一種化合物及其制備方法及利用其制備多肽的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于多肽合成技術領域，具體地，涉及化合物及其制備方法及利用其制備 多肽的方法。
[0002]
【背景技術】
[0003] 趨化因子在維持機體穩態上發揮著重要的作用，尤其是介導免疫器官的形成和 對機體免疫的監控，以及幫助免疫細胞正常發育和實現功能。趨化因子介導的淋巴細胞 的趨化運動在炎癥、腫瘤及AIDS等疾病中均發揮著病理作用。趨化因子相關產品已進 入臨床應用研宄。比如最近發現，趨化因子CCL21通過與T淋巴細胞表面的趨化因子受 體CCR7相互作用，誘導T細胞進入中樞神經系統，從而導致了 T細胞急性淋巴細胞性白 血病（Buonamici.S·，Nature, 2009，459，1000-1004·)。再比如，固態腫瘤（比如黑 色素瘤）會通過分泌CCL21，誘導產生類淋巴網狀基質骨架，形成一種異化的細胞因子環 境，用來招募調節性淋巴細胞，從而形成腫瘤所在區域的抗免疫微環境，促進腫瘤的生長 (J.D. Shields·, Science, 2010，328，749-752·)。因此，發展一種靶向 CCL21 的癌癥療 法將是治療癌癥的一個新途徑。
[0004] 趨化因子CCL21為含有三對二硫鍵的111肽，它在一些癌癥的形成和生長中起著 重要的作用，靶向CCL21可能為癌癥療法提供新的思路，但是由于其111個氨基酸和三對二 硫鍵的復雜結構，導致其重組表達或是通過多肽全合成方法，都較難獲得具有正確結構和 活性的蛋白質。目前，由生物重組表達趨化因子（比如人源CCL21)價格昂貴（250 ug/7144 CNY，Life Technology)，且無法做到具有藥用價值的修飾（比如特定的標記，PEG化等)，因 此發展化學方法高效合成趨化因子，及其各種具有藥用價值的修飾變體是非常有必要的。
[0005] 化學合成蛋白質的常用策略是首先利用固相多肽合成技術合成多肽片段，然后在 水溶液中實現多肽的片段連接。目前使用最成功的多肽片段連接方法是Stephen Kent教授 報道的自然化學連接NCL。自然化學連接策略的基本原理是利用全不保護的多肽片段1的 C端硫酯單元與多肽片段2的N端半胱氨酸單元發生化學選擇性反應，從而將多肽片段1和 多肽片段2拼接為一個更大的多肽片段。傳統的多肽片段連接，在每次NCL后就要進行一 次分離純化，該步驟耗時費力，而且會造成產率的較大損失。對合成較大的蛋白質（100-150 氨基酸）時，發展多片段的一鍋法合成方法對提高蛋白合成效率具有非常重要的意義。
[0006] 因此，目前關于制備多肽的方法仍有待改進。

【發明內容】

[0007] 本發明旨在至少在一定程度上解決上述技術問題之一或至少提供一種有用的商 業選擇。為此，本發明的一個目的在于提出一種能夠快速有效地化學合成多肽和蛋白的手 段。
[0008] -種化合物，其特征在于，具有如下結構：
【主權項】
1. 一種化合物，其特征在于，具有如下結構：
2. -如權利要求1所述化合物的制備方法，其特征在于，包括： (1) 使三氟乙酰胺與甲醛反應，獲得N-(羥甲基）三氟乙酰胺； (2) 使芴甲氧羰基-S-三苯甲基-L-半胱氨酸與三氟乙酸反應，獲得Fmoc-L-半胱氨 酸； (3) 使所得N-(羥甲基）三氟乙酰胺與Fmoc-L-半胱氨酸反應，即得。
3. 根據權利要求2所述一種化合物的制備方法，其特征在于： 步驟（1)包括： (1-1)稱取三氟乙酰胺與碳酸鉀放在圓底燒瓶中； (1-2)量取甲醛水溶液加入到上述圓底燒瓶中； (1-3)在室溫下，步驟（1-2)中所得到的混合物反應后，得N-(羥甲基）三氟乙酰胺； 步驟（2)包括： (2-1)將三氟乙酸，三異丙基硅烷與二氯甲烷混合，得混合溶液； (2-2)在室溫下，將芴甲氧羰基-S-三苯甲基-L-半胱氨酸溶于（2-1)所得混合溶液中 反應，得Fmoc-L-半胱氨酸； 步驟（3)包括： (3-1)在室溫下，將Fmoc-L-半胱氨酸溶于三氟乙酸中； (3-2)在室溫下，將N-(羥甲基）三氟乙酰胺溶于三氟乙酸中； (3-3)將（3-2)所得的溶液滴加到（3-1)所得的溶液中； (3-4 )在室溫下，步驟（3-3 )中所得到的混合物反應后，即得所述的化合物。
4. 根據權利要求2所述一種化合物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 稱取10 mmol三氟乙酰胺，I mmol的碳酸鉀于25 ml的圓底燒瓶中，加入0.8 ml 37%的甲醛水溶液，得第一混合物； 將所述第一混合物在室溫下反應6小時，將所得的反應體系直接旋干，得N-(羥甲基） 三氟乙酰胺； (2) 將20 ml三氟乙酸，20 ml二氯甲烷，I ml三苯基硅烷混勻，得第二混合物； 將10 mmol芴甲氧羰基-S-三苯甲基-L-半胱氨酸溶于第二混合物中，在室溫下反 應1小時，將所得到反應體系旋干，將所得到的混合物中三苯甲烷用石油醚洗去，以便得到 Fmoc-L-半胱氨酸； (3) 將10 mmol Fmoc-L-半胱氨酸溶于20 ml三氟乙酸中，向所獲得的混合物中加入所 述溶于三氟乙酸的N-(羥甲基）三氟乙酰胺溶液5 ml，得第三混合物； 在室溫下，將所述第三混合物攪拌過夜，將所得到的反應體系有機相旋干，將所獲得固 體溶于乙腈中，用高效液相色譜分離純化，即得權利要求1所述的化合物。
5. -種利用權利要求1所述的化合物制備多肽的方法，其特征在于，包括： (a) 提供第一多肽片段和第二多肽片段，所述第一多肽片段的C端為酰肼基團，N端為 三氟乙酰氨甲基保護的半胱氨酸，所述第二多肽片段的N端為半胱氨酸，所述三氟乙酰胺 甲基保護的半胱氨酸是利用所述的化合物，通過Fmoc固相合成技術形成的； (b) 將所述第一多肽片段和第二多肽片段進行多肽片段連接反應，得到多肽片段連接 產物第三多肽片段； (c) 將步驟（b)中所得到的連接產物第三多肽片段經過堿性條件處理，將所述三氟乙酰 胺甲基保護的半胱氨酸轉化為半胱氨酸，得到第四多肽片段，即得。
6. 根據權利要求5所述一種利用化合物制備多肽的方法，其特征在于，所述堿性條件 處理是在pH為IL 5-12. 0,37°C下進行40分鐘。
7. 根據權利要求5所述一種利用化合物制備多肽的方法，其特征在于，步驟（b)包括： (b-Ι)將所述第一多肽片段和亞硝酸鈉接觸，對所述第一多肽片段的酰肼基團進行氧 化處理； (b-2)將步驟（b-Ι)中所得到的氧化處理產物與4-巰基苯乙酸溶液混合，并將所得到 混合物的pH調節至6,生成對應的多肽疏基苯乙酸硫醋； (b-3)向步驟（b-2)所得到的混合物中添加第二多肽片段，并在pH 6. 5的條件下進行 連接反應，得連接產物第三多肽片段。
8. 根據權利要求5所述一種利用化合物制備多肽的方法，其特征在于，步驟（c)包括： (c-Ι)將（b-3)所得的反應液，用10 M氫氧化鈉水溶液調節pH至11. 6 ; (c-2)將（c-Ι)所得的反應液，在37°C條件下反應40分鐘； (c-3)將（c-2)所得的反應液，用12 M鹽酸水溶液調節pH至6.5,得到第四多肽片段， 即得。
9. 根據權利要求5所述一種利用化合物制備多肽的方法，其特征在于，所述第四多肽 片段是通過以下步驟獲得的： (a-Ι)通過固相多肽合成方法制備第一多肽片段，所述第一多肽片段的C端形成有酰 肼基團，N端形成三氟乙酰氨甲基保護的半胱氨酸； (a-2)將N端半光氨酸被三氟乙酰胺甲基保護的第一多肽片段與所述的第二多肽片段 連接，得第三多肽片段； (a-3)將所得含有第三多肽片段的反應溶液，調節pH至11. 6,在37°C下反應40分鐘 后，再調節PH至6. 5,得第四多肽片段。
10. 根據權利要求5所述一種利用化合物制備多肽的方法，其特征在于， 所述第一多肽片段具有如SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列； 所述第二多肽片段具有如SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列； 所述第三多肽片段具有如SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列； 所述第四多肽片段具有如SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列。
【專利摘要】本發明公開了一種化合物及其制備方法及利用其制備多肽的方法，其中該化合物具有如下結構：利用該化合物能夠將多肽N端的半胱氨酸保護起來，從而掩蔽N端半胱氨酸的活性，進而在多肽片段連接制備蛋白時，能夠實現一次將多個（大于等于3個）多肽片段進行連接，即每連接兩個多肽片段后不需要進行分離純化處理，在解除掩蔽后可直接進行與下一個多肽片段的連接。
【IPC分類】C07C319-14, C07K14-52, C07C323-59
【公開號】CN104744327
【申請號】CN201510033192
【發明人】鄭基深, 唐姍, 司巖巖
【申請人】中國科學院合肥物質科學研究院
【公開日】2015年7月1日
【申請日】2015年1月22日