涉及具有強烈降低的受體結合親和力的細胞因子的融合因子的制作方法
【專利說明】潰及具有強烈降低的受體結合親和力的細胞因子的融合因子
[0001] 本發明設及一種包含至少兩個細胞因子的融合蛋白，其中至少一個是對它的受體 或對它的一種受體具有強烈降低的結合親和力的修飾的細胞因子。優選地，兩個細胞因子 由接頭，優選是GGS接頭連接。本發明還設及用于治療疾病的所述融合蛋白。
[0002] 細胞因子是分泌或膜結合的小蛋白質，其在細胞間通訊中起至關重要作用。細胞 因子結合于它的同源受體復合物會觸發細胞內信號傳導事件的級聯，所述級聯使得細胞能 夠根據細胞、細胞作為其一部分的組織和器官的需要感應它的周圍環境并對它的周圍環境 起應答。它們在特征上是多效性的，運意味著視祀細胞的性質和發育狀態而定，它們激起廣 泛范圍的應答。此外，它們中的一些是高度冗余的，因為若干細胞因子具有重疊活性，此使 得它們能夠在功能上彌補相互損失。細胞因子活性可為自分泌性、旁分泌性或內分泌性的， 從而導致在指定術語細胞因子、膚激素和生長因子之間的模糊界限。
[0003] 已知六種不同結構類別的細胞因子:a螺旋束細胞因子，其包括大多數白介素、集 落刺激因子和激素樣生長激素和瘦素(Nicola和化Iton, 1998) 聚腫瘤壞死因子(TNF)家 族(I化iss和Naismith,2000);半脫氨酸結生長因子(Sun和Davies, 1995);包括白介素-1家 族的PS葉形折疊(0-trefoil fold)組(Murzin等，1992);白介素17(比-17)家族(Gaffen, 2011)和趨化因子(Nomiyama等，2013)。
[0004] 若干細胞因子已得到重要臨床應用。實例包括紅血球生成素化PO)、粒細胞集落刺 激因子(G-CSF)、干擾素 a2和-PW及生長激素。相反，常常由于它們的促炎癥性質，使所選細 胞因子括抗也得到特定醫學應用。此處的主要實例是用W阻斷TWa活性W抗擊如類風濕 性關節炎的自體免疫疾病的策略。由于運些成功，正在探究用W優化細胞因子在臨床中的 活性的策略。運些策略包括優化半衰期，降低免疫原性，向特定細胞類型進行祀向遞送W及 遺傳融合兩個細胞因子，即所謂融合因子(fusokine)。
[0005] 融合因子是使用接頭序列遺傳連接的兩個不同細胞因子的人工組合。融合因子的 首個實例是作為粒細胞-巨隧細胞集落刺激因子(GMCSF)和IL-3的融合蛋白的PIXY321或 pixykine(Donahue等，1988)，其相較于任一單獨細胞因子顯示優越的造血和免疫作用。運 個作用可通過與它們的相應受體復合物的結合增強來解釋。值得注意的是，兩種受體共有 信號傳導性ec亞單位，從而排除在信號轉導水平上的協同作用。在III期臨床試驗中， PIXY321在相較于單獨GM-CSF時未顯示優越性質（O'Shau曲nessy等，1996)。也探究了與IL-2家族的細胞因子的基于GM-CSF的融合因子。運些細胞因子都通過包含T C亞單位的受體復 合物進行信號傳導。與GM-CSF的此類融合因子的實例包括化-2(Stagg等，2004)、化-15 (Rafei 等，2007)和比-21 (Williams 等，2010a)，也稱為GIFT2、GIFT15 和GIFT21。在信號傳導 水平（即祀細胞內的協同作用）與細胞水平（即不同祀細胞類型之間的協同作用）兩者上均 可預期協同作用。舉例來說，GIFT2相較于未融合細胞因子的組合誘導更強力NK細胞活化 (Penafuerte等，2009)，而GIFT15誘導未曾預期的強力免疫抑制性B細胞群體（Rafei等， 2009a)。同樣地，GIFT21對單核細胞發揮出乎意料的促炎性作用(Williams等，201化）。組合 a螺旋細胞因子的融合因子的另一實例是比-2^kl2(Gillies等，2002;化hn等，2012)。
[0006] 另一類別的融合因子組合來自不同結構家族的細胞因子。實例包括IL-18(IL-1細 胞因子家族的成員）和IL-2的融合物(Acres等，2005) W及IL-18與EGF(表皮生長因子)之間 的融合物。因為常觀察到EGFR在某些腫瘤細胞類型上過度表達，所W后述融合因子提供使 比-18活性祀向EGFR+腫瘤細胞的可能性化U等，2008)。也更詳細地探究了a螺旋束細胞因子 與趨化因子之間的融合物。趨化因子常使用濃度梯度起操縱免疫細胞向感染和炎癥部位 遷移的作用。許多趨化因子受體顯示限制性表達模式，從而允許祀向所選(免疫)細胞。此 夕h通過蛇根堿(serpentine)進行信號傳導，G蛋白偶聯趨化因子受體在根本上不同于由a 螺旋束細胞因子受體復合物活化的路徑，并且可預期正協同和負協同交互作用機理。值得 注意的是，趨化因子的設計N末端截短形式可保留它們的受體結合性質，但顯示括抗性行 為。一實例是GM-CSF與缺乏前5個N末端氨基酸的N末端截短的CCL2之間的融合因子，也稱為 GMMEl (Rafei等，2009b)。運個融合因子誘導炎癥性CCR化細胞的調亡，并且用GMMEl處理的 小鼠顯示實驗誘發的自體免疫疾病評分(包括分別針對多發性硬化癥(Rafei等，2009b)和 類風濕性關節炎(Rafei等，2009c)的EAE和CIA)降低。同樣地，運個融合因子誘導CCR化腫瘤 細胞的調亡(Rafei等，2011)。
[0007]然而，W前未探究野生型細胞因子與對它的同源受體復合物具有強烈降低的親和 力的突變細胞因子之間的融合物。運個方法的優勢是野生型細胞因子的可能全身性毒性被 消除。驚人地，我們發現此類融合因子允許細胞因子活性達成細胞特異性祀向，借此此類突 變細胞因子可重新獲得它對祀向細胞的活性，而不具有野生型細胞因子的負面作用。如W 下所例示，已使用=種各自由來自在結構上不同的細胞因子類別的兩個細胞因子組成的融 合因子證明該原理的一般適用性。
[000引 X化l/IFNa2突變體
[0009] X化1是一種由CD8+T細胞、Thl細胞極化CD4+T細胞和NK細胞分泌的93個氨基酸的趨 化因子。它與僅由樹突細胞表達的趨化因子受體XCRl相互作用。在小鼠中，XCRl在大多數脾 CDllc+CD8a+樹突細胞中表達，而僅有極少的子組CDScT樹突細胞表達運個受體(Dorner等 2009) dXCRI是與小鼠 CDSa+樹突細胞同源的哺乳動物細胞(包括人細胞)的保守選擇性標志 物(Crozat等2010)。引起關注的是，已顯示I型干擾素（IFNa/e)對運個樹突細胞子組的作用 對小鼠中先天性免疫識別生長的腫瘤至關重要(化ertes等2011)。
[0010] 全身性IFNa療法具有相當大的毒性，包括如重度疲勞、發熱、寒冷、抑郁、甲狀腺功 能障礙、視網膜疾病、脫發、皮膚干燥、皮疹、發癢和骨髓抑制的副作用。因此，將高度值得的 是使IFN活性僅祀向應該用IFN處理的細胞群體。對于在抗腫瘤療法中應用，祀向表達XCRl 的樹突細胞的群體是高度合乎需要的，因為運些細胞專口致力于抗原交叉遞呈(Bachem等 2012)。許多實驗數據表明表達XCRl的樹突細胞群體代表在腫瘤微環境中必須與I型IFN反 應W引發最終將允許達成腫瘤破壞和免疫的免疫應答的關鍵細胞群體(Gajewski等2012)。
[0011] 人IF化2-Q124R突變體對鼠類IFNARl鏈具有高親和力，而對鼠類IFNAR2鏈具有低 親和力(Weber等，1987)。它顯示對鼠類細胞的活性極低，并且因此代表適于使IF腳舌性祀向 所選小鼠細胞的工程改造的I型IFN亞型的原型(PCT/EP2013/050787)。
[0012] (XL2O/IL10
[0013] CC趨化因子(XL20,也稱為肝和活化調控的趨化因子（LARC)、巨隧細胞炎癥性蛋 白-3a(MIP-3a)或Exodus-I,是一種主要在肝和淋己組織中表達的96個氨基酸的蛋白質 化iesMma等，1997)。在分泌后，(XL20通過結合屬于G蛋白偶聯受體(GPCR)I家族的CC趨化 因子受體6(CCR6)來發揮它的活性(Baba等，1997)。報道了關于不同白細胞子組的CCR6表 達，但化17細胞群體的CCR6表達被文獻最充分證明（Sin曲等，2008)。正常化17功能為針對 一定范圍的病原體的保護性免疫所必不可少，所述病原體包括結核分枝桿菌 (Mycobacterium tuberculosis ) (Khader等，2007)、肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae) "e等，2001)和百日咳博德特氏菌（BordetelIa pe;rtussis)巧iggins等， 2006) O
[0014]已堅定地確定IL-10對不同T細胞子組(特別是化17細胞）的擴增和分化的增強作 用（Sutton等，2006; Acosta-Ro化iguez等，2007; Dunne等，2010;化aw等，2012)。在T細胞子 組之中，化17細胞表達最高水平的IL-1R，并且IL-I在化17致敏中起重要作用。因此，控制激 動性IL-I活性可應用于其中免疫刺激性作用將為合乎需要的不同生理/病理過程中。然而， 關于在免疫刺激性療法中使用IL-I的一個主要顧慮是它在全身性施用時的重度毒性。因 此，當可使IL-I作用限于所選細胞群體時，毒性問題可能被解決，運打開例如作為T細胞佐 劑用于增強對微弱疫苗的應答的治療遠景(Ben-Sasson等，2011)。為使IL-I突變體特異性 祀向化17細胞群體，使用由融合于CCL20祀向部分的突變IL-I組成的IL-I變體。因為活化將 僅被限于表達CCR6的細胞(即Thl7細胞），所W預期無重大全身性毒性。
[001引 TNFa/瘦素突變體
[0016] TWa是一種具有廣泛范圍的生物活性的細胞因子，所述活性包括細胞毒性、調控 免疫細胞W及介導炎癥性應答。它是一種具有233個氨基酸的自我裝配性、非共價結合的同 源S聚II型跨膜蛋白。TNFa作為膜結合W及可溶性蛋白質具有活性，在由TNFa轉化酶 (TACE，也稱為ADAM17)蛋白水解裂解76個氨基末端氨基酸(前導序列）之后從細胞膜釋放。 它通過均為在配體結合的細胞外結構域中具有富含半脫胺酸的基序的跨膜糖蛋白的巧中不 同受體，即TNF-Rl (p55)和TNF-R2 (p75)進行信號傳導。盡管具有細胞外同源性，但它們具有 不同的細胞內結構域，并且因此信號傳導不同的TN巧舌性化ehlgans和Pfeffer ,2005)。如W 前由Bosched等，2010所述，我們產生由通過GGGGS接頭偶聯的S個TNF單體組成的單鏈變 體（scTNF)。
[0017] 瘦素是一種設及許多生物過程，包括免疫、繁殖、線性生長、葡萄糖穩態、骨代謝和 脂肪氧化的16kDa的脂肪細胞細胞因子，但因它作為飽腹感信號的顯著作用而最眾所周知 化alaas等，1995)。由于它對免疫細胞的作用，瘦素也牽設于若干自體免疫疾病中（Ukuni 等，2008)。瘦素活性的選擇性祀向可有益于代謝病癥與免疫或炎癥相關病癥兩者。
[0018] 本發明的第一方面是一種包含至少兩個細胞因子的融合蛋白，其中至少一個