專利名稱：新血管緊張肽受體,其制備和用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及新血管緊張肽受體，其制備和用途。
腎素血管緊張肽系統在心血管系統調控和電解質及體液平衡調節中起重要作用。生理活性效應物激素如血管緊張肽Ⅱ(AngⅡ)和血管緊張肽1-7(Ang1-7)分別通過蛋白裂解由裂解肝臟中合成的前體血管緊張肽原或從血管緊張肽原形成的血管緊張肽Ⅰ獲得。大量蛋白酶參與這些裂解(如腎素和血管緊張肽轉化酶(ACE))。
目前已描述了被稱為AT1和AT2的兩種人血管緊張肽受體。兩種受體均為血管緊張肽Ⅱ(AngⅡ)受體，即這些受體優選結合AngⅡ。這兩個受體的cDNA序列(Takayanagi,R等，(1992)，生物化學和生物物理學研究通訊(Biochemical and Biophysical Research Communications),183,910-915；Tsuzuki,S.等，(1994)，生物化學和生物物理學研究通訊，200,1449-1454)各含有七個構成潛在跨膜結構域的疏水性區域。因為此特征性結構域結構，可假定血管緊張肽受體AT1和AT2屬于七跨膜受體家族，其通過胞內G蛋白偶聯的信號傳導級聯反應介導配體血管緊張肽Ⅱ的作用。
因為由其它血管緊張肽介導的藥理學作用與AngⅡ和/或分別來自血管緊張肽Ⅰ和血管緊張肽Ⅱ的肽(AngⅠ和AngⅡ的內源性形成片段)不同，因此懷疑一定存在其它人血管緊張肽受體。在此方面，最近證明了一種受體七肽Ang1-7(Ferrario,CM等(1997)，高血壓(Hypertension)30,535-541)。
本發明涉及一種新血管緊張肽受體，其具有至少一個含有SEQ IDNO.10氨基酸序列的亞基，此氨基酸序列在C-末端可能還含有其它氨基酸。
血管緊張肽受體是跨膜受體。與先前已描述的血管緊張肽受體不同，它優選地擁有少于7跨膜結構域。含有SEQ ID NO.10序列的亞基優選地擁有一個跨膜結構域。此跨膜結構域的長度優選地多于6個，優選8個或9個，特別優選7個氨基酸。跨膜結構域優選地具有序列“MSIVIPL”(以氨基酸單字符表示)。
血管緊張肽受體可擁有一個或多個亞基。例如，受體可以下列形式存在a)單體(一個含有SEQ ID NO.10序列的亞基)，或為b)二聚體，含有相同或不同的亞基，或為c)四聚體，其中含有三個相同的亞基或含有一個相同亞基和兩個不同亞基。
然而，血管緊張肽受體也可以單體(一個亞基)或二聚體(兩個不同亞基)的形式存在直到結合配體，且作為結合配體的結果僅僅分別改變為二聚體或四聚體的形式。
具有與該新血管緊張肽受體相似結構的受體尤其是胰島素受體、生長因子如神經生長因子(NGF)、內皮生長因子(EGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)、血小板衍生的生長因子(PDGF)、T細胞抗原受體、造血細胞因子受體(如IL1、IL15)和粘附分子(整合素和選擇蛋白)。
如適當，新血管緊張肽受體可被翻譯后修飾，例如，受體可被糖基化和/或磷酸化。
血管緊張肽受體可結合其配體，可細胞內介導這種(些)配體的作用。血管緊張肽受體可結合血管緊張肽1-7和/或血管緊張肽1-7衍生物。血管緊張肽1-7衍生物優選為來自Ang1-7截短的肽，如Ang1-7的降解產物。Ang1-7衍生物的例子有血管緊張肽Ⅲ和血管緊張肽Ⅳ。受體優選結合Ang1-7。
本發明涉及具有或含有示于表2 SEQ ID NO.10的氨基酸序列之受體。血管緊張肽受體或含有SEQ ID NO.10的亞基是長度至少為175個氨基酸。
本發明還涉及具有編碼新血管緊張肽受體(“受體”)之序列的核酸。例如，受體可部分或全部由具有SEQ ID NO.9序列的核酸編碼。編碼受體或其亞基的核酸可含有SEQ ID NO.9的序列，且可能進一步在3’端擁有屬于編碼序列的核苷酸。
核酸可為例如DNA、cDNA或RNA。核酸可為一種基因，其可以是被非編碼序列(內含子)間隔的SEQ ID NO.9的序列。
如適當，核酸可為衍生的。核酸衍生物可例如為一種鹽，或者是除了天然核苷酸之外含有修飾的核苷酸之核酸衍生物，或是完全由修飾的核苷酸組成的核酸衍生物。
本發明還涉及制備編碼血管緊張肽受體及含有SEQ ID NO.9的序列的核酸的方法。例如，該核酸可利用寡核苷酸作為引物通過PCR擴增，其中所述引物的序列相應于血管緊張肽受體AT1和AT2之核苷酸序列的同源區(保守區)，以及這樣的cDNA，其優選地從血管緊張肽1-7或其衍生物具有作用的組織(或細胞)制備，和/或從其中AT1和/或AT2不表達的組織(或細胞)制備。在本發明方法的一個特定實施方案中，使用了其序列來自AT1和AT2序列同源區的簡并性引物。優選使用引物Ang3A和Ang3B用于此目的。從內皮細胞制備的cDNA可例如用作模板。例如，從HUVEC(人臍靜脈內皮細胞)制備的cDNA可用做模板。
本發明還涉及制備新受體的方法。例如，新血管緊張肽受體可這樣制備，通過將核酸整合入適當的載體，其中核酸序列編碼血管緊張肽受體且優選地含有SEQ ID NO.9的序列，將所得重組載體導入細胞，血管緊張肽受體在該細胞中表達。
本發明還涉及編碼血管緊張肽受體且優選地含有SEQ ID NO.9的序列的核酸的如下用途，例如用于制備重組血管緊張肽受體的方法中，包括將在適當啟動子控制下的核酸導入細胞，并在該細胞中表達。
本發明還涉及編碼血管緊張肽受體且優選地含有SEQ ID NO.9序列的核酸用于制備重組細胞的用途，在所述重組細胞中血管緊張肽受體可表達。本發明涉及表達具有SEQ ID NO.10序列的血管緊張肽受體之重組細胞。本發明還涉及編碼血管緊張肽受體且優選地含有SEQ ID NO.9序列的核酸的用途，其用于制備治療和預防與心血管系統、電解質平衡或體液平衡的調節紊亂相關的疾病之藥物。本發明涉及含有帶SEQ IDNO.9序列之核酸的藥物。
本發明還涉及編碼血管緊張肽受體且優選地含有SEQ ID NO.9序列的核酸用于制備轉基因動物的用途，所述動物不含有相應地血管緊張肽受體基因，或者用于制備過量表達相應的血管緊張肽受體基因的轉基因動物。轉基因動物可用于例如表征血管緊張肽的特異性和生物化學功能。本發明涉及表達血管緊張肽受體之非人轉基因動物。
本發明還涉及編碼血管緊張肽受體且優選地含有SEQ ID NO.9序列的核酸的這種用途，其用于鑒定和表征可用作血管緊張肽受體的拮抗劑和激動劑之物質的方法中，和/或用于鑒定可抑制或激活所編碼之血管緊張肽受體的功能性表達的物質的方法中。本發明涉及鑒定和表征血管緊張肽受體的拮抗劑或激動劑之方法，包括將含有SEQ ID NO.9序列的核酸導入細胞且血管緊張肽受體在該細胞中表達，該細胞與待研究的物質一起溫育，測定此物質對血管緊張肽受體的作用。
本發明也涉及編碼血管緊張肽受體且優選地含有SEQ ID NO.9序列的核酸的用途，其用于基因治療或用于制備可用于基因治療的藥物。
此外，本發明涉及編碼血管緊張肽受體且優選地含有SEQ ID NO.9序列的核酸的用途，其用作分子生物學的工具(如，用作探針)。
本發明還涉及新血管緊張肽受體的用途。例如，所述血管緊張肽受體可用于鑒定和表征物質的方法(如，篩選中的功能性鑒定和結合鑒定)中，所述物質可用作受體的拮抗劑或激動劑。
此外，血管緊張肽受體或其部分(例如，一種由例如SEQ ID NO.1O或其部分預先決定的表位)可用于依照周知的方法制備抗體(Harlow和Lane，“抗體實驗室手冊”，Cold Spring Harbor Laboratory,ISBN-O-87969-314-2)。由此種方法制備的特異性結合新血管緊張肽受體之抗體可在例如診斷方法和/或將受體進行進一步表征的過程中，用來檢測新受體。發明詳述為找到新受體，使用編碼血管緊張肽Ⅱ受體AT1和AT2的已知序列來合成寡核苷酸，所述寡核苷酸的序列相應于AT1/AT2編碼序列的保守區或其針對所述保守區(Ang3A和Ang3B)。這些寡核苷酸可用于以來自人HUVEC(人臍靜脈內皮細胞)的cDNA為模板之PCR反應。該細胞系來自血管襯里的內皮細胞。這些細胞不表達任何AT1或AT2受體。
擴增且鑒定了一種具有開放閱讀框且核苷酸序列(SEQ ID NO.3)此前未被描述的DNA片段。該核苷酸序列與EMBL或Genbank數據庫中現有的序列不一致。將該序列與Lifeseq數據庫中的序列利用“Blast”和“Assembly”程序模塊(GCG軟件包)進行比較，顯示SEQ ID NO.3與Lifeseq克隆號1458429,3341232,3440195,1250818,2836520,1310286和1362205(未知功能的EST)有重疊。可從該實際(3)重疊群中衍生的理論上0.5kbp DNA片段通過了實驗證實(實施例2，利用引物對Ang4A和Ang4B的PCR)。通過5’延伸入載體序列(實施例3)闡明了DNA片段的序列以及其中所含的開放閱讀框(SEQ ID NO.9)。SEQ ID NO.9序列也含有5’非翻譯區或其部分。
SEQ ID NO.9核苷酸序列的5’區域分析顯示，在推定起始甲硫氨酸三聯密碼子(ATG)上游，一個嘌呤核苷酸位于-3位，胞嘧啶核苷酸位于-1和-4位。在-1、-3和-4位的這些核苷酸位置相應于起始mRNA翻譯的起始位點知真核共有序列。
SEQ ID NO.9的開放閱讀框編碼含有至少175個氨基酸(SEQ IDNO.10)的蛋白質。利用GCG程序進行的該氨基酸序列疏水性分析顯示，該序列在N-末端擁有長度約7個氨基酸的疏水性結構域。此結構域可代表用于在膜上錨定所述新受體的跨膜結構域。相反，在C-末端擁有結構域的序列或多或少具有親水性。
Ang3A的核苷酸序列SEQ ID NO.1:5’-TTG TKC TKK YCT TYW TCW TTT SCT GGM TTC CC-3′Ang3B的核苷酸序列SEQ ID NO.2:5’-TTY CCM ASA AAR CMA TAM ARA ARM GGA TT-3′其中M=(A/C)Y=(C/T)R=(A/G)S=(G/C)K=(G/T)W=(A/T).
PCR反應中，HUVEC文庫中的1微克cDNA與重組水生嗜熱菌(Thermus aquaticus)(Taq)DNA聚合酶(Boehringer Mannheim，德國)以及每50微升反應體積中引物Ang3A和Ang3B各10pmol一起在熱循環儀(Perkin Elmer 2400熱循環儀，Perkin Elmer applied Biosystems,Weiterstadt)中溫育。利用如下溫度循環進行PCR反應95℃ 20秒，38℃ 10秒及72℃ 20秒(60個循環)。擴增了一個長度為130堿基對(bp)的DNA片段。
將此130bp DNA片段連接入載體pCR 2.1 TOPO(Invitrogen BV,NV Leek，荷蘭)，轉化至大腸桿菌Top10F’。利用毛細管電泳測序儀測定130bp DNA片段的序列存在于pCR 2.1中(ABI 310,appliedBiosystems,Weiterstadt)(SEQ ID NO.3)。
與SEQ ID NO.3重疊的表達序列標記(EST)序列在Lifeseq數據庫中得到鑒定(Lifeseq克隆號1458429,3341232,3440195,1250818,2836520,1310286和1362205)。基于由發明人訂購重疊表達序列標記(EST)裝配的序列合成了引物Ang4A和Ang4B。
Ang4A的核苷酸序列SEQ ID NO.4:5’-TGG GGG TTG ATA CAG CAG AGA C-3′Ang4B的核苷酸序列SEQ ID NO.5:5’-GCA CTG CCC TCT CTT TAT CCA AA-3’每個PCR反應利用HUVEC文庫中的0.1微克cDNA作為模板，每50微升反應體積中引物Ang4A和Ang4B各10pmol，以及AdvantagecDNA聚合酶混合物(Clontech,Heidelberg)進行。利用如下溫度循環進行PCR反應94℃ 30秒，60℃ 2分30秒(60個循環)。獲得了一個長度為500bp的DNA片段。如實施例1所述將此片段克隆并測序。此序列擁有一個開放閱讀框(ORF)。
Ang5A的核苷酸序列SEQ ID NO.7:5’-TGG GGA TTG ATA GGC AG-3’Ang5B的核苷酸序列SEQ ID NO.8:5’-ATA ACT GTT GGA TTT CTC AA-3’在每個情況中，Ang5A和Ang5B的核苷酸序列相應于500bpDNA片段的序列之一部分。在分別用M13反向和M13正向(-20)引物的進一步的PCR中使用了這兩個引物。M13反向和M13正向(-20)引物相應于用來制備HUVEC cDNA文庫的Uni-ZAP噬菌體載體之序列。這些PCR反應這樣進行每個情況中利用HUVEC文庫中的0.1微克cDNA作為模板，引物Ang5A和Ang5B各10pmol，以及分別地，M13反向或M13正向(-20)引物(來自Topo-TA克隆試劑盒(Clontech))和Taq聚合酶(boehringer Mannheim)還有Taq StartTM抗體(Clontech)。利用如下溫度循環進行PCR反應96℃ 30秒，50℃ 30秒及72℃ 45秒(70個循環)。
由此得到了一個長度為660bp的DNA片段。如實施例1所述將此片段克隆并測序。此DNA片段擁有SEQ ID NO.9。SEQ ID NO.9序列含有完整的5’編碼區。
除了前面已經描述的軟件模塊之外，GCG模塊中的裝配(Assemble)、繪圖(Map)、翻譯(Translate)、結構繪制(Plotstructure)、和比較(Pileup)均用于進行計算機輔助序列分析。
表1 SEQ ID NO.9血管緊張肽受體核苷酸序列(部分)1 TCGTGTGTGA ACATCACAGG GTTTGTGGAT GCACTTAGAT GTTTGCAATG51 AGCACTGTGG CTGGCATGCC CCAGTGTTTT GGATACCAAT GCATAGGACT101 CCATAGTAAT CGAATTTACC AGAGGCGAAC GTCATGAGCA TAGTGATCCC151 ATTGGGGGTT GATACAGCAG AGACGTCATA CTTGGAAATG GCTGCAGGTT201 CAGAACCAGA ATCCGTAGAA GCTAGCCCTG TGGTAGTTGA GAAATCCAAC251 AGTTATCCCC ACCAGTTATA TACCAGCAGC TCACATCATT CACACAGTTA301 CATTGGTTTG CCCTATGCGG ACCATAATTA TGGTGCTCGT CCTCCTCCGA351 CACCTCCGGC TTCCCCTCCT CCATCAGTCC TTATTAGCAA AAATGAAGTA401 GGCATATTTA CCACTCCTAA TTTTGATGAA ACTTCCAGTG CTACTACAAT451 CAGCACATCT GAGGATGGAA GTTATGGTAC TGATGTAACC AGGTGCATAT501 GTGGTTTTAC ACATGATGAT GGATACATGA TCTGTTGTGA CAAATGCAGC551 GTTTGGCAAC ATATTGACTG CATGGGGATT GATAGGCAGC ATATTCCTGA601 TACATATCTA TGTGAACGTT GTCAGCCTAG GAATTTGGAT AAAGAGAGGG651 CAGTGCTACT表2 SEQ ID NO.10新受體氨基酸序列(部分)1 MSIVIPLGVDTAETSYLEMAAGSEPESVEASPVVVEKSNSYPHQLYTSSS51 HHSHSYIGLPYADHNYGARPPPTPPASPPPSVLISKNEVGIFTTPNFDET101 SSATTISTSEDGSYGTDVTRCICGFTHDDGYMICCDKCSVWQHIDCMGID151 RQHIPDTYLCERCQPRNLDKERAVL表3 SEQ ID NO.31 CTCCTCCATC AGTCCTTATT AGCAAAAATG AAGTAGGCAT ATTTACCACT51 CCTAATTTTG ATGAAACTTC CAGTGCTACT ACAACCAGAG CGAG表4 SEQ ID NO.61 ATTGGGGGTT GATACAGCAG AGACGTCATA CTTGGAAATG GCTGCAGGTT51 CAGAACCAGA ATCCGTAGAA GCTAGCCCTG TGGTAGTTGA GAAATCCAAC101 AGTTATCCCC ACCAGTTATA TACCAGCAGC TCACATCATT CACACAGTTA151 CATTGGTTTG cCCTATGCGG ACCATAATTA TGGTGCTCGT CCTCCTCCGA201 CACCTCCGGC TTCCCCTCCT CCATCAGTCC TTATTAGCAA AAATGAAGTA251 GGCATATTTA CCACTCCTAA TTTTGATGAA ACTTCCAGTG CTACTACAAT301 CAGCACATCT GAGGATGGAA GTTATGGTAC TGATGTAACC AGGTGCATAT351 GTGGTTTTAC ACATGATGAT GGATACATGA TCTGTTGTGA CAAATGCAGC401 GTTTGGCAAC ATATTGACTG CATGGGGATT GATAGGCAGC ATATTCCTGA451 TACATATCTA TGTGAACGTT GTCAGCCTAG GAATTTGGAT AAAGAGAGGG501 CAGTGCTACT序列表(1)一般信息(ⅰ)申請人(A)姓名Hoechst Marion Roussel Deutschland GmbH(B)街道(C)城市Frankfurt(D)聯邦州(E)國家德國(F)郵政編碼65926(G)電話069-305-7072(H)傳真069-35-7175(I)電傳(ⅱ)發明題目新血管緊張肽受體，其制備和用途(ⅲ)序列數目10(ⅳ)計算機可讀形式(A)介質類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，版本#1.30(EPO)(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度32個堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵詞外顯子(B)位置1..32(D)其它信息/注=“M=(A/C)；Y=(C/T)；R=(A/G)；S=(G/C)；K=(G/T)；W=(A/T)”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:TTGTKCTKKY CTTYWTCWTT TSCTGGMTTC CC 32(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)長度29個堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵詞外顯子(B)位置1..29(D)其它信息/注=“M=(A/C)；Y=(C/T)；R=(A/G)；S=(G/C)；K=(G/T)；W=(A/T)”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:TTYCCMASAA ARCMATAMAR AARMGGATT29(2)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特征(A)長度94個堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵詞外顯子(B)位置1..94(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:CTCCTCCATC AGTCCTTATT AGCAAAAATG30AAGTAGGCAT ATTTACCACT CCTAATTTTG60ATGAAACTTC CAGTGCTACT ACAACCAGAG CGAG 94(2)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特征(A)長度22個堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵詞外顯子(B)位置1..22(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4:TGGGGGTTGA TACAGCAGAG AC 22(2)SEQ ID NO:5的信息(ⅰ)序列特征(A)長度23個堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈
(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵詞外顯子(B)位置1..23(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5:GCACTGCCCT CTCTTTATCC AAA 23(2)SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)序列特征(A)長度510個堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵詞外顯子(B)位置1..510(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6ATTGGGGGTT GATACAGCAG AGACGTCATA CTTGGAAATG GCTGCAGGTT CAGAACCAGA 60ATCCGTAGAA GCTAGCCCTG TGGTAGTTGA GAAATCCAAC AGTTATCCCC ACCAGTTATA 120TACCAGCAGC TCACATCATT CACACAGTTA CATTGGTTTG CCCTATGCGG ACCATAATTA 180TGGTGCTCGT CCTCCTCCGA CACCTCCGGC TTCCCCTCCT CCATCAGTCC TTATTAGCAA 240AAATGAAGTA GGCATATTTA CCACTCCTAA TTTTGATGAA ACTTCCAGTG CTACTACAAT 300CAGCACATCT GAGGATGGAA GTTATGGTAC TGATGTAACC AGGTGCATAT GTGGTTTTAC 360ACATGATGAT GGATACATGA TCTGTTGTGA CAAATGCAGC GTTTGGCAAC ATATTGACTG 420CATGGGGATT GATAGGCAGC ATATTCCTGA TACATATCTA TGTGAACGTT GTCAGCCTAG 480GAATTTGGAT AAAGAGAGGG CAGTGCTACT 510(2)SEQ ID NO:7的信息(ⅰ)序列特征(A)長度17個堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵詞外顯子(B)位置1..17(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7:
TCGGGGATTGA TAGGCAG 17(2)SEQ ID NO:8的信息(ⅰ)序列特征(A)長度20個堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵詞外顯子(B)位置1..20(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:8:
ATAACTGTTG GATTTCTCAA20(2)SEQ ID NO:9的信息(ⅰ)序列特征(A)長度660個堿基對
(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵詞外顯子(B)位置1..660(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:9:TCGTGTGTGA ACATCACAGG GTTTGTGGAT GCACTTAGAT GTTTGCAATG AGCACTGTGG60CTGGCATGCC CCAGTGTTTT GGATACCAAT GCATAGGACT CCATAGTAAT CGAATTTACC 120AGAGGCGAAC GTCATGAGCA TAGTGATCCC ATTGGGGGTT GATACAGCAG AGACGTCATA 180CTTGGAAATG GCTGCAGGTT CAGAACCAGA ATCCGTAGAA GCTAGCCCTG TGGTAGTTGA 240GAAATCCAAC AGTTATCCCC ACCAGTTATA TACCAGCAGC TCACATCATT CACACAGTTA 300CATTGGTTTG CCCTATGCGG ACCATAATTA TGGTGCTCGT CCTCCTCCGA CACCTCCGGC 360TTCCCCTCCT CCATCAGTCC TTATTAGCAA AAATGAAGTA GGCATATTTA CCACTCCTAA 420TTTTGATGAA ACTTCCAGTG CTACTACAAT CAGCACATCT GAGAATGGAA GTTATGGTAC 480TGATGTAACC AGGTGCATAT GTGGTTTTAC ACATGATGAT GGATACATGA TCTGTTGTGA 540CAAATGCAGC GTTTGGCAAC ATATTGACTG CATGGGGATT GATAGGCAGC ATATTCCTGA 600TACATATCTA TGTGAACGTT GTCAGCCTAG GAATTTGGAT AAAGAGAGGG CAGTGCTACT 660(2)SEQ ID NO:10的信息(ⅰ)序列特征(A)長度175個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵詞肽(B)位置1..175(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:10:Met Ser Ile Val Ile Pro Leu Gly Val Asp Thr Ala Glu Thr Ser Tyr1 5 10 15Leu Glu Met Ala Ala Gly Ser Glu Pro Glu Ser Val Glu Ala Ser Pro20 25 30Val Val Val Glu Lys Ser Asn Ser Tyr Pro His Gln Leu Tyr Thr Ser35 40 45Ser Ser His His Ser His Ser Tyr Ile Gly Leu Pro Tyr Ala Asp His50 55 60Asn Tyr Gly Ala Arg Pro Pro Pro Thr Pro Pro Ala Ser Pro Pro Pro65 70 75 80Ser Val Leu Ile Ser Lys Asn Glu Val Gly Ile PheThr Thr Pro Asn85 90 95Phe Asp Glu Thr Ser Ser Ala Thr Thr Ile Ser Thr Ser Glu Asp Gly100 105 110Ser Tyr Gly Thr Asp Val Thr Arg Cys Ile Cys Gly Phe Thr His Asp115 120 125Asp Gly Tyr Met Ile Cys Cys Asp Lys Cys Ser Val Trp Gln His Ile130 135 140Asp Cys Met Gly Ile Asp Arg Gln His Ile Pro Asp Thr Tyr Leu Cys145 150 155 160Glu Arg Cys Gln Pro Arg Asn Leu Asp Lys Glu Arg Ala Val Leu165 170 17權利要求
1．一種擁有至少一個含有SEQ ID NO.10氨基酸序列之亞基的血管緊張肽受體。
2．權利要求1的血管緊張肽受體，其中SEQ ID NO.10氨基酸序列在C-末端可能進一步擁有其它氨基酸。
3．權利要求1和2中一項或多項的血管緊張肽受體，其中含有SEQ IDNO.10序列的亞基擁有跨膜結構域。
4．權利要求1-3中一項或多項的血管緊張肽受體，其中受體結合血管緊張肽1-7或血管緊張肽1-7的衍生物。
5．權利要求1-4中一項或多項的血管緊張肽受體，其中受體的至少一個亞基由帶有SEQ ID NO.9序列的核酸編碼，其中SEQ ID NO.9序列在3’末端可能含有屬于編碼序列的其它核苷酸。
6．一種制備擁有SEQ ID NO.9序列的核酸的方法，其中，在PCR反應中利用其序列相應于血管緊張肽受體AT1和AT2的核苷酸序列中同源性區之寡核苷酸為引物，利用從其中不表達AT1和AT2受體的細胞中制備的cDNA為模板。
7．一種制備權利要求1-5中一項或多項的血管緊張肽受體的方法，其中，將含有SEQ ID NO.9序列的核酸整合入適當的載體，將重組載體導入細胞，血管緊張肽受體表達在該細胞中。
8．含有SEQ ID NO.9序列的核酸在制備重組血管緊張肽受體的方法中的用途，所述方法中將在適當啟動子控制下的核酸導入細胞并在該細胞中表達。
9．含有SEQ ID NO.9序列的核酸在制備重組細胞的方法中的用途，所述方法中血管緊張肽受體可被表達。
10．含有SEQ ID NO.9序列的核酸在制備藥物中的用途，所述藥物用于制備治療和/或預防與心血管系統、電解質平衡和/或體液平衡的調節紊亂相關的疾病。
11．含有SEQ ID NO.9序列的核酸在制備可用于基因治療的藥物中的用途。
12．含有SEQ ID NO.9序列的核酸在鑒定和表征可用作血管緊張肽受體的拮抗劑或激動劑之物質的方法中的用途。
13．如權利要求1-5中一項或多項的血管緊張肽受體在鑒定和表征血管緊張肽受體的拮抗劑或激動劑之方法中的用途。
14．一種鑒定和表征血管緊張肽受體的拮抗劑或激動劑之方法，其中將含有SEQ ID NO.9序列的核酸導入細胞且血管緊張肽受體在該細胞中表達，將該細胞與待研究的物質一起溫育，測定此物質對血管緊張肽受體的作用。
15．一種包含帶有SEQ ID NO.9序列的核酸之藥物。
16．一種重組細胞，其通過將帶有SEQ ID NO.9序列的核酸導入此細胞并在細胞中表達制備。
全文摘要
本發明涉及一種新血管緊張肽受體,以及其制備和用途。新血管緊張肽受體具有至少一個含有SEQ IDNO.10氨基酸序列的亞基。
文檔編號C07K14/435GK1304449SQ99807126
公開日2001年7月18日 申請日期1999年5月12日 優先權日1998年6月8日
發明者H·希斯切, J－P·克雷姆, G·利斯, G·斯本霍 申請人:阿文蒂斯藥物德國有限公司