包含二級結構的寡核苷酸及其用圖
【技術領域】
[0001] 本發明設及寡核巧酸，并尤其設及它們作為探針在使用可檢測標記物(例如目視 可檢測的標記物)檢測雜交事件和檢測和/或區分核酸中的用途。
【背景技術】
[0002] 基于用可檢測標記物(例如巧光團)標記的寡核巧酸的探針技術，尤其W巧光團作 為5'憐酸末端處添加物的探針技術已經建立已久。運種末端標記價廉，并且因此運類探針 的開發和應用廣泛遍及各種分子生物學應用。相比之下，其中多個巧光團可W與寡核巧酸 序列內部的核巧堿基或糖連接（即內部標記）的優化探針設計，例如HyBeacon探針(French et al，（2001)、W0 01/73118、W0 07/010268)應用并不廣泛，原因在于運類內部巧光團添加 本身更為昂貴。在末端標記的寡核巧酸中，通常還需要存在單獨的澤滅物分子，W防止在寡 核巧酸與祀多核巧酸雜交前的信號。內部標記的寡核巧酸（例如W0 01/73118、W0 07/ 010268中描述的那些)通常不需要單獨澤滅物的存在，原因是寡核巧酸探針的單鏈序列作 為標記物的澤滅物(DNA澤滅)而發揮作用。
[0003] 建立已久的使用標記核酸寡核巧酸作為祀核酸序列（DNA或RNA)存在的報道分子 的領域利用了基于寡核巧酸的探針與其祀核酸序列的直接核巧酸序列互補性，W及其與基 因組背景相比足夠的共有序列所實現的唯一匹配。
[0004] 寡核巧酸與核酸序列的雜交消除了 DNA澤滅和染料-染料相互作用，并且引起巧光 發射的增加(W0 01/73118、W0 07/010268)。巧光發射的變化使得可W檢測特異的核酸序 列，探針和祀之間相互作用的穩定性，使得可W基于長度和序列區分多態性序列（French et al.2001,Rrench et al.2002,Rrench et al.2007,Rrench et al.2008)。
[0005] 除非需要獲得與探針-祀相互作用并存的特定的額外分子端點，否則沒必要刻意 使用部分序列互補性或使用在探針及其祀之間提供媒介雜交事件的額外寡核巧酸。
[0006] 在巧光寡核巧酸探針的例子中，常規探針-祀雜交配對中發現的直接序列互補性 的重要增量收益在于，祀中的任何序列變異(如單核巧酸多態性(SNP))直接破壞了運種雜 交并且因此直接破壞了探針的巧光輸出。
[0007] 主要地，已知寡核巧酸探針中的DNA莖環序列可用于信號生成和祀檢測，從而使得 在寡核巧酸與祀多核巧酸雜交時，莖環結構消失（即寡核巧酸不再具有二級結構）。
[000引"分子信標"是形成莖環結構的單鏈寡核巧酸（Tyagi&Kramer，1996 ;Tyagi et al. 1998)。莖包括位于探測序列任一側的兩條互補的核酸序列。莖序列之一通常用巧光團 標記，另一條通常用非巧光澤滅物標記。莖環結構使巧光團和澤滅物部分緊密靠近，從而充 分澤滅巧光發射。分子信標寡核巧酸的環組件與祀核酸互補，并且雜交引起莖環解離，原因 是分子間的探針/祀雜交比寡核巧酸莖序列之間的分子內相互作用更穩定。巧光團和澤滅 標記物在探針雜交時由于莖環結構的解離而分離，運導致信號發射增加。分子信標寡核巧 酸可用于實時PCR和解鏈曲線分析。
[0009] 與分子信標類似，Knemeyer et al. (2000)描述了運樣的寡核巧酸（Sma;rt探針 (Smad probes))，所述寡核巧酸具有莖環結構，但卻通過光誘導的分子內電子轉移至一條 寡核巧酸莖序列內的鳥嚷嶺殘基而實現了巧光澤滅。連接在一條寡核巧酸莖序列末端的巧 光團（例如嗯嗦染料JA242)與發夾的互補莖序列中的富含G序列緊密靠近。探針與祀序列的 雜交將巧光團與富含G序列分開，從而導致巧光增強。
[0010] Scorpion?引物包含位于莖環結構內部的探測序列，其具有位于探測序列任一側 的互補莖序列(怖itcombe et al.l999;Thelwell et al.2000)。連接至寡核巧酸5'末端的 巧光團部分被連接至莖環的3'末端的內部澤滅物修飾所澤滅。莖環序列通過PCR制止物(例 如六乙二醇化EG))而與PCR引物的5'末端連接。引物組件的延伸產生了用于寡核巧酸的探 測組件的祀序列。與所擴增的祀的分子內探針雜交引起了莖環結構的解離W及巧光發射的 增加。
[0011] 分子信標、Smad探針和Scorpion?引物利用了具有位于探測序列的兩個末端的莖 序列的發夾結構。環與祀多核巧酸結合，但莖序列不與祀相互作用。
[0012] Satterfield et al. (2007)和US2009/0305264描述了具有類似于分子信標(其中 巧光團和澤滅物部分在發夾內緊密靠近)且通過連接子與捕獲探針序列連接的莖環序列的 寡核巧酸(Tentacle探針?)。捕獲探針組件與祀序列結合，并使莖環組件與下游祀緊密靠 近。然后，發夾的探針序列與祀序列結合，從而將巧光團和澤滅標記物分開，并增加巧光發 射。據報道，捕獲探針序列的加入改善了雜交的動力學。
[0013] W0 2010/101947也描述了用于檢測核酸序列的莖環寡核巧酸（也是tentacle探 針?的形式）。在不存在祀的情況下（用于染料澤滅或FRET)，發夾結構在5'或3'末端形成，從 而使兩個標記物緊密靠近。寡核巧酸末端之一(5'或3'）與探針序列的內部區域互補，發夾 的環與核酸祀互補。另一個寡核巧酸末端(3'或5'）的延伸超出發夾，從而引發祀雜交并幫 助莖環結構內探測序列的雜交。發夾之外的額外的探測序列改善了雜交的動力學。祀雜交 引起寡核巧酸標記物分離，用于去除巧光澤滅或FRET相互作用。
[0014] 化zarenko et al.(1997)描述了具有連接到引物的5'末端的莖環結構的寡核巧 酸(Sunri Se引物或Amp 1 if 1 uor?)。巧光團連接到寡核巧酸的5 '末端，澤滅物的位置接近引 物的3'末端。莖環結構的形成使巧光團和澤滅物部分在莖上緊密靠近，從而引起高效的巧 光澤滅。PCR擴增使Sunrise引物被引入到擴增產物中，阻止了莖環結構的形成，并引起巧光 團和澤滅物部分的分離。巧光發射在擴增的祀序列存在下增加。然而，由引物二聚體產生的 非特異性擴增也可W導致巧光發射增加。
[0015] 化zarenko et al.(2002)描述了用位置臨近引物3'末端的單個巧光團標記的寡 核巧酸化UX引物?Κ5-7個核巧酸的序列位于寡核巧酸的5'末端，其與引物的3'末端互補， 從而產生發夾。寡核巧酸不包含澤滅物修飾，但是在發夾中使用DNA澤滅，從而在無祀時降 低信號發射。PCR擴增導致寡核巧酸被引入到擴增產物中，運阻止了莖環結構的形成，并且 去除了發夾施加的DNA澤滅。
[0016] Tentacle探針?、sunrise引物和LUX引物?全部使用莖環序列，用于通過使用發夾 結構使兩個標記物(或一個標記和澤滅核巧酸序列)在無祀時緊密靠近而檢測祀。探針和祀 核酸的雜交導致寡核巧酸標記物分開，從而可W測定改變的巧光發射。在每種情況下，祀特 異性核巧酸序列均被引入到發夾結構中。
[0017] US 2007/0015176教導了具有變化的二級結構且每一種二級結構均包含至少一個 莖環結構的檢測探針。US 2007/0015176的檢測探針均要求具有含兩個獨立寡核巧酸的雙 鏈核巧酸結構。
[0018] US 2006/0216692描述了用巧光標記物和澤滅物分子兩者標記的核酸構建體。標 記的寡核巧酸包含至少一個莖環結構，并且發揮在兩個可選二級結構之間轉換的可轉換構 建體的功能。第一二級結構包含兩個莖環結構，并且使澤滅物和巧光團彼此緊密靠近，在雜 交祀構象時形成的另一二級結構是延長的莖環結構(具有一個延長的莖），從而使巧光團和 澤滅物不再緊密接近，并且使信號為可檢測的。與祀雜交的寡核巧酸部分位于(雙莖環構象 中）一個莖環結構的環部分中，并且位于延長的單莖環結構的莖中。
[0019]還有一些研究關注于防止在提供合適的單鏈DM延伸溫度W前，引物寡核巧酸在 反應混合物中參與DNA聚合酶引物延伸。一個方法是包含一個短的雙鏈構型的引物的3 '末 端，其中引物的5'末端具有在合適的溫度解鏈開從而用于引發的序列。引物的構型可W是 環（Ailenberg and Silve;rman(2000)，或者發夾化aboev et al.2000，Nazarenko et al.2002)。運些結構旨在能夠進行優選聚合酶延伸溫度下的3'延伸。Nazarenko et al. (2002)觀察到，引物二聚體假體可影響基于探針的方法，原因是引物二聚體的形成抑制了 特異擴增子的形成。
[0020] US 2006/0088856描述了用巧光團和澤滅物標記，并且巧光團或澤滅物任一者連 接3'核巧酸的寡核巧酸。US 2006/0088856的寡核巧酸在單鏈時W及和祀核酸結合時均顯 示顯著恒定水平的信號發射。寡核巧酸在祀擴增過程中雜交，并且通過標準DNA聚合酶的 5'-3'方向的加工功能而被切割，從而使巧光團和澤滅標記物分開。使巧光團和澤滅物分開 的切割是產生可檢測信號的作用。US 2006/0088856例舉了與標準的線性5'-3'水解探針相 比，改善了祀的實時擴增和檢測的具有5'發夾的寡核巧酸(使檢測Ct降低2-3個循環）。所描 述的發夾結構旨在改善實時擴增的速度和效率，從而能夠提高利用快速PCR熱循環的測試 靈敏度。
[0021] W0 2006/020933描述了含有利用澤滅物-巧光團對的探針且僅能夠在切割探針后 被檢測的發夾。W0 2005/007818描述了含有發夾的標記探針，其中在PCR中所述探針在3'末 端延伸。W0 99/2462UEP 0881302和W0 98/02449均描述了含有標記的發夾的探針，其中EP 0881302和W0 98/02449還公開了使用僅在其分離后可被檢測的澤滅物-巧光團對。此外，W0 98/02449需要探針在PCR中在3 '末端延伸。
[0022] 寡核巧酸探針通常包含在PCR或等溫擴增反應中，從而檢測所擴增的祀序列，同時 不直接參與擴增過程。在運方面，標準操作是通過寡核巧酸3'末端的修飾而加入保護帽，從 而降低來自探針的聚合酶延伸。然而，具有強的3'-5'核酸外切酶活性的聚合酶可引起運些 3'修飾被去除，從而使寡核巧酸探針能夠被延伸并用作引物。運種核酸外切酶活性和/或寡 核巧酸探針的延伸可降低目視可檢測的標記物的有效性。

【發明內容】

[0023] 本文描述了標記寡核巧酸探針設計中的新變化，目的是通過阻止3'-5'核酸外切 酶切割和聚合酶介導的寡核巧酸探針延伸而改善寡核巧酸探針的功能。
[0024] 本發明的第一方面提供了具有5 '末端和3 '末端的單鏈寡核巧酸，所述寡核巧酸包 含第一區段和第二區段，第一區段位于第二區段的5'，并且其中：
[0025] (i)第一區段用至少兩種可檢測的標記物標記，并且能夠與祀多核巧酸雜交;并且
[0026] (ii)第二區段不能與祀多核巧酸雜交;所述第二區段包含莖環結構，所述莖環結 構含有第一部分、第二部分和第Ξ部分，并且其中第二部分位于第一部分和第Ξ部分之間， 并且第一部分和第Ξ部分彼此互補，其中所述莖環結構沒有用可檢測標記物標記；
[0027] 并且進一步地，其中，當用在檢測祀多核巧酸的方法中時，所述寡核巧酸(a)不被 3 ' -5 '核酸外切酶切割，且(b)不被聚合酶延伸。
[0028] 第二區段的第二部分(環)能夠實現第一部分和第Ξ部分(莖序列)360°回折。
[0029] 3'莖環結構被本發明的寡核巧酸用于阻止在PCR中或擴增混合物中（尤其是具有 多個引物序列存在的多重成分中）與其他寡核巧酸的配對，并且用于阻止3'pc啡a斷性修飾 的3 ' -5 '核酸外切酶切割。3 '莖環結構還用于阻止獨立于寡核巧酸二聚體形成而發生的3 ' - 5'核酸外切酶切割，例如在擴增過程中當探針與祀核酸雜交時。3'莖環結構避免了探針延 伸W及可阻止所擴增祀序列的檢測的額外較高Tm解鏈峰的產生。本發明的莖環序列與探針 寡核巧酸的3 '末端連接，任選通過連接子或間隔子修飾而連接，并且不與所擴增的核酸祀 序列雜交。
[0030] 莖環結構具有被非互補序列分開并且彼此具有相當大的互補性的兩條核巧酸序 列。互補序列通過分子內自雜交而形成雙鏈的"莖"，間插的非互補序列生成"環"。DNA莖環 二級結構通常還被稱為"發夾"。
[0031 ]莖環序列應優選地在PCR延伸階段中形成發夾結構，W防止3 '探針修飾被3 ' -5 '核 酸外切酶活性去除。Ξ步驟PCR方案和兩步驟PCR方案的延伸階段通常在55°C至72°C之間。 因此，發夾的解鏈溫度應大于55°C，并優選大于65°C。合適的解鏈溫度可W通過富含GC的短 莖序列的分子內雜交而實現。間插性環優選富含AT，但也可包含任何組合的核巧酸，前提是 該序列與莖、探針或祀序列沒有同源性。構成莖環的莖的寡核巧酸部分應通常為富含GC的 互補序列。
[0032] 在設計寡核巧酸探針時，使用最近鄰熱力學計算確定解鏈溫度（Breslauer et al. 1986; San化Lucia, 1998)。探針解鏈溫度代表了與祀DNA序列的分子間雜交的穩定性。還 可W使用最近鄰熱力學確定寡核巧酸二級結構的分子內穩定性。
[0033] 寡核巧酸AG(G化bs自由能）定義為體系和環境之間的凈能量交換。W下計算可W 用來確定寡核巧酸A G:
[0034] Δ6=ΔΗ-Τ.Δ8
[0035] 其中，ΔΗ是洽(體系和環境之間的總能量交換），Δ8 =賭（由體系消耗于自我組織 的能量），Τ =溫度(開氏溫度）。對于寡核巧酸，正AG值表示體系將按單鏈的方向移動，而負 A G值表示體系將按產物（即探針/祀雙鏈體或寡核巧酸二級結構）的方向移動。當AG = Okcal/摩爾時，體系處于平衡，并且當50%寡核巧酸為單鏈并且50%為雜交時，運通常是體 系的Tm。負AG值提示寡核巧酸二級結構并且幅度可W決定引物和探針的性能。
[0036] 利用mfold?程序(Zuker，2003)，可W評價寡核巧酸序列形成莖環結構的能力。通 過利用基于最近鄰熱力學的自由能計算的11^〇1(1(5曰]11曰山(^曰，1998)，還可^確定二級結構 的AG和Tm值。發夾結構的穩定性取決于莖和環組件的長度和序列(參見實施例的表6)。
[0037] 探針系統的寡核巧酸具有與祀多核巧酸序列互補的序列。因此，寡核巧酸能夠在 適宜條件下與祀多核巧酸序列雜交。因此，除非上下文指明，否則，"互補"包括寡核巧酸能 夠與祀多核巧酸序列雜交的含義。寡核巧酸可w與祀多核巧酸序列完全互補（即寡核巧酸 之間的堿基配對完美匹配），或寡核巧酸可W部分互補于祀多核巧酸序列（即在寡核巧酸和 祀多核巧酸序列之間存在一個或多個錯配，但是寡核巧酸仍然能夠雜交）。一般，當寡核巧 酸部分地與祀多核巧酸互補時，存在少于5個錯配，優選1個或2個或3個或4個錯配，更優選1 個錯配。
[0038] 在提到"雜交"或寡核巧酸和/或引物與另一個核巧酸序列"雜交"的能力時，技術 人員將理解，運類雜交能夠在用于解鏈或退火曲線分析的條件下發生，所述解鏈或退火曲 線分析一般在15 °C至95 °C、優選地在35 °C至75 °C進行。
[0039] 莖(和/或連接子)序列的前（5'）兩個核巧酸不應與祀互補，從而避免增加探針雜 交的長度。優選地，整個5'莖(和/或連接子)序列不應與祀核巧酸互補，從而避免增加探針 雜交的長度。另外，連接子、莖和環序列的序列不應與探測序列互補，其中Ξ個或更少的連 續核巧酸應互補，從而確保發夾的形成W及探針與核酸祀的正確雜交。
[0040] 祀多核巧酸可W是任何感興趣的多核巧酸或其中的序列變異。祀多核巧酸因此可 W衍生自任何來源，運取決于正在進行的檢測的應用，其中運類來源包括包含核酸的生物， 即病毒；原核生物，