微流體渦流輔助式電穿孔系統及方法
【專利說明】微流體滿流輔助式電穿孔系統及方法
[0001] 相關申請案的交叉參考
[0002] 本申請案主張2013年8月7日提交的第13/961,084號美國實用申請案的優先權益， 所述申請案的內容W引用的方式全部并入本文中。
【背景技術】
[0003] 將外來分子引入到活細胞及人體組織中的能力對生物學研究及醫療中的各種應 用具有顯著的啟示。已研發出包含病毒介導、化學、物理及光學途徑的數種方法W將外生分 子傳遞到細胞中。當前，病毒介導途徑是基因傳遞及表達的最有效方式;然而，除了只能夠 傳遞核酸之外，病毒傳遞系統還伴隨著相當多的風險，包含毒性、染色體整合及免疫原性。 病毒途徑因此對于要求最小的移植后風險的許多臨床及研究應用(例如細胞重新編程或血 統轉型的基因療法及研究)來說并不理想，。
[0004] 因此，非病毒分子傳遞技術作為必然的替代已開始獲得更多關注。在此類技術當 中，電穿孔由于其將無數類型的分子引入到體外及體內的祀細胞中且不需要潛在地對化學 試劑或病毒進行細胞破壞的能力而被視為有效且強大的技術。電穿孔利用短的高電壓脈沖 來瞬間且可逆地在細胞隔膜上產生小孔，所關注的分子探針可穿過小孔而被傳遞到胞液 中。然而，使用比色皿或微毛細血管的常規電穿孔技術依賴于大批隨機分子傳遞程序，從而 使所述系統不適用于需要精確且個別控制的轉移分子劑量的應用。此外，具有大的細胞直 徑異質性的樣本難W獲得實際效率及生存能力，因為瞬間破壞細胞隔膜所需要的電場強度 與細胞大小有很大關系。
[0005] 微流體的最近進展促進了微觀電穿孔技術的發展，允許通過增強細胞生存能力進 行轉移分子的單細胞級電穿孔及劑量控制。盡管在增強生存能力的情況下其在產量及分子 傳遞效率方面的改進是顯著的，但單向溢流法方案(大部分當前的微流體電穿孔系統在所 述方案下操作)使當前微流體電穿孔器呈現為不提供多個不同分子且還缺乏良好的劑量控 制。

【發明內容】

[0006] -種系統及方法包含經由連接多個捕捉器的通道將關注細胞傳遞到所述捕捉器、 維持捕捉器中的滿流W將關注細胞捕捉在捕捉器中、將第一關注分子提供到捕捉器、W及 跨捕捉器提供電場W執行第一關注分子到捕捉器中的關注細胞的電穿孔。
[0007] 在一個裝置中，第一通道具有慣性集中區域W朝所述通道的側移動行進通過第一 通道的溶液中的細胞。多個捕捉器沿第一通道的長度安置在慣性集中區域下游。每一捕捉 器的大小適用于在溶液流過第一通道時促進捕捉器內的滿流W將細胞捕捉在捕捉器中。通 道的出口設置在所述多個捕捉器下游。電極禪合到相對的捕捉器的端部W跨捕捉器施加適 用于分子到細胞中的電穿孔的電場。
【附圖說明】
[0008] 圖1是根據實例實施例的電穿孔系統的方框圖俯視圖。
[0009] 圖2是根據實例實施例的用于跨捕捉器產生大致上均勻電場的電極的透視圖。
[0010] 圖3是說明根據實例實施例的捕捉細胞及執行電穿孔的方法的流程圖。
[0011] 圖4是根據實例實施例的具有替代電極結構的電穿孔系統的方框透視圖。
[0012] 圖5是根據實例實施例的具有圖案化電極結構的電穿孔系統的方框透視圖。
[0013] 圖6是根據實例實施例的一側上具有捕捉器的通道的方框圖。
[0014] 圖7是根據實例實施例的替代側上具有捕捉器的通道的方框圖。
[0015] 圖8是一或多個實例實施例中的用于實施控制功能的計算機系統的方框示意圖。
【具體實施方式】
[0016] 在W下詳細描述中，參考形成詳細描述的一部分的附圖，且在附圖中通過說明的 方式展示可實踐的特定實施例。此類實施例經足夠詳細描述W使得所屬領域技術人員能夠 實踐本發明，且應了解可利用其它實施例，且在不脫離本發明的范圍的情況下可作出結構、 邏輯及電改變。實例實施例的W下描述因此不應被視為限制意義，且本發明的范圍由隨附 權利要求書界定。
[0017] 在一個實施例中，本文中描述的功能或算法可在軟件或軟件與人類實施程序的組 合中實施。軟件可由存儲在例如存儲器或其它類型的存儲裝置的計算機可讀媒體上的計算 機可執行指令組成。此外，此類功能對應于模塊，所述模塊是軟件、硬件、固件或其任何組 合。多個功能可按照需要在一或多個模塊中執行，且所描述實施例僅僅是實例。軟件可在數 字信號處理器、ASIC、微處理器或在計算機系統(例如個人計算機、服務器或其它計算機系 統)上操作的其它類型的處理器上執行。
[0018] 在各個實施例中，系統及方法提供滿流輔助式微流體電穿孔，其利用循序多分子 傳遞W預選擇具有精確且獨立的分子量及參數可控性的祀細胞。
[0019] 圖1說明一個實施例中總體為100的電穿孔系統。在一個實施例中的系統100包含 經禪合W從多個溶液源110接收溶液的多個入口 105。在各個實施例中，源110適用于保存包 含關注細胞的溶液及含有不同關注分子的各種溶液。在一些實施例中，溶液還可包含各種 溶液的流動之間或之后用于培養及洗涂或沖洗的溶液(例如DPBS)。控制器115控制源now 按照所需方式循序供應溶液到輸入端口。在一個實施例中，控制器包括氣動流量控制系統， 其及時且獨立地給個別溶液腔室110加壓W驅動流動通過微流體電穿孔器100。控制器還控 制閥口（例如，閥口歧管）W按照受控循序方式提供各種溶液。
[0020] 入口 105可包含粗過濾器且各自禪合到至少第一通道120且任選地第二通道125 W 提供溶液到通道。在一個實施例中，第一及第二通道大致上彼此平行地伸展，且接收相同溶 液。其它實施例中可包含其它通道。每一通道還可包含分別圖示為130、131的慣性集中區 域。慣性集中區域用來允許響應于溶液中的細胞的流體動態力而朝通道的壁遷移。
[0021] 稱為例如捕捉器135、136及137、138的多個腔室分別禪合到慣性集中區域130、131 下游的通道120及125。在一個實施例中，每一通道具有圍繞每一對捕捉器中的捕捉器入口 140及捕捉器出口 141安置的若干對相對捕捉器。入口 140及出口 141有效地平分所述對捕捉 器135、136,運形成矩形結構。溶液經由每一對的相應入口及出口繼續流過所述對捕捉器， 且最后退出其中可收集廢棄物及細胞的表示為出口 143的一或多個通道出口。在其它實施 例中，捕捉器不一定是相對的，且可w重疊或非重疊方式彼此沿通道交錯或甚至只從通道 的一側延伸。
[0022] 在所示的實施例中，對應于五對相對捕捉器，每個通道存在十個捕捉器。給定兩個 通道，總共有20個捕捉器。在其它實施例中，可形成多達80對或更多對捕捉器，相當于有160 個或更多滿流來用于捕捉細胞。捕捉器及通道可由一個實施例中來自使用常見的光刻程序 形成的娃鑄模具的聚二甲基硅氧烷(PDMS)板形成。PDMS板可例如由氧等離子體清潔劑活化 (或功能化)且覆蓋有玻璃板W封閉捕捉器及通道。在其它實施例中，可使用不同材料，例如 娃或塑料，從而允許(i)剛性有壁通道在壓力下不會發生通道橫截面變形，及(ii)在較高壓 力下進行流體注入而不使通道及因此額外多對捕捉器分層。
[0023] 在一個實施例中選擇捕捉器的大小使得流過通道及捕捉器的溶液在每一捕捉器 中形成滿流，如例如捕捉器135中的145及捕捉器136中的146所說明。當雷諾數大于近似100 時，在溶液流動的同時將細胞捕捉在滿流145、146中。溶液保持流過由通道的區段152、153 分離的剩余相對捕捉器對中的每一者。隨著溶液朝出口 143流動，每一捕捉器對具有所產生 的滿流連同所捕捉的細胞。在一個實施例中，捕捉器中的每一者可含有幾乎相同的細胞群。
[0024] 在一些實施例中，作用于細胞上的力可使細胞取決于其生物物理性質(例如，大小 及可變形性)被慣性集中到靠近通道壁的相異橫向平衡位置，例如慣性集中區域130、131 中。此粒子/細胞排序現象可起因于作用于流動細胞上的兩個抵消的慣性升力（即，壁效應 提升及剪切力梯度提升)之間的平衡。由于慣性集中的流動細胞進入突然膨脹的捕捉器(又 稱為電穿孔腔室區域），剪切力梯度提升單獨地引發流動細胞朝微觀滿流的核屯、橫向遷移，