用于在胱天蛋白酶抑制劑存在下無細胞蛋白合成的方法和裝置的制造方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及在脫天蛋白酶抑制劑的存在下使用真核細胞裂解物進行無細胞蛋白 合成的改進的方法、用于進行此方法的裝置、W及在此種使用真核細胞裂解物合成蛋白的 無細胞方法中脫天蛋白酶抑制劑用于提高所合成蛋白的產率和/或穩定性的用途。
【背景技術】
[0002] 近來，無細胞蛋白合成已經成為體內蛋白表達的有效替代(化rlson，E.D.et al.， Biotechnology Advances，2012,30(5) :pp. 1185-1194)。在本文中，使用細胞內含物W便W 快速、可靠 W及有成本效益的方式來制造特定的目標蛋白。所獲得的細胞提取物也稱作細 胞裂解物，含有無細胞蛋白合成所需的基本成分:核糖體、翻譯因子和酶。如今，可W在原核 細胞W及真核細胞裂解物中W有功能活性的形式制造選定的重組蛋白。目前，如下基于真 核細胞裂解物的翻譯系統的使用日益增多：麥胚裂解物、網狀細胞裂解物、昆蟲細胞裂解 物、W及來自化La和化La雜交瘤細胞的細胞提取物。
[0003] 與基于大腸桿菌巧scherichia coli)的原核體外翻譯系統相比，使用大部分真核 翻譯系統的蛋白產率相對較低(上文的化rlson et al.)。運一方面的例外是極其有效的麥 胚裂解物表達系統。基于蛋白和反應形式，其實現了每毫升反應體積幾百微克蛋白（Madin， K.et al.，Proc.化 tl. Acad. Sci. USA, 2000.97(2) :pp. 559-64)。然而，此細胞提取物不適宜 用于合成具有翻譯后修飾(例如糖基化)的蛋白。
[0004] 基于昆蟲細胞裂解物和網狀細胞裂解物的真核翻譯系統使得可W合成具有翻譯 后修飾的復雜結構的蛋白（其不能在大腸桿菌中合成）。然而，網狀細胞裂解物必需為此目 的而用另一物種的微粒體膜進行富集化（非均質翻譯系統）。與之相反，來自草地貪夜蛾 (Spodoptera frugiperda)的細胞裂解物可W用作均質翻譯系統，運是由于所述細胞裂解 物與所含有的膜小泡源自相同的細胞系。通過適宜的細胞分解方法的措施，可W獲得含有 重要的細胞區室(具體而言內質網）成分的真核細胞裂解物。從細胞排出的或者滲入細胞膜 內的所有蛋白，攜帶有糖殘基或者具有二硫橋用于穩定其分子結構，遷移穿過此細胞區室。 含有ER結構(所謂的微粒體或膜小泡）的細胞裂解物，現在可W用于制造具有功能活性形式 的此類蛋白候選。W此方式，防止了裂解物的小泡和細胞質蛋白之間的不匹配性，結果是相 對較高的蛋白產率(在分批模式的昆蟲細胞裂解物中達到20μg/ml)W及目標蛋白有效轉移 至裂解物的微粒體內。
[0005] 無細胞蛋白合成反應在實驗上可W通過各種方式來實現。最簡單的反應路徑是在 一鍋反應(分批反應）中合成目標蛋白。基于分批的系統因而適宜用于目標蛋白不復雜且快 速的合成。然而另一方面，其特征是短的運行時間W及相對較低的蛋白產率。
[0006] -般而言，基于分批的無細胞翻譯反應在1-1.5小時后達到所合成目標蛋白的最 大值。超過此時間的溫育時間并不會導致蛋白產率增加，而很大可能會導致目標蛋白濃度 的降低，運可能是由于目標蛋白的蛋白水解分解，例如由細胞提取物中存在的蛋白酶所分 解。然而，在特定的情況下高度有利的是，還將所合成的目標蛋白w完整的形式保存在翻譯 溶液中更長的溫育時間（〉化）。
[0007] 延長無細胞蛋白合成反應的運行時間W便由此獲得更高的蛋白產率的一種可能 是，使用透析系統（持續交換無細胞系統，CECF;Spirin，A. et al.，Science ,1988,242 (4882):pp. 1162-4)。在本文中，高能物質如ATP和GTP通過擴散穿過膜進入反應區室內（進 行翻譯的處所）。同時，反應耗盡了抑制性物質如游離的憐酸鹽和ADP。
[0008] 在反應區室中連續供應無細胞反應延長了合成的運行時間，并且導致與分批系統 相比顯著提高的蛋白產率。此類型的透析系統已經是商業可購買的，雖然只會與原核細胞 裂解物(來自大腸桿菌)或者與麥胚裂解物組合提供。
[0009] 盡管與不連續的分批系統相比產率提升，但是使用相應真核透析系統的蛋白產率 與基于大腸桿菌的系統相比依然相對較低。
[0010] 針對此背景，本發明的目的是提供運樣的措施，其使得能夠在無細胞翻譯系統中， W相對較大的量合成穩定且有功能活性形式的復雜真核和原核蛋白，特別是膜蛋白或者具 有翻譯后修飾的蛋白。
[0011] 根據本發明此目的是通過W下來實現的:權利要求1的無細胞蛋白合成方法(其中 使用真核細胞裂解物并且所述體外翻譯反應是在脫天蛋白酶抑制劑的存在下進行的）、權 利要求13和15中脫天蛋白酶抑制劑的用途、W及權利要求17中用于進行本發明方法的裝 置。本發明更具體的或者優選的實施方案W及方面是從屬權利要求的主題。

【發明內容】

[0012] 本發明的主要方面設及無細胞蛋白合成的方法，其包括使用核酸模板和真核細胞 裂解物的體外翻譯反應，特征在于所述翻譯反應是在脫天蛋白酶抑制劑的存在下進行的。
[0013] 所使用的真核細胞裂解物并無特別的限制并且基本上包含任何細胞裂解物(其含 有核酸模板的體外翻譯所需的所有成分）。特別優選的是也能夠合成具有翻譯后修飾的復 雜蛋白的細胞裂解物。
[0014] 在更具體的實施方案中，所使用的真核細胞裂解物選自包含W下的組:麥胚裂解 物，昆蟲細胞裂解物，特別是Sf 21細胞裂解物，網狀細胞裂解物，角化細胞裂解物，來自C冊 細胞、Hela細胞、雜交瘤細胞或培養的淋己瘤細胞的細胞提取物。
[0015] 運些細胞裂解物可W其天然形式使用，或者通過添加或去除特定成分而經過修 飾。
[0016] 如果主要得自一種細胞系的細胞裂解物不含有例如膜小泡(如網狀細胞裂解物）， 運些可W從例如另一細胞系的裂解物來添加，W便使得能夠合成具有翻譯后修飾的蛋白。 另外，裂解物中膜小泡的存在是膜蛋白嵌入天然的脂質-蛋白基質(其保證了膜蛋白的正確 折疊和構象)的前提條件。
[0017] 相反，對于特定蛋白的合成，使用天然不含膜小泡(或者例如通過離屯、步驟去除了 小泡）的細胞裂解物可W是有利的。使用此種"小泡耗盡的"細胞裂解物可W導致特定蛋白 的產率提高(參見實施例1，圖1)。
[0018] 所述"小泡耗盡的"細胞裂解物也是有翻譯活性的并且可W用于不具有翻譯后修 飾的蛋白的無細胞合成。
[0019] 所使用的細胞裂解物的成分因而可W是源自一種細胞系的細胞(均質翻譯系統） 或者不同細胞系的細胞(非均質翻譯系統）。原則上也可W使用人工細胞裂解物，其中一種 或多種成分經過合成產生。
[0020] 用于進行本發明方法的反應混合物，其在所述真核細胞裂解物和所述脫天蛋白酶 抑制劑之外含有至少一種核酸模板、聚合酶、氨基酸、W及高能物質如ATP、GTP等。原則上， 可W使用已知用于體外翻譯系統的所有反應混合物和成分（在添加脫天蛋白酶抑制劑之 后）。所述反應混合物還可能含有另外的添加劑，其促進特定目標蛋白的合成或者穩定性， 例如DTT或其它還原劑，特別是還原的和氧化的谷脫甘膚的混合物。
[0021] 如下文所述的實驗W及測試數據所示，將脫天蛋白酶抑制劑添加至無細胞真核翻 譯系統中（特別是使用連續透析系統），令人吃驚地顯著提高了蛋白產率，對于具有翻譯后 修飾的復雜蛋白也是如此。
[0022] 脫天蛋白酶抑制劑對于無細胞蛋白合成反應合成性能的此種作用的生化機制目 前還不清楚。在細胞破裂期間，細胞經受巨大的壓力，其可能誘導調亡過程。調亡也稱作"程 序化細胞死亡"，其基本上由具有蛋白水解活性的酶類別控制，也即所述的"脫天蛋白酶"。 據推測脫天蛋白酶抑制劑對脫天蛋白酶的抑制延長了裂解物中特定翻譯因子的壽命，運繼 而會對細胞提取物的整體合成產出有正面作用。
[0023] 在使用真核細胞裂解物的無細胞蛋白合成系統中存在脫天蛋白酶抑制劑的另外 的優勢在于，對所合成的蛋白穩定性的正面影響，特別是在運些蛋白于翻譯混合物中保持 較長(例如〉1.5h)的條件下。運設及例如運樣的反應，其中一種或多種目標蛋白的無細胞合 成在同一微粒體混合物中于多個相繼的合成中發生。此種類型的反應路徑已知為"多重或 重復合成"并且用于使重新合成的目標蛋白在微粒體小泡的腔或膜中富集。
[0024] 原則上，脫天蛋白酶(特別是目前已知的脫天蛋白酶1-14型的一種）的任何可逆或 不可逆的抑制劑，都適宜用作脫天蛋白酶抑制劑。脫天蛋白酶抑制劑在例如W下的出版物 中有描述：C 曰 llus ,Β.Α.曰 nd D . L. V曰 ux , C曰 sp 曰 se inhibitors