miR-200c-3p在制備CXCR6抑制劑中的用圖
【專利摘要】本發明公開了miR?200c?3p、miR?200c?3p模擬物或miR?200c?3p激動劑在制備CXCR6抑制劑中的用途。本發明還公開了一種CXCR6抑制劑，它是以miR?200c?3p、miR?200c?3p模擬物或miR?200c?3p激動劑為活性成分，加上藥學上可接受的輔料或者輔助性成分制備而成的制劑。本發明miR?200c?3p、miR?200c?3p模擬物或miR?200c?3p，均可以下調CXCR6的表達，抑制乳腺癌的增殖、侵襲、遷移和體內成瘤等生物學活性，可以制備成為CXCR6抑制劑，治療腫瘤，具有良好的臨床應用前景。
【專利說明】
m i R-200c-3p在制備CXCR6抑制劑中的用途
技術領域
[0001] 本發明涉及miR-200c-3p、miR-200c-3p模擬物或miR-200c-3p激動劑在制備CXCR6 抑制劑中的用途。
【背景技術】
[0002] 近年來有研究顯示腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉移和血管生成等生物學特性與炎癥 反應的趨化因子相關。趨化因子具有相應的受體，趨化因子受體表達于參與炎癥反應的白 細胞表面，通過趨化因子的濃度梯度介導白細胞向炎癥部位的迀移。
[0003] 目前發現多種趨化因子受體如CXCR4、CXCR5、CXCR6等在腫瘤細胞中的表達，其中， CXCR6是一新近發現的趨化因子受體，它在前列腺癌、卵巢上皮癌、黑色素瘤、結直腸腺癌、 乳腺癌等多種癌組織細胞中的表達與相應正常組織細胞的表達有統計學差異，并且還發現 CXCR6與癌細胞的侵襲、轉移等特性呈正相關。
[0004] 但是，抑制CXCR6是否能夠治療腫瘤是未知的。

【發明內容】

[0005] 本發明提供了 miR-20〇C-3p及其激動劑的用途。
[0006] 本發明提供了 miR-200c-3p、miR-200c-3p模擬物或miR-200c-3p激動劑在制備 CXCR6抑制劑中的用途。
[0007] 所述CXCR6抑制劑是抗腫瘤藥物。優選地，所述抗腫瘤藥物是抑制乳腺癌的增殖、 侵襲、迀移和/或體內成瘤性的藥物。
[0008] 所述抗腫瘤藥物是抗乳腺癌、和抗腫瘤組織中表達CXCR6同時低表達或無表達 miR-200c的所有惡性腫瘤的藥物，包括頭頸部腫瘤(鼻咽癌、口腔癌、口咽癌、下咽癌、喉癌、 甲狀腺癌、副鼻竇癌）、腦瘤、非小細胞肺癌、食管癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、結直腸癌、宮頸癌、 前列腺癌、卵巢上皮癌、惡性黑色素瘤、皮膚癌、骨及軟組織肉瘤等惡性腫瘤。
[0009] 所述miR-200c-3p的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0010] 所述miR-200c-3p模擬物的核苷酸序列如SEQIDN0·2所示。
[0011 ]所述 miR-200c-3p 激動劑是 Agomir 或 EndoFectinTM-Plus 轉染試劑。
[0012] 本發明還提供了 CXCR6抑制劑在制備抗腫瘤藥物中的用途;優選地，所述藥物是抗 乳腺癌的藥物。
[0013] 本發明還提供了一種CXCR6抑制劑，它是以miR-200c-3p、miR-200c-3p模擬物或 miR-200c-3p激動劑為活性成分，加上藥學上可接受的輔料或者輔助性成分制備而成的制 劑。
[0014] 所述miR-200c-3p的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0015] 所述miR-200c-3p模擬物的核苷酸序列如SEQIDN0·2所示。
[0016]所述 miR-200c_3p 激動劑是 Agomir。
[0017 ]本發明CXCR6抑制劑可以抑制CXCR6的表達，進而抑制乳腺癌的增殖、侵襲、迀移和 體內成瘤性，miR-200c-3p、miR-200c-3p模擬物或miR-200c-3p，均可以下調CXCR6的表達， 可以制備成為CXCR6抑制劑，治療腫瘤，具有良好的臨床應用前景。
[0018]顯然，根據本發明的上述內容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離 本發明上述基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0019]以下通過實施例形式的【具體實施方式】，對本發明的上述內容再作進一步的詳細說 明。但不應將此理解為本發明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發明上述內容 所實現的技術均屬于本發明的范圍。
【附圖說明】
[0020] 圖1 CXCR6和miRNA在正常乳腺上皮細胞及三種乳腺癌細胞中的自然表達情況。每 個細胞系有4個柱子，從左至右均分別代表CXCR6、miR-200c-3p、miR-375和miR-203的表達。 CXCR6的相對表達量(黑色柱子)對應左側縱坐標;其余miRNA的相對表達量(條紋柱子)對應 右側縱坐標。
[0021] 圖2自然狀態下正常乳腺上皮細胞及三種乳腺癌細胞的增殖、侵襲和迀移能力。 (A)正常乳腺上皮細胞及三種乳腺癌細胞自然情況下的增殖情況。***代表MDA-MB-231與其 他3個細胞系相比，P〈0.01; (B)侵襲實驗：正常乳腺上皮細胞及三種乳腺癌細胞侵透 Matrigel膠并穿過微孔膜后，粘附于微孔膜上，采用Giemsa對細胞進行染色，并于顯微鏡觀 察計數，記錄10個100倍鏡下細胞數，進行平均數和方差計算。圖為典型照片(上)和平均計 數結果（下）：（C)迀移實驗:正常乳腺上皮細胞及三種乳腺癌細胞穿過微孔膜后，粘附于微 孔膜上，采用Giemsa對細胞進行染色，并于顯微鏡觀察計數，記錄10個100倍鏡下細胞數，進 行平均數和方差計算。圖為典型照片(上)和平均計數結果(下）。
[0022] 圖 3 在MDA-MB-231 細胞中過表達miR-200c-3p、miR-375及 shRNA 沉默 CXCR6 后 CXCR6 在蛋白水平和mRNA水平的表達情況。所有圖中，BC均為自然狀態下的231細胞，NC-mi均為 mimic陰性對照，200c_mi代表mimic轉染miR-200c_3p的實驗組，375-mi代表mimic轉染miR-375的實驗組，sh-NC為shRNA的陰性對照，sh-R6為shRNA干擾CXCR6表達的實驗組，200c-mi、375-mi和sh-CXCR6均以BC為空白對照。（A)mimic轉染miR-200c-3p后，miR-200c-3p的表 達情況；（B)mimic轉染miR-375后，miR-375的表達情況；（C)mimic及shRNA轉染MDA-MB-231 細胞后CXCR6在蛋白水平(上)和mRNA水平(下）的表達情況。
[0023] 圖 4 過表達 miR-200c-3p、miR-375 及 shRNA 沉默 CXCR6 后 MDA-MB-231 的增殖、侵襲和 迀移情況。BC為MDA-MB-231細胞空白對照組，NC-mi為mimi c陰性對照組，200c-mi為MDA-MB-231細胞中mimic過表達miR-200c的實驗組，sh-NC為shRNA陰性對照組，sh-R6為MDA-MB-231 細胞中shRNA干擾CXCR6表達組。（A)MDA-MB-231細胞的增殖實驗，*代表200c-mi與NC-mi及 BC相比，P〈0.001，#代表sh-R6于sh-NC及BC相比，P〈0.001; (B)侵襲實驗:上述各組細胞穿過 微孔膜后，粘附于微孔膜上，采用Giemsa對細胞進行染色，并于顯微鏡觀察計數，記錄10個 100倍鏡下細胞數，進行平均數和方差計算。圖為典型照片(上)和平均計數結果(下）；（C)迀 移實驗:上述各組細胞穿過微孔膜后，粘附于微孔膜上，采用Giemsa對細胞進行染色，并于 顯微鏡觀察計數，記錄10個100倍鏡下細胞數，進行平均數和方差計算。圖為典型照片（上） 和平均計數結果(下）。
[0024] 圖 5 在MDA-MB-231 細胞中過表達 miR-200c-3p、miR-375 及 shRNA沉默 CXCR6 后 AKT/ mTOR通路中關鍵分子的表達情況。BC為自然狀態下的231細胞，NC-mi為mimic陰性對照組， 200c-mi代表mimic轉染miR-200c-3p的實驗組，375-mi代表mimic轉染miR-375的實驗組， sh-NC為轉染shRNA的陰性對照，sh-R6為shRNA干擾CXCR6表達的實驗組。（A)上述各組細胞 中AKT/mTOR通路的關鍵分子Akt、p40S6K和4E-BP-1以及它們的磷酸化水平（p-Akt、p-P40S6K和p-4E-BP-l)的表達情況。
【具體實施方式】
[0025]實施例1 miR-200c-3p及其激動劑與CXCR6表達以及乳腺癌的關系 [0026] 一、實驗材料和檢測方法
[0027] 1、實時熒光定量PCR檢測試劑盒：
[0032] 2、MTT實驗檢測細胞的增值能力實驗步驟：
[0033] (1)將處于對數生長期的各組細胞消化，用含10%胎小牛血清得培養液配成單個 細胞懸液，每組細胞計數2.5xl03個，接種于96孔培養板，每組共設5個復孔，共接種7塊培養 板。
[0034] (2)每24小時測定各組細胞的吸光度值，共檢測7天。
[0035] (3)每次檢測前每孔細胞加入20μ1 MTT (5mg/ml用PBS配制，pH= 7 · 4)，在5 %⑶2、 37 °C恒溫、和濕度的細胞培養箱中孵育4h。小心吸棄96孔板孔內培養液，每孔加入200μ1 DMS0,于振蕩器上振蕩lOmin。將96孔板置于多功能酶標儀中，選擇490nm波長，在多功能酶 標儀上測定各孔光吸收值，記錄結果，以時間為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制細胞生長曲 線。
[0036] 3、Transwell實驗檢測細胞的侵襲和迀移能力(實驗步驟：
[0037] (l)Transwell小室制備：①進行侵襲實驗前，需用50mg/LMatrigel 1:8稀釋液包 被Transwell小室底部膜的上室面，4°C風干。吸出培養板中殘余液體，每孔加入50ul含10g/ L BSA的無血清培養液，置于37°C，30min。②進行迀移實驗前無需包被Matrigel，其余同侵 襲實驗。
[0038] (2)制備細胞懸液：制備細胞懸液前，進行細胞換液，使各組細胞在無血清環境下 培養12 - 24h，進一步去除血清的影響。消化細胞，終止消化后離心棄去培養液，用PBS液洗 1 - 2遍，用0.05%-0.2% BSA的無血清培養基重懸。計數細胞1 X 105個/孔(侵襲實驗）或1_ 50 X 104-50 X 104個/孔(迀移實驗）。
[0039] (3)接種細胞:取細胞懸液100 - 200μ1加入Transwell小室。24孔板作為下室，加入 500-600μ1含10%FBS的細胞培養液，將Transwell小室架于24孔板孔上，去除下層培養液和 小室間氣泡，使Transwe 11小室底面微孔膜與24孔板孔中培養液充分接觸。在5 % C02、37 °C 恒溫、飽和濕度的細胞培養箱中培養24-48h。
[0040] (4)結果統計：用棉簽擦去基質膠和上室內的細胞，用滴管或移液器吸去PBS液，緩 緩沖洗Transwell小室底面，去除殘留的培養液，將Transwell小室瞭干備用。棄去24孔板中 培養液，加入Giemsa染色液，將Transwell小室置于其中，使小室底面微孔膜與24孔板孔中 Giemsa染色液充分接觸，染色15-30min。取出Transwell小室，用滴管或移液器吸去roS液， 緩緩沖洗小室底面l_3min，使之充分脫色。將小室晾干，置于顯微鏡下，在放大倍數為100倍 的光學顯微鏡下隨機取10個視野對貼附于聚碳酸酯微孔膜的細胞計數，取其均值代表侵襲 或迀移細胞數。
[0041 ] 二、實驗方法
[0042] 1、選取正常乳腺上皮細胞系(MCF-10A)，較低侵襲性乳腺癌細胞系(MCF7、SK-BR-3)和高侵襲性乳腺癌細胞系(MDA-MB-231)，采用All-in One? miRNA qRT-PCR Detection Kit(美國Genecopoeia公司）（qualitative Real-Time PCR，qRT_PCR)進行實時焚光定量PCR 檢測（按照試劑盒上的方法操作)上述4個細胞系自然狀態下CXCR6和miR-200c-3p、miR-375 和miR-203的表達情況。
[0043]使用MTT實驗檢測上述4個細胞系自然狀態下的增殖能力，使用Transwell實驗檢 測上述4個乳腺癌細胞系自然狀態下的侵襲和迀移能力。
[0044] 2、選取CXCR6高表達、miR-200c-3p和miR-375低表達的高侵襲性乳腺癌細胞MDA-MB-231進行進一步的實驗。
[0045] 使用microRNA模擬物過表達MDA-MB-231細胞中miR-200c-3p和miR-375的表達(其 中，過表達miR-200c-3p的microRNA模擬物的核苷酸序列是UAAUACUGCCGGGUAAUGAUGGA)，用 qRT-PCR和Western Blot檢測CXCR6在mRNA和蛋白水平的表達情況。使用MTT實驗檢測過表 達miR-200c-3p和miR-375后MDA-MB-231細胞的增殖能力，使用Transwell實驗檢測過表達 miR-200c-3p和miR-375后MDA-MB-231細胞的侵襲和迀移能力。
[0046] 3、在MDA-MB-231細胞中，使用shRNA干擾技術特異性沉默CXCR6的表達，用qRT-PCR 檢測CXCR6在mRNA水平的表達情況，以及miR-200c-3p、miR-375和miR-203的表達情況。使用 Western Blot檢測沉默CXCR6表達后CXCR6蛋白水平的表達情況。使用MTT實驗檢測沉默 CXCR6后MDA-MB-231細胞的增殖能力，使用Transwell實驗檢測沉默CXCR6后MDA-MB-231細 胞的侵襲和迀移能力。
[0047]三、實驗結果：
[0048] l、miR-200c 與 CXCR6 呈負相關
[0049] 如圖1所示，miR-200c、miR-375在低表達CXCR6的乳腺上皮細胞和乳腺癌細胞 (MCF-10A、MCF7和SK-BR-3)中表達較高，而在高表達CXCR6的乳腺癌細胞(MDA-MB-231)中表 達低，即 miR-200c-3p(miR-200c-3p 的核苷酸序列是 SEQ ID N0.1: UAAUACUGCCGGGUAAUGAUGGA)、miR-375與CXCR6在不同乳腺癌細胞中的表達呈負相關的趨 勢。而miR-203與CXCR6表達的負相關趨勢不明顯。
[0050] 如圖2所示，miR-200c-3p、miR-375低表達，CXCR6高表達的MDA-MB-231細胞增殖 (圖2A)、侵襲（圖2B)和迀移（圖2C)能力最強，而其他miR-200c-3p、miR-375中/高表達， CXCR6低表達的乳腺癌細胞增殖、侵襲和迀移能力均較弱且它們之間無明顯差異。
[0051 ] 2、上調miR-200c可以降低抑制CXCR6的表達
[0052] 如圖3所示，在MDA-MB-231細胞中使用Mimic(核苷酸序列是 UAAUACUGCCGGGUAAUGAUGGA)過表達 miR-200c 和使用RNAi 特異性干擾 CXCR6 均導致 CXCR6 的 mRNA水平和蛋白水平的表達下調，且過表達miR-200c-3p與shRNA沉默CXCR6的效果相似（圖 3C)〇
[0053] 而過表達miR-375不能影響CXCR6的表達。
[0054] 3、抑制CXCR6表達可以降低腫瘤細胞的增殖、侵襲和迀移能力
[0055] 使用mimic過表達miR-200c-3p和使用shRNA沉默CXCR6均導致MDA-MB-231細胞的 增殖（圖4A)、侵襲（圖4B)和迀移能力（圖4C)下降，且兩者作用效果相似。而過表達miR-375 僅能抑制MDA-MB-231細胞的侵襲能力（圖4B)。
[0056] 如圖5所示，在MDA-MB-231細胞中使用Mimic過表達miR-200c和使用RNAi特異性干 擾CXCR6均導致CXCR6下游的Akt/mTOR通路關鍵分子p70S6K和4E-BP-1的激活(磷酸化水平） 受到抑制，Akt的表達亦受到抑制，且兩者作用效果相當，而過表達miR-375進輕度抑制Akt 和P70S6K的磷酸化水平。
[0057]四、實驗結論：
[0058] 結果表明，miR-200c-3p或其激動劑(核苷酸序列是UAAUACUGCCGGGUAAUGAUGGA的 mimic)在乳腺癌中可以抑制CXCR6的表達，進而抑制CXCR6下游的Akt/mTOR通路的激活，從 而抑制乳腺癌的增殖、侵襲、迀移和體內成瘤等生物學活性。
[0059]綜上，CXCR6的抑制劑可以有效抑制CXCR6的表達，抑制乳腺癌的增殖、侵襲、迀移 和體內成瘤性等，降低乳腺癌的惡性程度，而miR-200c-3p或其激動劑（核苷酸序列是 UAAUACUGCCGGGUAAUGAUGGA的mimi c)可以抑制CXCR6，可以作為CXCR6抑制劑，在乳腺癌的基 因治療方面將具有較強的潛力和廣闊的應用前景。
【主權項】
1. miR-200c-3p、miR-200c-3p模擬物或miR-200c-3p激動劑在制備CXCR6抑制劑中的用 途。2. 根據權利要求1所述的用途，其特征在于:所述CXCR6抑制劑是抗腫瘤藥物。3. 根據權利要求2所述的用途，其特征在于:所述抗腫瘤藥物是抗乳腺癌、和抗腫瘤組 織中表達CXCR6同時低表達或無表達miR-200c的所有惡性腫瘤包括頭頸部腫瘤（如，鼻咽 癌、口腔癌、口咽癌、下咽癌、喉癌、甲狀腺癌、副鼻竇癌）、腦瘤、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、 食管癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、結直腸癌、宮頸癌、前列腺癌、卵巢上皮癌、惡性黑色素瘤、皮膚 癌、骨及軟組織肉瘤等惡性腫瘤的藥物。4. 根據權利要求1所述的用途，其特征在于:所述miR-200c-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。5. 根據權利要求1所述的用途，其特征在于:所述miR-200c-3p模擬物的核苷酸序列如 SEQIDN0.2**。6. 根據權利要求1所述的用途，其特征在于：所述miR-200c-3p激動劑是Agomir或 EndoFectinTM-Plus 轉染試劑。 7. CXCR6抑制劑在制備抗腫瘤藥物中的用途;優選地，所述藥物是抗乳腺癌的藥物。8. -種CXCR6抑制劑，其特征在于：它是以miR-200c-3p、miR-200c-3p模擬物或miR-200c-3p激動劑為活性成分，加上藥學上可接受的輔料或者輔助性成分制備而成的制劑。9. 根據權利要求8所述的CXCR6抑制劑，其特征在于:所述miR-200c-3p的核苷酸序列如 SEQIDN0.1所示;所述miR-200c-3p模擬物的核苷酸序列如SEQIDN0.2所示。10. 根據權利要求8所述的CXCR6抑制劑，其特征在于：所述miR-200c-3p激動劑是 Agomir〇
【文檔編號】A61K31/7088GK105833274SQ201610145133
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年3月14日
【發明人】陳念永
【申請人】四川大學華西醫院