新型家禽腺病毒及其疫苗的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及新型家禽腺病毒及其疫苗。
【背景技術】
[0002] 被稱為包涵體肝炎（Inclusion body hepatitis)或家禽腺病毒感染癥（Fowl adenovirus，FAdV)的疾病是因1群家禽腺病毒(FAdV)發病的傳染病。FAdV屬于腺病毒科 (Family Adenoviridae)，基因組（gemone)由沒有分節的線形雙鏈（double-stranded)DNA 構成。屬于1群的家禽腺病毒共存在12個血清型，運些血清型之間表現出非常不同的病原 性。已知危害韓國國內養雞業的主要血清型是4型、8型、11型，在包涵體肝炎的情況下，大部 分血清型中均被發現，在4型的情況下，已知伴有屯、包積水癥，并且通常病原性最強。腺病毒 感染癥是通過感染作為主要祀標的肝細胞并形成特征性的包涵體（Inclusion body)而引 起死亡的疾病。包涵體肝炎能夠垂直傳播或水平傳播，在垂直傳播的情況下，通常3~4周齡 時發病，也報道過當進行了垂直傳播時7日齡之前發病的案例。單獨感染時，死亡率為10% 左右，較低，但與甘保羅病或雞傳染性貧血等免疫抑制性疾病形成復合感染時，死亡率會進 一步變高。已知在感染伴有屯、包積水的血清型4型的情況下，發病率和死亡率相對變高，在 敏感性高的肉雞中死亡率能夠達到80%，因此所處狀況是，對韓國國內養雞業造成巨大經 濟損失。
[0003] 該疾病于1949年首次從鳥類分離，目前已廣泛分布，全世界均有發病報告。之后， 于1987年伴有屯、包積水癥的血清型4型腺病毒感染癥在己基斯坦被報告，后來隨著全世界 性的發病報告，對養雞業造成了嚴重的損害。在屯、包積水癥的情況下，與W往包涵體肝炎不 同，其特征在于，在沒有免疫抑制性疾病的狀態下，單獨感染也能夠導致高發病率和死亡 率。此外，是在幼齡敏感性高的疾病，并且能夠進行蛋傳(egg化ansmission)，因此其是如 下疾病:種雞群受到感染后一直無癥狀，但蛋傳給后代維雞而引發嚴重病癥，從而能夠對肉 雞產業造成損害。
[0004] 根據農林畜產檢疫本部的報告，對于2007年至2010年申報發生包涵體肝炎的情況 可W確認，血清型4型占46%，比率最高，之后是11型（31 % )，8b型（23%)，因此4型、m3型W 及11型所占比率高。此外，可W確認總發病報告中，72%為來自肉雞的發病報告，蛋雞和± 雞占據剩余比率，包涵體肝炎所造成的災害在肉雞中最為嚴重(圖1)。
[000引此外，根據農林畜產檢疫本部，對于2周齡之前的雞中因疾病的垂直傳播而導致感 染的情況而言，在報告的共39件中占10件，因此所處狀況是，由來源于種雞群的包涵體肝炎 病毒的傳播導致的災害也持續出現發病報告。
[0006] 目前韓國國內的狀況是，由于未實施包涵體肝炎疫苗，因此相應疾病已胚胎繼代， 引起了后代維雞中的死亡率增加，生產性降低等問題，養雞產業正遭受著打擊。因此，切實 的狀況是，引入一種包涵體肝炎疫苗，其在種雞群中，能夠在抑制疾病感染的同時保持高抗 體滴度，并且有助于傳遞母源抗體。
[0007] 現有專利文獻
[000引韓國專利公開號第16
[0009] 韓國專利公開號第16

【發明內容】

[0010] 技術課題
[0011] 本發明是依據上述必要性而提出的，本發明的目的在于，提供一種韓國國內分離 的新型家禽腺病毒。
[0012] 解決技術的方法
[001引為了實現上述目的，本發明提供W保藏號KCTC 12425BP保藏的FAdVK4家禽腺病 0
[0014] 本發明的菌株已于2013年6月12日保藏在韓國典型菌種保藏中屯、（韓國大田儒城 區科學路125,韓國生物科學和生物技術研究院，305-806)。
[0015] 在本發明的一個實施方式中，上述病毒優選為從韓國國內的雞分離的病毒，并且 優選包含序列號1的堿基序列，但不限于此。
[0016] 此外，本發明提供包含上述本發明的家禽腺病毒和可藥用的載體或稀釋劑的針對 由家禽腺病毒感染引發的疾病的家禽保護用疫苗。
[0017] 在本發明的一個實施方式中，上述疫苗優選對預防或治療包涵體肝炎有效，優選 為滅活的形態，優選進一步包含助劑，優選進一步包含一種W上對家禽具有感染性的其他 病原菌的疫苗成分，但不限于此。
[0018] 此外，本發明提供家禽腺病毒的制造方法，該制造方法包括：向易受感染的基質接 種上述本發明所定義的家禽腺病毒的步驟;b)使上述家禽腺病毒增殖的步驟;及C)收集含 有上述家禽腺病毒的物質的步驟。
[0019] 在本發明的一個實施方式中，上述基質優選為選自由雞肝胚細胞(CEL)、雞胚成纖 維細胞(CEF)、雞腎細胞(CK)和非洲綠猴腎細胞(Vero)細胞株組成的組中的一種細胞，但不 限于此。
[0020] 此外，本發明提供針對由家禽腺病毒感染引發的疾病的家禽保護用疫苗的制造方 法，其特征在于，包括將通過上述本發明的方法得到的收集后的家禽腺病毒與可藥用的載 體或稀釋劑結合的步驟，必要時在將上述家禽腺病毒滅活后實施上述步驟。
[0021] 此外，本發明提供在家禽中控制由家禽腺病毒感染引發的疾病的方法，該方法包 括將上述本發明的疫苗施用于鳥。
[0022] 本發明的疫苗例如能夠根據用于市售的活的滅活的家禽腺病毒疫苗所經常使用 的常規方法來準備。獸醫學疫苗組合物的制造尤其在巧andbunch der Schutzimp化ngen in der Tiermedizin"(編寫：Mays , A.等人，Verlag Paul Parey,Berlin und Hamburg, Germany, 1984)和"Vaccines or Veterinary Applications"(編寫：Peters ,A.R.等人， Butterworth-Heinemann Ltd, 1993)中已被說明。
[0023] 將增殖步驟后收集的病毒滅活的目的在于，防止病毒的再生。一般而言，滅活能夠 通過化學或物理方法來實施。化學滅活例如能夠通過用酶、甲醒、β-丙內醋、乙締亞胺或其 衍生物處理病毒來實施。必要時，滅活的化合物在后期被中和。被甲醒滅活的物質例如可W 由硫代硫酸鹽中和。物理滅活能夠優選通過向病毒照射能量充分的射線、例如UV光而實施。 必要時，照射后抑能夠被調整為約7的值。
[0024] 含有滅活的家禽腺病毒的疫苗例如可W包含一種W上符合該目的的前述可藥用 的載體或稀釋劑。優選的是，本發明的滅活的疫苗包含一種W上具有輔助活性的化合物。符 合該目的化合物或組合物包含將氨氧化侶、憐酸侶、氧化侶、礦物油、維生素 E乙酸醋等植物 油和皂巧作為主成分的水包油型或油包水型乳劑。
[0025] 滅活的疫苗主要非經口施用，即通過肌肉內或皮下內施用。
[0026] 本發明的疫苗包含有效量的家禽腺病毒作為活性成分，所述有效量是指通過抵抗 毒性病毒所引起的攻擊(施用抗原），在接種疫苗的鳥類或其后代中使能夠誘導免疫的家禽 腺病毒物質免疫化的量。本申請中，免疫被定義為，與未進行疫苗接種的組相比，疫苗接種 后在鳥類群體中誘導相當高水平的免疫。
[0027] 通常，滅活疫苗包含與每只鳥類104-1〇WtCID50等效的抗原。
[0028] 本發明的家禽腺病毒疫苗能夠有效地用于雞，但火雞、珍珠雞(guinea fowl)和鶴 譜等其他家禽也能夠有效地W疫苗來接種。雞包含食用雞、克隆家畜和下蛋的家畜。
[0029] 有益效果
[0030] 本發明通過提供新型家禽腺病毒、包含其的疫苗及它們的制造方法，能夠有效保 護家禽不受家禽腺病毒感染。
【附圖說明】
[0031] 圖1是2007年至2010年之間韓國國內成功分離的包涵體肝炎病毒的血清型和發病 比率。< 出處:農林畜產檢疫本部〉
[0032] 圖2是其他病原體感染與否的試驗。
[0033] 圖3是HEX0N基因部位的系統學分析。
【具體實施方式】
[0034] W下，通過非限制性的實施例來更詳細說明本發明。但，下述實施例是為了例示本 發明而記載的，本發明的范圍不應理解為受到下述實施例的限制。
[00巧]①韓國國內露天養殖場中的化wl Adenovirus FAdV K4株分離、鑒定，其他病原體 否定試驗
[0036] 從2010年位于京畿道的肉雞養殖場委托的肉雞摘取肝并放入滅菌憐酸緩沖溶液 (pH7.2)，從而制作10重量％的乳液。將其在3,000g下離屯、分離15分鐘使細胞和組織沉淀， 將上清液用〇.45μπι的注射器過濾器過濾。通過解化11日齡的SPF雞胚的絨毛尿囊膜 (chorioallantoic membrane : CAM)接種法分離，并通過聚合酶鏈式反應（PCR)最終鑒定 FAdV K4細胞株。
[0037] ②新型FAdV露天分離株內其他病原體否定試驗
[0038] 為了確認能夠在雞胚胚胎的尿囊液和絨毛尿囊膜中增殖的其他病原體的存在與 否，對傳染性支氣管炎病毒（Infectious bronchitis virus, IBV)、新城疫病毒(Newcastle disease,NDV)、傳染性F囊病病毒（Infectious bursal disease virus, IBDV)、雞傳染性貧 血病毒（Qiicken infectious anemia virus,CIAV)、支原體(Mycoplasma)實施逆轉錄聚合 酶鏈式反應（RT-PCR)和聚合酶鏈式反應（PCR),從而確認除了甘保羅病病毒分離株（IBD K7)W外沒有其他病原體。
[0039] ③基因組堿基序列分析