作為附加DNA標記物用于RFLP(″限制性片段長度多態性，″描述見美國專利5,272,057)。
另外，本發明的序列可以用于提供一種替代性的技術，該技術能夠對個體基因組中所選部分的DNA序列進行真正的逐個堿基的測序。因此，可用本發明所述的BAFF-R序列從該序列的5′和3′端制備出兩個PCR引物。然后可用這些引物擴增個體的DNA，然后測定其序列。
由于每一個體因等位差異都具有一套獨特的所述DNA序列，所以用這種方式從個體制備的多組相應的DNA序列，可為個體提供獨一無二的鑒別。本發明的序列可用于從個體和從組織獲得所述鑒定序列。本發明的BAFF-R序列獨一無二地代表人基因組的部分。等位突變一定程度上出現于編碼區域，更大程度上出現于非編碼區域。據估計人個體之間等位突變出現的頻率為每500個堿基中約1個堿基。等位突變多數歸因于單個核苷酸多態性(SNPs)，其中包括限制性片段長度多態性(RFLPs)。
本發明所述的每一序列一定程度上都可以作為標準，用于與來自個體的DNA進行比較鑒定。由于較多的多態性出現在非編碼區，所以區分個體只需要較少的這種序列。圖1A(SEQ ID NO1)，圖1B(SEQ ID NO2)，圖2A(SEQ ID NO3)，圖2B(SEQ ID NO4)，圖3(SEQ ID NO6)中的非編碼區可以很容易地提供陽性個體鑒定，所用的是大約10～1,000個引物的一組引物，每一引物都能得到長為100個堿基的非編碼擴增序列。如果使用的是編碼序列，如圖1A(SEQ ID NO1)，圖1B(SEQ ID NO2)，圖2A(SEQ ID NO3)，圖2B(SEQ ID NO4)，圖3(SEQ ID NO6)中的編碼序列，提供陽性個體鑒定的較合適的引物數目為500-2,000個。
預測醫學本發明還涉及可預測醫學領域，其中診斷試驗、預測試驗、藥物基因組學以及臨床監測試驗都用于預測(預見)目的，從而達到預防性地治療個體。因此，本發明的一個方面涉及診斷試驗，用于測定生物樣本(例如，血液、血清、細胞、組織)中BAFF-R蛋白和/或核酸表達以及BAFF-R活性，從而確定個體是否在患與BAFF-R表達異常或活性異常相關疾病或病癥或者是否有患這類疾病的危險。本發明還提供了診斷(預見)試驗，用來測定個體是否有患與BAFF-R蛋白、核酸表達或活性相關的病癥的危險。例如，可測定生物樣本中BAFF-R基因的突變。這類測定試驗可用于預測或預見目的，從而可在以BAFF-R蛋白、核酸表達或活性為特征或與其相關的疾病發生之前對個體進行預防性治療。
本發明另一方面提供了用于測定個體中BAFF-R蛋白、核酸表達或BAFF-R活性的方法，從而為該個體選擇合適的治療或預防物質(本發明中稱為″藥物基因組學″)。藥物基因組學可以根據個體的基因型來為個體的治療或預防選擇物質(例如，藥物)(例如，測定個體的基因型以確定個體應答具體物質的能力)。
本發明另一方面涉及在臨床試驗中監測物質(例如，藥物，化合物)對BAFF-R表達或活性的影響。
這些物質和其他物質在下列部分進一步詳述。
診斷試驗用于檢測生物樣本中有無BAFF-R存在的一個范例性的方法包括從受試者獲得生物樣本，讓該生物樣本與能夠檢測BAFF-R蛋白或編碼BAFF-R蛋白的核酸(例如，mRNA，基因組DNA)的化合物或試劑接觸，從而檢測生物樣本中有無BAFF-R存在。用于檢測BAFF-R mRNA或基因組DNA的試劑可以是能與BAFF-R mRNA或基因組DNA雜交的標記核酸探針。所述核酸探針可以是，例如全長BAFF-R核酸，例如圖1A(SEQ ID NO1)，圖1B(SEQ ID NO2)，圖2A(SEQ ID NO3)，圖2B(SEQ ID NO4)，圖3(SEQ ID NO6)所示的任一核酸或其部分，如長至少15，30，50，100，250或500個核苷酸的寡核苷酸，并且該寡核苷酸足以能在嚴謹條件下與BAFF-RmRNA或基因組DNA雜交。本發明還描述了其他可用于診斷試驗的合適探針。
用于檢測BAFF-R蛋白的試劑是能結合BAFF-R蛋白的抗體，優選帶有可檢測標記的抗體。抗體可為多克隆抗體，或者更優選為單克隆抗體。完整抗體或其片段(例如，Fab或F(ab′)2)都可使用。術語“標記”就探針或抗體而言包括，通過將可檢測物質連接(即，物理連接)到探針或抗體而對探針或抗體進行的直接標記，以及通過與另一被直接標記了的反應物進行反應而對探針或抗體進行的間接標記。間接標記的實例包括用熒光標記第二抗體對第一抗體進行檢測以及用生物素末端標記DNA探針再用熒光標記的鏈霉親和素對其進行檢測。“生物樣本”包括從受試者分離而來的組織、細胞和生物體液，以及存在于受試者體內的組織、細胞和體液。也就是說，本發明的檢測方法可用于體內或體外檢測生物樣本中的BAFF-R mRNA，蛋白或基因組DNA。例如，體外檢測BAFF-R mRNA的技術包括Northern雜交和原位雜交。體外檢測BAFF-R蛋白的技術包括酶聯免疫吸附試驗(ELISAs)，Western印跡，免疫沉淀和免疫熒光。體外檢測BAFF-R基因組DNA的技術包括Southern雜交。另外，體內檢測BAFF-R蛋白的技術包括將一標記后的抗-BAFF-R抗體導入受試者。例如，用放射性標記物標記抗體，該標記物在受試者體內的存在和定位可通過標準成像技術來檢測。
一個實施方案中，所述生物樣本包括來自受試者的蛋白分子。替代地，所述生物樣本可包含來自受試者的mRNA分子或基因組DNA分子。優選的生物樣本為用常規方法從受試者分離到的外周血淋巴細胞。
另一實施方案中，所述方法進一步還包括從對照受試者獲得對照用生物樣本，讓對照生物樣本與能夠檢測BAFF-R蛋白、mRNA或基因組DNA的化合物或試劑接觸，從而檢測生物樣本中有無BAFF-R蛋白、mRNA或基因組DNA存在，將對照樣本中BAFF-R蛋白、mRNA或基因組DNA的存在情況與待測樣本中BAFF-R蛋白、mRNA或基因組DNA的存在情況進行比較。
本發明還包括用于檢測生物樣本中BAFF-R存在的試劑盒。例如，該試劑盒可包含可用于檢測生物樣本中BAFF-R蛋白或mRNA的標記化合物或試劑；用于檢測樣本中BAFF-R含量的方法；以及用于將樣本中BAFF-R含量與標準進行比較的方法。所述化合物或試劑可包裝于合適的容器中。所述試劑盒還可進一步包括說明書，該說明書教導如何用該試劑盒檢測BAFF-R蛋白或核酸。
預后分析本發明的診斷方法還可用于鑒定受試者是否患有與異常BAFF-R表達或活性相關的疾病或病癥或者有無患該病的危險。例如本發明所述試驗，如前面的診斷試驗或下列試驗，都可以用于鑒定受試者是否患有與BAFF-R蛋白、核酸表達或活性相關的病癥或者有無患該病的危險，所述病癥例如，自身免疫疾病，如自身免疫溶血性貧血和系統性紅斑狼瘡。替代地，預后分析也可用于鑒定受試者是否患有疾病或病癥或者有無患病危險。因此，本發明提供了一種用于鑒定與異常BAFF-R表達或活性相關的疾病或病癥的方法，其中測試樣本獲自受試者，并檢測其中的BAFF-R蛋白或核酸(例如，mRNA，基因組DNA)，其中有無BAFF-R蛋白或核酸存在是判斷受試者是否患有與異常BAFF-R表達或活性相關的疾病或者有無患該病危險的診斷依據。本發明中“測試樣本”是指從目的受試者中獲取的生物樣本。例如測試樣本可以為生物體液(例如，血清)，細胞樣本或組織。
此外，本發明所述預后分析可用于測定受試者是否可被給藥試劑(例如，激動劑、拮抗劑、肽模擬物、蛋白質、肽、核酸、小分子或其他藥物侯選物)以治療與異常BAFF-R表達或活性相關的疾病或病癥。例如，該方法可用于測定受試者的病癥用試劑效治療。因此，本發明提供了用于測定受試者與異常BAFF-R表達或活性相關的病癥用試劑是否能得到有效治療的方法，該方法包括獲得測試樣本并檢測其中的BAFF-R蛋白或核酸(例如，其中有無BAFF-R蛋白或核酸存在是判斷受試者能否被給藥該試劑來治療與異常BAFF-R表達或活性相關的病癥的診斷依據)。
本發明的方法還用于檢測BAFF-R基因中的基因損傷(genetic lesion)，從而判定帶有損傷基因的受試者是否有患致瘤性疾病或自身免疫疾病的危險，或者正患該病。不同實施方案中，所述方法包括檢測來自受試者的細胞樣本中有無基因損傷存在，該損傷的特征在于至少有1處改變影響BAFF-R蛋白編碼基因的完整性，或者使BAFF-R基因錯誤表達。例如，所述基因損傷可通過確定至少一種下列情況存在來檢測(1)從BAFF-R基因中缺失1個或多個核苷酸；(2)向BAFF-R基因添加1個或多個核苷酸；(3)BAFF-R基因中的1個或多個核苷酸被取代；(4)BAFF-R基因的染色體重排；(5)BAFF-R基因在信使RNA轉錄本水平發生了變化；(6)BAFF-R基因的異常修飾，如基因組DNA的甲基化模式；(7)BAFF-R基因存在有信使RNA轉錄本的非野生型剪接模式；(8)非野生型水平的BAFF-R-蛋白，(9)BAFF-R基因的等位缺失，以及(10)BAFF-R-蛋白的翻譯后的非適當修飾。如本發明所述，本領域中有大量已知試驗技術可用于檢測BAFF-R基因中的損傷。優選的生物樣本是用常規技術從受試者分離到的外周血淋巴細胞樣本。但是，任何一種含有核細胞的生物樣本都可使用，包括，例如，口腔粘膜細胞。
某些實施方案中，所述損傷的檢測涉及在聚合酶鏈反應(PCR)中使用探針/引物(見，例如，美國專利4,683,195和4,683,202)，所述PCR如錨定PCR或RACE PCR，或者，替代地，連接酶鏈反應(LCR)(見，例如，Landegranet al.(1988)Science 2411077-1080；和Nakazawa et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91360-364)，其中后者可具體用于檢測BAFF-R-基因中的點突變(見Abravaya et al.(1995)Nucl.Acids Res.23675-682)。該方法包括下列步驟收集患者的細胞樣本；從樣本的細胞中分離核酸(例如，基因組核酸，mRNA或者二者均有)，使該核酸樣本與一個或多個引物接觸；這些引物能夠在使BAFF-R基因(如果存在)能發生雜交或擴增的條件下與BAFF-R基因雜交；檢測有無擴增產物存在，或者檢測擴增產物的大小并與對照樣本比較長度。可以想到的是，可期望PCR和/或LCR用做與檢測本發明所述突變的任一技術聯用時的一預先擴增步驟。
可替代地擴增方法包括自我維持序列復制(self sustained sepuencereplication)(Guatelli et al.，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 871874-1878)，轉錄擴增系統(Kwoh，et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 861173-1177)，Q-β復制酶(Replicase)反應(Lizardi et al.(1988)BioTechnology 61197)或任一其他核酸擴增方法，然后用本領域技術人員已知的方法檢測擴增到的分子。如果核酸分子存在的數目極少，那么這些檢測方案特別適用于這樣的核酸分子的檢測。
替代的實施方案中，來自樣本細胞的BAFF-R基因中的突變可以通過限制性酶切割模式的變化來鑒定。例如，分離樣本DNA和對照DNA，擴增(可任選)，用一種或多種限制性內切酶消化，通過凝膠電泳測定片段長度并加以比較。樣本DNA和對照DNA間片段大小的差異表明樣本DNA中存在突變。另外，可使用序列特異性核酶(參見，例如，美國專利5,493,531)通過核酶切割位點的產生或缺失來判定特異性突變的存在。
另一實施方案中，通過使樣本核酸和對照核酸，例如DNA或RNA，與含成百或成千個寡核苷酸探針的高密度陣列雜交，檢測BAFF-R中的基因突變(Cronin et al.(1996)Human Mutation 7244-255；Kozal et al.(1996)NatureMed.2753-759)。例如，BAFF-R中的基因突變可用含發光的DNA探針的二維陣列來檢測，對此的描述見Cronin et al.(1996)Human Mutation 7244-255。簡而言之，用第一雜交陣列的探針對樣本和對照中的DNA長段序列進行篩選，通過制備連續重疊探針的線性陣列鑒定序列間的堿基變化。該步驟可用來檢測點突變。該步驟后接著用第二雜交陣列，通過使用較小的互補于所有所檢測的變體或突變的特異性探針陣列顯示特異性突變的特征。每一突變陣列由多組平行的探針組成，每組探針中的一個探針與野生型基因互補，另一個與突變基因互補。
另一實施方案中，本領域已知的多種測序反應中的任一種都可用于直接測序BAFF-R基因，并通過將樣本BAFF-R序列與相應的野生型(對照)序列比較來檢測突變。測序反應的實例包括以下列文獻中技術為基礎的測序反應Maxim和Gilbert(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74560或Sanger(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 745463。還可以預見的是當實施診斷性試驗時，多種自動測序方法中的任一種都可使用(Naeve etal.(1995)Biotechiziques 19448)，包括質譜法測序(見，例如，PCT國際公開號為WO 94/16101的專利申請；Cohen et al.(1996)Adv.Chromatogr.36127-162；和Griffin et al.(1993)Appl.Biochem.Biotechnol.38147-159)。
其他用于檢測BAFF-R基因中突變的方法包括用能否免受切割試劑切割的方法來檢測RNA/RNA或RNA/DNA異源雙鏈中的錯配堿基(Myers etal.(1985)Science 2301242)。通常，本領域“錯配切割”技術首先需要使含野生型BAFF-R序列的(標記的)RNA或DNA與獲自組織樣本的可能突變的RNA或DNA雜交形成異源雙鏈。用試劑處理得到的雙鏈雙螺旋，該試劑能夠切割雙螺旋中的單鏈區，如由于對照和樣本鏈間的堿基對錯配而存在的單鏈區。例如，RNA/DNA雙螺旋可用RNase處理，DNA/DNA雜合體可用S1核酸酶處理，以酶促消化錯配區。其他實施方案中，DNA/DNA或RNA/DNA雙螺旋二者都可用羥胺或四氧化鋨以及用哌啶處理以消化錯配區。錯配區被消化后，用變性聚丙烯酰胺凝膠將上述得到的材料根據大小分離開來從而測定出突變的位點。參見，例如，Cotton et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 854397；Saleeba et aL(1992)Methods Enzymol.217286-295。一個實施方案中，可標記對照DNA或RNA用于檢測。
另一個實施方案中，所述錯配切割反應可在特定系統中使用一種或多種能識別雙鏈DNA中錯配堿基對的蛋白(故稱為″DNA錯配修復″酶)來檢測獲自細胞樣本的BAFF-R cDNAs中的點突變并作圖。例如，大腸桿菌的mutY酶能切割G/A錯配中的A，來自HeLa細胞的胸苷DNA糖基化酶可切割G/T錯配中的T(Hsu et al.(1994)Carcinogenesis 151657-1662)。根據范例性實施方案，使基于BAFF-R序列，例如野生型BAFF-R序列的探針與來自待測細胞的cDNA或其他DNA產物雜交。用DNA錯配修復酶處理得到的雙螺旋，如果有切割產物的話，該產物可用電泳或類似的方法來檢測。參見，例如，美國專利5,459,039。
其他實施方案中，用電泳遷移率的變化來檢測BAFF-R基因中的突變。例如，可用單鏈構象多態性(SSCP)來檢測突變體和野生型核酸間電泳遷移率的差異(Orita et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 862766，還參見Cotton(1993)Mutat.Res.285125-144；Hayashi(1992)Genet.Anal.Tech.Appl.973-79)。把樣本和對照BAFF-R核酸的單鏈DNA片段變性，并使其復性。單鏈核酸的二級結構因序列不同而不同，電泳遷移率出現的變化使得即使只有1個堿基改變也能被檢測出來。可DNA片段標記或者用標記探針來檢測。可通過使用RNA(而不是DNA)來提高檢測的敏感度，這是由于RNA的二級結構對序列中的變化更敏感。一個實施方案中，本發明所述方法使用異源雙鏈分析，根據電泳遷移率的變化將雙鏈異源雙鏈分子分離開來(Keen et al.(1991)Trends Genet.75)。
另一個實施方案中，用變性梯度凝膠電泳(DGGE)方法(Myers etal.(1985)Nature 313495)，在含梯度變性劑的聚丙烯酰胺凝膠中分析突變體或野生型片段的移動。用DGGE作為分析方法時，要修飾DNA以確保其不致完全變性，例如通過PCR添加約40bp的富含GC的高熔點DNA即GC夾子(clamp)。另一個實施方案中，用溫度梯度取代變性梯度來鑒別對照和樣本DNA間遷移率的差異(Rosenbaum和Reissner(1987)Biophys.Chem.26512753)。
其他用于檢測點突變的實例包括，但不限于，選擇性寡核苷酸雜交，選擇性擴增，或選擇性引物延伸。例如，制備寡核苷酸引物，將已知突變置于其中心，然后使其在只有出現最佳匹配時才雜交的條件下與目標DNA雜交(Saiki et al.(1986)Nature 324163)；Saiki et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 866230)。當寡核苷酸結合到雜交膜并與標記的目的DNA雜交時，所述等位基因特異性寡核苷酸雜交于PCR擴增的目的DNA或大量不同的突變。
替代地，取決于選擇性PCR擴增的等位基因特異性擴增技術可與本發明結合使用。用作特異性擴增的引物的寡核苷酸可將目標突變帶入分子中心(以便使擴增取決于示差雜交)(Gibbs et al.(1989)Nucl.Acids Res.172437-2448)或者在一個引物的3′最末端，在合適的條件下，防止錯配，或減少聚合酶延伸(Prossner(1993)Tibtech 11238)。此外，還期望在突變區導入新的限制性位點以創造出以切割為基礎的檢測(Gasparini et al.(1992)Mol.Cell.Probes 61)。可以預料的是，在一些實施方案中，還可使用擴增用的Taq連接酶實施擴增反應(Barany(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88189)。這些情況下，如果在5′序列的3′末端存在有最佳匹配時才會發生連接反應，這樣就使得有可能通過查找有無擴增發生來檢測特異位點有無已知突變發生。
本發明所述方法可通過，例如，用預包裝好的診斷試劑盒來實施，所述試劑盒中包含至少1種本發明所述的探針核酸或抗體反應物，該試劑盒可方便地用于如臨床，對表現出BAFF-R基因相關疾病的癥狀或有該疾病家族史的患者進行診斷。
另外，任一類型的表達BAFF-R的細胞或組織都可用于本發明所述預后分析。但是，任一種含有核細胞的生物樣本都可使用，包括，例如，口腔粘膜細胞。
藥物基因組學經本發明所述篩選試驗鑒定出的對BAFF-R活性(例如，BAFF-R基因表達)具有刺激或抑制作用的試劑或調節劑，可用來向個體給藥治療(預防或治療)疾病(例如，癌相關疾病或自身免疫疾病)。可考慮將個體的藥物基因組學(即對個體基因型與該個體對外來化合物或藥物應答之間的關系進行的研究)與所述治療結合使用。由于改變劑量與藥理活性藥物血濃度間的關系，治療物代謝的差異能引發嚴重的毒性反應或導致治療失敗。因此，用個體藥物基因組學可根據個體的基因型篩選出用于預防或治療的有效試劑(例如，藥物)。所述藥物基因組學還可進一步用于測定合適的劑量和治療方案。因此，可對個體的BAFF-R蛋白活性、BAFF-R核酸表達或BAFF-R基因突變范圍進行測定從而篩選出合適的試劑用于預防或治療個體。
藥物基因組學涉及的是，由于受影響的人體內藥物分布的變化及異常的作用而導致的臨床上具有重要意義的藥物應答方面的遺傳性差異。參見，例如，Eichelbaum(1996)Clin.Exp.Pharmacol.Physiol.23983-985和Linder(1997)Clin.Chem.43254-266。通常，兩種藥物遺傳疾病可被區分。因為改變了藥物作用于機體的途徑(改變了藥物作用)這一單一因素而被傳遞的遺傳疾病或者由于改變了機體作用于藥物的途徑(改變了藥物代謝)這一單一因素而被傳遞的遺傳疾病。這些藥物遺傳疾病或者是因為罕見的缺陷或者是因為多態性而發生。例如，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)缺陷是一種常見的遺傳性酶病，該病的主要臨床并發癥是攝取了氧化劑藥物(抗-瘧疾藥物、磺胺藥物、止痛藥、硝基呋喃)和蠶豆后的溶血反應。
作為解釋性實施方案，藥物代謝酶活性是藥物作用強度和作用時間的決定因素。藥物代謝酶(例如，N-乙酰轉移酶2(NAT2)和細胞色素P450酶CYP2D6和CYP2C19)的基因多態性的發現為下述現象提供了解釋為什么一些患者在服用了標準及安全劑量的藥物后沒有獲得期望的藥效或者表現出超乎尋常的藥物應答和嚴重的毒性。這些多態性在群體中表現為兩個表型，強代謝者(extensive metabolizer)(EM)和弱代謝者(poor metabolizer)(PM)。不同群體中PM的分布(prevalence)不同。例如，編碼CYP2D6的基因高度多態并且在PM中已鑒定出數個突變，這些都導致功能性CYP2D6的缺乏。CYP2D6和CYP2C19的弱代謝者當服用了標準劑量時極常表現出超乎尋常的藥物應答及副反應。如果代謝物是活性治療單元，PM就不表現治療應答，這一現象也表現在可待因的止痛效果上，所述可待因的止痛效果要通過其CYP2D6-形成的代謝物嗎啡來介導。另一個極端是所謂的超-快速代謝者，它們不應答標準劑量。近來，超-快速代謝的分子基礎已被鑒定為由于CYP2D6基因的擴增。
因此，可對個體的BAFF-R蛋白活性、BAFF-R核酸表達或BAFF-R基因的突變范圍進行測定從而選擇出可對該個體有效治療或預防的合適藥劑。此外，可利用藥物遺傳學研究將編碼藥物代謝酶的多態性等位基因的基因型用于鑒定個體的藥物應答表型。這一知識，當用于確定劑量或進行藥物選擇時，可避免副反應或治療失敗，因而當用BAFF-R調節劑處理受試者時可提高治療或預防的效力，如本發明所述的一種范例性篩選試驗鑒定出的調節劑。
監測臨床效能監測試劑(例如，藥物、化合物)對BAFF-R表達或活性的影響(例如，調控異常細胞增殖和/或分化的能力)不僅可用于基礎藥物篩選，還可用于臨床試驗。例如本發明所述篩選試驗測定的試劑在增加BAFF-R基因表達、蛋白水平或上調BAFF-R活性方面的有效性，可用對表現出BAFF-R基因表達下降、蛋白水平降低或BAFF-R活性下調的受試者進行臨床試驗來監測。替代地，篩選試驗測定的試劑在減弱BAFF-R基因表達、下調蛋白水平或BAFF-R活性方面的有效性，可用對表現出BAFF-R基因表達增加、蛋白水平升高或BAFF-R活性上調的受試者進行臨床試驗來監測。在這些臨床試驗中，BAFF-R的表達或活性以及，優選，參與疾病的其他基因，可作為特定細胞的免疫應答的“指示(read out)”或標記。
例如，可以鑒定這樣的基因，包括BAFF-R，所述基因即當用能調控BAFF-R活性(經本發明所述篩選試驗鑒定)的試劑(例如，化合物、藥物或小分子)進行處理時能夠在細胞中得到調控的基因。因此，為了研究試劑對細胞增殖紊亂的影響，例如在臨床試驗中，可以分離細胞，制備RNA，分析BAFF-R和參與疾病的其他基因的表達水平。基因表達水平(即，基因表達模式)可用Northern印跡試驗或RT-PCR定量，如本發明所述，或者替代地用本發明所述方法中的一種測定所產生蛋白的量，或者測量BAFF-R或其他基因的活性水平。在這種情況下，基因表達模式可作為標記，指示細胞對試劑的生理應答。因此，可以在用試劑對個體處理之前或處理過程中的不同時間點對該應答狀態進行測定。
一個實施方案中，本發明提供了一種用于監測試劑(例如，激動劑、拮抗劑、蛋白質、肽、肽模擬物，核酸、小分子、或本發明所述篩選試驗鑒定到的其他候選藥物)對受試者治療有效性的方法，該方法包括下列步驟(i)在給藥試劑前從受試者獲取給藥前樣本；(ii)檢測給藥前樣本中的BAFF-R蛋白、mRNA、或基因組DNA的表達水平；(iii)從受試者獲取一份或多份給藥后樣本；(iv)檢測給藥后樣本中BAFF-R蛋白、mRNA或基因組DNA的表達或活性水平；(v)將給藥前樣本中BAFF-R蛋白、mRNA或基因組DNA的表達或活性水平與給藥后樣本進行比較；以及(vi)據此來調整受試者的試劑給藥量。例如，期望通過增加試劑給藥量來將BAFF-R的表達或活性提高到比檢測前更高的水平，即，提高試劑的有效性。替代地，可通過減少試劑給藥量來將BAFF-R的表達或活性減少到比檢測前更低的水平，即，減弱試劑的有效性。
治療方法本發明提供了一種預防及治療方法，該方法對有患與異常BAFF-R表達或活性有關的疾病的危險(或易患該疾病)或者患有該疾病的受試者進行處理。
特征在于水平或生物活性增高(相對于未患所述疾病或病癥的受試者而言)的疾病或病癥可用拮抗(即，減弱或抑制)活性的治療物處理。拮抗活性的治療物可以治療或預防方式給藥。可利用的這類治療物包括，但不限于，(i)BAFF-R多肽或者其類似物、衍生物、片段或同系物；(ii)抗BAFF-R肽的抗體；(iii)編碼BAFF-R肽的核酸；(iv)給藥反義核酸以及用“功能不良的(dysfunctional)”核酸(即，由于BAFF-R肽編碼序列中的異源插入)通過同源重組來“敲除”內源功能性BAFF-R肽(見，例如，Capecchi(1989)Science 2441288-1292)；或者(v)能改變BAFF-R肽與其結合配偶體間相互作用的調節劑(即，抑制劑、激動劑及拮抗劑，包括本發明所述的額外的肽模擬物或者特異于本發明肽的抗體)。
特征在于水平或生物活性減弱(相對于未患該疾病或病癥的受試者而言)的疾病及病癥可用能增強(即，有激動作用)活性的治療物來治療。可以治療或預防的方式來給藥可上調活性的治療物。可使用的這樣的治療物包括，但不限于，BAFF-R肽或者其類似物、衍生物、片段或同系物；或者能增強生物利用率的激動劑。
水平的增加或減少可通過對肽和/或RNA定量很容易地檢測出來，即獲取患者組織樣本(例如，來自活組織檢查)，體外測定RNA或肽的水平、所表達肽(或BAFF-R肽的mRNAs)的結構和/或活性。本領域熟知的方法包括，但不限于，免疫檢測法(例如，通過Western印跡試驗，免疫沉淀和之后的十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳，免疫細胞化學，等)和/或雜交試驗檢測mRNAs的表達(例如，Northern試驗，點印跡，原位雜交，等)。
一方面，本發明提供了一種方法，該方法通過向受試者給藥能調控BAFF-R表達或至少1種BAFF-R活性的試劑，來防止受試者患上與異常BAFF-R表達或活性相關的疾病或病癥。有患因異常BAFF-R表達或活性所引發或導致的疾病危險的受試者可通過，例如，本發明所述任一診斷試驗或預測試驗或其結合來鑒定。可在特征在于BAFF-R異常的癥狀出現之前給藥預防藥物，從而防止疾病或病癥，或者延緩其進展。根據BAFF-R異常的類型，例如，可用BAFF-R激動劑或BAFF-R拮抗劑來治療受試者。合適試劑可根據本發明所述篩選試驗來測定。
本發明另一方面涉及為治療目的而調控BAFF-R表達或活性的方法。本發明所述調控方法包括讓細胞與能調控與該細胞相關的一種或多種BAFF-R蛋白活性試劑接觸。能調控BAFF-R蛋白活性的試劑就可作為本發明所述試劑，例如核酸或蛋白質、天然生成的BAFF-R蛋白相應配體、肽、BAFF-R肽模擬物或其他小分子。一個實施方案中，所述試劑刺激BAFF-R蛋白的一種或多種活性。這類刺激試劑的實例包括活性BAFF-R蛋白和已導入細胞的編碼BAFF-R的核酸分子。另一實施方案中，所述試劑抑制BAFF-R蛋白的一種或多種活性。這類抑制試劑的實例包括反義BAFF-R核酸分子和抗-BAFF-R抗體。這些調控方法可體外進行(例如，將細胞與試劑一起培養)或者，可替代地，在體內進行(例如，向受試者給藥該試劑)。因此，本發明提供了對患有特征在于BAFF-R蛋白或核酸分子表達或活性異常的疾病或病癥的個體進行治療的方法。一個實施方案中，所述方法包括給藥試劑(例如，用本發明篩選試驗鑒定的試劑)，或與能調控(例如，上調或下調)BAFF-R表達或活性的試劑聯用。另一實施方案中，所述方法包括給藥BAFF-R蛋白或核酸分子作為治療補償BAFF-R表達或活性的減少或異常。
一個實施方案中，本發明提供了使用BAFF-R的方法。這類方法中包括用BAFF-R多肽抑制動物體內B細胞生長、樹突狀細胞-介導的B細胞的生長及成熟或者免疫球蛋白生成的方法，所述多肽至少包含BAFF-R的BAFF結合部分。其他實施方案包括用BAFF-R多肽刺激動物體內B細胞生長、樹突狀細胞-介導的B細胞的生長及成熟或者免疫球蛋白生成的方法(例如用能有效表達BAFF-R的載體轉染BAFF-R缺陷細胞，或者給藥能結合BAFF-R的抗體及模擬BAFF)。
另一實施方案中，本發明提供了用BAFF-R治療下列疾病的方法自身免疫疾病、高血壓、心血管病、腎功能紊亂、B-淋巴細胞增生疾病、免疫抑制疾病、器官移植，以及HIV。本發明還提供了用試劑治療、抑制或改變涉及BAFF-R和其配體間信號通路的免疫應答的方法，本發明還提供了通過給藥特異于BAFF-R或其表位的抗體抑制炎癥的方法。
優選通過給藥治療有效量的BAFF-R多肽、含融合到異源氨基酸序列的BAFF-R多肽的嵌合分子，或抗-BAFF-R抗體同系物，實施本發明所述方法。一個實施方案中，本發明提供了藥物組合物，其中包括BAFF-R多肽和藥物學上可接受的賦形劑。
另一實施方案中，本發明提供了含有融合有異源多肽或氨基酸序列的BAFF-R多肽的嵌合分子。所述嵌合分子的實例包括將BAFF-R融合于免疫球蛋白Fc區或表位標簽序列。
另一實施方案中，本發明提供了可與BAFF-R多肽特異性結合的抗體。任選地，該抗體為單克隆抗體。
本發明的一個實施方案是通過向哺乳動物給藥治療有效量的含BAFF-R拮抗劑的組合物，治療哺乳動物的與不期望的細胞增生相關的疾病，其中所述的BAFF-R拮抗劑包括可拮抗BAFF-R與其相應受體間相互作用的多肽以及藥物學上可接受的賦形劑。
優選實施方案中，細胞表面BAFF的相應受體為BAFF-R。
所述方法可使用具有可拮抗BAFF-R與其相應受體間相互作用的多肽的任一BAFF-R拮抗劑。BAFF-R拮抗劑的實例包括但不限于可溶性BAFF-R多肽、可溶性嵌合BAFF-R分子，包括但不限于BAFF-R-IgG-Fc和抗-BAFF-R抗體同系物。
本發明所述方法可用于與不期望的細胞增生相關的任一疾病。具體而言，本發明的方法可用于治療表達BAFF和/或BAFF-R的腫瘤細胞。
其細胞增生可被BAFF調控的癌癥的實例可以通過體外測量腫瘤組織文庫中BAFF和/或BAFF-R信使的表達水平篩選出來。其中BAFF和/或BAFF-R信使高表達的腫瘤組織文庫可作為侯選者。替代地，可用例如全長人源BAFF cDNA序列搜索公共及私人數據庫(即，Incyte數據庫)來篩選侯選者。
本發明所述的用于治療不期望的細胞增生相關疾病的BAFF-R拮抗劑，具體而言就是腫瘤的拮抗劑，可有利地抑制腫瘤細胞生長10％以上，20％以上，30％以上或40％以上，最有利地50％以上。所述BAFF-R拮抗劑可篩選獲得。例如，可根據對人結腸癌HT29或對人肺癌A549的生長抑制活性(即，超過10％，20％，30％，40％或50％的抑制)來篩選BAFF-R拮抗劑，人結腸癌HT29和人肺癌A549分別來自結腸腫瘤和肺腫瘤。
本發明的另一實施方案，提供了用上述那些BAFF-R多肽抑制動物體內B細胞和非B細胞生長、樹突狀細胞-介導的B細胞生長及成熟或者免疫球蛋白生成的方法。
所述的抑制B細胞和非B細胞的生長、樹突狀細胞-介導的B細胞的生長及成熟或者免疫球蛋白生成的方法還可包括給藥抗-BAFF-R抗體(多克隆或單克隆)，該抗體能結合BAFF-R并且能抑制BAFF與BAFF-R的結合。給藥該抗體從而抑制B細胞和非B細胞生長、樹突狀細胞-介導的B細胞的生長及成熟或者免疫球蛋白的生成。適于使用的抗體的量可以從本發明提供的體內數據推算出來。本領域已知多種從動物試驗推算劑量的方法，包括，例如，根據體重或體表面積推算。
本發明一些實施方案中，BAFF-R:Fc多肽或抗-BAFF-R抗體的給藥量為約1-20mg/kg/劑。所用劑量可一周二次給予，一周一次給予，每兩周一次或者一月一次給予，根據需要而定。臨床醫師可以在療效與減少副作用兩方面平衡來確定合適的劑量。
另一實施方案中，本發明提供了使用了BAFF-R或抗-BAFF-R抗體治療下列疾病的方法自身免疫疾病、高血壓、心血管病、腎功能紊亂、B-淋巴細胞增生疾病、免疫抑制疾病、器官移植，炎癥以及HIV。本發明還提供了用試劑治療、抑制或改變涉及BAFF-R和其配體間信號通路的免疫應答的方法。
抑制所表達的蛋白(包括BAFF-R和BAFF-R:Fc)凝集的方法本發明還提供了用于抑制或減弱表達蛋白凝集的方法，具體為人BAFF-R或huBAFF-R:Fc，這些表達蛋白在表達過程中有凝集傾向，阻止高產量純化。本發明的方法中，將在重組系統表達時有凝集傾向的蛋白的氨基酸序列與表現較弱凝集活性的所述蛋白的同系物的氨基酸序列進行比較。這兩種同系物具有保守區域，非保守氨基酸位于保守區域之間或者散布于區域之內。通常，可將凝集蛋白中的至少1個非保守氨基酸取代為同系物中的氨基酸以減弱凝集。一些實施方案中，非極性氨基酸可被取代。非極性氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸及半胱氨酸。一些實施方案中，非極性氨基酸取代其他非極性氨基酸。抑制或減弱凝集的優選非極性氨基酸為脯氨酸及丙氨酸。其他實施方案中，不帶電荷的極性氨基酸被取代為非極性氨基酸。不帶電荷的極性氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸以及酪氨酸。
本發明的方法中，所作的取代優選使該蛋白保留生物活性。通常，非-保守氨基酸允許取代而不會明顯地影響生物活性。
本發明所述方法的一個具體實施例中，人BAFF-R蛋白可有這樣的氨基酸取代，在SEQ ID NO5的V20，P21，A22和L27(或SEQ ID NO10的V41，P42，A43和L48)位置上導入氨基酸取代或其不同組合，這些取代可大大減弱蛋白的凝集。類似策略可用于其他當用重組系統表達時有凝集傾向的蛋白。盡管不希望受到任何具體操作理論的限制，但是可確信的是用不帶電的極性氨基酸取代非極性氨基酸會賦于該蛋白溶解性，并阻礙蛋白間非極性區域的凝集。
本發明不僅限于本發明所述具體實施方案的范圍。實際上，除本發明描述之外，對本發明的各種改進本領域技術人員都可以從上述說明書及附圖中顯而易見地獲知。這些改動都落在所附權利要求請求保護的范圍之內。
實施例實施例1本實施例描述了BAFF-R，BAFF的一種新受體的分子克隆。
材料和方法從BJAB細胞中制備寡聚-dT引導的cDNA文庫，并將該文庫定向克隆入表達載體CH269，所述BJAB細胞是一種能結合人BAFF的人B細胞系。CH269是pCEP4(Invitrogen)的衍生物，其中包含驅動所克隆的DNA表達的CMV啟動子，還包含EBV的oriP。這使得這些質粒能在EBNA-1穩定轉化的細胞中多拷貝自動復制，例如在293EBNA中。可將上述BJAB cDNA文庫轉染入大腸桿菌DH10B細胞中，并種植于96孔板中，形成每孔約2500個獨立克隆的庫。用Qiagen BioRobot 9600從這些庫中制備DNA。用Lipofectamine(Life Technologies)將該DNA庫轉染入種植在纖連蛋白包被的6孔培養皿中的293EBNA細胞中。轉染后48小時，去除培養基，用平板檢測洗滌緩沖液(20mM HEPES，0.5mg/ml牛血清白蛋白，0.1％NaN3)洗滌細胞。用含有100mg/ml生物素標記的人重組可溶性mycBAFF(myc-huBAFF)的結合緩沖液(PBS，2％胎牛血清，0.1％NaN3)覆蓋細胞單層，室溫下孵育1小時。試驗中使用的myc-huBAFF(136-285位的氨基酸)表達于巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris)，用陰離子交換層析純化后再凝膠過濾純化。
除去BAFF溶液，洗滌細胞，用含1.8％甲醛-0.2％戊二醛的PBS溶液孵育5分鐘固定細胞。再次洗滌細胞，將偶聯有堿性磷酸酶的鏈霉親和素(SAV-AP)(Jackson ImmunoResearch)原液以1∶3000稀釋于結合緩沖液，然后用其孵育細胞30分鐘。
洗滌細胞，用固紅/奈酚磷酸鹽(Pierce)染色。可通過低倍顯微鏡下觀察時紅色沉淀物存在，鑒定出結合有生物素-BAFF/SAV-AP復合物的細胞。二級篩選要作的是從BAFF結合庫的DH10B甘油儲存物中挑出多個單克隆，接種培養100個庫，然后重復上述BAFF結合試驗。類似地，將二級篩選陽性庫分散為多個單克隆，用上述方法轉染到293EBNA中時測定BAFF結合情況。對獨立的BAFF結合克隆的DNA序列進行測定。
結果BAFF結合克隆中的一個是pJST576。其中含有的插入片段大小為1201個堿基對(bp)但不包括聚-A尾。pJST576插入片段的序列見圖1A(SEQ IDNO1)。該克隆的BLAST分析顯示在Genbank數據庫中與染色體22 BAC克隆HS250D10(登記號Z99716)具有同源性。pJST576全序列出現于該BAC中。還發現該序列與人EST，AI250289(IMAGE克隆2000271)的3′端具有同源性。所述EST制備自人濾泡性淋巴瘤文庫。ESTAI250289獲自Incyte，并測定了插入片段的序列(圖1B)(SEQ ID NO2)。該序列將15bp的5′端序列添加到了pJST576序列上，該序列與基因組序列鄰接，而長23bp的序列，不與基因組序列鄰接。EST序列其余的部分與pJST576具有理想的同源性。這些克隆中未鑒定到開放閱讀框。
實施例2該實施例中，我們測定出JST576 cDNA中含有內含子，然后我們構建了開放閱讀框。
方法對JST576 cDNA序列運行GENSCAN(Burge，C.& Karlin，S.J.(1997)Mol.Biol.26878-94)外顯子預測程序。該程序預測的結果表明該cDNA中存在有內含子。為了確定該預測是否正確，對來自2個表達JST576的細胞系的第一鏈cDNA進行PCR分析。用RNeasy試劑盒(Qiagen)按照說明書建議的方法，從約107個BJAB或IM-9細胞純化出RNA。對RNA定量，取5μg，用Superscript預擴增試劑盒(Life Technologies)進行第一鏈cDNA反應。用寡聚dT和隨機六聚體制備第一鏈產物。按照推薦的方法合成第一鏈。每一反應物各取3μl，然后用10ng JST576或者不含DNA的試樣作PCR模板，使用位于所預測內含子兩側的寡核苷酸作引物。反應中使用的寡核苷酸為5′寡聚體BAF-225[5′-GGCCGAGTGCTTCGACCTGCT-3′](SEQ IDNO33)或BAF-226[5′-GGTCCGCCACTGCGTGGCCTG-3′](SEQ ID NO34)和3′寡聚體BAF-191[5′-CACCAAGACGGCCGGCCCTGA-3′](SEQ ID NO35)。每一反應體系中包含1×Pfu緩沖液(Stratagene)，200μM dNTPs，10％DMSO，每種寡聚體各150ng，以及1.25單位Turbo Pfu聚合酶(Stratagene)。反應在下列參數下進行35個循環94℃，30秒；60℃，1分鐘；以及72℃，1.5分鐘。每一種反應物各取10μl，在1％瓊脂糖凝膠上電泳。用High PurePCR產物純化試劑盒(Roche Molecular Biochemicals)對來自BJAB和IM-9BAF-225/191反應體系的剩余產物進行純化，對大批產物進行DNA測序。此外，用引物BAF-225和BAF-191，從靜止的B細胞cDNA制備出PCR產物，進行亞克隆，并對單個的克隆進行測序。取5μl靜止的B細胞cDNA(Clontech)用于上文詳述的用BAF-225和BAF-191作為引物的PCR反應中。然后用High Pure PCR產物純化試劑盒純化PCR產物，并濃縮。為了亞克隆上述PCR片段，按推薦的方法用Sure Clone連接試劑盒(Amersham Pharmacia Biotech)將片段的末端磷酸化，并補平。將得到的產物克隆入pBluescriptII(Stratagene)的EcoRV位點，然后轉化大腸桿菌。培養單個克隆，小量制備質粒DNA。對6個單個的克隆進行測序。
結果用GENSCAN程序推測到的JST576的成熟核苷酸序列和氨基酸序列見圖2A(SEQ ID NO3)。來自BJAB和IM9反應體系的PCR產物包含推測內含子顯示于圖2B，這確證了JST576 cDNA克隆中有內含子存在。用BAF-225/BAF-191從JST576 cDNA擴增到的PCR產物的推測長度為約788bp，而用BAF-226/BAF-191時為約767bp。從JST576模板得到的PCR產物大約也是這樣大小(泳道10和11)。用BAF-225/BAF-191從oligo dT引導的BJAB或IM-9第一鏈cDNA得到的PCR產物(泳道2和6)大小相同，并且明顯的小于來自JST576 cDNA的產物。不包含推測內含子的該片段的推測大小為484bp。PCR產物的大小與該推測結果一致。如果用隨機六聚體作引物擴增BJAB或IM-9 RNA得到了同樣的結果(泳道4和8)。使用BAF-226/BAF-191的反應不會在第一鏈cDNA模板上發生。因此，顯然用GENSCAN程序推測的內含子確實存在于JST576 cDNA。從BJAB和IM-9RNA得到的剪接產物的序列可以通過對大批PCR產物測序得到確證，并反映于圖2C(SEQ ID NO4)所示序列中。該序列與圖2A(SEQ ID NO3)所示序列相同，只是沒有第149位核苷酸處的丙氨酸密碼子(GCA)(用小寫字母顯示)。對來自靜止B細胞cDNA RT-PCR反應的6個獨立的克隆測序的結果表明兩個剪接受體位點都已被使用。優選的受體位點是那種能產生1個丙氨酸殘基的產物(6個克隆中的5個是這種情況)。但是，由GENSCAN推測出的含兩個丙氨酸的序列(SEQ ID NO3)，僅出現于在這6個克隆中的1個。因此，人JST576的開放閱讀框已建立，并已確定出單個氨基酸剪接變體。該開放閱讀框預示的是圖2D所示的含184個氨基酸的蛋白質(SEQ ID NO5)。用粗體字表示的丙氨酸(A)殘基代表該剪接變體。該蛋白被稱為BAFF-R。推導出的BAFF-R的氨基酸序列包括一從第72-100位殘基的疏水區域(Hopp-Woods算法)以及一用TMPred算法分析出的從第84-102位殘基的潛在跨膜區段。該區域后面接的是一段高度帶電的氨基酸片段，其功能是作為終止轉移信號。BAFF-R不含N-末端信號序列，是III型膜蛋白，類似于其他的BAFF結合蛋白BCMA(Laabi et al.(1992)EMBO J.113897-3904)和TACI(von Bulow和Bram，(1997)Science 278138-141)。N-末端被推測為是BAFF-R的胞外區，在第19～35位殘基的部位含4個半胱氨酸基序，這一點與TNF受體家族其他任一成員都不同。BAFF-R的C-末端被推測為胞內區。
實施例3該實施例中，我們測定了人BAFF-R中推定的起始蛋氨酸上游的DNA序列，人BAFF-R包含框內終止密碼子。
方法根據BAC HS250d10(Genbank登記號Z99716)中出現于推定的ATG上游的基因組序列，設計引物BAF-254(5′GGGCGCCTACAATCTCAGCTA3′)(SEQ ID NO36)，并將其與寡聚體BAF-236(5′GGCGGACCAGCAGGTCGAAGCACTC 3′)(SEQ ID NO37)一起用于PCR擴增反應。該反應所用模板為第一鏈cDNA，該cDNA是用PCR預擴增試劑盒按照廠家推薦方法(LifeTechnologies)從人脾RNA(Clontech)制得的。PCR反應體系中包括3μl第一鏈反應物，1×Pfu緩沖液(Stratagene)，10％DMSO，0.2mM dNTPs，每一引物各150ng，以及1.25單位的Pfu Turbo聚合酶(Stratagene)。遵照產品說明用High Pure PCR產物純化試劑盒(Roche Molecular Biochemicals)純化上述PCR產物。用Sure Clone連接試劑盒(Amersham Pharmacia Biotech)將該PCR產物末端補平，并進行末端磷酸化，并將該產物克隆入pBSK2(Stratagene)的EcoRV位點，然后轉化DH5細胞。用Wizard系統(Promega)小量制備連接反應得到的克隆，然后用ABI儀器測序。
結果對PCR產物的測序證實了mRNA中包含有這樣的序列，即包含于基因組序列中直接位于ATG上游的序列。該序列為圖3所示序列的下劃線部分。框內上游終止密碼子的存在以及其它蛋氨酸的缺如表明，JST576 cDNA中發現的蛋氨酸是真正的起始蛋氨酸。
實施例4該實施例描述了小鼠BAFF-RcDNA的克隆。
方法按照廠商的詳細說明，從購自Stratagene(La Jolla，CA)的小鼠A20細胞系cDNA文庫中，篩選約1百萬個噬菌體噬斑。用EcoNI消化JST576人BAFF-R cDNA，并在1％低熔點凝膠上電泳。切下含425bp片段的凝膠條，稱重。加入3倍體積的水，將該凝膠條煮沸5分鐘。然后用50μCi32P-dCTP(Amersham)標記該片段，所用的反應體系包括50mM Tris pH8，5mM MgCl2，10μM(β-巰基乙醇，200mM HEPES pH6.5，20μM dNTPs(dCTP除外)，0.27單位pd(N)6六聚核苷酸(Amersham Pharmacia Biotech)以及1單位Klenow酶(USB)，室溫過夜。該探針以每毫升探針約1百萬個噬斑的量與濾膜一起在噬菌斑篩選緩沖液中(50mM Tris，1％SDS，1M NaCl，0.1％硫代硫酸鈉，0.2％PVP，0.2％Ficoll，0.2％BSA)65℃過夜孵育。50℃下，用2XSSC和0.1％SDS漂洗濾膜1.5小時(3×2升)，然后對X-線膠片曝光兩天。這樣鑒定出約36個陽性噬菌斑，對其中6個噬菌斑進行了噬菌斑純化。用Stratagene詳述的體內剪切方法釋放出噬菌粒。培養所獲得的克隆，然后小量制備DNA(Qiagen)。并對cDNA克隆測序。
結果小鼠BAFF-R共有核苷酸序列見圖4A(SEQ ID NO8)，共有氨基酸序列見圖4B(SEQ ID NO9)。其中的3個克隆缺失了鼠BAFF-R胞內區的第119～129位的10個氨基酸。將人BAFF-R與小鼠BAFF-R的序列進行比對顯示胞外區中的4個半胱氨酸殘基是保守的，起始的蛋氨酸的位置是類似的，人和小鼠該蛋白的C-末端區域高度保守(圖4C)，最后的24個殘基是相同的。這些序列的全長有約56％的同一性。
實施例5該實施例中，描述了人重組可溶性BAFF能夠與用pJST576和GFP報告質粒共轉染后的細胞結合。
材料和方法報告質粒編碼膜錨定GFP分子，使得可從非轉染細胞中鑒定出轉染細胞。用該報告質粒和pJST576共轉染293EBNA細胞，所使用的轉染試劑為Lipofectamine 2000(Life Technologies)。轉染后18-20小時，用含5mM EDTA的PBS緩沖液將細胞從平板上解離下來，并計數。用FACS緩沖液(PBS中含10％胎牛血清，0.1％NaN3)洗滌細胞兩次，將生物素標記的myc-huBAFF以8ng/ml至5μg/ml濃度范圍稀釋于FACS緩沖液，取2.5×105個上述細胞，與該稀釋液在冰上孵育1小時。用FACS緩沖液洗滌孵育后的細胞，在鏈霉親和素-藻紅蛋白偶聯物的儲存液(SAV-PE)(JacksonImmunoResearch)以1∶100稀釋后，再用該稀釋液孵育細胞30分鐘。然后用FACS緩沖液再次洗滌細胞，并將其重懸于含1％多聚甲醛的FACS緩沖液中。通過FACS分析細胞的GFP及PE熒光，將得到的數據繪制成4象限的點圖。右側兩個象限中的點代表表達有轉染報告物GFP的細胞。上面兩個象限中的點代表通過SAV-PE所顯示的結合作用結合了生物素標記的myc-huBAFF的細胞。右上象限中的細胞是轉染后的細胞，該細胞結合了生物素標記的myc-huBAFF。
結果未被染色的細胞以及只被SAV-PE染色的細胞中，約50％為GFP陽性，已經被報告質粒共轉染(圖5)。當被GFP報告物和pJST576共轉染的細胞用1μg/ml生物素標記的myc-huBAFF染色時，右下象限內的細胞幾乎全部都上移，這表明這些細胞結合了BAFF。如果用表達huTACI的質粒代替pJST576進行共轉染，可得到類似的結果。已知huTACI能結合BAFF。將生物素標記的myc-huBAFF在5μg/ml～8ng/ml范圍內5倍稀釋，用得到的系列稀釋液染色細胞，隨著生物素化的myc-huBAFF濃度降低，上述細胞的上移程度減弱。
實施例6該實施例中，描述了人重組可溶性BAFF或小鼠重組可溶性BAFF能夠與用pJST576和GFP報告質粒共轉染后的細胞結合。
材料和方法按照實施例5描述共轉染293EBNA。轉染后18-20小時，移出細胞，并計數，染色進行FACS分析，與實施例5類似，僅作下述改動。將所述細胞置于冰上用5μg/ml小鼠或人重組可溶性標簽-BAFF孵育1小時。洗滌，然后用5μg/ml抗-標簽單克隆抗體M2(Sigma Aldrich)孵育30分鐘，然后，將PE偶聯的驢抗-小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch)原液作1∶100稀釋，用該稀釋液孵育洗滌后的細胞30分鐘顯色。再次洗滌細胞，用多聚甲醛固定，用FACS分析GFP和PE陽性細胞。
結果約50％細胞為GFP陽性，因而已被報告質粒共轉染(圖6)。當被GFP報告物和pJST576共轉染的細胞用5μg/ml人或小鼠重組可溶性標簽-BAFF染色時，右下象限內的細胞幾乎全部都上移，這表明小鼠和人BAFF都能結合pJST576轉染后的細胞。
實施例7該實施例中，描述了小鼠重組可溶性APRIL與用pJST576和GFP報告質粒共轉染后的細胞不能結合。
材料和方法按照實施例5描述共轉染293EBNA。轉染后18-20小時，移出細胞，計數，染色進行FACS分析，與實施例5類似，僅作下述改動。將所述細胞置于冰上用1μg/ml小鼠重組可溶性myc-APRIL孵育1小時。洗滌，然后用5(g/ml抗-小鼠APRIL單克隆抗體孵育30分鐘，然后，用5μg/ml生物素標記的抗-大鼠IgG2b(Pharmingen)將洗滌后的細胞孵育30分鐘，最后用SAV-PE將洗滌后的細胞孵育30分鐘顯色。再次洗滌細胞，用多聚甲醛固定，用FACS分析GFP和PE陽性細胞。
結果約50％細胞為GFP陽性，因而已被報告質粒共轉染(圖7)。當被GFP報告物和pJST576共轉染的細胞用1μg/ml小鼠myc-APRIL染色時，右下象限內的細胞無一上移，這與用表達人TACI的質粒替代pJST576共轉染的細胞相反。在這些轉染細胞中，幾乎全部細胞都能結合myc-APRIL。此前已表明BAFF與APRIL二者均能結合TACI和BCMA。因此，APRIL不能與pJST576轉染細胞表達的BAFF-R結合這一事實表明BAFF-R與BAFF的結合是特異性的。
實施例8該實施例描述了，當BAFF-R表達自pJST576時其能與重組可溶性人標簽-BAFF免疫共沉淀。
材料和方法用pJST576、用僅作為對照的載體、或者用表達huTACI的作為BAFF結合的陽性對照的質粒，通過Lipofectamine 2000轉染293EBNA細胞。孵育20小時后，吸出轉染培養基，用PBS洗滌細胞，將培養基改換為35S標記的培養基(不含蛋氨酸和半胱氨酸的DMEM 9份與1份完全DMEM混合而成，其中添加了10％透析后的胎牛血清、4mM谷氨酰胺、和100μCi/ml35S蛋氨酸和半胱氨酸(Translabel，ICN Radiochemicals))。將細胞在該培養基中孵育6小時后，除去培養基。用PBS洗滌細胞，然后用250(1提取緩沖液(1％Brij 98，150mM NaCl，50mM Tris pH7.5)溶解細胞。取75μl35S標記的細胞的提取物，使該提取物與含有5μg重組可溶性人標簽-BAFF并添加了10％胎牛血清和0.1％NaN3的1ml DMEM 4℃孵育過夜，進行共-免疫沉淀，加入10μg抗-標簽單克隆抗體M2和蛋白A-Sepharose，繼續孵育2小時。離心收集Sepharose微粒，用FACS緩沖液洗滌，然后重懸于SDS上樣緩沖液，該緩沖液中加有β-巰基乙醇作為還原劑。樣本煮沸5分鐘，簡短離心沉淀Sepharose微粒，分成等份后用SDS-PAGE電泳。用Enlightning(NewEngland Nuclear)孵育凝膠，干燥后，在-80℃對膠片曝光。
結果這種免疫共沉淀將標簽-BAFF通過抗-標簽抗體M2結合到蛋白ASepharose微粒上。這樣也就能把細胞提取物中的任一種可結合標簽-BAFF的蛋白質一起沉淀下來，用放射自顯影的方法檢測這些放射性標記的蛋白質。293EBNA細胞沒有結合BAFF時，空載體顯示該方法固有的背景(圖8)。當轉染TACI的細胞的提取物與標簽-BAFF發生免疫共沉淀時，觀察到一條表觀分子量約34kDa的條帶。這幾乎相當于全長人TACI的推測分子量(31.2kDa)，該TACI蛋白已知能結合BAFF。當pJST576轉染的細胞的提取物與標簽-BAFF發生免疫共沉淀時，觀察到一條表觀分子量約12kDa的條帶。表達自pJST576的BAFF-R的推測分子量為18.9kDa。推測分子量與觀察到的分子量之間的差異可能是由于BAFF-R的電荷或構象引發異常電泳遷移所導致的。另一種解釋是12kDa可能為BAFF-R的蛋白水解片段。
實施例9本實施例描述了可溶型BAFF-R的制備。設計互補于pJST576的寡核苷酸引物，用其進行PCR擴增不含跨膜結構域和胞內結構域的BAFF-R胞外結構域。通常，該部分包含莖干(stalk)的大部分，或者位于配體結合結構域與跨膜結構域之間的氨基酸區。可通過改變所包含的莖干區域的大小使得到的可溶型受體的功效達到最佳。可利用合適的限制性位點來改造該擴增片段，使得各種異源前導序列克隆到該片段5′末端，以及可通過3′末端克隆入各種Ig融合嵌合體融合體載體。替代地，可在BAFF-R胞外結構域的3′末端插入終止信號，制備該受體的可溶形式，或者在無需使用Ig融合嵌合體方法的情況下用另一種C-末端融合配偶體(partner)。另外，可構建由融合配偶體組成的N-末端融合蛋白，所述融合配偶體包含信號序列和其后的BAFF-R的N-末端胞外結構域。得到的載體可在生物工程學中所使用的大多數系統中表達，所述系統包括酵母、昆蟲細胞、細菌和哺乳動物細胞，且對于所有這些類型的表達都有實例。可根據需要附加不同的人Fc結構域來優化或消除FcR及補體的相互作用。替代地，這些Fc結構域的突變形式可用于選擇性地消除FcR或補體的相互作用或將N-連接的糖附加到Fc結構域，從而獲得一些優勢。BAFF-R:Fc融合分子的實例見圖9。該分子包括來自小鼠Ig-k基因的I型前導序列，該序列通過Aat2限制性位點連接于BAFF-R胞外結構域(圖2D所示的第2-71位氨基酸殘基)，該結構域再通過SalI限制性位點連接于人IgG1的Fc結構域。
實施例10該實施例中，我們用Northern印跡分析展示了BAFF-R在人多種組織和細胞系中的表達譜。
材料和方法在合適條件下培養不同的B細胞及非-B細胞系。用RNeasy試劑盒(Qiagen)從約107個細胞中提取RNA。對該RNA進行定量，并且每一樣本各取20μg在1.2％甲醛凝膠上電泳，按照Sambrook et al.MOLECULARCLONINGA LABORATORY MANUAL，1989所述方法。將該凝膠印跡到尼龍膜(BMB)上，然后進行紫外線(UV)交聯。數個人Northern印跡(12泳道多個-組織，人II和免疫系統II)購自Clontech。在65℃，將濾膜置于ExpressHyb(Clontech)緩沖液中預雜交30分鐘，然后與來自JST576 3’端的隨機引導的32P標記的EcoNI片段雜交約3小時。將該濾膜用2X SSC/0.05％SDS室溫下漂洗45分鐘，然后用0.1X SSC/0.1％SDS在50℃漂洗45分鐘。使用2個增光屏將該濾膜對照X-線膠片曝光4天。此外，數個人Northern印跡(12泳道多個-組織，人II和免疫系統II)購自Clontech，與JST576探針雜交，并用上述方法進行處理。
結果在這一檢測水平上，BAFF的mRNA在免疫系統器官中的表達占絕對的優勢。表達水平最高的是脾和淋巴結，但是mRNA還出現在PBLs，胸腺、小腸和結腸(圖10A，B和C)。該信使RNA的大小約為4.5kb；樣本中顯示有兩個mRNA群的基因沒有高表達。這兩群mRNA也存在于脾和淋巴結中。這一點表明BAFF-R具有不同的polyA添加位點，或者RNA經歷了不同的剪接。當檢測多種細胞系有無BAFF-RmRNA存在時，對這一相同的4.5kbmRNA進行了檢測。只有B細胞系表達BAFF-R mRNA(圖11)。在U266、RPMI8226和Daudi細胞系或者被檢測的非-B細胞系中未檢測到所述mRNA。
實施例11該實施例中，我們發現JST576的表達僅限于能結合BAFF的細胞系。
材料和方法細胞系購自ATCC，并在推薦的條件下培養。
在合適條件下培養不同的B細胞系及非-B細胞系。用RNeasy試劑盒(Qiagen)從約107個細胞中提取RNA。對該RNA定量，并且每一樣本各取20μg在1.2％甲醛凝膠上電泳，按照Sambrook et al.MOLECULAR CLONINGA LABORATORY MANUAL，1989所述方法。將該凝膠印跡到尼龍膜(BMB)上，然后紫外線(UV)交聯。讓該濾膜與JST576標記的片段雜交，然后用實施例10的方法洗滌。用FACS分析來檢查這些細胞結合BAFF的能力。收集約2.5-5×105個細胞，并洗滌。將標簽-標記的BAFF稀釋于PBS+5％FCS和0.05％疊氮鈉(FACS緩沖液)中，用一定濃度范圍(8-0.125μg/ml)的該稀釋液在冰上孵育所述細胞30分鐘。用FACS緩沖液洗滌細胞，然后用5μg/ml的抗-標簽單克隆抗體M2(Sigma)在冰上孵育30分鐘。再次用FACS緩沖液洗滌細胞，然后用山羊抗-小鼠IgG PE偶聯抗體(Jackson Immuno Research)的1∶5000稀釋液在冰上孵育該細胞30分鐘。用上述方法洗滌細胞，然后用CellQuest軟件在FACSCalibur流體分選儀(Becton-Dickinson)上分析這些細胞。
結果BAFF結合試驗的結果列于表1。能結合BAFF的細胞系是Ramos，Namalwa，IM-9，NC-37，Raji，BJAB和SKW6.4。用“+”的數目來表示結合的水平。不能結合BAFF的細胞系是U266，RPMI 8226，Daudi，U937，Jurkat，HT29，A549，SW480和ME260。細胞系結合BAFF的能力與BAFF-R mRNA的存在相關，見圖11。
表1

實施例12該實施例描述了通過瞬時轉染293EBNA細胞而表達并分泌到條件培養基中的huBAFF-R:huIgG1融合蛋白，能夠免疫共沉淀重組可溶性生物素標記的myc-huBAFF。
材料和方法用表達huBAFF-R(aa2-71):Fc的pJST618，用表達huBCMA:huIgG1的質粒作為BAFF結合陽性對照，或用表達huFN14:huIgG1的質粒作為BAFF結合陰性對照，通過Lipofectamine 2000(LifeTechnologies)轉染293EBNA細胞。孵育24小時后，收集條件培養基。
SDS-PAGE通過下述操作來進行將加有或不加還原劑的2X SDS電泳緩沖液與上述條件培養基等體積混合，煮沸5分鐘。然后將樣本在4-20％SDS聚丙烯酰胺凝膠上電泳。將已知量的純化hBCMA:Fc上樣于鄰近泳道，以測算上述條件培養基中hIgG1融合蛋白的量。
用Western印跡試驗，在0.01M CAPS pH11-10％MeOH緩沖液中將樣品轉移到膜(Immobillon P，Millipore)上。用含5％脫脂干奶粉(NFDM)的TBST封閉該膜，并將該膜與1∶3000稀釋的山羊抗-人IgG-HRP(JacksonImmunoResearch)作用1小時，然后用TBST洗膜，對膠片曝光。取200μl上述條件培養基，與溶于1ml DMEM-10％胎牛血清-0.1％NaN3中的200ng重組可溶性人標簽-BAFF 4℃孵育過夜，進行免疫共沉淀。加入蛋白A-Sepharose，繼續孵育2小時。離心收集Sepharose微粒，再用FACS TBST緩沖液洗滌，然后重懸于其中加有還原劑β-巰基乙醇的SDS上樣緩沖液中。將樣品煮沸5分鐘，簡短離心沉淀Sepharose微粒，分成等份在SDS-PAGE上電泳。標簽-huBAFF 50ng電泳作為陽性對照。用Western印跡試驗，在0.01M CAPS pH11/10％MeOH緩沖液中將樣品轉移到PVDF膜(Immobillon P，Millipore)上。用5％NFDM-TBST封閉膜，再將該膜與1μg/ml抗-標簽M2-HRP作用1小時，用TBST洗膜后，對膠片曝光。
結果免疫共沉淀反應通過融合配偶體與蛋白ASepharose間的相互作用帶著各種受體Fc融合體沉落下來。能與R:IgG1融合體相互作用的任何一種蛋白質也都能被帶著沉落下來，如標簽-BAFF。表達hBCMA:Fc的細胞的條件培養基與標簽-BAFF發生了免疫共沉淀，正如預想的那樣，且western印跡出現了與標簽-BAFF共-遷移的條帶(圖12)。表達hFN14:Fc的細胞的條件培養基與標簽-BAFF未發生免疫共沉淀。表達BAFF-R:Fc的細胞的條件培養基能夠共-免疫沉淀標簽-BAFF，western印跡出現了與標簽-BAFF共-遷移的條帶，且該條帶的強度與huBCMA:huIgG1免疫共沉淀時出現的條帶近似。
實施例13該實施例說明，BAFF-R:Fc融合蛋白，huBAFF-R(aa2-71):huIgG1，能夠阻斷huBAFF與BJAB細胞間的結合。
材料和方法制備實施例9中所述的huBAFF-R(2-71)-huIgG1融合體，稱其為pJST618。將該構建體瞬時轉染入293EBNA細胞，收獲該條件培養基。蛋白純化的方法為用酸從蛋白A Sepharose洗脫，然后凝膠過濾層析。取200ng/ml的生物素標記的myc-huBAFF，與50μl FACS緩沖液或與在5μg/ml～200ng/ml范圍內5倍連續稀釋的純化的huBAFF-R:Fc在冰上預孵育30分鐘。然后用這些溶液在冰上孵育BJAB細胞(2.5×105個細胞)1小時。用FACS緩沖液洗滌細胞，并用SAV-PE染色。通過FACS分析細胞的PE熒光，得到的數據繪制為重疊的柱形圖。替代地，將200ng/ml生物素標記的-BAFF與2倍連續稀釋的hBAFF-R:Fc，hTACI:Fc，或hLTBR:Fc預孵育。按照上述方法染色細胞，以檢測這些細胞與生物素標記的BAFF的結合。
結果圖13A顯示在不同濃度huBAFF-R:Fc存在條件下由huBAFF結合BJAB所描繪的柱形圖的重疊情況。用″A″標記的黑線代表SAV-PE結合的背景，用″E″標記的紅線代表未經BAFF-R:Fc預孵育而直接用生物素標記myc-huBAFF染色后的細胞。生物素標記的myc-huBAFF與5μg/mlhuBAFF-R:Fc預孵育后導致柱形圖上移，幾乎接近背景水平(曲線B)。用1μg/ml(曲線C)或200ng/ml(曲線D)huBAFF-R-huIgG1預孵育后導致與生物素標記myc-huBAFF的結合下降約4倍。
圖13B顯示BAFF-R:Fc和TACI:Fc二者都能阻斷BAFF與BJAB細胞的結合。用LTBR:Fc預孵育沒有對BAFF的阻斷作用。
實施例14該實施例描述了BAFF-R:IgG1融合蛋白能阻止BAFF誘導的B細胞增殖。
材料和方法對于體外增殖試驗，用B細胞回收柱(column(CellectTMMouse B CellRecovery ColumnCedarlane Laboratories Limited，Ontario，Canada.)從C57B16小鼠(8周齡)的脾分離小鼠B細胞。純化后的B細胞進行FACS分析，發現＞90％的細胞為B220染色陽性。將B細胞在有或無2mg/ml山羊抗-人m鏈抗體(Sigma Chemical Co.)存在的情況下，在96-孔板(105個細胞/孔，培養液為50mlRPMI，其中添加了10％FBS)中孵育72小時，對照用hIgG(10mg/ml)huBAFF-R:Fc(10mg/ml)。將樣本以平行3份鋪板，并使用建議濃度的myc-hBAFF。再用[3H]胸苷(1μCi/孔)脈沖18小時標記細胞，然后收獲細胞。通過液體閃爍計數檢測[3H]胸苷的摻入量。將按照實施例13方法制備的人BAFF-R:Fc融合蛋白用于本試驗，按照實施例9所述方法從pJST618轉染的293EBNA細胞的培養上清液中制備該蛋白。收獲所述上清，上樣于蛋白A柱，用酸洗脫，然后進行中和，再進行凝膠層析，以獲得沒有聚集體的huBAFF-R:Fc蛋白。本試驗中使用的BAFF表達于巴斯德畢赤氏酵母，通過陰離子交換層析和其后的凝膠過濾進行純化。
結果圖14表明BAFF能夠在有抗-m抗體(正方形)和hIgG(三角形)存在的情況下共刺激B細胞生長。BAFF單獨(菱形)不能誘導B細胞增殖。用10mg/ml huBAFF-R:Fc(星形)孵育導致BAFF-誘導的B細胞增殖被完全抑制。
實施例15材料和方法小鼠六周齡雌性BALB/c小鼠，獲自The Jackson Laboratory(BarHarbor，ME)，圈養于Biogen Animal Facility。
試劑和處理方案受體融合蛋白包含人IgG1 Fc區域。小鼠(5只/組)接受200μg融合蛋白(小鼠BAFF-R:Fc或人BAFF-R:Fc)2次/周，共四周，ip(腹膜內注射)。對照小鼠接受多克隆人IgG(PanglobulinTM)(HIgG)，200μg 2次/周，共4周。最后一劑注射后3天，從眶下竇(orbital sinus)采血，然后讓小鼠無痛苦死亡，再取脾、淋巴結及骨髓用于試驗。
流式細胞術分析宰殺時記錄脾重。用低滲溶液溶解紅細胞后，從脾和血液制備單細胞懸液。然后從腹股溝淋巴結和骨髓制備單細胞懸液。用抗B220、IgM、IgD和CD21的mAbs進行流式細胞計量術。脾B細胞亞群定名為濾泡狀B細胞(B220+，IgM低，CD21低)，邊緣區B細胞(B220+，IgM高，CD21高)以及新生B細胞(B220+，IgM高，CD21-)。簡單地說，取大約1.5×106個細胞，用10μg/mlFc封閉液(Pharmingen)在冰上孵育10分鐘封閉Fc受體，然后加入熒光標記的mAbs，冰上孵育30分鐘。洗滌細胞一次，然后重懸于0.5％多聚甲醛中。在FAC SCalibur流式細胞儀(Becton Dickinson，San Jose，CA)上獲得細胞熒光數據，并用CellQuest軟件(Becton Dickinson)進行分析。
結果在用小鼠或人BAFF-R:Fc作了為期4周的處理后，發現經小鼠和人BAFF-R:Fc(圖.15)處理后的小鼠與用作對照的用人IgG-處理后的小鼠相比，脾重明顯減輕。發現由于脾B細胞數目的減少而引發了脾細胞樣結構(splenic cellularity)的明顯衰減。經小鼠和人BAFF-R:Fc-處理后的小鼠，體內總B220+脾B細胞的平均數目分別為1.8×106和2.6×106個細胞，與經HIgG-處理的對照動物體內的B細胞數目相比明顯減少，后者的平均數目為19.8×106個細胞(圖16)。對脾B細胞不同亞群檢測，即濾泡狀B細胞亞群，邊緣區B細胞亞群及新生B細胞亞群進行的檢測表明，經BAFF-R:Fc-處理后的小鼠體內各亞群B細胞都減少(表2)，而濾泡狀及邊緣區B細胞減少的程度最嚴重。
表2.BAFF-R::Fc處理導致脾B細胞各亞群的細胞數目減少

在第1，4，8，11，15，18，22和25天時，小鼠接受200μg HIgG，mBAFF-R:Fc或hBAFF-R:Fc。在第28天時宰殺小鼠，取脾用于B細胞亞群分析。
對腹股溝淋巴結(LN)中所含B220+B細胞百分比的測試表明經小鼠和人BAFF-R::Fc-處理后的小鼠體內B細胞群細胞平均值大幅減少，分別為12.3％±1.4和18.6％±1.3，而對照用經HIgG-處理后的小鼠，B細胞的平均值為30.8％±4.1(圖17)。當測試外周血淋巴細胞時也得到類似結果，經人IgG-處理后的小鼠體內淋巴細胞中42.5％±2.9為B細胞，而經小鼠和人BAFF-R::Fc-處理后的小鼠中，B細胞分別僅占淋巴細胞的21.2％±6.1和8.3％±4.5(圖18)。
在經BAFF-R::Fc-處理后的小鼠中，盡管新生(未成熟)B細胞和成熟B細胞都減少，但是骨髓中的B細胞前體仍保持不變(數據未給出)。
討論這些結果表明用溶性BAFF-R受體融合蛋白體內封閉BAFF可導致B細胞存活和/或成熟被抑制。
這些結果還表明，在臨床治療B-細胞介導疾病方面BAFF-R融合蛋白作為治療藥物的潛在用途。上述疾病包括那些本質上是自身免疫的疾病，例如系統性紅斑狼瘡、重癥肌無力，自身免疫溶血性貧血、自發性血小板減少性紫癜、抗-磷脂綜合征、恰加斯氏病、格雷夫氏斯病、韋格內氏肉芽腫病、結節性多動脈炎以及急進性腎小球腎炎。所述治療劑還可用于漿細胞疾病，例如多發性骨髓瘤、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血癥、重鏈疾病、原發性或免疫細胞相關性淀粉樣變以及monoclonal gammopathy of undeterminedsignificance(MGUS)。腫瘤學治療目標包括B細胞癌、白血病及淋巴瘤。
實施例16該實施例中，描述了所制備的起始批次(initial panel)的抗BAFF-R胞外結構域的小鼠單克隆抗體的特征。所有這些抗體都能識別BAFF-R的胞外結構域，這些抗體的亞組具有拮抗劑活性，因為它們能夠阻止BAFF與BAFF-R間的結合。
材料和方法免疫RBF小鼠，并用huBAFF-R:Fc加強免疫。將取自免疫小鼠的脾細胞與小鼠骨髓瘤FL653細胞株融合，通過標準雜交瘤技術制備雜交瘤所述FL653細胞株是P3-X63-Ag8.653的衍生物。
對來自分泌抗huBAFFR胞外結構域的抗體的雜交瘤克隆的條件培養基進行FACS分析。如實施例5所述用表達全長huBAFF-R或muBAFF-R的質粒和表達GFP的質粒共轉染293EBNA細胞，然后對該細胞進行FACS結合分析。將雜交瘤條件培養基用FACS緩沖液作1∶10稀釋，再與上述轉染細胞一起在冰上孵育30分鐘。用FACS緩沖液洗滌細胞，通過用1∶100稀釋的-小鼠IgG(H+L)(Jackson ImmunoResearch)冰上孵育30分鐘，來顯示是否發生結合。細胞再次用FACS緩沖液洗滌，然后重懸于含1％多聚甲醛的FACS緩沖液。通過FACS分析細胞上的GFP和PE熒光，得到的數據按照實施例5中的方法繪制成4象限的點狀圖。通過使10ug/ml經蛋白A純化的抗-BAFF-RmAb或對照抗體(MOP C21)與BJAB細胞在冰上孵育30分鐘來完成BAFF封閉試驗。洗滌后，細胞在冰上用250ng/ml生物素標記的huBAFF孵育30分鐘。再次洗滌細胞，通過用SAV-PE孵育來顯示BAFF的結合。用FACS分析這些細胞上的PE熒光，得到的數據繪制成重疊的柱形圖。
結果觀察發現來自10個克隆的上清液能夠結合huBAFF-R轉染后的細胞圖19A給出了上述10份抗-BAFF-R上清液中4份的FACS數據點狀圖。轉染效率約為50％，用上清液染色后幾乎所有轉染細胞都向右上象限移動。這10份上清液中無一與muBAFFR轉染后的293EBNA細胞結合(數據未給出)。取來自能結合BAFF-R的克隆的條件培養基，測試其能否阻止BAFF與BJAB細胞表面表達的BAFF-R之間的結合。BJAB細胞在其表面表達BAFFR，并表達不可檢測量的BCMA或TACI(Thompson etal.(2001)Science Aug 16)。上述10個雜交瘤中2個，克隆2和克隆9，產生的單克隆抗體能夠阻斷BAFF-R與BAFF間的相互作用。(克隆2于2001年9月6日保藏于ATCC，名稱為″anti-BAFF-R clone#2.1″(IgG1-κ同種型)，指定的保藏號為ATCC No.＿＿＿＿；克隆9于2001年9月6日保藏于ATCC，名稱為″anti-BAFF-R clone#9.1″(IgG1-κ同種型)，指定的保藏號為ATCC No.＿＿＿＿)。圖19B中出現的柱形圖的重疊表明用10μg/ml mAb克隆2(曲線(b))或9(曲線(c))的預孵育可使BAFF結合曲線向左移動10倍以上，幾乎移到了無BAFF對照的信號處(曲線(a))。最右側的柱形(曲線(d))顯示在結合BAFF之前細胞用對照mAb MOPC21、抗-BAFF-R非-封閉性mAbs孵育或無蛋白孵育時的遷移情況。
實施例17該實施例描述了hBAFF-R(2-71)-Fc中氨基酸取代的構建，序列和蛋白特征，所述氨基酸取代導致重組表達分子的溶解性提高。
材料和方法通過將帶有粘性末端的雙鏈寡核苷酸盒，連接入hBAFF-R(2-71):IgG1基因相同的位點，從而導入目標殘基的取代。
按照實施例5方法使用Lipofectamine 2000，將表達質粒轉染入293EBNA細胞。通過下述操作測定凝集(Aggregation)情況轉染后20小時取條件培養基進行非-還原性SDS-PAGE電泳，然后進行western轉印，用HRP偶聯的抗-人IgG(1∶100，Jackson ImmunoResearch)檢測，以及如實施例12所述進行ECL檢測。
取轉染后20小時的條件培養基100μl，在1ml DMEM/10％FBS/0.2％NaA3中與200ng標簽-huBAFF免疫共沉淀。樣本在4℃振搖30分鐘，每試管加入30μl蛋白A-Sepharose，繼續再振搖30分鐘。離心收集Sepharose微粒，用1ml冷PBS洗滌3次。將微粒重懸于2X SDS還原性緩沖液，然后上樣至4-20％丙稀酰胺凝膠。按照上述方法western轉印后，通過用1μg/ml HRP偶聯抗-標簽M2(Sigma)孵育濾膜然后進行ECL檢測，來顯示免疫共沉淀標簽-BAFF的能力。
結果盡管人BAFF-R:Fc高度凝集，但是小鼠BAFF-R:Fc卻僅僅是輕微(＜10％)凝集。缺失分析表明可將BAFF-R整個C末端部分從A71至V36(富含半胱氨酸的結構域(CRD)中的最后一個Cys為C35)缺失而凝集反應不減弱。這說明hBAFFR的N-末端和CRD區域是形成凝集所必需的。
首先，制備數種小鼠-人BAFF-R:Fc嵌合體，其中人BAFF-R序列的不同長度的N-末端被同源的小鼠序列所取代，分析這一改變對蛋白凝集的影響。這些嵌合體的氨基酸序列以及hBAFF-R:Fc中所發生的氨基酸取代見圖20。該圖給出了“野生型”人(圖9)和小鼠BAFF-R:Fc二者的BAFF-R部分，并對應于全長人(圖2d)(SEQ ID NO5)或小鼠BAFF-R(圖4b)(SEQ IDNO9)進行了編號。圖20還給出了hBAFFR-R:Fc克隆具有的取代，被取代的殘基用粗體紅色下劃線的方式來顯示。其中在人源序列轉換點之前包括最開始的不超過21個的鼠源殘基(Q21)的嵌合體，其凝集性能類似于野生型的hBAFF-R:Fc；但是至少包含最開始的39個鼠源殘基的嵌合體，其凝集性能大大下降，與mBAFF-R相近似。這兩個嵌合的BAFF-R:Fc構建體之間另外9個不同的殘基中，4個在鼠和人之間是不同的。這表明在C19和L27之間的人源殘基中至少1個是凝集所必需的，所述C19至L27是CRD的一個內部區域。
用標準技術制備這樣的構建體及其亞型，即僅在下述4個位點用相對應的鼠源殘基取代人源殘基。當只將V20N P21Q A22T L27P這4個殘基取代入人BAFFR部分時，這種修飾后的BAFF-R:Fc不再凝集。通過免疫沉淀試驗發現hBAFF-R(V20N P21Q A22T L27P):Fc仍能與BAFF相互作用。所述V20N L27P取代也可使hBAFF-R:Fc的凝集從約90％下降至約10％。所述P21Q L27P(40％)，L27P(60％)，V20N L27A(60％)和V20N L27S(60％)取代會使hBAFF-R:Fc發生中等程度的凝集。下列取代無一減少蛋白凝集V20N P21Q A22T；V20N A22T；V20N P21Q；V20N；和P21Q。
實施例18該實施例描述了p21-Arc是一種與BAFF-R結合的蛋白質。用于測定這種相互作用的方法是免疫沉淀。
方法構建構建體，該構建體包含編碼BAFF-R胞內結構域(BAFF-R-i.c.d.)的cDNA并在其N-末端融合標簽myc，將該構建體亞克隆入CH269質粒NheI(5′)和XhoI(3′)位點。將該構建體轉染293E細胞，72小時后裂解細胞，裂解緩沖液包含150mM NaCl，50mM Tris-HCl，pH7.5，1mM Na3VO4，50mM NaF和1％Brij97。用臺式離心機10,000g5分鐘，澄清裂解物，用抗-myc單克隆抗體9E10進行免疫沉淀。通過進行還原條件下10-20％SDS-PAGE電泳分離免疫沉淀物，然后轉印到PVDF膜上。用0.2％PonceauS溶液使轉印后的蛋白質顯色，切取與BAFF-R特異性結合的蛋白區域，進行N-末端氨基酸序列測序。用PATTERN SEARCH算法在非-冗余蛋白數據庫(non-redundant protein data base)中進行多義檢索(ambiguous search)。
結果與myc-標記的BAFFR胞質結構域特異性結合的蛋白質之一的表觀分子量為21kDa。該蛋白明確地鑒定為p21-Arc(肌動蛋白相關蛋白復合體)。P21-Arc是名為Arp2/3復合體的7亞基蛋白的組分，該復合體參與肌動蛋白聚合(Welch et al.(1997)J.Cell Biol.138357)。最近報道，一種肌動蛋白-結合蛋白，細絲蛋白，其能夠與腫瘤壞死因子受體-結合因子(TRAF2)結合(Leonardi et al.(2000)J.Biol.Chem.275271)。因此，用BAFFR胞質結構域共沉淀反應鑒定p21-Arc表明，p21-Arc既可直接結合BAFFR也可通過與TRAF2和/或其他TRAF蛋白的結合(TRAF2和/或其他TRAF與BAFFR結合)來間接結合BAFFR。
從上述對本發明具體實施方案的詳細描述中，應該可以明顯地看出本發明的獨特之處。盡管本申請詳細公開了具體的實施方案，但是給出實施例的目的僅僅是為了更好地說明，而決不對所附權利要求的范圍構成任何限制。特別指出，本發明人預見到，在不脫離權利要求所限定的本發明的實質和范圍的情況下，可對本發明作出各種替換、變化及改動。
序列表<110>比奧根公司(Biogen，Inc.)杰弗里.S.湯普森(Thompson，Jeffrey S)克里斯廷.M.安布羅斯(Ambrose，Christine M)<120>新的受體核酸及多肽<130>BIOG-0086<150>60/233,152<151>2000-09-18<150>60/234,140<151>2000-09-21<150>60/268,499<151>2001-02-13<150>60/312,185<151>2001-08-14<160>37<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1201<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>1gcaccatgag gcgagggccc cggagcctgc ggggcaggga cgcgccagcc cccacgccct 60gcgtcccggc cgagtgcttc gacctgctgg tccgccactg cgtggcctgc gggctcctgc120gcacgccgcg gccgaaaccg ggtaaggggg acccacgggg cgcgcggcgc cggcagctgc180ggggagaacg gggccccgat cgccagggcg caggcagagc cccgaccccc gggggcgccg240agggctgaaa ggaccctgtg ggcagggcct ggaggggccc gcgatcaccg cgtggccctc300accgccgcct ctctccctcc ccttgtccac cgccccccgg ctgtccctcc cctccccggc360cagcctcgcc cccctccgcc cctccccgtc cccgctcctc cctcccctcg gccccctggc420ctccctccct gtcccctccc gaagcagccg gggccagcag ccctgcgccc aggacggcgc480tgcagccgca ggagtcggtg ggcgcggggg ccggcgaggc ggcgctgccc ctgcccgggc540tgctctttgg cgcccccgcg ctgctgggcc tggcactggt cctggcgctg gtcctggtgg600gtctggtgag ctggaggcgg cgacagcggc ggcttcgcgg cgcgtcctcc gcagaggccc660ccgacggaga caaggacgcc ccagagcccc tggacaaggt catcattctg tctccgggaa720tctctgatgc cacagctcct gcctggcctc ctcctgggga agacccagga accaccccac780
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<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>3ggcgcgccgc accatgaggc gagggccccg gagcctgcgg ggcagggacg cgccagcccc 60cacgccctgc gtcccggccg agtgcttcga cctgctggtc cgccactgcg tggcctgcgg120gctcctgcgc acgccgcggc cgaaaccggc agccggggcc agcagccctg cgcccaggac180ggcgctgcag ccgcaggagt cggtgggcgc gggggccggc gaggcggcgc tgcccctgcc240cgggctgctc tttggcgccc ccgcgctgct gggcctggca ctggtcctgg cgctggtcct300ggtgggtctg gtgagctgga ggcggcgaca gcggcggctt cgcggcgcgt cctccgcaga360ggcccccgac ggagacaagg acgccccaga gcccctggac aaggtcatca ttctgtctcc420gggaatctct gatgccacag ctcctgcctg gcctcctcct ggggaagacc caggaaccac480cccacctggc cacagtgtcc ctgtgccagc cacagagctg ggctccactg aactggtgac540caccaagacg gccggccctg agcaacaata gcagggagcc ggcaggaggt ggcccctgcc600ctccctctgg acccccagcc aggggcttgg aaatcaaatt cagctcttca ctccagcatg660cacatgccct ctttctggga ccaggctaac cctgcagaag cacagacact acagaccaca720gcattcagcc cccatggagt ttggtgtgct tgcctttggc ttcagacctc accatctttg780acagcccttg aaggtggtag cccagctcct gttcctgtgc cttcaaaagg ctggggcact840atgagtaaaa gaccgctttt aaaatgggga aggcaccatt aagccaaaat gaatctgaaa900aaagac 906<210>4<211>903<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>4ggcgcgccgc accatgaggc gagggccccg gagcctgcgg ggcagggacg cgccagcccc 60cacgccctgc gtcccggccg agtgcttcga cctgctggtc cgccactgcg tggcctgcgg120gctcctgcgc acgccgcggc cgaaaccggc cggggccagc agccctgcgc ccaggacggc180gctgcagccg caggagtcgg tgggcgcggg ggccggcgag gcggcgctgc ccctgcccgg240gctgctcttt ggcgcccccg cgctgctggg cctggcactg gtcctggcgc tggtcctggt300gggtctggtg agctggaggc ggcgacagcg gcggcttcgc ggcgcgtcct ccgcagaggc360ccccgacgga gacaaggacg ccccagagcc cctggacaag gtcatcattc tgtctccggg420aatctctgat gccacagctc ctgcctggcc tcctcctggg gaagacccag gaaccacccc480
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<221>sig_peptide<222>(1)..(63)<223>編碼信號肽<220>
<221>misc_feature<222>(64)..(66)<223>導入限制性位點<220>
<221>misc_feature<222>(67)..(276)<223>編碼BAFF-R胞外區<220>
<221>misc_feature<222>(277)..(279)<223>導入限制性位點<220>
<221>misc_feature<222>(280)..(960)
<223>編碼人IgG1 Fc<400>11atggagacag acacactcct gttatgggtg ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60gacgtcaggc gagggccccg gagcctgcgg ggcagggacg cgccagcccc cacgccctgc120gtcccggccg agtgcttcga cctgctggtc cgccactgcg tggcctgcgg gctcctgcgc180acgccgcggc cgaaaccggc cggggccagc agccctgcgc ccaggacggc gctgcagccg240caggagtcgg tgggcgcggg ggccggcgag gcggcggtcg acaaaactca cacatgccca300ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc360aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc420cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc480aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc540gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc600ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag660gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc720ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg780gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ttggactccg acggctcctt cttcctctac840agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg900atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tcccgggaaa960tga 963<210>12<211>320<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>SIGNAL<222>(1)..(21)<223>信號序列<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(22)..(22)<223>由導入限制性位點的區域所編碼<220>
<221>PEPTIDE<222>(23)..(92)<223>BAFF-R的胞外結構域<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(93)..(93)<223>由導入限制性位點的區域所編碼<220>
<221>PEPTIDE<222>(94)..(320)<223>人IgG1 Fc<400>12Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro1 5 10 15Gly Ser Thr Gly Asp Val Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg20 25 30Asp Ala Pro Ala Pro Thr Pro Cys Val Pro Ala Glu Cys Phe Asp Leu35 40 45Leu Val Arg His Cys Val Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro50 55 60Lys Pro Ala Gly Ala Ser Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gln Pro65 70 75 80Gln Glu Ser Val Gly Ala Gly Ala Gly Glu Ala Ala Val Asp Lys Thr85 90 95His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser100 105 110Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg115 120 125Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro130 135 140Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala145 150 155 160Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val165 170 175Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr180 185 190Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr195 200 205Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu210 215 220Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys225 230 235 240Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser245 250 255
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp260 265 270Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser275 280 285Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala290 295 300Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys305 310 315 320<210>13<211>70<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>13Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro Thr1 5 10 15Pro Cys Val Pro Ala Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg His Cys Val20 25 30Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala Ser35 40 45Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gln Pro Gln Glu Ser Val Gly Ala50 55 60Gly Ala Gly Glu Ala Ala65 70<210>14<211>65<212>PRT<213>小鼠(Mus musculus)<400>14Gly Ala Arg Arg Leu Arg Val Arg Ser Gln Arg Ser Arg Asp Ser Ser1 5 10 15Val Pro Thr Gln Cys Asn Gln Thr Glu Cys Phe Asp Pro Leu Val Arg20 25 30Asn Cys Val Ser Cys Glu Leu Phe His Thr Pro Asp Thr Gly His Thr35 40 45Ser Ser Leu Glu Pro Gly Thr Ala Leu Gln Pro Gln Glu Gly Ser Ala50 55 60Leu65<210>15
<211>73<212>PRT<213>A(Homo sapiens)<220>
<221>VARIANT<222>(1)..(1)<223>取代<220>
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<221>VARIANT<222>(6)..(6)<223>取代<220>
<221>VARIANT<222>(7)..(7)<223>取代<220>
<221>VARIANT<222>(10)..(10)<223>取代<220>
<221>VARIANT<222>(12)..(12)<223>取代<220>
<221>VARIANT<222>(15)..(15)<223>取代<400>15Gly Ala Arg Arg Leu Arg Val Arg Ser Gln Arg Ser Arg Asp Ser Pro1 5 10 15Ala Pro Thr Pro Cys Val Pro Ala Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg20 25 30His Cys Val Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala35 40 45Gly Ala Ser Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gln Pro Gln Glu Ser50 55 60
Val Gly Ala Gly Ala Gly Glu Ala Ala65 70<210>16<211>73<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>VARIANT<222>(1)..(1)<223>取代<220>
<221>VARIANT<222>(2)..(2)<223>取代<220>
<221>VARIANT<222>(10)..(10)<223>取代<220>
<221>VARIANT<222>(12)..(12)<223>取代<220>
<221>VARIANT<222>(15)..(15)<223>取代<220>
<221>VARIANT<222>(16)..(16)<223>取代<220>
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<221>VARIANT<222>(20)..(20)<223>取代<400>16Gly Ala Arg Arg Leu Arg Val Arg Ser Gln Arg Ser Arg Asp Ser Ser1 5 10 15Val Pro Thr Gln Cys Val Pro Ala Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg20 25 30His Cys Val Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala35 40 45
Gly Ala Ser Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gln Pro Gln Glu Ser50 55 60Val Gly Ala Gly Ala Gly Glu Ala Ala65 70<210>17<211>73<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>VARIANT<222>(1)..(1)<223>取代<220>
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<221>VARIANT<222>(12)..(12)<223>取代<220>
<221>VARIANT<222>(15)..(15)<223>取代<220>
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<221>VARIANT<222>(24)..(24)<223>取代<220>
<221>VARIANT<222>(29)..(29)<223>取代<400>17Gly Ala Arg Arg Leu Arg Val Arg Ser Gln Arg Ser Arg Asp Ser Ser1 5 10 15Val Pro Thr Gln Cys Asn Gln Thr Glu Cys Phe Asp Pro Leu Val Arg20 25 30His Cys Val Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala35 40 45Gly Ala Ser Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gln Pro Gln Glu Ser50 55 60Val Gly Ala Gly Ala Gly Glu Ala Ala65 70<210>18<211>73<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>VARIANT<222>(1)..(1)<223>取代<220>
<221>VARIANT
<222>(2)..(2)<223>取代<220>
<221>VARIANT<222>(5)..(5)<223>取代<220>
<221>VARIANT<222>(6)..(6)<223>取代<220>
<221>VARIANT<222>(7)..(7)<223>取代<220>
<221>VARIANT<222>(10)..(10)<223>取代<220>
<221>VARIANT<222>(12)..(12)<223>取代<220>
<221>VARIANT<222>(15)..(15)<223>取代<220>
<221>VARIANT<222>(16)..(16)<223>取代<220>
<221>VARIANT<222>(17)..(17)<223>取代<220>
<221>VARIANT<222>(20)..(20)<223>取代<220>
<221>VARIANT<222>(22)..(22)<223>取代<220>
<221>VARIANT<222>(23)..(23)<223>取代
<220>
<221>VARIANT<222>(24)..(24)<223>取代<220>
<221>VARIANT<222>(29)..(29)<223>取代<220>
<221>VARIANT<222>(33)..(33)<223>取代<400>18Gly Ala Arg Arg Leu Arg Val Arg Ser Gln Arg Ser Arg Asp Ser Ser1 5 10 15Val Pro Thr Gln Cys Asn Gln Thr Glu Cys Phe Asp Pro Leu Val Arg20 25 30Asn Cys Val Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala35 40 45Gly Ala Ser Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gln Pro Gln Glu Ser50 55 60Val Gly Ala Gly Ala Gly Glu Ala Ala65 70<210>19<211>70<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>VARIANT<222>(22)..(22)<223>取代<220>
<221>VARIANT<222>(23)..(23)<223>取代<220>
<221>VARIANT<222>(24)..(24)<223>取代<220>
<221>VARIANT<222>(29)..(29)<223>取代<400>19
Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro Thr1 5 10 15Pro Cys Asn Gln Thr Glu Cys Phe Asp Pro Leu Val Arg His Cys Val20 25 30Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala Ser35 40 45Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gln Pro Gln Glu Ser Val Gly Ala50 55 60Gly Ala Gly Glu Ala Ala65 70<210>20<211>70<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>VARIANT<222>(22)..(22)<223>取代<220>
<221>VARIANT<222>(24)..(24)<223>取代<220>
<221>VARIANT<222>(29)..(29)<223>取代<400>20Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro Thr1 5 10 15Pro Cys Asn Pro Thr Glu Cys Phe Asp Pro Leu Val Arg His Cys Val20 25 30Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala Ser35 40 45Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gln Pro Gln Glu Ser Val Gly Ala50 55 60Gly Ala Gly Glu Ala Ala65 70<210>21<211>70<212>PRT<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>VARIANT<222>(22)..(22)<223>取代<220>
<221>VARIANT<222>(23)..(23)<223>取代<220>
<221>VARIANT<222>(29)..(29)<223>取代<400>21Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro Thr1 5 10 15Pro Cys Asn Gln Ala Glu Cys Phe Asp Pro Leu Val Arg His Cys Val20 25 30Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala Ser35 40 45Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gln Pro Gln Glu Ser Val Gly Ala50 55 60Gly Ala Gly Glu Ala Ala65 70<210>22<211>70<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>VARIANT<222>(22)..(22)<223>取代<220>
<221>VARIANT<222>(29)..(29)<223>取代<400>22Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro Thr1 5 10 15Pro Cys Asn Pro Ala Glu Cys Phe Asp Pro Leu Val Arg His Cys Val20 25 30Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala Ser35 40 45
Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gln Pro Gln Glu Ser Val Gly Ala50 55 60Gly Ala Gly Glu Ala Ala65 70<210>23<211>70<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>VARIANT<222>(23)..(23)<223>取代<220>
<221>VARIANT<222>(24)..(24)<223>取代<220>
<221>VARIANT<222>(29)..(29)<223>取代<400>23Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro Thr1 5 10 15Pro Cys Val Gln Thr Glu Cys Phe Asp Pro Leu Val Arg His Cys Val20 25 30Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala Ser35 40 45Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gln Pro Gln Glu Ser Val Gly Ala50 55 60Gly Ala Gly Glu AIa Ala65 70<210>24<211>70<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>VARIANT<222>(23)..(23)<223>取代<220>
<221>VARIANT<222>(29)..(29)<223>取代
<400>24Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro Thr1 5 10 15Pro Cys Val Gln Ala Glu Cys Phe Asp Pro Leu Val Arg His Cys Val20 25 30Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala Ser35 40 45Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gln Pro Gln Glu Ser Val Gly Ala50 55 60Gly Ala Gly Glu Ala Ala65 70<210>25<211>70<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>VARIANT<222>(29)..(29)<223>取代<400>25Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro Thr1 5 10 15Pro Cys Val Pro Ala Glu Cys Phe Asp Pro Leu Val Arg His Cys Val20 25 30Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala Ser35 40 45Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gln Pro Gln Glu Ser Val Gly Ala50 55 60Gly Ala Gly Glu Ala Ala65 70<210>26<211>70<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>VARIANT<222>(22)..(22)<223>取代<220>
<221>VARIANT<222>(29)..(29)
<223>取代<400>26Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro Thr1 5 10 15Pro Cys Asn Pro Ala Glu Cys Phe Asp Ser Leu Val Arg His Cys Val20 25 30Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala Ser35 40 45Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gln Pro Gln Glu Ser Val Gly Ala50 55 60Gly Ala Gly Glu Ala Ala65 70<210>27<211>70<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>VARIANT<222>(22)..(22)<223>取代<220>
<221>VARIANT<222>(29)..(29)<223>取代<400>27Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro Thr1 5 10 15Pro Cys Asn Pro Ala Glu Cys Phe Asp Ala Leu Val Arg His Cys Val20 25 30Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala Ser35 40 45Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gln Pro Gln Glu Ser Val Gly Ala50 55 60Gly Ala Gly Glu Ala Ala65 70<210>28<211>70<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>VARIANT
<222>(22)..(22)<223>取代<220>
<221>VARIANT<222>(23)..(23)<223>取代<220>
<221>VARIANT<222>(24)..(24)<223>取代<400>28Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro Thr1 5 10 15Pro Cys Asn Gln Thr Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg His Cys Val20 25 30Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala Ser35 40 45Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gln Pro Gln Glu Ser Val Gly Ala50 55 60Gly Ala Gly Glu Ala Ala65 70<210>29<211>70<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>VARIANT<222>(22)..(22)<223>取代<220>
<221>VARIANT<222>(24)..(24)<223>取代<400>29Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro Thr1 5 10 15Pro Cys Asn Pro Thr Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg His Cys Val20 25 30Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala Ser35 40 45Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gln Pro Gln Glu Ser Val Gly Ala50 55 60
Gly Ala Gly Glu Ala Ala65 70<210>30<211>70<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>VARIANT<222>(22)..(22)<223>取代<220>
<221>VARIANT<222>(23)..(23)<223>取代<400>30Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro Thr1 5 10 15Pro Cys Asn Gln Ala Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg His Cys Val20 25 30Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala Ser35 40 45Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gln Pro Gln Glu Ser Val Gly Ala50 55 60Gly Ala Gly Glu Ala Ala65 70<210>31<211>70<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>VARIANT<222>(23)..(23)<223>取代<400>31Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro Thr1 5 10 15Pro Cys Val Gln Ala Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg His Cys Val20 25 30Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala Ser35 40 45Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gln Pro Gln Glu Ser Val Gly Ala50 55 60
Gly Ala Gly Glu Ala Ala65 70<210>32<211>70<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>VARIANT<222>(22)..(22)<223>取代<400>32Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro Thr1 5 10 15Pro Cys Asn Pro Ala Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg His Cys Val20 25 30Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala Ser35 40 45Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gln Pro Gln Glu Ser Val Gly Ala50 55 60Gly Ala Gly Glu Ala Ala65 70<210>33<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物<400>33ggccgagtgc ttcgacctgc t 21<210>34<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物<400>34ggtccgccac tgcgtggcct g 21<210>35<211>21<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物<400>35caccaagacg gccggccctg a 21<210>36<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物<400>36gggcgcctac aatctcagct a 21<210>37<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物<400>37ggcggaccag caggtcgaag cactc 2權利要求
1.一種分離的核酸，其包含編碼多肽的序列，所述多肽與含SEQ ID NO5所示氨基酸序列的多肽之間至少50％相同。
2.權利要求1的核酸，其中所述核酸編碼的多肽與SEQ ID NO5至少90％相同。
3.權利要求1的核酸，其中所述的被編碼的多肽可結合BAFF。
4.權利要求1的核酸，其中所述的核酸是DNA。
5.權利要求1的核酸，其中所述的核酸是RNA。
6.權利要求1的核酸，其中所述的核酸是cDNA分子。
7.一種分離的核酸，其包含的核苷酸序列與SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4或SEQ ID NO6的至少一部分互補。
8.一種載體，其包含權利要求1或2所述的核酸。
9.一種細胞，其包含權利要求8所述的載體
10.一種藥物組合物，其包括權利要求1所述的核酸和藥物學上可接受的載體。
11.一種基本上純化的多肽，該多肽由權利要求1或2所述核酸編碼。
12.一種藥物組合物，其包括權利要求11所述多肽和藥物學上可接受的載體。
13.一種抗體，其能特異性結合權利要求12所述多肽。
14.一種抗體，其能結合權利要求12所述多肽上的表位。
15.一種試劑盒，其包括可結合權利要求12所述多肽的抗體，以及，可任選地，陰性對照抗體。
16.一種藥物組合物，其包括權利要求13所述抗體以及藥物學上可接受的載體。
17.一種制備BAFF-R多肽的方法，該方法包括提供權利要求9的細胞；在足以使所述BAFF-R多肽能夠表達的條件下培養所述細胞；以及回收所述BAFF-R多肽，從而制備出所述BAFF-R多肽。
18.權利要求17的方法，其中所述細胞是原核細胞。
19.權利要求17的方法，其中所述細胞是真核細胞。
20.一種診斷受試者是否患有B-細胞介導的疾病的方法，該方法包括提供來自所述受試者的蛋白樣本；測量所述受試者樣本中BAFF-R多肽的含量；以及將所述受試蛋白樣本中的BAFF-R多肽含量與對照蛋白樣本中的BAFF-R多肽含量進行比較，其中所述受試者蛋白樣本中的BAFF-R多肽含量相對于所述對照蛋白樣本中的BAFF-R多肽含量有了變化，則提示該受試者患有B-細胞介導的疾病。
21.權利要求20的方法，其中所述的B-細胞介導的疾病是自身免疫疾病。
22.權利要求20的方法，其中所述的B-細胞介導的疾病是癌癥。
23.一種診斷受試者是否患有B-細胞介導的疾病的方法，該方法包括提供來自所述受試者的核酸樣本；測量所述受試者核酸樣本中BAFF-R核酸的含量；以及將所述受試者核酸樣本中的BAFF-R核酸含量與對照樣本中的BAFF-R核酸含量進行比較，其中受試者核酸樣本中的BAFF-R核酸含量相對于所述對照樣本中的BAFF-R核酸含量有了變化，則提示該受試者患有B-細胞介導的疾病。
24.權利要求23的方法，其中所檢測的BAFF-R核酸是BAFF-R RNA。
25.權利要求23的方法，其中所檢測的BAFF-R核酸是BAFF-R DNA。
26.權利要求23的方法，其中所述BAFF-R核酸用權利要求1所述核酸來檢測。
27.權利要求23的方法，其中所述BAFF-R核酸是用一種或多種能擴增權利要求1所述核酸的核酸來檢測。
28.一種診斷受試者是否患有B-細胞介導的疾病的方法，該方法包括提供來自所述受試者的核酸樣本；鑒定所述受試者核酸樣本中BAFF-R核酸的至少一部分核苷酸序列；以及將所述受試者核酸樣本中的BAFF-R核苷酸序列與對照樣本中的BAFF-R核苷酸序列進行比較，其中受試者核酸樣本中的BAFF-R核苷酸序列相對于所述對照樣本中的BAFF-R核苷酸序列有了變化，則提示該受試者患有B-細胞介導的疾病。
29.一種治療或預防或延緩自身免疫疾病或致瘤性疾病的方法，該方法包括向期望該治療或預防或延緩的受試者給藥足以能治療、預防或延緩所述受試者自身免疫疾病或致瘤性疾病的量的權利要求1所述核酸。
30.一種用于治療或預防或延緩自身免疫疾病或致瘤性疾病的方法，該方法包括向期望該治療或預防或延緩的受試者給藥足以能治療、預防或延緩所述受試者自身免疫疾病或致瘤性疾病的量的權利要求12所述多肽。
31.一種用于治療或預防或延緩自身免疫疾病或致瘤性疾病的方法，該方法包括向期望該治療或預防或延緩的受試者給藥足以能治療、預防或延緩所述受試者自身免疫疾病或致瘤性疾病的量的權利要求16所述抗體。
32.一種用于鑒定可結合BAFF-R蛋白的化合物的方法，其中包括a)使BAFF-R蛋白與化合物接觸；以及b)檢測所述化合物是否結合BAFF-R蛋白。
33.權利要求32的方法，其中所述化合物與BAFF-R蛋白的結合是通過蛋白結合試驗測定的。
34.一種用權利要求32所述方法鑒定的化合物。
35.一種鑒定能與編碼BAFF-R蛋白的核酸結合的化合物的方法，該方法包括下列步驟a)使所述編碼BAFF-R蛋白的核酸與化合物接觸；以及b)測定所述化合物是否結合所述核酸分子。
36.一種用權利要求35方法鑒定的化合物。
37.一種鑒定能調控BAFF-R蛋白活性的化合物的方法，該方法包括下列步驟a)使BAFF-R蛋白與化合物接觸；以及b)測定BAFF-R蛋白的活性是否受到了調節。
38.一種用權利要求37方法鑒定的化合物。
39.一種減弱重組表達蛋白凝集的方法，該方法包括a)從作為重組表達蛋白時凝集的目標蛋白同系物中鑒定出保守的氨基酸區域；b)取代所述目標蛋白中的至少1個非-保守氨基酸以形成突變的目標蛋白；其中所述的突變的目標蛋白當重組表達時凝集程度減弱。
40.權利要求39的方法，其中所述非-保守氨基酸是非極性氨基酸。
41.權利要求39的方法，其中所述非極性氨基酸變為不帶電荷的極性氨基酸。
42.權利要求39的方法，其中所述的非極性氨基酸變為脯氨酸、絲氨酸或丙氨酸。
43.權利要求39的方法，其中所述非極性氨基酸變為脯氨酸。
44.一種分離的核酸分子，該分子編碼BAFF-R蛋白的至少一部分，所述BAFF-R蛋白包含如下氨基酸序列SEQ ID NO13；SEQ ID NO15；SEQID NO16；SEQ ID NO17；SEQ ID NO18；SEQ ID NO19；SEQ ID NO20；SEQ ID NO21；SEQ ID NO22；SEQ ID NO23；SEQ ID NO24；SEQ IDNO25；SEQ ID NO26；SEQ ID NO27；SEQ ID NO28；SEQ ID NO29；SEQ ID NO30；SEQ ID NO31或SEQ ID NO32。
45.權利要求44所述的分離的核酸分子，其中所述核酸編碼作為嵌合蛋白一部分的所述BAFF-R蛋白。
46.權利要求45的分離的核酸，其中所述嵌合蛋白包含免疫球蛋白的恒定區。
47.一種分離的核酸分子，該分子編碼含有SEQ ID NO14所示氨基酸序列的BAFF-R蛋白。
48.權利要求47的分離的核酸分子，其中所述的核酸編碼作為嵌合蛋白一部分的所述BAFF-R蛋白。
49.權利要求48所述的分離的核酸分子，其中所述嵌合蛋白包含免疫球蛋白的恒定區。
50.一種分離的多肽，其包含選自下列序列的氨基酸序列SEQ ID NO13；SEQ ID NO15；SEQ ID NO16；SEQ ID NO17；SEQ ID NO18；SEQ IDNO19；SEQ ID NO20；SEQ ID NO21；SEQ ID NO22；SEQ ID NO23；SEQ ID NO24；SEQ ID NO25；SEQ ID NO26；SEQ ID NO27；SEQ ID NO28；SEQ ID NO29；SEQ ID NO30；SEQ ID NO31或SEQ ID NO32。
51.權利要求50所述的分離的多肽，其中所述多肽是一種嵌合蛋白。
52.權利要求51所述的分離的多肽，其中所述嵌合蛋白包含免疫球蛋白的恒定區。
53.一種分離的小鼠BAFF-R多肽，其包含SEQ ID NO14所示氨基酸序列。
54.權利要求53所述的分離的多肽，其中所述多肽是一種嵌合蛋白。
55.權利要求54所述的分離的多肽，其中所述嵌合蛋白包含免疫球蛋白的恒定區。
全文摘要
本發明公開了編碼BAFF－R多肽的核酸，還公開了抗BAFF－R多肽的抗體，以及含這些物質的藥物組合物。另外，本發明還提供了用本發明所述核酸、多肽、抗體以及藥物組合物治療致瘤性疾病及自身免疫疾病的方法。
文檔編號A61P25/28GK1622995SQ01819084
公開日2005年6月1日 申請日期2001年9月6日 優先權日2000年9月18日
發明者克里斯廷·M·安布羅斯, 杰弗里·S·湯普森 申請人:比奧根公司