新趨化因子受體cxcr8的鑒別的制作方法
【專利說明】
[0001] 有關聯邦資助的研究或開發的聲明
[0002] 本發明是依據美國國家衛生研究院(化tional Institutes of Health)的授權號 R01-AI093548在政府的支持下提出。美國政府在本發明中享有某些權利。
[0003] 有關序列表的參考
[0004] 序列表是W名為"1279588SE化1ST"的ASCII文本文件與本發明一起提交，該序列 表于2014年9月30日創建，并且大小是51千字節。序列表全文通過引用并入本文中。
技術領域
[0005] 本發明設及趨化因子巧化17及其受體巧CR8/GPR35。
【背景技術】
[0006] 人趨化因子超家族包括某些48種配體和19種已知的受體。大部分配體的受體已得 到鑒別，但有一些仍是"孤兒(0巧han)"(l)。趨化因子(C-X-C基序)配體17(CX化17)是描述 的最新趨化因子配體(2)。發明人先前報道，CXCL17是在特發性肺纖維化（IPF)患者的支氣 管肺泡灌洗液中顯著上調的粘膜相關趨化因子(3)。重要的是，它還是受體尚未得到鑒別的 少數"孤兒"趨化因子配體之一(另一個是CX化14) (1)。

【發明內容】

[0007] 趨化因子是引導白細胞和其它細胞在體內運輸的趨化性細胞因子家族。趨化因子 結合到在祀細胞表面上表達的G蛋白偶合受體(GPCR)，由此起始細胞內信號傳導級聯并誘 導趨化作用。盡管大多數趨化因子的同源受體已經得到表征(4)，但最近報道的趨化因子配 體CX化17的受體仍不明確。如本文所描述，已顯示GPR35是CX化17的受體。已知CX化17可對 巨隧細胞和樹突狀細胞發揮趨化作用（2KGPR35是由CXCL17反應性人單核細胞、樹突狀細 胞(DC)表達或在其上表達，并且在THP-1單核細胞樣細胞系中有表達。另外，如通過巧調動 檢驗所測量，將GPR35轉染到Ba/F3細胞中使運些細胞對CX化17起反應。CX化17是在粘膜組 織中表達的趨化因子(3) ;GPR35表達反映了運一粘膜表達模式。GPR35還展現出趨化因子受 體的若干結構特征，包括DRY盒及ΤχΡ基序。由此得出結論，GPR35是一種新的趨化因子受體， 并因此提出應當將其命名為趨化因子(C-X-C基序)受體8(CXCR8)dGPR35與人類疾病有關； GWAS研究已將其與炎性腸病（I抓)聯系在一起巧）。總的說來，運些觀察結果有力地表明，運 一新的粘膜趨化因子CX化17/CXCR8軸是呼吸系統或消化系統病理生理學或發炎過程中治 療干預的重要祀標。該配對在人體中得到證實，而且在不同物種中對應物將W類似方式配 對。不同物種的對應物可能配對，并且可能顯示正常的交叉反應性，或可能具有與天然配對 不同的親和力或信號傳導能力。
[0008] 在一方面，提供了一種治療受試者的與CXCR8信號傳導增加相關的病癥的方法。該 方法包括破壞受試者體內由配體CX化17引起的受體CXCR8的活化。在所述方法中：a)所述破 壞可W包括向受試者施用干擾CX化17與CXCR8的結合的物質;b)所述病癥可W是胃腸病癥、 呼吸系統病癥、代謝病癥、感染性病癥或腫瘤病癥，在具體實施方案中，該病癥可w是肺、消 化系統或生殖系統炎性疾病；C)此類炎性疾病的實例包括但不限于，克羅恩氏病(Crohn's disease, CD)、原發性硬化性膽管炎、潰瘍性結腸炎、脂瀉病或腸易激綜合癥（IBS)、潰瘍、缺 血性結腸炎、放射性結腸炎、乳糜瀉、支氣管肺發育異常、特發性肺纖維化、過敏性肺炎、非 特異性間質性肺炎、慢性阻塞性肺病、肺炎、哮喘、支氣管炎、肺氣腫、亞臨床間質性肺病(亞 臨床ILD)、囊性纖維化、肉樣瘤病、子宮內膜異位、平滑肌瘤、子宮腺肌病、細菌性陰道炎，或 者尿道感染或炎癥;d)或a)-c)的任何組合。
[0009]在另一方面，提供了一種篩選破壞受體CXCR8與配體CX化17之間的締合的物質的 方法。該方法包括將CX化17添加到表達CXCR8的細胞中，及測量在所述物質存在下細胞中 CXCR8信號傳導的減少。舉例來說，可W使用實施例中描述的Ba/F3細胞系的CXCR8轉染子來 篩選CXCR8/CX化17相互作用的激動劑和括抗劑。
[0010]在又一方面，提供了一種篩選破壞受體CXCR8與配體CX化17之間的締合的物質的 方法。該方法包括將CX化17添加至化XCR8中，及測量在所述物質存在下CX化17與CXCR8結合 的減少。
[0011]在本文所描述的運些或其它方法中，所述物質可W是:a)結合到CX化17或CXCR8的 抗體或其片段;b)展現CXCL17的天然或變體序列的多膚;c)CXCL17的非膚偶聯變體;d)結合 到CX化17或CXCR8的小分子;e)結合到CX化17或CXCR8的適體;或a) - e)的任何組合。
[0012]在其它方面，提供W下內容：
[0013] a)提供了 CXCR8的配體，其中所述配體選擇性結合到CXCR8受體。該配體可W是通 過所述受體進行信號傳導的配體，如激動劑；對少于85%、90%、95%或更高百分比的人 CX化17進行信號傳導的配體，如括抗劑;反向激動劑(抑制CXCR8的基礎活性的激動劑）；別 構調節物（改變CXCR8的信號傳導活性，但不干擾該配體(CXCL17)的結合的調節物）；與人 CX化17具有至少約85%、90%、95%或更高序列同一性的配體，如突變蛋白；包含了與人 CX化17展現至少94%同一性的具有至少17、19、23、27、31或更多個氨基酸的區段的配體； 和/或結合到靈長類動物的CXCR8受體的配體。所述配體可呈無菌組合物形式;被配制用 于全身或局部施用；呈治療性組合物形式;處于單劑量容器中；和/或與人CX化17具有至少 90%序列同一性。在與人CX化17包括約85%、90%、95%或更高序列同一性的一些實施方案 中，運些實施方案不包括與天然存在的人CX化17序列同一的序列。
[0014] b)提供了選擇性結合到CXCR8的配體的抗體。該抗體可W阻斷與CXCR8受體的結 合;和/或阻斷由CXCR8受體進行的信號傳導。
[0015] C)提供了人CXCL17的受體或結合蛋白。該受體或結合蛋白可在結合所述人 CX化17后進行進一步信號傳導；與人CXCR8相比較，在結合CX化17后對至少約80%的信號進 行信號傳導；與人CXCR8具有至少約95%同一性；和/或結合到靈長類動物CX化17。在與人 CXCR8包括至少約95 %或更高序列同一性的一些實施方案中，運些實施方案不包括與天然 存在的人CXCR8序列同一的序列。
[0016] d)還提供了一種抑制CX化17通過CXCR8進行的信號傳導的方法。該方法包括:曰)使 CXCR8 (受體)與CX化17 (配體)括抗劑接觸;b)使CX化17 (配體)與阻斷劑接觸;和/或C)使表 達CXCR8的細胞與細胞信號傳導阻斷劑接觸。CX化17 (配體）括抗劑可W選自：a)結合到 CXCR8(受體)的抗體(或其片段)或物種變體;b)CXCL17(趨化因子)變體(例如結合但不進行 信號傳導;包括物種變體及對應物）；或C)小分子化合物。阻斷劑可W選自：a)結合到CX化17 的抗體(或其片段）（例如趨化因子并阻斷結合;包括物種變體）；b)所述受體的片段，該片段 可W是該受體的可溶性部分;和/或C)小分子化合物。細胞信號傳導的阻斷劑可W是:a)信 號傳導路徑成員的例如RNAi、CRISPR、TALEN化合物;b)阻斷信號傳導路徑的抗體;或C)小分 子化合物。
[0017] e) -種誘導CXCR8(受體)信號傳導的方法，所述方法包括使所述受體與其同源配 體接觸，該配體可W是CXCL17或其激動劑。該激動劑可W是CXCL17的多膚序列變體或 CX化17的非膚偶聯變體，或其片段。
[0018] f) 一種篩選所述CX化17括抗劑的方法，其中所述篩選使用了利用巧光成像板讀取 器(fluorescent imaging plate reader JLIPR)或相關檢測系統的基于細胞的檢驗，包括 選自W下各項的檢驗:FLIPR、基于細胞的檢驗、生物化學檢驗等等。在所述方法中，所述篩 選可W針對一種或多種化合物，運些化合物包括：i)結合到CX化17的抗體，包括物種變體或 對應物；ii)CX化17的多膚序列變體，包括物種變體；iii)CX化17的非膚偶聯變體，例如糖基 化或其它修飾;iv)小分子括抗劑候選物;或V)適體文庫。
[0019] g) -種篩選（f)中所述的阻斷劑的方法，其中所述篩選使用了如F LIPR(參見 World Wide Web的mo 1 eculardevices.com/Products/Instrum ents/FLIPR- Systems . html)、基于細胞的檢驗或生物化學檢驗等檢驗；i)結合到CXCR8的抗體或物種變 體；i i) CX化17的多膚序列變體，例如可溶性受體片段或物種變體；i i i)CX化17的非膚偶聯 變體，如糖基化或其它修飾;iv)小分子括抗劑候選物;和/或V)適體文庫。
[0020] h)-種篩選所述CX化17括抗劑或阻斷劑的方法，其中使用了 Ba/F3細胞系的CXCR8 轉染子來篩選CXCR8/CX化17相互作用的激動劑和括抗劑。在某些實施方案中，所述篩選使 用了利用FLira或相關檢測系統的基于細胞的檢驗，該檢驗可W是基于細胞的檢驗、生物化 學檢驗等等。在其它實施方案中，所述篩選是針對一種或多種化合物，運些化合物包括:a) 結合到CX化17的抗體或物種變體;b)CX化17的多膚序列變體或物種變體;c)CX化17的非膚 偶聯變體，包括糖基化或其它修飾;d)小分子括抗劑候選物;或e)適體文庫。類似地提供了 一種方法，其中所述篩選使用了化IPR、基于細胞的檢驗或生物化學檢驗。另外的實施方案 包括了所述篩選針對一種或多種化合物的情形，運些化合物包括:a)結合到CXCR8的抗體或 物種對應物或變體;b)CX化17的多膚序列變體，包括可溶性受體片段和物種對應物或變體； c)CX化17的非膚偶聯變體，包括糖基化或其它修飾;d)小分子括抗劑候選物;或適體文庫。 在一個具體實施方案中，使用了 Ba/F3細胞系的CXCR8轉染子來篩選CXCR8/CX化17相互作用 的激動劑或括抗劑。
[0021] i)與CXCR8信號傳導增加相關并能夠通過所述方法治療的各種胃腸病癥包括:a) 克羅恩氏病(CD)、潰瘍性結腸炎化C)、脂瀉病或腸易激綜合癥(IBS)、缺血性結腸炎、放射性 結腸炎、脂瀉病;b)胃癌、膜腺癌、結腸直腸癌或肝細胞癌、食道癌、肝癌、膽囊癌、膽管癌、胃 腸間質瘤;C)自體免疫性肝炎、原發性膽汁性肝硬化、其它(非自體免疫性)肝硬化、原發性 硬化性膽管炎或肝纖維化;或d)丙型肝炎病毒化CV)介導的肝硬化、由幽口螺桿菌引起的消 化性潰瘍。參見例如，化user,S.C.Mayo Clinic Gastroenterology and Hepatology Board Review,第四版,Mayo Clinic Scientific Press,2013;Hawkey等人,Clinical and Gastroenterology and Hepatology,第二版，Wiley-Blackwell,2012;及Yamada T.等人， Yamada's 化η化ook of Gastroenterology,第3版，Wil巧-Blackwell,2013。
[0022] j)與CXCR8信號傳導增加有關并能夠通過所述方法治療的代謝病癥包括1型糖尿 病或2型糖尿病。參見例如，Fonseca, V.A. Clinical Diabetes .Elsevier ,2012。
[0023] k)與CXCR8信號傳導增加有關并能夠通過所述方法治療的致癌性代謝病癥包括白 血病、淋己瘤或成膠質細胞瘤，或相關腦腫瘤。參見例如，Mughal，Τ. I .Understanding Leukemias , Lymphomas and Myelomas ,第2片反，Informa 2012;及Kaye , A .H.和Laws E.R.Jr.Brain Tumors,第3版,Elsevier 2012。
[0024] 1)與CXCR8信號傳導增加有關并能夠通過所述方法治療的呼吸系統病癥可W選 自：a)肺癌(6)，包括小細胞(7)或非小細胞肺癌(8)或間皮瘤(9)(惡性）;b)特發性肺纖維化 (10)、過敏性肺炎（11)或非特異性間質性肺炎;C)與間質性肺病有關的呼吸系統疾病，包括 自體免疫性疾病，如類風濕性關節炎或硬皮病;d)慢性阻塞性肺病(C0PDK12)、支氣管肺發 育異常(BPD) (13)，或哮喘（14);和/或e)其它呼吸系統癌癥，包括氣管癌、喉癌、食道癌、支 氣管癌或鼻/竇癌。參見例如，Judd, S,J,Respiratory Disorders Sourcebook,第2版， Health Reference Series ,2012;及Lechner,A.Respiratory,An integrated approach to disease;McGrawHi11 LANGE,2012。
[0025] m)所述施用可W是a)局部、局部性或全身性的;b)W氣霧劑或薄霧形式吸入;或c) 與另一治療劑組合。
[0026] η)提供了一種疫苗，該疫苗包含CX化17激動劑例如作為佐劑和/或激動劑，或包含 正別構調節物，也就是說，提供了無改變受體(CXCR8)的信號傳導能力的激動劑或括抗劑活 性(對于CX化17)的分子。該疫苗可W包括保護性抗原，如針對乙型肝炎、人乳頭瘤病毒、DPT 和/或麻疹病毒的疫苗中的那些。在一些情形中，祀抗原是腫瘤相關抗原(包括選自W下癌 癥的腫瘤:肺癌、膜腺癌、結腸直腸癌、前列腺癌、乳癌、肝細胞癌、軟組織肉瘤和/或成膠質 細胞瘤），或在彌散性白血病和淋己瘤中。所述疫苗可W用于選自肺癌、膜腺癌、結腸直腸 癌、前列腺癌、乳癌、肝細胞癌、軟組織肉瘤或成膠質細胞瘤的癌癥。所述疫苗可W施用給受 試者。參見例如，Pl〇tnA，S.A.等人，化ccines,第6版，Elsevier 2012。在其它實施方案中， 所述疫苗可W包括能夠抑制耐受性細胞募集的適合濃度的CX化17括抗劑。
[0027] 0) -種調節受試者升高的血壓的方法，所述方法包括施用適量的CXCR8激動劑W 調節所述血壓。在一些實施方案中，升高的血壓可W是高血壓。所述激動劑可W選自：a)重 組人CX化17;b)人CX化17的多膚變體(包括物種變體）；c)CX化17的非膚偶聯變體(例如糖基 化或其它修飾）。
[00%] P)-種募集巨隧細胞或樹突狀細胞的方法，所述方法包括施用CXCR8括抗劑(例如 并收集所述細胞）；所述方法可W另外包括施用CCR2激動劑，如CCL2，定義為在表達CCR2的 細胞中引起巧流動的分子。
[0029] q) -種使用CXCR8作為人類疾病發病機理中所設及的細胞標記物的方法，所述疾 病包括胃腸疾病、代謝疾病及呼吸系統疾病和癌癥，所述CXCR8是白血病、淋己瘤、胃癌、結 腸直腸癌或膜腺癌的轉移性細胞的生物標記物、包括小細胞或非小細胞肺癌在內的肺癌或 惡性間皮瘤的轉移性細胞的生物標記物，或浸潤性胃腸道或呼吸系統癌癥的細胞的預后生 物標記物。
[0030] r)一種治療或預防動脈粥樣硬化（參見例如，George , S.J. Atherosclerosis : Molecular and Cellular Mechanisms,Wiley-Blackwell 2012)，或者治療或預防多發性 硬化（參見例如，Hoi land, N.等人,Multiple Sclerosis,第4 版,Demos Health, 2012)的方 法，所述方法包括向受試者施用有效量的：a)CXCR8括抗劑；或CXCR8表達的抑制劑；或b) CXCL17括抗劑；或CXCL17表達的抑制劑。CXCR8括抗劑可W選自：a)結合至化XCR8的抗體(或 物種變體;例如結合但不傳送信號）；b)CX化17的多膚序列變體(例如可溶性受體片段;物種 變體）；c)CX化17的非膚偶聯變體（例如糖基化或其它修飾）；d)小分子括抗劑；或e)適體。 CXCR8表達或下游信號傳導的抑制劑可W使用RNAi、CRISPR、TALEN化合物等。CX化17括抗劑 可W選自：a)結合到CX化17的抗體(或物種變體;結合但不傳送信號）；b)CX化17的多膚序列 變體(包括物種變體）；c)CX化17的非膚偶聯變體(例如糖基化或其它修飾）；d)小分子括抗 劑;或e)適體。CX化17表達或信號傳導的抑制劑可W使用RNAi、CRISPR、TALEN化合物等。
[0031] S) -種抑制CX化17通過CXCR8進行的信號傳導的方法，所述方法包括使用抑制 CXCR8(受體)表達的RNAi、CRISPR或TALEN化合物來減少CXCR8受體。同樣，一種抑制CX化17 通過CXCR8進行的信號傳導的方法，所述方法包括使用抑制CX化17[配體]表達的RNAi、 CRISPR或TALEN化合物來減少CX化17。
[0032] t) 一種分離表達CXCR8的細胞的方法，該方法包括將抗CXCR8抗體與外周血單核細 胞制劑混合，及分離所述抗體所結合的CXCR8陽性細胞。在所述方法中，抗CXCR8抗體可W是 單克隆抗體、中和抗體或人源化抗體，或其組合;該分離可W通過巧光活化細胞分選進行； 和/或該分離可W通過磁珠分離進行。
[0033] 在包括治療受試者的與CXCR8信號傳導增加相關的病癥的方法在內的方法的一些 實施方案中，所述物質、激動劑或括抗劑不包括W下各物:犬尿哇嘟酸、2-酷基溶血憐脂酸、 色甘酸、雙香豆素、毛地黃黃酬、尼氣滅酸、NPPB、雙徑糞酸鹽及帕莫酸(pamoic acid)、搬皮 酬、酪氨酸憐酸化抑制素（地7巧11〇31:;[]1)-51、扎普司特^日91'；[]1日31:)、]\1]^144、]\1]^145或〔10- 2765487ο
[0034] 在本申請通篇，分子GPR35又稱為巧CR8。
[0035] 受試者可W是人類或其它動物，并且典型地是靈長類動物或哺乳動物。
[0036] 來自各種物種的CX化17的序列具有W下登錄號（全部通過引用并入本文中）： HGNC: 19232(人CX化17KHUG0基因命名委員會數據庫；同源物:MGI :2387642(小鼠 Cxcll7) (MGI數據庫）；RGD: 1304717(大鼠 Cxcl 17) (RGD數據庫）；核巧酸序列：Ref Seq:匪 198477 (NCBI參考序列數據庫）；蛋白質序列：UniProtKB:Q6UXB2化niProt Knowledgebase)。另參 見 GENBANK、NCBI、化 est、Swiss-p;rot、Unigene、Refseq、n;r-aa、PRF或PDBSTR。
[0037] 來自各種物種的CXCR8/GPR35的序列具有W下登錄號（全部通過引用并入本文 中）：HGNC:4492(人GPR35KHUG0基因命名委員會數據庫；同源物:MGI:1929509(小鼠 Gpr35) (MGI數據庫）；RGD:1309404(大鼠 Gpr35)(RGD數據庫）；核巧酸序列：RefSeq:醒 001195382 (NCBI參考序列數據庫）；蛋白質序列：UniProtKB:Q9HC97化niProt Knowledgebase)。另參 見 GENBANK、NC