一種高活性人趨化因子的制備方法及用圖
【技術領域】
[0001] 本發明設及基因工程和食品醫藥技術領域，特別設及一種高活性細胞因子 Eotaxin-I的制備方法及用途。
【背景技術】
[0002] 高活性細胞趨化因子Eotaxin-I屬于0趨化因子或CC化學趨化因子家族的成員，是 一種分子量多為8-lOkDa的一種蛋白質。W近N-端處有2個相鄰的半脫氨酸為特征。通過與 具有7個跨膜區的G蛋白偶聯受體即趨化因子受體結合，激活細胞內的信號轉導通路，在細 胞的遷移中發揮了重要作用。
[0003] 目前越來越多的研究表明Eotaxin-I的趨化因子受體CCR3在炎癥反應、過敏性哮 喘等疾病中發揮著關鍵作用，是重要的藥物祀點，通過阻斷CCR3的信號傳導途徑將有望大 大緩解或徹底治愈炎癥及過敏性哮喘等相關疾病。因此，Eotaxin-I作為趨化因子的重要的 組成部分，其研究受到了廣泛的關注。
[0004] Eotaxin-I最早發現于致敏豚鼠抗原刺激后的支氣管肺泡灌概液(BALF)中，是一 種嗜酸性粒細胞的特異性趨化因子，其基因位于第17號染色體的q21. 1-21. 2區 (Griffithsjohnson D.A.,Collins P.D.,Rossi A.G.,et al.The chemokine,eotaxin, activates guine曰-pig eosinophils in vitro and causes their accumulation into the lung in vivo[J].Biochem.Bio地ys.Res.Commun.,1993,V197(3):1167-1172)。
[0005] 1996年人Eotaxin-I基因被克隆，經研究發現，在生理抑條件下，存在單體和二聚 體之間的動態平衡。在發揮趨化功能的濃度下，Eotaxin-I呈單體形式。單體的結構中含有 S個反向平行的0片層和一個覆蓋于其上的a螺旋，W及一個無序的N-端，可W與受體靈活、 定向的結合。運樣的結構及N-端對受體結合和信號傳導都是很關鍵的，形成Eotaxin-I對大 量存在于嗜酸粒細胞上的CCR3受體具高度選擇性的結構基礎（Crump M.P. ,Rajarathnam K.,Kim K.S.,et al. Solution structure of eotaxin,a chemokine that selectively recruits eosinophils in allergic inflammation[J]. Journal of Biological Chemistry，1998，V273(35):22471-22479)。
[0006] 目前Eotaxin-I的獲得由兩種主要途徑:從活體中天然提取和用基因工程的方法 進行基因克隆到原核細胞中進行異源表達。第一種方法產量低，成本過高，不利于大規模生 產，第二種方法經常會產生過量表達，然而過量表達會產生不溶和無活性的多膚，不溶的聚 集物通常形成包涵體（Prou壯OOt A.E.I.,Bo;rlat F..化emokine P;rotocols[M].Humana Press,New York,2002,75
[0007] 87)。
[000引重組蛋白被包裹在包涵體中是不具有生物活性的，必須重新增溶、變性和復性W 促進分子內正確二硫鍵和自然構象的形成，運個過程由于增加了許多色譜分離純化步驟而 比較費時且復性效果不好。因此，需要建立一個更加快速、高效的趨化因子表達系統，不僅 可溶性蛋白表達量高，而且分離純化步驟簡單。

【發明內容】

[0009] 本發明所要解決的技術問題在于:提供了一種簡便、快速、低成本、高產量、高純度 的細胞趨化因子Eo化Xin-I的制備方法，并對其活性進行了驗證。
[0010] 為解決上述技術問題，本發明提供了一種高活性細胞因子的制備方法，包括如下 步驟：
[0011] 步驟1:根據NCBI數據庫中Eo化Xin-I的氨基酸序列，對其密碼子進行了優化，人工 合成目的基因；
[0012] 步驟2:通過設計引物在其N端引入一個或多個化S標簽、TEV酶切位點，并在N端和C 端分別引入限制性酶切位點EcoR I和化nd III;
[0013] 步驟3:利用PCR技術將目的片段進行擴增，再將基因片段雙酶切后連接到用相同 酶切割后的載體上面，而后導入大腸桿菌中進行異源表達，生產Eo化Xin-I蛋白。
[0014] 所述步驟1中，所得人工合成目的基因的核巧酸序列優選為：GGT CCG GCA TCT GTT CCG ACC ACG TGC TGT TTT AAC CTG GCA AAT CGT AAA ATT CCG CTG CAG CGC CTG GAA AGC TAT CGT CGC ATC ACC TCT GGC AAA TGC CCG CAA AAA GCG GTG ATT TTC AAA ACG AAA CTG GCG AAA GAT ATC TGT GCC GAC CCG AAA AAA AAA TGG GTG CAA GAC TCA ATG AAA TAC CTG GAC CAA AAA TCC CCG ACG CCG AAA CCG TAA。
[0015] 所述步驟2中，所得修飾后的人工合成目的基因的核巧酸序列優選為：
[0016] EcoR I site 6XHis TEV cleavage
site Hind 虹 site
[001引所述高活性細胞因子的制備方法，可W進一步包括：
[0019] 步驟4:將誘導表達后的大腸桿菌收集、破碎、離屯、、過濾、儀柱親和層析、凝膠過濾 脫鹽、酶切除去化S標簽后得到純度很高的蛋白。
[0020] 所述Eo1:axin-l基因優選源自嗜酸性粒細胞(eosinophils)。
[0021] 為解決上述技術問題，本發明還提供了一種人工合成目的基因，所述基因是根據 MrRT漸庶賠出P一。vin-1的扇巖：懶皮方Il姑甘婚陽革化紅下件從 A -T會成日的巖:巧.
[0023] 為解決上述技術問題，本發明另提供了一種人工合成目的基因，所述基因是根據 NCBI數據庫中Eotaxin-I的氨基酸序列，對其密碼子進行了優化，人工合成目的基因；并通 過設計引物在其N端引入一個或多個化S標簽、TEV酶切位點，并在N端和C端分別引入限制性 酶切位點EcoR I和化nd III;
[0024] 所得修飾后的人工合成目的基因的核巧酸序列為：
[002引 EcoR I site 6X化S TEV cleavage site Hind 虹 site
[0027] 為解決上述技術問題，本發明又提供了一種如前述任一項所述高活性細胞因子的 制備方法在制備治療肝炎、關節炎、特應性皮炎、變應性鼻炎、哮喘、寄生蟲感染、氣道慢性 炎癥、艾滋病化IV)、老年性黃斑變性、脈絡膜新生血管性疾病、動脈粥樣硬化、免疫性血小 板減少癥、和/或炎癥及免疫相關疾病的藥物中的應用。
[0028] 為解決上述技術問題，本發明再提供了一種如前述任一項所述人工合成基因在制 備治療肝炎、關節炎、特應性皮炎、變應性鼻炎、哮喘、寄生蟲感染、氣道慢性炎癥、艾滋病 化IV)、老年性黃斑變性、脈絡膜新生血管性疾病、動脈粥樣硬化、免疫性血小板減少癥、和/ 或炎癥及免疫相關疾病的藥物中的應用。
[0029] 為解決上述技術問題，本發明另提供了一種如前述任一項所述高活性細胞因子的 制備方法和/或所述人工合成基因，在治療肝炎、關節炎、特應性皮炎、變應性鼻炎、哮喘、寄 生蟲感染、氣道慢性炎癥、艾滋病化IV)、老年性黃斑變性、脈絡膜新生血管性疾病、動脈粥 樣硬化、免疫性血小板減少癥、和/或炎癥及免疫相關疾病的藥物設計方面的應用。
[0030] 所述的表達載體為普通大腸桿菌表達載體，優選質粒祀T28a、pET32a、pMAkp4X， 分別對應于大腸桿菌宿主細胞化21 (DE3)、0rigami、TB1。
[0031] 本發明還進一步對所用表達載體、誘導時機、誘導溫度和時間進行了優化，最終優 化的表達條件為:表達載體選用祀T28a、OD6〇o = 1.0~1.3、誘導時間為化、誘導溫度為25°C。
[0032] 本發明方法還可W用SDS-PAGE、質譜方法對制備得到的蛋白的純度和分子量進行 了分析和驗證，用表面等離子共振技術(SPR)對制備得到的Eo化Xin-I的生物活性進行了表 征。
[0033] 本發明制備得到的Eotaxin-I有生物活性且純度很高，在相關疾病的治療和藥物 的設計方面顯示了很大的應用前景。
[0034] 本發明有益的技術效果在于：
[0035] 1.本發明為運用基因工程技術，將Eotaxin-I基因進行了優化，并在其N端加入了 能與Ni柱特異性結合的化S標簽W及后續可W去除標簽的TEV酶切位點，在N端和C端分別加 入限制性酶切位點EcoR I和化nd III，連接到表達載體上然后轉入相應的大腸桿菌表達體 系中，在菌體ODsoo= 1.0~1.3時加入IPTG誘導蛋白表達。運一生產過程生產周期為12個小 時，同時大腸桿菌易于實現高密度大規模培養，從而大大縮短了培養時間，降低生產成本。
[0036] 2.大腸桿菌細胞容易破碎，且含雜蛋白比較少，因為是誘導型表達，有利于目的蛋 白的富集和反應過程的調控，使得下游純化過程變得更加簡單，容易獲得低成本、高產量、 高純度的Eo化xin-1蛋白。
[0037] 3、本發明通過優化最終選擇表達菌株祀T28a/BL21(DE3)，使Eotaxin-I水溶性表 達量高，包涵體形成較少，所得蛋白結構折疊正確、性質穩定。培養IL大腸桿菌可W獲得 8.7mg左右的蛋白，和傳統提取方法相比產量提高100倍W上。
[003引 4、本發明Eotaxin-I的分離純化過程簡單，只經過儀柱親和層析和凝膠層析兩步， 減少了過多的分離純化步驟對蛋白活性和產量的影響。
[0039] 5、在蛋白的純化過程中雜蛋白組氨基酸的含量比較少，在與目的蛋白進行競爭性 結合Ni柱時，由于結合力較弱非常容易就被少量的咪挫洗脫下來，而目的蛋白用500mM的咪 挫洗脫，從而得到純度很高的蛋白。
[0040] 6、本發明中通過Eo化Xin-I表達體系的選擇、表達條件的優化和表達過程的調控， 最終獲得的蛋白單體比較多，二聚體和寡聚體比較少。
[0041] 7、本發明用表面等離子共振技術(SPR)對制備得到的Eotaxin-I的生物活性進行 了驗證，通過活性實驗可