2,3-丁二醇的生成能力得到增加的重組微生物及利用其的2,3-丁二醇的生產方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及2,3-下二醇的生成能力得到增加的重組微生物及利用其的2,3-下二 醇的生產方法。
【背景技術】
[0002] 作為具有四個碳和兩個徑基（-0Η)的乙醇中之一 (C也C冊HCH0HC也）的2，3-下二醇 可使用作為合成橡膠制備工序的原料物質的1,3-下二締（1，3-Butadiene)、燃料添加劑及 用作溶劑的甲基乙基酬(M邸，Methyl ethyl ketone)進行化學催化劑轉換（Ji et al.， Biotechnol.Adv. ,29: 351,2011)。并且，2,3-下二醇與汽油(Gasoline)混合而可適用為辛 燒助推器（octane booster),從而是產業上非常重要的中間體（Celinska et al., Biotechnol.Adv.,27:715,2009)〇
[0003] 2，3-下二醇可通過化學合成工序和微生物發酵工序來生產。但是，由于通過上述 工序生產2，3-下二醇的價格非常高，因而不生產商業性規模的2，3-下二醇。另一方面，最 近，隨著與通過微生物發酵工序生產2,3-下二醇技術的飛躍發展一同，對化石原料物質的 價格急劇上升和國際環境污染的制約強化，從而對W通過微生物發酵的生物為基礎的2,3- 下二醇生產的關屯、和研究開發的重要性增大。
[0004] W通過微生物發酵工序的生物為基礎的2,3-下二醇的生產研究分為發酵工序最 佳化(溫度、pH、溶解氧等）和微生物開發(微生物挖掘、掌握生理學特性、突然變異、基因操 作等)領域來進行。在發酵工序最佳化方面，查明了可有效生產2,3-下二醇的溫度、pH、溶解 氧濃度等多種條件（Ji et al.,Bioresou;r.Technol.,100:3410,2009;化kashimada et al.,J.Biosci.Bioeng.,90:661,2000；Nakashimada et al.,Biotechnol.Lett.,20:1133, 1998)。但是，由于通過上述條件下的微生物發酵工序的2,3-下二醇生產的生產率 (Productivity)及收率(Yield)仍然低，實際難W直接適用于商業工序。并且，在發酵過程 中，存在與2,3-下二醇一同，生成包含乳酸的多種有機酸(Organic acids)和包含乙醇的多 種乙醇(Alcohols)等多種副產物(By-products)的缺點。
[0005] 副產物的生成不僅降低對生物原料物質的2,3-下二醇的收率，而且在從培養液回 收2,3-下二醇的過程中需要巨大的分離及純化費用。因此，有關2,3-下二醇生產的微生物 開發研究主要向減少副產物的方向進行。代表性地，Ji等通過向野生型產酸克雷伯菌菌株 露出物理/化學突然變異方法中之一的紫外線化V)，來成功地部分抑制了作為副產物的多 種有機酸的生成(Ji et al.，Biotechnol丄ett.，30:731，2008)。與此同時，將離子束（Ion beam)方式適用于肺炎克雷伯菌菌株來增加生物質消耗速度，從而可提高2,3-下二醇的生 產(Ma et al. ,ΑρρΙ.Microbiol.Biotechnol. ,82:49,2009)。在有關通過選擇性基因操作 的副產物減少的研究中，去除參與作為主要副產物中之一的乳酸化actic acid)生成的基 因（1化A)來制備的變異微生物在一般條件下表示最佳的性能。并且，還有為了減少作為副 產物的乙醇的生成而去除參與乙醇生成的基因（adhE、aldA)的例（Ji et al.， Appl .Microbiol .Biotechnol. ,85 :1751,2010)。并且，還有在乳酸菌化AB，lactic acid bacteria)中降低參與甲酸生成的酶（pyruvate-formate lyase)的活性的例（W02010/ 037114 A1)。
[0006] 本發明人確認了具有2,3-下二醇的轉換能力的基因，確認抑制上述基因的活性的 重組微生物的2,3-下二醇生成能力得到增加且所生成的2,3-下二醇的消耗受到抑制，并完 成了本發明。

【發明內容】

[0007] 技術問題
[0008] 本發明的目的在于，提供2,3-下二醇的生成能力得到增加的重組微生物及利用其 的2,3-下二醇的生產方法。
[0009] 技術方案
[0010] 為了達成上述目的，本發明提供基因，上述基因對具有乙偶姻與2,3-下二醇之間 的轉換活性的酶進行編碼，并具有SEQ ID NO. 12的堿基序列。
[0011] 并且，本發明提供重組載體，其特征在于，包含上述基因。
[0012] 并且，本發明提供由上述基因進行編碼的蛋白質。并且，本發明提供重組微生物， 其特征在于，上述蛋白質的活性受到抑制。
[0013] 并且，本發明提供2,3-下二醇的生成能力得到增加的重組微生物，具有2,3-下二 醇及乳酸生物合成途徑，其特征在于，上述蛋白質的活性受到抑制。
[0014] 并且，本發明提供2,3-下二醇的生成能力得到增加的重組微生物，具有2,3-下二 醇及乳酸生物合成途徑，其特征在于，具有乙偶姻與2，3-下二醇之間的轉換活性，向2，3-下 二醇的轉換活性低于向乙偶姻的轉換活性的酶受到抑制。
[0015] 并且，本發明提供2,3-下二醇的生產方法，上述2,3-下二醇的生產方法包括:對上 述重組微生物進行培養的步驟；W及從通過上述步驟得到的培養液中回收2,3-下二醇的步 驟。
[0016] 發明的效果
[0017] 本發明的重組微生物增加2,3-下二醇的生成能力，并減少已生產的2,3-下二醇的 消耗率。并且，根據重組微生物的培養的乙偶姻積累率低。
【附圖說明】
[0018] 圖1表示2,3-下二醇生成菌株中的2,3-下二醇的生物合成途徑（圖1的(A)部分)及 消耗途徑(圖1的(B)部分及圖1的(C)部分）。
[0019] 圖2圖示有關存在于產酸克雷伯菌內的2,3-下二醇合成的基因操縱子。
[0020] 圖3中，為了確認有關存在于產酸克雷伯菌內的2,3-下二醇合成的基因的細胞內 功能，圖示化大腸桿菌化.CO1 i JM109)表達重組載體制作過程。
[0021] 圖4表示重組大腸桿菌的分批式發酵時2,3-下二醇的生成能力，圖5表示乙偶姻的 生成能力（參：P服budRAB/E. col i JM109、▲:地肺udRABC/E. col i JM109、 : pBRbudRA抓/ E.coli JM109)。
[0022] 圖6為在M9最少培養基中，3-下二醇作為唯一的碳源來使重組克雷伯氏菌菌 株生長的結果，圖7為殘留的2,3-下二醇的濃度（?:!(0 Δ1化A、^:KO AdhA AbudC、·: ΚΟ AldhA Adar.^：K0 AldhA AbudCAdar.) 〇
[0023] 圖8至圖11表示分批式發酵多個重組克雷伯氏菌菌株來生產2,3-下二醇的結果 (圖8:Κ0 AldhA，圖9:Κ0 AldhA AbudC，圖 10:Κ0 AldhA Adar，圖 11:Κ0 AldhA Δ budC Ad曰r)〇
【具體實施方式】
[0024] 本發明設及基因，上述基因對具有乙偶姻與2,3-下二醇之間的轉換活性的酶進行 編碼，并具有SEQ ID NO. 12的堿基序列。
[0025] 并且，本發明設及重組載體，其特征在于，包含上述基因。
[00%]并且，本發明設及由上述基因進行編碼的蛋白質。并且，本發明設及重組微生物， 其特征在于，上述蛋白質的活性受到抑制。
[0027] 并且，本發明設及2,3-下二醇的生成能力得到增加的重組微生物，具有2,3-下二 醇及乳酸生物合成途徑，其特征在于，上述蛋白質的活性受到抑制。
[0028] 并且，本發明設及2,3-下二醇的生成能力得到增加的重組微生物，具有2,3-下二 醇及乳酸生物合成途徑，其特征在于，具有乙偶姻與2，3-下二醇之間的轉換活性，向2，3-下 二醇的轉換活性低于向乙偶姻的轉換活性的酶受到抑制。
[0029] 并且，本發明設及2,3-下二醇的生產方法，上述2,3-下二醇的生產方法