趨化因子2在促進肝再生中的用圖
【專利摘要】本發明提供趨化因子2在促進肝再生中的用途，可以促進肝再生。肝再生速率高、肝功能穩定。
【專利說明】
趨化因子2在促進肝再生中的用途
技術領域
[0001] 本發明涉及再生生物學領域，尤其涉及趨化因子2促進肝再生中的用途。
【背景技術】
[0002] 再生生物學是現代生物學中發展最為迅速和最受關注的領域之一，肝再生也屬于 這一范疇。肝臟在正常的生理狀態下僅有約〇. 〇〇 12 % -0.01 %的細胞進行有絲分裂，但當肝 臟受到創傷或者手術切除后有很強的再生能。大鼠70 %部分肝切除（partical hepatect〇my，PH)模型是進行肝臟再生研究的主要模型，剩余肝臟經過約1周時間就基本再 生至原有的重量和體積，并保持最佳的重量/體積比，基本恢復原有的功能。對肝臟再生調 控機制的研究不僅豐富了對肝損傷和術后再生修復機制的認識和了解，同時也為器官移植 開辟了新的前景。因此，開發研究能夠促進肝再生的分子意義重大。
[0003] 趨化因子(chemokine)是一類小分子分泌蛋白，分子量約8-10kDa，能激活并趨化 白細胞作定向迀移。趨化因子是當今國內外醫學生物學研究的熱點之一，部分趨化因子的 衍生物或抑制物具有潛在的臨床應用前景。趨化因子2(C-C chemokine ligand 2，CCL2)由 脂肪細胞、纖維母細胞、內皮細胞、血管平滑肌細胞等多種細胞分泌，趨化各種炎癥細胞如 中性粒細胞、單核細胞、淋巴細胞向病變部位聚積，在炎癥反應、新生血管生成、損傷修復、 腫瘤發生中均有重要作用。CCL2已發現在肝炎、肝纖維化、肝癌等眾多肝臟疾病的發生發展 中起著重要作用，但其在肝再生中的作用并不清楚。

【發明內容】

[0004] 本發明目的是提供趨化因子2在促進肝再生中的用途，可以促進肝再生，且肝再生 速率高、肝功能穩定。
[0005] 為了解決上述技術問題，本發明提供的趨化因子2在促進肝再生中的用途是這樣 實現的：
[0006] 趨化因子2在促進肝再生中的用途。
[0007] 趨化因子2促進肝再生過程中脂肪形成的用途。
[0008] 趨化因子2在促進肝再生藥物中的用途。
[0009] 趨化因子2在促進肝再生中脂肪形成的藥物中的用途。
[0010]本發明通過大鼠 PH模型，往大鼠體內轉入趨化因子2,記錄大鼠生長數據，轉入趨 化因子2的大鼠肝再生率及肝臟指數均顯著大于未轉入趨化因子2的大鼠；肝功能上，轉入 趨化因子2大鼠的ALT、AST和TBIL降低，與未轉入趨化因子2的大鼠有顯著差異。
[0011] 大鼠肝再生168h使用蘇丹IV對肝組織進行染色，脂肪數量明顯較多。
[0012] 提取組織中的RNA，制備cDNA。然后在PRISM 7900Sequence Detector上擴增靶基 因和進行PCR檢測，與脂肪相關基因酰基輔酶A合成酶長鏈4、載脂蛋白E、脂肪分化相關蛋白 和類固醇脫氫酶樣蛋白在轉入趨化因子2的大鼠中的數量明顯大于未轉入趨化因子2的大 鼠的量。
【附圖說明】
[0013] 圖1是本發明提供的再生肝臟轉基因后綠色熒光蛋白的表達結果圖；
[0014] 圖2是本發明提供的再生肝臟再生率試驗結果對比圖；
[0015] 圖3是本發明提供的再生肝臟指數試驗結果對比圖；
[0016] 圖4是本發明提供的再生肝臟組織經蘇丹IV染色的試驗結果對比圖；
[0017] 圖5是Real-time PCR檢測再生肝臟脂肪相關基因的表達的對比圖。
【具體實施方式】
[0018]本發明采用大鼠 PH模型進行肝臟再生試驗。本發明采用SPSS 13.0統計軟件對實 驗組和對照組資料進行t檢驗，P〈0.05為有顯著性差異，P〈0.01為有極顯著性差異。
[0019] 選用Sprague Dawley(SD)大鼠，重200±20g，購買于軍事醫學科學院實驗動物中 心，合格證號SCXK(軍）2002-0001。本發明將趨化因子2(chemokine(C-C motif)ligand 2， CCL2)通過PEGFP-N1轉入切除了部分肝的大鼠肝臟中，以促進大鼠肝臟的再生。PEGFP-N1是 PE綠色焚光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP)_Nl。趨化因子（chemokine)是一類小 分子分泌蛋白，分子量約8-10kDa，能激活并趨化白細胞作定向迀移。趨化因子2(C-C chemokine ligand 2，CCL2)由脂肪細胞、纖維母細胞、內皮細胞、血管平滑肌細胞等多種細 胞分泌，趨化各種炎癥細胞如中性粒細胞、單核細胞、淋巴細胞向病變部位聚積，在炎癥反 應、新生血管生成、損傷修復、腫瘤發生中均有重要作用。具體試驗如下：
[0020] 大鼠隨機分為三組:部分肝切除組、部分肝切除后轉PEGFP-N1(空質粒)組、部分肝 切除轉pEGFP-Nl -cc 12 (cc 12表達質粒)組，每組10只。
[0021] 大鼠部分肝切除模型的建立：用0.9%氯化鈉溶液配制1 %的戊巴比妥鈉溶液。各 組大鼠經戊巴比妥鈉(40mg/kg)麻醉后，剪去腹部和胸部的毛，75%乙醇消毒，取仰臥位固 定于手術臺，從胸骨劍突下方3cm處沿腹中線切開皮膚至胸骨劍突，暴露腹腔，將肝的左葉 和中葉（約占總肝質量的70%)擠出，以0號絲線結扎肝葉根部后，切除肝葉，5號縫合線縫合 傷口，撒少許四環素粉沫以預防感染。在切除部分肝臟后，分別三組大鼠切除兩葉之肝重A， 并對應記錄。
[0022] 部分肝切除組，大鼠于恒溫(21-22Γ)動物房中飼養，實驗期間大鼠自由飲食及飲 水。
[0023] 轉pEGFP-Nl組和轉pEGFP-Nl-ccl2組在部分肝切除后立即通過尾靜脈液壓轉基因 方法轉入pEGFP-Nl質粒或pEGFP-Nl-ccl2質粒。注射濃度為30mg/L質粒，注射速度為2ml/s， 注射質粒溶液的體積為大鼠體重X9% X 1/3 X 1.35。大鼠于21-22°C恒溫動物房中飼養，實 驗期間大鼠自由飲食及飲水。
[0024] 注射后6h熒光顯微鏡下分別觀察轉pEGFP-Nl組和轉pEGFP-Nl-ccl2組大鼠肝右葉 綠色熒光蛋白的表達，如圖1所示，A為轉pEGFP-Nl組，B為轉pEGFP-Nl-ccl2組，轉pEGFP-Nl 組和轉pEGFP-Nl-ccl2組均觀察到綠色熒光蛋白的表達，并且表達量大于30%，說明轉 pEGFP-Nl組和轉pEGFP-Nl-cc 12組大鼠肝臟中已經分別成功注入了 pEGFP-Nl和pEGFP-Nl-ccl2。部分肝切除組與部分肝切除后轉pEGFP-Nl組綠色熒光蛋白的表達結果近似，因此圖1 中省略了部分肝切除組的綠色熒光蛋白表達的圖片。
[0025]如下，本發明分別在三組大鼠飼養24、72、120、1681!時，對大鼠進行一系列檢測，具 體如下：
[0026] 一、稱重計算肝再生率和肝臟指數
[0027]三組大鼠分別在飼養24、72、120、168h各時間點稱量大鼠體重和再生肝重，按以下 公式計算肝再生率及肝臟指數。
[0028] 肝再生率=[Β-(Α/0·684-Α)]/ΑΧ100%
[0029] 肝臟指數= B/GX100%
[0030] 其中，A為切除兩葉之肝重，B為再生肝重，G為體重，0.684相當于切除兩葉肝重與 原肝重之比。
[0031] 如圖2所示，轉入pEGFP-Ni-ccU質粒的大鼠 PH后72和168h肝臟指數都顯著大于轉 pEGFP-Ni組，120h也達到 了顯著水平。其中，*P〈0 · 05，#Ρ〈0 · 01。
[0032] 如圖3所示，轉入PEGFP-NHC12質粒的大鼠 PH后120h肝臟指數極顯著大于轉 pEGFP-他組，168h也達到了顯著水平，而轉pEGFP-他組與部分肝切除組相比無顯著差異。其 中，*Ρ〈0·05，**Ρ〈0·01。
[0033] 二、肝功能檢測
[0034]飼養兩組大鼠168h后，經戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，仰臥位固定，打開腹腔，下腔 靜脈采血lmL，室溫靜置30min，4000r/min離心5min，取血清300μ1，全自動生化儀檢測血清 中谷丙轉氨酶（alanine amiotransferase, ALT)、谷草轉氨酶（aspartate aminotransf erase，AST)與總膽紅素 （total bi 1 irubin，TBIL)的含量。如表一所不，轉 pEGFP-Nl-ccl2組具用一定的降低ALT、AST和TBIL的作用，與轉pEGFP-Ni組比較均有極顯著 性差異，
[0035]
[0036] a轉pEGFP-Nl組與部分肝切除組比較，b轉pEGFP-Nl-ccl2組與轉pEGFP-Nl組比 較，*P〈〇 · 05，**Ρ〈0 · 01
[0037] 表一
[0038] 三、蘇丹IV染色
[0039] 三組大鼠在飼養168h，分別取三組大鼠的肝組織。10%甲醛固定肝組織4h，雙蒸水 洗滌三次，用冰凍切片機制備ΙΟμπι的冰凍切片，冰凍切片用雙蒸水洗三次，切片放入蘇丹 IV染液中，置于56 °C溫箱中30min或延長至lh。新配制的70 %乙醇分化，直至洗去切片上的 浮色為止(約5-10s)，雙蒸水洗三次。用濾紙將切片周圍的水分吸干。用甘油明膠封固。37°C 烤一天后盡快照相。脂肪呈猩紅色。如圖4所示，A為轉pEGFP-沁組，B為轉pEGFP-NrccU組； PEGFP-R-CC12轉基因后有脂肪聚積，猩紅色明顯較多，圖4中脂肪滴的數量呈增多的趨勢。 蘇丹IV由上海恒遠生化試劑有限公司提供。部分肝切除組與部分肝切除后轉pEGFP-ΝΙ組蘇 丹IV染色結果近似，因此省略部分肝切除組的染色結果圖片。
[0040] 三、Real-time PCR檢測脂肪相關基因的表達
[0041 ] 三組大鼠在飼養168h后，分別提取組織中的lyg RNA，按Invitrogen公司逆轉錄試 劑盒說明制備cDNA。然后按照QuantiTect SYBR Green RT-PCR Kit(Qiagen)的操作指南在 PRISM7900Sequence Detector上擴增革巴基因和進行PCR檢測，并根據標準曲線計算樣本中 靶基因的拷貝數/ml，根據β-actin的拷貝數計算靶基因的相對含量。Real-time PCR各基因 特異性引物序列見表二。
[0042]
[0043] 表二
[0044] 如圖5所示，部分肝切除后24、72、120和168h，脂肪相關基因酰基輔酶A合成酶長鏈 4(acly-coA synthetase long chainfamily 4，ACSL4)、載月旨蛋白E(apolipoprotein E， ApoE)、脂肪分化相關蛋白（adipose differentiation-related protein,ADRP)和類固醇 脫氫酶樣蛋白（NAD(P)dependent steroid dehydrogenase like,NSDHL)在轉pEGFP-Ni-ccl2組的總體來說大于僅部分肝切除組和轉pEGFP-見組，后兩組的差別不大。
[0045] 綜上所述，本發明將趨化因子2轉入切除部分肝臟的大鼠肝臟中，第一、二項檢測 分別說明肝再生率、肝臟指數和肝臟功能也比切除部分肝臟組和pEGFP-沁組有顯著恢復， 轉pEGFP-Nl-ccl2組具用降低ALT、AST和TBIL的作用，與部分肝切除組和轉pEGFP-Ni組比較 均有極顯著性差異，說明趨化因子2有促進肝再生的用途;經蘇丹IV染色，Real-time PCR檢 測脂肪相關基因的表達，進一步說明趨化因子2通過增加脂肪產生，促進肝臟再生。
[0046] 以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并不用以限制本發明，凡在本發明的精 神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 趨化因子2在促進肝再生中的用途。2. 權利要求1中所述趨化因子2促進肝再生過程中脂肪形成的用途。3. 趨化因子2在促進肝再生藥物中的用途。4. 權利要求3中所述趨化因子2在促進肝再生中脂肪形成的藥物中的用途。5. -種促進肝再生的趨化因子2。6. 權利要求5中促進肝再生中脂肪形成的趨化因子2。
【文檔編號】C07K14/52GK105886455SQ201610267737
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年4月27日
【發明人】邢雪琨, 張艷芬, 王樹芳, 陳紅麗, 李永海, 南文濱, 徐志浩, 林俊堂, 豐慧根, 袁志慶
【申請人】新鄉醫學院