一種牛趨化因子介導的o型口蹄疫靶向性復合表位蛋白及疫苗的制作方法
【技術領域】
[0001 ]本發明屬于口蹄疫免疫技術領域，具體涉及一種牛趨化因子介導的0型口蹄疫靶 向性復合表位蛋白及疫苗。
【背景技術】
[0002] 口蹄疫（foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus，FMDV)引起的急性、熱性、高度接觸性傳染病。主要侵害對象為牛、羊和豬 等主要畜種及其它家養和野生偶蹄動物，易感者多達70余種。發病動物的特征癥狀是口、 鼻、蹄和母畜乳頭等部位發生水泡，或水泡破損后形成的潰瘍或斑痂，表現流涎、跛行和臥 地，由此導致生產力大幅下降。口蹄疫傳染性強，發病率高達100%，可造成巨大的經濟損失 和社會政治影響，素有"政治經濟病"之稱，國際動物衛生組織(0ΙΕ)將該病列為必需通報的 重大動物傳染病，我國也將該病列為一類重大動物傳染病之首。
[0003] FMDV不僅宿主范圍廣，傳播迅速，變異快，而且血清型眾多，共有A、0、C、Asia 1、 SAT1、SAT2和SAT3七個血清型，各血清型間缺乏交叉保護性，同一血清型的不同亞型或分 離株間的抗原變異很大。近年來，全球除C型口蹄疫未見流行外，其他6個血清型都在流 行。A型和0型流行面最廣，其次為Asial型和SAT2型。目前，對于口蹄疫的防治以免疫接 種滅活疫苗為主，該疫苗為FMD疫情防控做出了重大貢獻。歐洲經歷了十多年的滅活疫苗接 種后，疫情得到了控制，多數國家達到了無疫標準。但滅活疫苗的生產和應用存在諸多的缺 點。即生產該疫苗需要繁殖大量的活病毒，存在病毒逃逸的風險;非純化的滅活疫苗免疫動 物(尤其是多次免疫)會產生非結構蛋白抗體，給以非結構蛋白為基礎的感染動物與免疫動 物鑒別診斷帶來干擾;需要冷鏈運輸和低溫貯存以保證抗原穩定性;疫苗免疫不能阻斷形 成病毒攜帶狀態，更為嚴重的是病毒滅活不完全有引發疫情的危險。為了克服這些缺點，研 究者一直在尋找一種更為安全有效的口蹄疫新型疫苗。隨著口蹄疫病毒抗原結構日益明 朗，免疫學方面的新理論與新方法的不斷發展，在疫苗分子設計、復合表位疫苗與免疫佐劑 等方面都取得了明顯進展。
[0004] 表位蛋白疫苗與滅活疫苗相比，具有以下優點：生產過程不涉及活病毒，不存在散 毒的風險;既可隨時根據流行毒株的變化調整表位序列，也可使用不同的抗原序列，增加抗 原的廣譜性;利用非疫苗用表位建立的診斷方法可對疫苗免疫和自然感染動物進行有效區 分。近年來，表位疫苗逐漸成為研究的熱點。大量研究表明，表位蛋白疫苗在豬體試驗是成 功的（Cubillos et al, 2008;Shao et al, 2011;Cao et al, 2013,2014)。但是在牛上不 能獲得有效的保護（Taboga et al, 1997;Rodriguez et al, 2003)。

【發明內容】

[0005] 本發明的目的是克服現有表位蛋白疫苗對牛體免疫效果差的缺陷，提供一種牛趨 化因子介導的〇型口蹄疫靶向性復合表位蛋白及疫苗。利用本發明的XCL-0B7靶向性復合表 位蛋白疫苗免疫牛，能夠產生較高的抗體水平，以及較好的保護性免疫效果，是一種安全的 口蹄疫新型疫苗。
[0006] 為了提高表位蛋白疫苗對牛的免疫效果，將表位蛋白分子靶向于樹突狀細胞(DC) 表面受體，將有可能提尚表位蛋白的抗原遞呈效率，進而提尚表位疫苗的免疫效果。DC是最 重要的抗原遞呈細胞(antigen-presenting cells，APCs)，通過其表面受體介導的胞吞、胞 飲與吞噬作用，對自身產生的病變細胞與入侵病原進行監視與清除，在啟動與控制獲得性 免疫應答方面發揮著關鍵性的作用。通過DC表面受體將抗原靶向到DC，可以顯著提高抗原 遞呈效率，即使少量的抗原也能夠刺激產生較高的細胞免疫與體液免疫。近來發現趨化因 子受體XCR1僅表達于一群具有抗原交互遞呈功能的DC，是C型趨化因子XCL1唯一的受體。通 過XCL1將抗原靶向到這類DC，不但具有很高的特異性，而且靶向的抗原可以通過MHC-I與 MHC-II兩類分子交叉遞呈抗原給⑶8+T細胞(CTL)與⑶4+ T細胞，從而產生強而持久的細胞 免疫與體液免疫應答。XCL1的氨基酸序列在不同種屬動物之間有差異，因而具有種屬特異 性。
[0007] 本發明的第一個目的是提供一種融合牛趨化因子XCL1的0型口蹄疫靶向性復合表 位蛋白，所述靶向性復合表位蛋白的氨基酸序列為序列表中SEQ ID No.2。
[0008] 本發明的牛0型口蹄疫靶向性復合表位蛋白包含N端融合的牛趨化因子XCL1序列， 中國型（Cathay)、泛亞、緬甸98三個譜系0型FMDV主要中和性抗原表位區、通用T細胞表位、 FMDV特異性T細胞表位以及表位間的間隔序列，增加 FMDV特異性T細胞表位旨在提高對牛的 FMDV特異性細胞免疫效果。表位間的間隔序列有助于蛋白形成穩定的空間結構，提高蛋白 的免疫原性;在重組蛋白末端融合有6個組氨酸標簽，以便于表位蛋白的分離純化。
[0009] 本發明的第二個目的是提供編碼權利要求1所述的牛趨化因子介導的0型口蹄疫 靶向性復合表位蛋白的核苷酸； 作為優選，所述核苷酸序列為序列表中SEQ ID No. 1。
[0010] 本發明的第三個目的是提供一種牛趨化因子介導的0型口蹄疫靶向性復合表位蛋 白疫苗，所述疫苗由水相和油相按比例混合后制備而成;所述水相的溶質為權利要求1所述 的牛趨化因子介導的〇型口蹄疫靶向性復合表位蛋白。
[0011 ]作為優選，所述油相為油佐劑。
[0012] 作為進一步優選，所述油佐劑為Montanide ISA-201油佐劑。
[0013] 作為優選，所述水相和油相的體積比為1: (0.95-1.05)。
[0014] 作為優選，所述疫苗的主要組分含量為權利要求1所述的牛趨化因子介導的0型口 蹄疫靶向性復合表位蛋白500yg/mL. 作為優選，所述疫苗的免疫有效量為每頭份2ml。
[0015] 本發明的第四個目的是提供上述疫苗的制備方法，將權利要求1所述的牛趨化因 子介導的〇型口蹄疫靶向性復合表位蛋白溶于磷酸鹽緩沖液中，得到水相;將水相與油相等 溫度充分混合，乳化，得疫苗。
[0016] 本發明的第五個目的是提供上述牛趨化因子介導的0型口蹄疫靶向性復合表位蛋 白在制備牛0型口蹄疫疫苗中的應用。
[0017] 本發明的第六個目的是提供上述疫苗在制備預防和/或控制牛0型口蹄疫的藥物 中的應用。
[0018] 本發明的有益效果： 牛免疫試驗結果表明，免疫1 mg XCL-0B7后，7天就可檢測到FMDV特異性中和抗體，抗 體效價不斷升高，至21天抗體效價達最高，加強免疫后抗體效價迅速升高。非祀向性的0B7 抗原加入Toll樣受體激動劑P 〇ly(I:C)(pIC)后，也產生了高水平的抗體應答，但早期抗體 應答水平，明顯低于XCL-0B7靶向性抗原免疫牛。靶向性XCL-0B7抗原加入Tol 1樣受體激動 劑P〇ly(I:C)后，初免后的抗體應答水平相比前兩組反而降低，二免后的抗體水平相比前兩 組不升反降，顯示出P〇ly(I:C)與XCL具有相反的作用，顯示出單獨的XCL靶向性抗原分子在 誘導體液免疫應答方面具有明顯的優勢。而PBS對照組動物始終沒有檢測到FMDV特異性抗 體。特異型抗體檢測結果顯示，首免與加強免疫后IgGl型抗體均高于IgG2型抗體，說明機體 通過Th2型細胞因子調控免疫應答。加強免疫后第42天用200微升含10000個BID50的0/ Mya/98 口蹄疫病毒攻毒，X07免疫組牛只有1頭發病，其余4頭牛獲得完全保護;而PBS免疫組 牛全部發病。說明重組X07抗原是一種很好的免疫原，免疫牛能夠產生較高的體液免疫，以 及較好的保護性免疫效果，是一種安全的口蹄疫新型疫苗。
【附圖說明】
[0019] 附圖用來提供對本發明的進一步理解，并且構成說明書的一部分，與本發明的實 施例一起用于解釋本發明，并不構成對本發明的限制。在附圖中： 圖1為XCL-0B7抗原表達產物SDS-PAGE圖。1為蛋白分子量Marker; 2為重組菌pET28a-XCL-0B7誘導5h產物；3為未誘導的重組菌pET28a-XCL-0B7對照;4為空載體pET28a誘導對 昭